CN101296938B - 粘菌素原料粉末的制造方法 - Google Patents
粘菌素原料粉末的制造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101296938B CN101296938B CN200680028123XA CN200680028123A CN101296938B CN 101296938 B CN101296938 B CN 101296938B CN 200680028123X A CN200680028123X A CN 200680028123XA CN 200680028123 A CN200680028123 A CN 200680028123A CN 101296938 B CN101296938 B CN 101296938B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- colistin
- material powder
- strain
- totazina
- rough material
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 61
- KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N polymyxin E2 Natural products CC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- 229960003346 colistin Drugs 0.000 title claims abstract description 59
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 title claims abstract description 59
- 239000000843 powder Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 239000002994 raw material Substances 0.000 title abstract description 6
- 241000194105 Paenibacillus polymyxa Species 0.000 claims abstract description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 52
- YKQOSKADJPQZHB-RGYSVOEGSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(6r,9s,12r,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-hydr Chemical compound CCC(C)CCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)C([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O YKQOSKADJPQZHB-RGYSVOEGSA-N 0.000 claims description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 12
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 12
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 7
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 16
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 16
- 230000007423 decrease Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 abstract 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N D-Maltose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- GPOPHQSTNHUENT-UHFFFAOYSA-N 6-Methyl caprylic acid Chemical compound CCC(C)CCCCC(O)=O GPOPHQSTNHUENT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000501711 Centaurium Species 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- XDJYMJULXQKGMM-RVYUQJQSSA-N colistin A Chemical compound CC[C@@H](C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-RVYUQJQSSA-N 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000012204 lemonade/lime carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000002834 Paulownia tomentosa Species 0.000 description 1
- 241000132152 Polymyxa Species 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- KNIWPHSUTGNZST-SSWRVQTPSA-N colistin B Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O KNIWPHSUTGNZST-SSWRVQTPSA-N 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000031891 intestinal absorption Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229940041153 polymyxins Drugs 0.000 description 1
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/02—Linear peptides containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/07—Bacillus
- C12R2001/12—Bacillus polymyxa ; Paenibacillus polymyxa
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种粘菌素原料粉末的制造方法，其能够解决脱色步骤造成的制造时间增加、粘菌素主成分的收率下降而导致成本上升、以及碳废弃物的产生造成的环境负荷等现有制造法的问题，且不进行脱色步骤。本发明提供能够生产白色度高的粘菌素原料粉末的多粘芽孢杆菌变种粘菌素、白色度高的粘菌素原料粉末、以及制造白色度高的粘菌素原料粉末的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种不进行脱色步骤而得到白色度高的粘菌素原料粉末(原末)的制造方法，其特征在于，可以得到与现有的粘菌素发酵生产中使用的生产菌株相比培养液的着色大幅减少的新型菌株，并且将该新型菌株作为生产菌株使用。
背景技术
粘菌素是对革兰阴性菌具有广谱杀菌作用的肽类抗生物质。其作用机理是通过活化细菌的细胞质膜的磷脂酶而引起磷脂的分解，从而溶菌。粘菌素的选择毒性低，不从肠道吸收，因此作为饲料用添加物广泛使用。
作为通过微生物的发酵生产制造粘菌素的方法，已知以含有大量可以廉价得到的淀粉物质等的天然原料作为主原料的、通过杆菌(Bacillus)属细菌、特别是多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)进行发酵生产的方法(参照专利文献1、2)。
以便宜的天然原料作为主原料，通过杆菌属细菌特别是多粘芽孢杆菌进行粘菌素的发酵制造时，随着发酵的进行培养液的着色变深，一直到目标物粘菌素的生产量达到最高值的发酵结束时着色增加。因此，为了从含有粘菌素的培养液中除去培养基营养源成分或发酵生成的粘菌素以外的代谢物等，提高粘菌素的纯度，而实施纯化步骤。但是，对于发酵步骤中增加的培养液的着色物质而言，不能通过上述纯化步骤完全除去，而残留在制品的粘菌素原料粉末中，结果得到着色深的粘菌素原料粉末。特别是欧洲医药品(包括动物用医药品)中使用的质量标准《欧洲药典第5版》(2004年6月15日发行，2005年1月1日实施)中，规定了粘菌素原料粉末的颜色标准是“白色或者大致白色”。为了制造符合该标准的粘菌素原料粉末，在现有的粘菌素原料粉末的制造方法中，在纯化步骤中需要使用碳等的脱色步骤。通过碳进行脱色步骤的现有粘菌素原料粉末制造方法中，存在制造所需的时间增加、且目标物质粘菌素原料粉末的回收率下降等问题。
专利文献1：日本特开昭58-47493号公报
专利文献2：日本特开昭58-129993号公报
发明内容
本发明的目的在于提供不进行现有粘菌素原料粉末的制造方法中所必需的脱色步骤、而制造白色度高的粘菌素原料粉末的方法。
为了解决上述问题，本发明人进行了广泛深入的研究，结果发现通过对现有的生产菌株进行变异处理，可以得到着色度减少的菌株，并且通过使用该菌株，不进行脱色步骤可以得到白色度高的粘菌素原料粉末，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
(1)一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素(バチルス·ポリミキサ·バ一·コリスチニゥス，bacillus polymyxa var.colistinus)，其能够生产在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。
(2)一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素M50株，其在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心以登记号FERM ABP-10656保藏。
(3)一种制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末的方法，其中，培养上述(1)或(2)所述的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱后，进行浓缩和干燥。
(4)通过上述(3)所述的制造方法得到的在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。
发明效果
通过本发明，可以提供对粘菌素原料粉末的制造方法有用的新型生产菌株。另外，通过使用本发明的菌株作为生产菌株，不进行现有粘菌素原料粉末制造方法中必须的脱色步骤就可以提供白色度高的粘菌素原料粉末。
附图说明
图1表示来自实施例1得到的202-71株的培养滤液及来自M50株的培养滤液在300～600nm处的吸光度。
图2表示来自实施例3得到的M50株的粘菌素原料粉末溶于去离子水中得到的液体的液相色谱(HPLC)分析图。
具体实施方式
微生物的保藏
多粘芽孢杆菌变种粘菌素(bacillus polymyxa var.colistinus)M50株在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)以登记号：FERMABP-10656进行了国际保藏(平成18年8月11日自原保藏：FERMP-20553、原保藏日：平成17年5月31日基于布达佩斯条约移交国际保藏)。
以下详细说明本发明。
本发明中，对现有粘菌素发酵生产中使用的生产菌株进行人工突变处理，得到目标生产菌株。
作为人工突变处理方法，如果是人工变异处理则没有特别限制，可以使用例如：使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯等变异剂的化学方法；紫外线照射、X射线照射等物理方法；利用基因重组、转座子等的生物学方法等变异处理方法。
进行突变处理得到的菌群，使用烧瓶进行液体培养，以培养液的着色度及粘菌素的生产能力为指标进行筛选。在此，着色度以培养液的滤纸过滤液在400nm处的吸光度测定值为指标。另外，粘菌素生产能力以培养液的滤纸过滤液的HPLC分析值为指标。
这样，得到一种该着色度与现有的生产菌株相比大幅下降、且粘菌素生产能力为同等或者更好的生产菌株多粘芽孢杆菌变种粘菌素(bacillus polymyxa var.colistinus)。
本发明中，可以使用多粘芽孢杆菌变种粘菌素的粘菌素生产中得到的粘菌素原料粉末的白色度明显高的菌株。具体而言，如果是可以得到在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下、优选0.087以下、更优选0.070以上0.087以下的粘菌素原料粉末的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，则可以在本发明中使用。另外，作为本发明中可以使用的生产菌株，可以列举这些菌株的传代培养株、变异株、基因重组株等。
以本发明的生产菌株的一个例子M50株作为生产菌株从发酵生产的培养液不进行碳等的脱色步骤而制造的粘菌素原料粉末的色调，与从得自现有的生产菌株的培养液进行脱色步骤制造的粘菌素原料粉末的色调相比，白色度明显高。即，通过使用本发明得到的M50株作为生产菌株，不进行现有粘菌素原料粉末制造方法中所必须的脱色步骤，可以得到白色度高的粘菌素原料粉末。
本发明中，通过培养多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱，然后进行浓缩和干燥，不进行脱色步骤，可以制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。由此，可以制造符合欧洲医药品(包括动物用医药品)中使用的粘菌素原料粉末质量标准、即欧洲药典的颜色标准“大致为白色”的粘菌素原料粉末。另外，通常需要添加活性炭等碳并搅拌过滤等的脱色步骤，但是本发明的制造方法中由于省略了脱色步骤，因此可以将粘菌素原料粉末制造所需的时间缩短约半天。另外，可以减少脱色中使用的碳等造成的粘菌素原料粉末损失，同时也可以避免现有粘菌素原料粉末制造法的脱色步骤中使用的碳等的废弃。
另外，本发明的粘菌素原料粉末，含有作为多粘菌素类肽抗生物质普遍知道的粘菌素。粘菌素中，已知下述结构的粘菌素A、以及具有同样氨基酸结构的粘菌素B。
MOA：6-甲基辛酸
Dia：α，γ-二氨基丁酸
粘菌素A
本发明的粘菌素原料粉末，是指以可以作为医药品使用的程度含有粘菌素的粗提取物，如上所述不经脱色步骤而得到。粘菌素原料粉末的使用方法没有特别限制，既可以直接使用，也可以进一步处理后作为粘菌素制剂使用。
以下通过实施例和试验例更详细地说明本发明，但是本发明不限于这些实施例及试验例。另外，各实施例和试验例中吸光度的测定使用日本分光社制造的分光高度计V-560进行。另外，如果没有特别定义，则％表示重量对容量的百分率(W/V)。
实施例
<实施例1>
对现有在粘菌素原料粉末的制造中使用的多粘芽孢杆菌变种粘菌素202-71株，通过浓度10～1000μg/mg的NTG、在温度25～30℃静置或振荡1分钟～24小时，进行突变处理，在包含胰蛋白胨2％、酵母提取物0.2％和葡萄糖1％的琼脂培养板上培养菌落。将各菌落(菌株)接种到包含普通肉汤2％、酵母提取物0.2％和氯化钠0.3％的液体种子培养基上，在28℃培养约24小时后，将约0.1mL接种到加有30mL含有矢车菊4.5％、玉米粉1.5％、小麦胚芽0.2％、脱脂大豆0.2％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸亚铁0.005％、碳酸钙0.05％和糖稀1.5％的液体培养基的250mL容积锥形瓶中。在28℃振荡培养约120小时后，使用滤纸过滤培养液，比较所得滤液的色调和粘菌素的生产率。从这些菌群中选择M50株作为与202-71株的粘菌素生产能力同等或更好、并且滤液的色调明显比202-71株淡的菌株。对于202-71株和M50株的培养滤液，使用分光光度计测定300～600nm处的吸光度，结果示于图1。对于400nm的吸光度而言，与来自202-71株的培养滤液的3.61相比，来自M50株的培养滤液为1.42，发现有明显差异(表1)。
表1
| 菌株 | 粘菌素生产能力(％) | 吸光度(400nm) |
| M50 | 150 | 1.42 |
| 202-71 | 100 | 3.61 |
<实施例2>
将实施例1得到的培养液着色浅的M50株和现有的粘菌素发酵生产中使用的培养液着色深的202-71株接种到含有普通肉汤2％、酵母提取物0.2％和氯化钠0.3％的液体种子培养基中，在28℃培养约24小时后，将各自约15mL接种到加入了4L含有矢车菊4.5％、玉米粉1.5％、小麦胚芽0.2％、脱脂大豆0.2％、硫酸铵1％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸亚铁0.005％、碳酸钙0.05％和糖稀1.5％的液体培养基的5L容积的发酵缸中。分别在通风搅拌、且在pH5.0～7.0、30℃下培养约120～144小时。使用滤纸过滤得到的培养液，测定400nm处的吸光度，结果与来自202-71株的培养滤液的4.50相比，来自M50株的培养滤液为1.39，与实施例1用烧瓶的试验结果同样发现了明显差异(表2)。
表2
| 菌株 | 粘菌素生产能力(％) | 吸光度(400nm) |
| M50 | 129 | 1.39 |
| 202-71 | 100 | 4.50 |
<实施例3>
将实施例2得到的M50株和202-71株的5L容积发酵缸培养液用涂敷了助滤剂(ボディミックス)的吸滤器(Nutsche)过滤后，使其吸附到填充到柱子中的离子交换树脂(ァンバ一ラィトIRC-50(Na+型)ロ一ムァンドハ一ス社制，300mL)上。用约0.4mol/L的硫酸从离子交换树脂上洗脱粘菌素后，用600mL去离子水洗涤，将得到的洗脱液、洗涤液的混合液浓缩至约5％浓度(W/V)，得到粘菌素高含量液。粘菌素高含量液的在400nm处吸光度，与来自202-71株的粘菌素高含量液的0.359相比，来自M50株的粘菌素高含量液为0.07，很明显来自M50株的粘菌素高含量液的着色浅(表3)。
表3
| 菌株 | 吸光度(400nm) | 固体(％) | pH |
| M50 | 0.070 | 4.9 | 3.35 |
| 202-71 | 0.359 | 5.0 | 3.33 |
另外，将各粘菌素高含量液喷雾干燥，得到目标粘菌素原料粉末。来自202-71株的粘菌素原料粉末，为带有茶色的色调。与此相对，来自M50株的粘菌素原料粉末为稍带黄色的白色，很明显来自M50株的粘菌素原料粉末的着色比来自202-71株的粘菌素原料粉末浅，为更加白色。将各粘菌素原料粉末溶解于去离子水中至5％浓度(W/V)，得到5％浓度(W/V)水溶液。测定400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度，与来自202-71株的粘菌素原料粉末的0.479相比，来自M50株的粘菌素原料粉末为0.087，发现明显差异(表4)。
表4
| 菌株 | 吸光度(400nm) |
| M50 | 0.087 |
| 202-71 | 0.479 |
<试验例1>
将实施例3得到的来自M50株的粘菌素原料粉末溶解于去离子水中得到的液体通过液相色谱(HPLC)进行分析，其结果示于图2中。HPLC的测定条件如下所述。
测定条件
检测器：吸光度检测器(测定波长：215nm)
色谱柱：YMC-Pack ODS-AM(AM-312)(YMC社制)
150mm×Ф4.6mm
柱温：30℃
流动相：4.46克无水硫酸钠溶解于900ml纯水中，加入2.5ml的磷酸，定容到100ml(pH2.3～2.5)。在该溶液78中以22的比例混合乙腈。
流量：1.0ml/分钟
<试验例2>
为了使实施例3得到的来自202-71株的粘菌素高含量液达到实施例3得到的来自M50株的粘菌素高含量液的色调，关于必要的脱色碳量进行试验。相对于来自202-71株的粘菌素高含量液的固体成分换算量，添加相当于2％、5％和10％(均为W/V)的碳(精製白鹭，武田药品工业公司制)并搅拌30分钟，然后用桐山漏斗过滤，将得到的滤液喷雾干燥。将各喷雾干燥粉末溶解于去离子水，得到5％浓度(W/V)水溶液。测定400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度的结果，即使是脱色碳量最多的添加10％(W/V)碳的水溶液，吸光度也为0.135，未达到实施例3得到的未进行脱色碳处理的来自M50株的粘菌素高含量液的吸光度0.087(表5)。
表5
| 菌株 | 添加的碳量(W/V) | 吸光度(400nm) | 粘菌素收率损失(％) |
| M50 | 0％ | 0.087 | 0 |
| 202-71 | 0％ | 0.479 | 0 |
| 2％ | 0.246 | -- | |
| 5％ | 0.168 | -- | |
| 10％ | 0.135 | 26.7 |
另外，由于添加10％(W/V)碳的脱色步骤造成的粘菌素收率损失为约27％(表5)，因此包含脱色步骤的粘菌素制造法中粘菌素的收率明显下降。利用现有的生产菌株为了得到白色度高的粘菌素原料粉末，必须进行用大量的去离子水洗涤离子交换树脂、或者经过用大量碳处理离子交换树脂的洗脱液的脱色步骤，但是使用培养液的着色浅、无需碳脱色步骤的M50株的粘菌素原料粉末的制造法具有非常大的优点。
产业实用性
通过本发明，可以提供在粘菌素原料粉末的制造法中有用的新型生产菌株。另外，通过使用本发明的菌株，不经现有粘菌素原料粉末制造法中必须的脱色步骤，可以提供有效的粘菌素原料粉末制造法。
Claims (3)
1.一种多粘芽孢杆菌变种粘菌素M50株，其在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心以登记号FERM ABP-10656保藏。
2.一种制造在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末的方法，其中，培养权利要求1所述的多粘芽孢杆菌变种粘菌素，使培养物吸附到离子交换树脂上并洗脱后，进行浓缩和干燥。
3.通过权利要求2所述的制造方法得到的在400nm处5％浓度(W/V)水溶液的吸光度为0.15以下的粘菌素原料粉末。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2006/316057 WO2008020474A1 (fr) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | Procédé de production de poudre de colistine en vrac |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101296938A CN101296938A (zh) | 2008-10-29 |
| CN101296938B true CN101296938B (zh) | 2012-04-11 |
Family
ID=39082007
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN200680028123XA Active CN101296938B (zh) | 2006-08-15 | 2006-08-15 | 粘菌素原料粉末的制造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101296938B (zh) |
| WO (1) | WO2008020474A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102102117B (zh) * | 2010-11-17 | 2013-03-13 | 江苏大学 | 适用降血压肽工程菌的培养基 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1090459C (zh) * | 1994-06-29 | 2002-09-11 | 明治制果株式会社 | 含有硫酸粘菌素的稳定组合物 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5847493A (ja) * | 1981-09-12 | 1983-03-19 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | コリスチンの製造法 |
| JP2001505557A (ja) * | 1996-11-15 | 2001-04-24 | パソジェネシス コーポレイション | 肺感染を処置するための、純粋な生物学的活性コリスチン、その成分、およびコリスチン処方物 |
-
2006
- 2006-08-15 CN CN200680028123XA patent/CN101296938B/zh active Active
- 2006-08-15 WO PCT/JP2006/316057 patent/WO2008020474A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1090459C (zh) * | 1994-06-29 | 2002-09-11 | 明治制果株式会社 | 含有硫酸粘菌素的稳定组合物 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| hignite ce et al.synthesis of theophyline-8-13c.《j labelled compounds radiopharmaceuticals》.1978,第14卷(第3期),475-478. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101296938A (zh) | 2008-10-29 |
| WO2008020474A1 (fr) | 2008-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2016179735A1 (en) | A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp | |
| CN112831421B (zh) | 一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用 | |
| US10053744B2 (en) | Yeast strain with high yield of glutathione | |
| US9689017B2 (en) | Method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of Bacillus subtilis subsp | |
| WO2021000637A1 (zh) | 一株新的产达托霉素的链霉菌及其应用 | |
| CN101296938B (zh) | 粘菌素原料粉末的制造方法 | |
| KR960016874B1 (ko) | 미생물에 의한 트랜스-4-히드록시-l-프롤린의 제조방법 | |
| EP3085772B1 (en) | New streptomyces filamentosus variant and method for producing daptomycin using same | |
| JP6454052B2 (ja) | ポリアミン高生産新菌株バチルス・サブチリスｅｅ５菌株 | |
| KR20120058790A (ko) | 답토마이신 생산성이 향상된 스트렙토마이세스 로제오스포러스 변이주 및 이를 이용한 답토마이신 생산방법 | |
| KR101548640B1 (ko) | 엽산생성능이 우수한 신규한 락토바실러스 플랜타룸 ja71 균주 | |
| JP4958781B2 (ja) | コリスチン原末の製造法 | |
| NO150514B (no) | Homositronsyre oligoribosid-derivat, fremgangsmaate for dets fremstilling og middel for aa forhindre dental karies | |
| JPS6361952B2 (zh) | ||
| JP2012240974A (ja) | ダイデムニンｂの製造方法 | |
| JPS59198982A (ja) | 新抗生物質ｓｆ−２２４０物質およびその製造法 | |
| CN105603009B (zh) | 一种微生物转化的方法 | |
| Metabolite | B: EXPERIMENTAL DETAILS | |
| CN115975850A (zh) | 溶磷糖芽孢杆菌及其应用 | |
| Taechowisan et al. | Re-isolation of endophytic actinomycete from root of Alpinia galanga (L.) Willd. and its production of actinomycin D | |
| KR0183447B1 (ko) | 신균주 바실러스 엘케이-1 | |
| KR100454888B1 (ko) | 5'-이노신산을 생산하는 미생물 | |
| KR100411187B1 (ko) | 신규한 스트렙토마이세스 속 ｇ91353(ｋｃｔｃ18056ｐ)균주 및 신규 항세균제 | |
| CN117721042A (zh) | 一种产衣霉素复合物的菌株及其应用 | |
| EP0525846A1 (en) | Sporomiella intermedia and processes therefrom |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No. 16, 4th Floor, Jingqiao Erdingmu, Central District, Tokyo, Japan Patentee after: MEIJI SEIKA PHARMA Co.,Ltd. Address before: Tokyo, Japan Patentee before: MEIJI SEIKA Kabushiki Kaisha Ltd. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230323 Address after: No. 8, East Outer Ring Road, High-tech Zone, Jining City, Shandong Province Patentee after: Nuclear Core Pharmaceutical (Shandong) Co.,Ltd. Address before: No. 16, 4th Floor, Jingqiao Erdingmu, Central District, Tokyo, Japan Patentee before: MEIJI SEIKA PHARMA Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |