CN101293003B

CN101293003B - 一种杏香兔耳风有效部位及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101293003B
Application number: CN 200810106926
Authority: CN
Inventors: 范玫玫; 杨世林; 王跃生; 黄勇; 简晖; 饶毅; 邬秋萍; 钱霞
Original assignee: JIANGXI TIANYOU PHARMACEUTICAL CO Ltd; Jiangxi Bencao Tiangong Technology Co Ltd
Current assignee: Jiangxi you Mei Pharmaceutical Co., Ltd.; Jiangxi Bencao Tiangong Technology Co Ltd
Priority date: 2008-06-17
Filing date: 2008-06-17
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2028-06-17
Also published as: CN101293003A

Abstract

本发明涉及杏香兔耳风有效部位及其制备方法和应用，本发明①采用10％～80％乙醇进行渗漉或加热回流提取；②用乙酸乙酯萃取或大孔吸附树脂进行纯化精制。该法采用水、酒精、乙酸乙酯等一般常用溶媒，具有操作简单、流程短、成本低、有效成分含量高等优点。该杏香兔耳风有效部位主要含绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸等酚酸类成分，具有抑菌、抗炎作用，对乙肝病毒、艾滋病毒、人乳头瘤病毒等均具有明显抑制作用，对心血管疾病也有一定的疗效，可单独或与其它药物配合开发抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳头瘤病毒、治疗心血管疾病等新型药物。

Description

一种杏香兔耳风有效部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中药领域，具体来说，是一种杏香兔耳风有效部位及其制备方法。

本发明还涉及杏香兔耳风有效部位在开发抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳头瘤病毒、治疗心血管疾病等新型药物中的应用。

背景技术

杏香兔耳风为菊科植物铁灯兔耳风(Ainslia eamacroclinidioides Hay)或杏香兔耳风(Ainslia eafragrans Champ)的干燥全草，具有清热解毒，祛痰生新等功效，现临床上主要用于湿热下注所致慢性宫颈炎，子宫内膜炎，阴道炎，白带等症。现代研究表明，杏香兔耳风中主要含有绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基奎宁酸等酚酸类化合物，还含有倍半萜内酯、倍半萜苷、甾体、三萜类化合物，黄酮类、丁香烯和豆甾醇等成分。其中3，5-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基奎宁酸为酚酸类化合物，它们在抑制HIV-1整合酶、抑制小鼠黑色素瘤B₁₆细胞中黑色素的生成、提高免疫功能、促进前列腺环素释放、抗血小板聚集、清除DPPH自由基和抗脂质过氧化及体外抗炎、治疗心血管疾病等方面具有一定的作用。现代研究表明，二咖啡酰基奎宁酸对于乙肝病毒、艾滋病毒、冠状病毒感染有特殊治疗作用。

众所周知，乙肝和艾滋病都是威胁人类健康甚至是生命的疾病，目前用于抗病毒的药物大多效果不显著，或者有些药物的治疗费用太高，不适合我国国情，这就要求我们开发出疗效确切、成本低廉的抗病毒药物。我们通过研究发现，杏香兔耳风中含有大量的3，5-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基奎宁酸等二咖啡酰基奎宁酸类化合物，将其开发成具有抗乙肝病毒、抗艾滋病毒等新型的抗病毒药物具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种杏香兔耳风有效部位，本发明的另一目的是提供一种杏香兔耳风有效部位的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

一种杏香兔耳风有效部位的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤：

步骤(1)取杏香兔耳风药材，加10％～80％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩，得浓缩液B；

步骤(3)取浓缩液B，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并萃取液，减压浓缩，干燥得杏香兔耳风有效部位；

或步骤(3)取浓缩液B上大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用10％～90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得杏香兔耳风有效部位。

杏香兔耳风有效部位的制备方法，该制备方法依次包括以下步骤：

步骤(1)取杏香兔耳风药材粗粉，加入10～20倍量的10％～80％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩至药材量的3～8倍，得到杏香兔耳风浓缩液B；

步骤(3)取浓缩液B，先用石油醚萃取3～6次，再用乙酸乙酯萃取3～6次，分别合并萃取液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位；

或步骤(3)取浓缩液B，过大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用10％～90％乙醇洗，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位。

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有1-80％的总酚酸。

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸等酚酸类化合物。

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有总酚酸类具体为含0.05％-20％的绿原酸和0.5％-50％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-二咖啡酰基奎宁酸等其它酚酸类化合物。

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(1)中杏香兔耳风药材渗漉时间为1-15天，加热回流次数为1-4次，加热回流时间为1-3小时。

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(2)中减压浓缩温度是30-70℃。

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(3)中所使用的干燥方法为常压干燥、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括AB-8、NKA-9、HPD-700、HPD-600、HPD-500、HPD-400等型号的大孔吸附树脂，其中优选NKA-9大孔吸附树脂。

杏香兔耳风有效部位具有抑菌、抗炎作用，对乙肝病毒、艾滋病毒、人乳头瘤病毒等均具有明显抑制作用，对心血管疾病也有一定的疗效，可单独或与其它药物配合开发抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳头瘤病毒、治疗心血管疾病等新型药物。

本发明通过大量工艺研究结合药效筛选出杏香兔耳风的有效部位及其制备方法。我们通过抗炎、体内和体外抑制病毒等药理试验发现，本发明分离得到的有效部位具有明显抗炎作用，且对病毒具有明显抑制作用，尤其是对乙肝病毒、艾滋病毒、人乳头瘤病毒的抑制作用显著。我们提供的杏香兔耳风有效部位制备方法工艺稳定，重现性好，可进一步开发成抗炎、抗乙肝病毒、抗艾滋病毒、抗人乳头瘤病毒、治疗心血管疾病等新型药物。

具体实施方式

下列实施例、实验例是为了进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1-1

步骤(1)取杏香兔耳风药材，加10％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩，得浓缩液B；

或步骤(3)取浓缩液B上大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用10％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得杏香兔耳风有效部位。

实施例1-2

步骤(1)取杏香兔耳风药材，加80％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩，得浓缩液B；

或步骤(3)取浓缩液B上大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得杏香兔耳风有效部位。

实施例1-3

步骤(1)取杏香兔耳风药材，加50％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩，得浓缩液B；

或步骤(3)取浓缩液B上大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用60％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥得杏香兔耳风有效部位。

实施例2-1

步骤(1)取杏香兔耳风药材粗粉，加入10倍量的10％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩至药材量的3倍，得到杏香兔耳风浓缩液B；

步骤(3)取浓缩液B，先用石油醚萃取3次，再用乙酸乙酯萃取3次，分别合并萃取液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位；

或步骤(3)取浓缩液B，过大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用10％乙醇洗，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位。

实施例2-2

步骤(1)取杏香兔耳风药材粗粉，加入20倍量的80％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩至药材量的8倍，得到杏香兔耳风浓缩液B；

步骤(3)取浓缩液B，先用石油醚萃取6次，再用乙酸乙酯萃取6次，分别合并萃取液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位；

或步骤(3)取浓缩液B，过大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用90％乙醇洗，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位。

实施例2-3

步骤(1)取杏香兔耳风药材粗粉，加入15倍量的40％乙醇进行渗漉或加热回流提取，即得提取液A；

步骤(2)取提取液A，减压浓缩至药材量的6倍，得到杏香兔耳风浓缩液B；

步骤(3)取浓缩液B，先用石油醚萃取4次，再用乙酸乙酯萃取4次，分别合并萃取液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位；

或步骤(3)取浓缩液B，过大孔吸附树脂吸附，先用水洗至无色或颜色较浅，再用50％乙醇洗，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，即得杏香兔耳风有效部位。

实施例3-1

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有1％的总酚酸。

实施例3-2

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有80％的总酚酸。

实施例3-3

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有55％的总酚酸。

实施例4-1

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有总酚酸类具体为含0.05％％的绿原酸和50％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实施例4-2

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有总酚酸类具体为含20％的绿原酸和0.5％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实施例4-3

杏香兔耳风有效部位的制备方法，杏香兔耳风有效部位含有总酚酸类具体为含3.9％的绿原酸和18％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸及4，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实施例5-1

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(1)中杏香兔耳风药材渗漉时间为1天，加热回流次数为1次，加热回流时间为1小时。步骤(2)中减压浓缩温度是30℃。步骤(3)中所使用的干燥方法为常压干燥、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。其余同实施例2-1。

实施例5-2

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(1)中杏香兔耳风药材渗漉时间为15天，加热回流次数为4次，加热回流时间为3小时。步骤(2)中减压浓缩温度是70℃。步骤(3)中所使用的干燥方法为常压干燥、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。其余同实施例2-2。

实施例5-3

杏香兔耳风有效部位制备方法，步骤(1)中杏香兔耳风药材渗漉时间为10天，加热回流次数为2次，加热回流时间为2小时。步骤(2)中减压浓缩温度是40℃。步骤(3)中所使用的干燥方法为常压干燥、真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。其余同实施例2-3。

实施例6-1

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括AB-8大孔吸附树脂。其余同实施例2-1。

实施例6-2

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括NKA-9、大孔吸附树脂。其余同实施例2-2。

实施例6-3

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括HPD-700、大孔吸附树脂。其余同实施例2-3。

实施例6-4

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括HPD-600大孔吸附树脂。其余同实施例2-1。

实施例6-5

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括HPD-600大孔吸附树脂。其余同实施例2-2。

实施例6-6

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括HPD-500大孔吸附树脂。其余同实施例2-3。

实施例6-7

杏香兔耳风有效部位制备方法，其中所述的大孔吸附树脂主要包括HPD-400大孔吸附树脂。其余同实施例2-4。

实验例1：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加30％乙醇渗漉，流速控制在5ml/min左右，共收集渗漉液20L，减压浓缩原生药量5倍，即12.5L，浓缩液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物①55g，总酚酸含量51％，其中含3％的绿原酸和35％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例2：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉2.5kg，装入圆筒内，室温下加30％乙醇渗漉，流速控制在5ml/min左右，共收集渗漉液20L，减压浓缩至原生药量3倍，即7.5L，离心，取上清液，上已预处理好的大孔吸附树脂柱(NKA-9)，先用水洗至无色或颜色较浅，再用55％乙醇洗，收集酒精洗脱液约20L，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物②50g，总酚酸含量45％，其中含1％的绿原酸和32％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例3：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉500g，加入15倍量30％乙醇加热回流提取1小时，提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩至原生药量5倍，即2500ml，浓缩液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物③15g，总酚酸含量50％，其中含5％的绿原酸和30％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例4：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉500g，加入15倍量70％乙醇加热回流提取1小时，提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩至原生药量5倍，即2500ml，浓缩液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物④14g，总酚酸含量55％，其中含2％的绿原酸和38％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例5：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉500g，加入15倍量30％乙醇加热回流提取1小时，提取三次，过滤，合并滤液，减压浓缩至原生药量3倍，即1500ml，离心，取上清液，上已预处理好的大孔吸附树脂柱(NKA-9)，先用水洗至无色或颜色较浅，再用30％乙醇洗，收集酒精洗脱液约5000ml，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物⑤10g，总酚酸含量40％，其中含8％的绿原酸和18％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例6：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉500g，装入圆筒内，室温下加70％乙醇渗漉，流速控制在5ml/min左右，共收集渗漉液5000ml，减压浓缩至原生药量3倍，即1500ml，离心，取上清液，上已预处理好的大孔吸附树脂柱(NKA-9)，先用水洗至无色或颜色较浅，再用55％乙醇洗，收集酒精洗脱液约5000ml，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物⑥9g，总酚酸含量55％，其中含5％的绿原酸和40％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例7：杏香兔耳风有效部位的制备

取杏香兔耳风全草粗粉500g，装入圆筒内，室温下加70％乙醇渗漉，流速控制在5ml/min左右，共收集渗漉液5000ml，减压浓缩至原生药量5倍，即2500ml，浓缩液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物⑦11g，总酚酸含量65％，其中含5％的绿原酸和45％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸，萃余液部位浓缩、干燥后得杏香兔耳风提取物⑧25g，总酚酸含量18％，其中含10％的绿原酸和1％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。

实验例8：杏香兔耳风有效部位提取物体内抗炎实验的研究

1、杏香兔耳风有效部位提取物对角菜胶致大鼠足跖肿胀反应的影响

Wistar大鼠50只，按体重随机分组，每组10只，实验组大鼠分别给予杏香兔耳风有效部位提取物⑦(T)50～200mg/kg；阳性药对照组和溶煤对照组大鼠分别给予阿斯匹林100mg/kg和同体积蒸馏水，1.0ml/100g体重容积灌胃给药，24小时(±2小时)1次，连续5次。末次给药后立即以1％角叉菜0.1ml注射于大鼠右后足跖皮下致炎；自制毛细管放大测量装置测定大鼠致炎足外踝突出处平面以下部位致炎前和致炎后1～5小时的容积，计算大鼠足跖肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。

t检验比较组间足跖肿胀率(％)的显著性差异，实验结果见表1。

表1杏香兔耳风有效部位提取物(T)对角叉菜致大鼠足跖急性炎症(肿胀)反应的影响(x±s)(n＝8)

组别

剂量(mg/kg)

药前足容积(ml)

肿胀率(％)/肿胀率抑制率(％)

1h

2h

3h

4h

5h

溶媒对照

-

1.10±0.08

27.69±6.65

50.56±17.60

60.28±13.80

61.35±14.03

60.18±11.87

-

阿斯匹林

100

1.13±0.09

19.20±7.76^*

29.32±9.73^**

32.20±15.85^**

37.16±15.03^**

43.10±947^**

30.54

41.95

46.55

39.38

28.35

T大剂量

200

1.09±0.05

17.50±7.65^**

28.05±11.87^**

45.06±13.76^*

53.52±10.50

49.95±8.17

33.08

44.45

25.22

12.71

16.96

T中剂量

100

1.07±0.04

2032±7.10^*

34.60±17.93

53.43±23.85

56.04±10.16

56.74±9.25

26.56

31.50

11.39

8.60

5.69

T小剂量

50

1.08±0.11

20.25±4.76^*

43.85±11.13

59.65±11.70

52.83±7.15

46.64±8.35^*

26.82

13.20

1.06

13.87

22.55

注：与溶媒对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

结果表明，50～200mg/kg杏香兔耳风有效部位提取物⑦灌胃给药对角叉菜致大鼠足跖急性炎症反应有不同程度的抑制作用。其中，大剂量组1～3小时、中剂量组1小时、小剂量组5小时与溶媒对照组差异有高度显著性或显著性(P＜0.01或P＜0.05)。

2、杏香兔耳风有效部位提取物对二甲苯致小鼠耳廓肿胀反应的影响

雄性昆明种小鼠50只，26～30g，随机分组，实验组小鼠分别给予杏香兔耳风有效部位提取物⑦(T)65～260mg/kg；阳性药对照组和溶煤对照组小鼠分别给予阿斯匹林100mg/kg和同体积蒸馏水，0.2ml/10g体重容积灌胃给药，24小时(±2小时)1次，连续5次。末次给药后60min，以棉球蘸取二甲苯50μl接触试验小鼠右耳双面5秒，15min脱颈椎处死小鼠，用直径6mm打孔器将双耳同部位等面积切下，称取左右耳片重量，计算耳廓肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。

t检验比较组间耳廓肿胀率(％)组间差异的显著性，实验结果见表2。

表2杏香兔耳风有效部位提取物⑦(T)对二甲苯致小鼠耳廓急性炎症的抑制作用(x±s)

注：与溶媒对照组比较，^**P＜0.01。

结果表明，65～260mg/kg杏香兔耳风有效部位提取物⑦灌胃给药对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症反应有不同程度的抑制作用。其中，大剂量组260mg/kg杏香兔耳风有效部位提取物与溶媒对照组差异有高度显著性(P＜0.01)。

实验例9：杏香兔耳风有效部位提取物体外抗HBV实验研究

药物及试剂：杏香兔耳风有效部位提取物②、⑦、⑧，DMEM培养液，胎牛血清，青霉素，链霉素，谷氨酰胺，胰蛋白酶，MTT，DMSO。

细胞株：HBV-DNA克隆转染的人肝癌细胞HepG₂-2.2.15细胞株

实验方法：采用共转染法将克隆的HBV-DNA及抗G418质粒同时转入人肝癌细胞株HepG₂建立HepG₂-2.2.15细胞株，该细胞株能长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的病毒复制中间体，是目前体外抗HBV药物筛选和评价较好的细胞模型。HepG₂-2.2.15细胞采用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养，将HepG₂-2.2.15细胞以3×10⁵/mL的细胞悬液接种于96孔培养板，每孔0.1mL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养48h；根据预实验结果，将杏香兔耳风有效部位提取物②、⑦、⑧原液用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)分别配制成10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078mg/mL 8个浓度的稀释液，加入上述细胞中(0.1mL/孔)，每个浓度重复6孔，同时设空白对照组和细胞对照；继续置37℃，5％CO₂培养箱中培养，作用11d后，吸取培养上清液采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg，余下细胞用MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度，向培养孔中加入400ug/mL MTT，0.1mL/孔，37℃，5％CO₂孵育4h，弃去MTT液，加入100％DMSO 0.1mL/孔，充分振荡10min，用酶标仪570nm波长测定OD值，空白对照设6孔，加100％DMSO 0.1mL/孔。按下式计算半数毒性浓度(TC₅₀)。

A＝log＞50％破坏百分率 B＝log＜50％破坏百分率

C＝A-B

HBsAg、HBeAg的检测，采用ELISA测定盒检测，用酶标仪450/630nm双波长测定每孔OD值，并计算药物的半数有效浓度(IC₅₀)。

A＝log＞50％破坏百分率 B＝log＜50％破坏百分率

C＝A-B

治疗指数(TI)＝TC₅₀/IC₅₀

结果见表3：

表3杏香兔耳风有效部位提取物对HepG₂-2.2.15细胞株作用评价

结果表明，杏香兔耳风有效部位提取物⑦对HepG₂-2.2.15细胞株的治疗指数最高，其次是杏香兔耳风有效部位提取物②，杏香兔耳风有效部位提取物⑧对HepG₂-2.2.15细胞株的治疗指数最小。

实验例10：杏香兔耳风有效部位提取物体外抗HIV实验研究

药物及试剂：杏香兔耳风有效部位提取物②、⑦、⑧，AZT(叠氮胸苷)，

RPMI-1640，MTT，DMSO

细胞及病毒：HIV-1IIB病毒，MT4细胞

实验方法：

1、杏香兔耳风有效部位提取物对MT4细胞的毒性测定

MT4细胞按2×10⁵个/mL接种于96孔板中，每孔0.1mL，加入杏香兔耳风有效部位提取物②、⑦、⑧(分别以DMSO连续2倍稀释成1000～7.8ug/mL)，阳性对照药AZT(叠氮胸苷)2倍稀释为1000～7.8ug/mL，每个浓度接种6孔，同时设正常细胞对照，DMSO溶剂对照及空白MT4细胞对照(不加病毒)，置37℃，5％CO₂培养箱内培养6d，MTT法测定细胞活性，记CC₅₀值。

2、杏香兔耳风有效部位提取物对HIV诱导MT4细胞的抑制作用

病毒毒力测定用10倍稀释8个浓度HIV，在培养液RPMI-1640中观察MT4细胞病变，计算TCID₅₀为10^-6，将MT4细胞2×10⁵个/mL接种于96孔板中，每孔为O.1mL，分别加入1000TCID₅₀的HIV病毒100ul，同时设正常细胞对照和病毒对照，然后分别加入2倍稀释5个浓度的杏香兔耳风有效部位提取物②、⑦、⑧及AZT100ul，每个样品浓度均设3个平行孔，置37℃，5％CO₂培养箱内培养，72h后在倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)。

CPE判定标准：无合胞体形成“-”，无合胞体形成但细胞不规则“±”，有合胞体形成“+”。

EC₅₀的判定：

(1)只1孔为“+”，另两孔为“-”或“-”与“±”，此药物浓度可视为EC₅₀。

(2)3孔分别为“+”，“-”与“±”，此药物浓度可视为EC₅₀。

(3)3孔均为“±”，此药物浓度可视为EC₅₀。

(4)3孔均为“+”，下一个浓度作用下的3孔均为“-”，两个浓度的中间值可视为EC₅₀。

选择指数(SI)＝CC₅₀/EC₅₀。

结果见表4：

表4杏香兔耳风有效部位提取物对在HIV-1/MT4培养系对HIV-1诱导细胞病变作用评价

结果表明，杏香兔耳风有效部位提取物⑦对在HIV-1/MT4培养系对HIV-1诱导细胞病变的抑制作用最高，其次是杏香兔耳风有效部位提取物②，杏香兔耳风有效部位提取物⑧对在HIV-1/MT4培养系对HIV-1诱导细胞病变的抑制作用最小。

实验例11：杏香兔耳风有效部位提取物体外抗人乳头瘤病毒实验研究

药物及试剂：杏香兔耳风有效部位提取物⑦，HPV核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒细胞及病毒：尖锐湿疣混悬液

实验方法：

1、尖锐湿疣混悬液的制备：

人乳头瘤病毒(HPV)感染是引起尖锐湿疣(CA)的主要病因，从江西省中医院皮肤科采集来自于尖锐湿疣患者外阴部位的疣体标本(经鉴定为HPV6/11型)，集中到一只离心管中，称重30mg，用玻璃匀浆器匀浆，再加入5ml生理盐水，配成6mg/mL的离体CA混悬液，备用。

2、杏香兔耳风有效部位提取物处理疣体的方法：

将杏香兔耳风有效部位提取物⑦原液稀释成10，5，2.5，1.25，0.625，0.312，0.156，0.078mg/mL 8个浓度的样品液，用移液枪吸取25μl样品液和25μl CA混悬液至1.5mL离心管中，振摇均匀，使样品与疣体能充分作用，置37℃水浴箱培养，另设生理盐水对照、溶媒对照，在样品处理疣体1、3、5、7天后，各取一组进行以下试验。

3、HPV-DNA的提取：

从温浴箱中取出经样品处理的CA混悬液，按试剂盒步骤提取DNA：加入50μl生理盐水，混匀后再加入100μl DNA提取液1，振摇均匀，1200r/min离心10min，弃去上清液，再加入25μl DNA提取液2，充分混匀，100℃沸水煮10min，1200r/min离心10min，上清液即为HPV DNA。

4、定量标准曲线：

用荧光探针检测定量，按照检测试剂盒要求，设立4个系列浓度的HPV-DNA定量阳性标准品，依次为5×10⁷/mL，5×10⁶/mL，5×10⁵/mL，5×10⁴/mL，经PCR检测(其检测灵敏度为1×10³/mL，结果小于该浓度者判定为阴性)。以起始拷贝数的自然对数为横坐标，循环阈值为纵坐标，得到的回归直线为标准曲线，据此对样品的扩增倍数进行定量。

5、DNA扩增：

取检测试剂盒中的PCR反应液37.6μl，Taq DNA聚合酶0.4μl，UNG0.03μl于PCR反应管中，再加入HPV-DNA模板2μl，扣严管盖，置于定量PCR仪上循环扩增。HPV-DNA经高温变性、低温退火及延伸进行循环扩增，循环程序设置为：37℃，5min；94℃，1min；95℃，5sec；60℃，30sec，循环40次。

结果见表5：

表5杏香兔耳风有效部位提取物对HPV-DNA作用的评价

实验结果表明，HPV经各样品作用后，FQ-PCR检测所测得的DNA数值，“-”代表检测结果为阴性，病毒DNA被破坏而扩增受到抑制；阳性结果以DNA扩增的定量对数平均值表示(单位为“拷贝/mL”)，病毒没受到破坏，其DNA大量扩增。

实验例12：杏香兔耳风有效部位提取物对大鼠实验性动脉血栓形成的影响

取Wistar大鼠，按体重随机分组，每组10只，对照组大鼠静脉注射生理盐水；给药组静脉注射杏香兔耳风有效部位提取液⑦4、8、16mg/kg，给药体积均为0.1ml/100g。实验时腹腔注射20％乌拉坦1g/kg麻醉，仰卧位固定，分离颈总动脉，将实验性体内血栓形成仪的刺激电极和温度探头挂于颈总动脉上，给药后10min开始刺激，刺激强度为2mA，刺激5min后关闭刺激开关，取下电极，3min后调节控温表至零位，记录动脉血栓形成时间。结果表明，大鼠静脉注射杏香兔耳风有效部位提取液⑦4、8、16mg/kg后，与对照组比较，动脉血栓形成时间分别推迟15％(p＞0.05)、70％(p＜0.05)、90％(p＜0.01)，表明杏香兔耳风有效部位提取液⑦中、高剂量能明显推迟大鼠实验性动脉血栓形成时间。

Claims

1.一种杏香兔耳风有效部位的制备方法，其特征在于该制备方法依次包括以下步骤：取杏香兔耳风全草粗粉500g，装入圆筒内，室温下加70％乙醇渗漉，流速控制在5ml/min左右，共收集渗漉液5000ml，减压浓缩至原生药量5倍，即2500ml，浓缩液先加入等量的石油醚，萃取3次，合并萃取液，回收溶剂，水溶液部位再加入等量的乙酸乙酯，萃取6次，合并萃取液，减压浓缩、水浴上蒸干、真空干燥温度不能高于60℃，即得杏香兔耳风有效部位提取物11g，总酚酸含量65％，其中含5％的绿原酸和45％的3，5-二咖啡酰基奎宁酸。