CN113197927A - 一种杏香兔儿风提取物在制备治疗原发性痛经药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种杏香兔儿风粗提物在制备治疗原发性痛经药物中的应用。杏香兔儿风(Ainsliaea fragrans Champ.)粗提物在制备治疗原发性痛经的药物中的应用。本发明首次发现AF‑ext具有治疗原发性痛经作用，是AF‑ext的新用途，扩大了其临床应用范围。

Description

一种杏香兔儿风提取物在制备治疗原发性痛经药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种杏香兔儿风提取物在制备治疗原发性痛经药物中的治疗用途。
背景技术
原发性痛经，是一种月经期间子宫来源的疼痛性痉挛，是影响月经期妇女最常见的妇科问题。其特征主要为无明显器质性病变及下腹部疼痛。流行病学统计结果表明该疾病在正常的育龄妇女中发病率可高达90％并且常伴随其他症状例如头晕、呕吐、腹泻等。目前，用于治疗原发性痛经的药物以非甾体抗炎药(NASIDs)为主，如布洛芬、阿司匹林和萘普生，以达到缓解疼痛的目的。但NASIDs存在较多不良反应，包括头痛、头晕、恶心和消化不良。长期使用，患者可能会产生耐药性。中草药用于原发性痛经的治疗应用广泛且不良反应少，因此开发新的中草药提取药物和疗法对于治疗原发性痛经具有重要意义。
研究表明痛经的致病机制与子宫平滑肌细胞钙离子内流和前列腺素F2α(PGF2α)过度分泌有关。子宫肌层的钙离子信号在平滑肌收缩中起到重要作用，Ca2+内流增加诱导肌动蛋白相关激酶活化，增加收缩强度。COX-2的增加可能是由于氧化应激的增加，COX-2同时是催化花生四烯酸转化为PGs的关键酶之一，COX-2分泌增加后导致PGs分泌。PGF2α可引起血管和子宫肌层收缩，从而导致组织缺血和疼痛。所以对于治疗原发性痛经的药物，设计靶向Ca2+以及PGF2α的产生可能为一个有效策略。
菊科植物杏香兔儿风(Ainsliaea fragrans Champ.)，为我国江西地区珍贵野生中药材，杏香兔儿风具有止血、消积、散结等功效，现用于治疗女性因内湿热引发的带下病，在宫颈炎、子宫内膜炎等病症治疗中有良好效果。研究发现，杏香兔耳风茎叶中富含酚酸类、黄酮类、倍半萜内酯类等化学成分，其中酚酸类和黄酮类为其主要活性成分，具有抗菌、抗炎、止血、抗病毒、等药理活性，同时也是该药材在临床上发挥疗效的物质基础。但有关AF-ext对于原发性痛经的治疗作用未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种杏香兔儿风提取物在制备治疗原发性痛经药物中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
杏香兔儿风(Ainsliaea fragrans Champ.)提取物在制备治疗原发性痛经的药物中的应用。
所述的杏香兔儿风提取物优选杏香兔耳风药材的75-95％乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯部位。
所述的杏香兔儿风提取物进一步优选通过以下方法制备得到：取干燥的杏香兔耳风药材，粉碎研磨成粗粉，用75-95％的乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浓缩液采用乙酸乙酯萃取得到所述的杏香兔儿风提取物。
杏香兔儿风提取物在制备子宫内壁受损、抑制子宫组织平滑肌的收缩、抗炎的的药物中的应用。
所述的杏香兔儿风提取物优选杏香兔耳风药材的75-95％乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯部位。
所述的杏香兔儿风提取物进一步优选通过以下方法制备得到：取干燥的杏香兔耳风药材，粉碎研磨成粗粉，用75-95％的乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浓缩液采用乙酸乙酯萃取得到所述的杏香兔儿风提取物。
本发明采用了催产素诱导的小鼠原发性痛经模型，经杏香兔儿风提取物AF-ext给药，通过扭体次数和扭体延迟时间评估AF-ext镇痛效果，发现AF-ext可明显降低扭体次数，延长首次扭体反应时长。本发明可为原发性痛经提供了一种安全有效的治疗方法，为药物开发提供线索和依据。
本发明的技术方案为：在ICR小鼠中建立原发性痛经模型，期间AF-ext给药，观察扭体次数和首次扭体延迟时间，子宫组织一部分进行HE染色，其余匀浆进行多聚酶链式反应(PCR)实验，分析AF-ext用于原发性痛经治疗的可能性。离体子宫组织中使用不同激动剂刺激子宫平滑肌收缩，给药观察对收缩波形的影响。具体步骤如下：
步骤一：通过皮下注射苯甲酸雌二醇和腹腔注射催产素诱导扭体反应。
步骤二：子宫组织HE染色、PCR实验。
步骤三：AF-ext对离体子宫组织的自发性、继发性收缩的影响。
有益效果
本发明首次发现AF-ext具有治疗原发性痛经作用，是AF-ext的新用途，扩大了其临床应用范围。
附图说明：
图1：催产素给药后30min内各组扭体次数和扭体潜伏期。
图2：子宫组织矢向切片苏木素-伊红染色图。
图3：子宫组织中TNF-α相对表达量。
图4：离体子宫组织收缩情况。
具体实施方式
实施例1
杏香兔耳风(Ainsliaea fragrans Champ.,AF)由中国药科大学天然药物化学教研室采集，经中国药科大学药用植物学教研室秦民坚副教授鉴定为Ainsliaea fragransChamp.的干燥全草，样品保留于中国药科大学天然药物化学教研室，标本号为AF20050601。取干燥的杏香兔耳风药材6kg，粉碎研磨成粗粉，用75-95％的乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浓缩液采用乙酸乙酯萃取得到AF Ext。
实施例2
实验材料
试剂：AF-ext、苯甲酸雌二醇注射液、催产素注射液、布洛芬、)；Trizol RNA裂解液(货号：R401-01)、cDNA逆转录试剂盒(货号：R223-01)、qPCR试剂盒(货号：Q141-02)购买于南京诺唯赞生物科技公司(南京，中国)。
仪器：)；StepOnePlusTM Real-Time PCR仪(赛默飞，美国)；Nano Drop 2000(赛默飞，美国)
实验步骤
1)分组、造模及给药
动物分组：正常对照组、模型组、阳性药组(布洛芬200mg/kg)、AF-ext(100mg/kg)，n＝8。
造模：正常对照组皮下注射生理盐水，其余各组均皮下注射苯甲酸雌二醇(1mg/kg)，连续10天。在第11天，最后一次给药1h后，腹膜注射催产素(100U/kg)，在注射催产素30min内，记录扭体次数，并处死动物，眼球取血，收集子宫并称重，用于进一步分析。
给药：在造模期间各组灌胃给予相应的药物，空白对照组给予等体积的生理盐水，连续给药7天。
2)扭体
小鼠腹部内凹，后肢伸直，臀部抬起为扭体指标，观察45min内小鼠扭体反应次数与扭体潜伏期，计算扭体反应抑制率。扭体反应次数抑制率的计算公式：镇痛率(％)＝(对照组扭体均数–给药组扭体均数)/对照组扭体均数×100％。
3)苏木精-伊红染色
取小鼠子宫组织，于10％的福尔马林溶液中固定24小时以上，然后用石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察子宫组织的病理变化。
4)子宫组织匀浆PCR检测
取出小鼠子宫组织后，放置于液氮中过夜，随后保存在-80℃冰箱中。匀浆前称取等重量组织进行匀浆，根据定量PCR检测试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测，操作简要如下，配制反应体系：10μL AceQTMqPCR
Figure BDA0002922767750000042
Green Master Mix，0.8μL ROX Dye1，0.8μL引物，最后加入8.4μL cDNA，加入96孔板，置于AB StepOne plus RT-PCR system仪器于95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃延伸30s，重复40个循环，最后根据2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，实验所用引物序列见表1。
表1引物序列
Figure BDA0002922767750000041
实验结果
本实验结果表明，AF给药组扭体次数明显减少，扭体潜伏期显著提高，证明其在体内存在显著的镇痛效果(图1)；HE染色结果证明AF给药组小鼠的子宫内壁受损程度得到了明显改善，炎性细胞浸润、炎性分泌物均减少；PCR结果显示在子宫组织中，炎症因子TNF-α显著下调(图3)，证明其潜在的抗炎效果。
实施例3
实验材料
试剂：催产素，KCl溶液，AF-ext，乐氏缓冲液
仪器：PowerLab 8/35离体组织灌流系统
实验方法
ICR小鼠适应环境后连续腹腔注射2天苯甲酸雌二醇(10mg/kg)。脱颈处死小鼠，下腹部正中耻骨联合之上开2～3cm长切口，快速开腹剪取子宫置于盛有Lockes缓冲液的培养皿中，用眼科剪去除卵巢和子宫侧支交接部位，取一侧长约1cm的分支作为标本，置于Lockes缓冲液中，用细线分别扎住子宫肌条两端，将一端以丝线固定于浴槽内底部小钩上，另一端连接在张力换能器上，置于盛有5mL Lockes缓冲液的的恒温浴槽中，浴槽中营养液保持在(37.0土0.5)℃，并持续通入95％O2,+5％CO2混合气体，速度1～2个小气泡/s,通过调节换能器固定螺母加前负荷1g，待自发活动平稳后，通过Power Lab 8/35生物机能系统描记收缩曲线图，并记录子宫收缩的强度和频率。
记录30min正常收缩曲线，然后各组分别滴加10-7M催产素、50mM KCl，记录收缩频率10分钟后梯度给予不同浓度的AF-ext，加药记录每个浓度收缩波10min。分析收缩波的强度以及频率。强度取每条子宫收缩最高点，频率为每10min的收缩次数取平均值。
实验结果
正常小鼠离体的子宫组织存在自发性收缩，通过催产素刺激后其收缩频率和振幅均有明显变化，经AF给药后，收缩收到显著抑制(图4A,B)。在KCl刺激的收缩实验中的，AF-ext也具有类似的效果。证明AF可直接抑制子宫组织平滑肌的收缩。并表明AF-ext在治疗原发性痛经时子宫的痉挛有潜在治疗作用。

Claims (6)

1.杏香兔儿风提取物在制备治疗原发性痛经的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杏香兔儿风提取物为杏香兔耳风药材的75-95％乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯部位。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的杏香兔儿风提取物通过以下方法制备得到：取干燥的杏香兔耳风药材，粉碎研磨成粗粉，用75-95％的乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浓缩液采用乙酸乙酯萃取得到所述的杏香兔儿风提取物。
4.杏香兔儿风提取物在制备子宫内壁受损、抑制子宫组织平滑肌的收缩、抗炎的的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的杏香兔儿风提取物为杏香兔耳风药材的75-95％乙醇提取物经乙酸乙酯萃取得到的乙酸乙酯部位。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的杏香兔儿风提取物通过以下方法制备得到：取干燥的杏香兔耳风药材，粉碎研磨成粗粉，用75-95％的乙醇回流提取，提取液减压浓缩至无醇味，得到稠状浸膏，浓缩液采用乙酸乙酯萃取得到所述的杏香兔儿风提取物。
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