CN101280312A

CN101280312A - 甘蔗茎杆特异表达启动子及其植物表达载体

Info

Publication number: CN101280312A
Application number: CNA2008101090739A
Authority: CN
Inventors: 张树珍; 王正鹏; 杨本鹏; 蔡文伟; 冯翠莲; 顾丽红
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2008-05-22
Filing date: 2008-05-22
Publication date: 2008-10-08

Abstract

本发明涉及甘蔗茎杆特异高效表达启动子及其植物表达载体，是从甘蔗提取总DNA后用PCR法扩增，再与pMD－18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆得到甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a的启动子，该启动子长1968bp，以其取代植物表达载体pCAMBIA1301上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载体，命名为pCAMBIA1900。该启动子的获得，为甘蔗的转基因及甘蔗分子生物学的研究提供了一个有效的工具，特别是为利用甘蔗作为生物反应器生产具有高附加质的生物产品的研究和开发创造了必要的条件。因此，该启动子的获得，具有重要的理论和实践意义。

Description

甘蔗茎杆特异表达启动子及其植物表达载体

技术领域

本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域，具体地讲，是关于从甘蔗基因组DNA中克隆一个基因启动子序列，以及构建在该启动子下游含有GUS基因和其它目的基因的甘蔗茎杆特异高效表达载体。

背景技术

甘蔗是禾本科(Graminaceae)甘蔗属(SaccharumL.)植物，原产于热带、亚热带地区。甘蔗是一种高光效的C4植物，光饱和点高，二氧化碳补偿点低，光呼吸率低，光合强度大，因此，甘蔗生物产量高，收益大。甘蔗是作为生物反应器的理想材料，其优点主要有以下几个方面：1.容易种植：甘蔗喜光、喜热，是热带、亚热带地区生长最为迅速的一种植物，宿根性强，一次种植可多次收获；2.光合效率高、生物量巨大：甘蔗是一种典型的C4植物，其光合作用二氧化碳的补偿点较低，而光饱和点则较高，在正常的生长条件下，平均亩产可达10吨以上；3.甘蔗易于转化：国内外在甘蔗的遗传转化方面都做了大量的研究，通过载体法和非载体法均获得了甘蔗的转基因植株，而且可通过胚状体途径获得转化体，有利于外源基因的稳定表达；4.转基因安全性好：甘蔗是一种无性繁殖植物，在世界上大部分地区不能开花，转基因植株所带有的抗性基因不会随花粉发生“基因漂流”而对环境造成危害；5.甘蔗的茎杆是生物反应器的理想材料：茎杆是甘蔗的主要收获器官，其产量高、易于运输和加工。正是基于这些优点，我们才积极寻找合适于甘蔗茎杆特异表达的基因及其启动子，试图进一步利用甘蔗茎杆特异表达的启动子进行甘蔗生物反应器的研制，以期生产一些具有高附加质的生物产品。

植物基因的表达与其它真核生物一样是在DNA水平、转录水平、转录后水平、翻译水平及翻译后水平等多个层次上进行调控的。从效果来看，转录水平上的调控是最经济有效的，因此转录调控是控制植物基因表达的最重要方式。

外源基因能够在植物组织中实现正常乃至高效的表达，一个重要的条件是构建一个能高水平表达外源蛋白质的植物表达载体，而对于一个高效表达的载体而言，启动子是最重要的元件之一。因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首要考虑的问题。

基因启动子通常是指基因中转录起始位点之前控制基因表达的区域。靠近转录起始位点的近端区域构成所谓的“核心启动子区”(core promoter region)，其中通常含有TATA盒和CCTT盒序列，以及转录起始位点。核心启动子区通常与普遍性转录因子(generaltranscription factors)如RNA聚合酶II，转录因子TFILA，TFIIB，TFIID，TFIIE，TFIIF和TFIIH，以及一些辅助蛋白质结合，形成转录起始复合物；在核心启动子上游的区段是基因表达的调控序列，是增强体形成的主要部位。调控序列决定着基因表达的水平、表达的时间、表达的空间以及表达的方式。

目前植物基因工程中使用的启动子大多是组成型强启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV35S)启动子和玉米泛素(Ubiquitin)启动子等。虽然这些启动子能启动外源基因在植物中的高效表达，但外源基因的高效表达特别是在整个植株中的全方位表达必然大量消耗植株体内的基础物质，而基础物资的额外消耗又必然影响和抑制植物体内的其它代谢活动，这不但造成外源基因的浪费还会引起植物的形态发生改变，从而直接影响植物的生长发育。因此，为了更经济、更有效地发挥外源基因的作用，或避免基因产物对受体生物及环境产生副作用，利用组织特异性启动子，指导外源基因定向地在人们预定的时间和空间(组织或器官)表达，不仅能使目的基因的表达产物在一定空间积累，增加区域表达量，并且使外源基因的表达处于人们的控制之下。

已发现的的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如种子特异性启动子、果实特异性启动子、根特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、花特异性启动子、光诱导特异性启动子、伤诱导特异性启动子等。这些特异启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了良好的基础。关于茎杆特异表达启动子的研究，路静等(路静，赵华燕，何奕昆，宋艳茹.高等植物启动子及其应用研究进展.自然科学进展.2004，14(8)：658-664)报道他们从毛白杨中分离的C4H基因的启动子能驱动外源基因在烟草茎的维管组织中丰富表达；Trindade等(Verdelho Trindade LM，Horvath BM，Bachem CWB，et al.Isolation and functional characterizationof a stolon specific promoter from potato(Solanum tuberosum L.)，2003，303：77-87)从马铃薯中分离了Stgan基因的启动子，构建了该启动子下游含有GUS基因的植物表达载体并转化烟草，GUS组织化学染色显示该启动子能驱动GUS基因在茎结节处特异表达。

Casu R.E等(Casu RE，Grof CP，Rae AL，et al.Identificationof a novel sugar transporter homologue strongly expressed inmaturing stem vascular tissues of sugarcane by expressedsequence tag and microarray analysis.Plant Mol.Biol.2003，52：371-386.)报道了甘蔗的一个编码己糖转运蛋白的基因(PST2a)，并证明该基因在甘蔗成熟茎杆中大量表达。据此我们认为该基因的启动子很可能是甘蔗茎杆特异高效表达启动子。

发明内容

为了解决甘蔗作为生物反应器对甘蔗茎杆特异表达启动子的需要，本发明的目的是提供一个在甘蔗茎杆特异高效表达的启动子及其植物表达载体。

本发明的技术方案为：一种甘蔗茎杆特异高效表达启动子，具有序列表中<400>1项下的序列。

上述启动子是包括从甘蔗总DNA中克隆的甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a的启动子，经测序其长度为1968bp，通过Promoter predictions等软件进行基础启动子的分析，结果表明该启动子在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp存在五处基础启动子区。利用该启动子序列与植物表达载体pCAMBIA1301构建成一个含有PST2a基因启动子和GUS基因的新的植物表达载体pCAMBIA1900。通过基因枪法转化甘蔗茎杆和叶片，GUS组织化学染色结果显示PST2a基因启动子是一个茎杆特异性的高效启动子。

以下我们分为两部分详细介绍我们的发明内容。

一、PST2a基因启动子的克隆及植物表达载体的构建

1)、PST2a基因启动子的分离及序列分析

甘蔗基因组DNA提取：采用经改良的CTAB法小量提取甘蔗基因组DNA。根据基因库中已登录的PST2a基因的序列(登录号为AY165599.1)，按照Universal GenomeWalker Kit的要求设计两条引物(S1：5’-GCAACAAGAGCAGCTCCCGACATGTTTTC-3’，

S2：5’-GCTCAACGATCCCTGCAACAGCGAGTTAA-3’)，再依据试剂盒提供的引物、方法及反应条件进行PCR扩增。PCR扩增得到一条长约2000bp的产物，扩增片段回收后与pMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。测序结果表明其为长1968bp，序列如序列表中<400>1。通过Promoter predictions等软件进行基础启动子的分析，结果表明在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp存在五处基础启动子区。该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒、转录起始位点及其他调控元件(表1)。

表1：PST2a基因启动子元件分析

名称	个数	代表序列	序列中位点	功能
名称	个数	代表序列	序列中位点	功能	G-box	2	CACGTA	378	光反应顺式调控元件
ACIII element	1	GTTAGGTTC	999	维管束特异表达相关元件	G-box	2	CACGTA	378	光反应顺式调控元件
ACIII element	1	GTTAGGTTC	999	维管束特异表达相关元件	RY-repeat	1	CATGCA	632	核蛋白的结合位点
GATA-box	7	GATA	185，488，615，752，1071，16581904	特异性表达启动子的必需元件	RY-repeat	1	CATGCA	632	核蛋白的结合位点
GATA-box	7	GATA	185，488，615，752，1071，16581904	特异性表达启动子的必需元件	ABRE元件	1	TACGTG	49	脱落酸应答元件
ARE元件	1	TGGTTT	112	厌氧应答所必需的元件	ABRE元件	1	TACGTG	49	脱落酸应答元件
ARE元件	1	TGGTTT	112	厌氧应答所必需的元件	HD-Zip3	2	GTAAT	736，772	蛋白结合位点
LTR元件	1	CCGAAA	1543	低温应答元件	HD-Zip3	2	GTAAT	736，772	蛋白结合位点
LTR元件	1	CCGAAA	1543	低温应答元件	MBS元件	1	CAACTG	588	干旱诱导应答相关的MYB结合位点
Skn-1_motif	2	GTCAT	535，1913	植物胚乳形成有关	MBS元件	1	CAACTG	588	干旱诱导应答相关的MYB结合位点
Skn-1_motif	2	GTCAT	535，1913	植物胚乳形成有关	TGACG-motif	4	TGACG	436，9541135，1316	茉莉酸应答元件
Circadian	2	CAANNNNATC	253，298	节律控制应答元件	TGACG-motif	4	TGACG	436，9541135，1316	茉莉酸应答元件

2)、茎杆特异表达植物载体pCAMBIA1900的构建

根据已测序的PST2a基因启动子序列，设计在5’端加上BamH I酶切位点的上游引物P1(5’-GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3’)和在3’端加上NcoI酶切位点的下游引物P2(5’-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3’)。通过PCR反应扩增启动子目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用BamH I和NcoI双酶切该产物和植物表达载体pCAMBIA1301，并将酶切获得的含有两个酶切位点的启动子片段和pCAMBIA1301载体大片段连接获得含有PST2a基因启动子的植物表达载体pCAMBIA1900。

二、PST2a基因启动子的功能鉴定

1)、基因枪法转化及GUS基因的组织化学染色定位

取甘蔗的叶、茎杆，用75％酒精浸泡30S，灭菌蒸馏水冲洗数次，将甘蔗叶、茎杆切成0.5cm×0.5cm小块，并置于MS培养基上，室温放置3h。以pCAMBIA1301、pCAMBIA1900和H₂O三种表达载体的DNA包被钨粉制备微弹，按基因枪使用说明书提供的方法用基因枪轰击甘蔗材料。轰击后的甘蔗材料于26℃暗培养72h，然后进行组织化学染色和显微观察，证明该启动子具有甘蔗茎杆特异表达的特性。

本发明的优点：本发明提供的甘蔗茎杆特异高效表达启动子及其植物表达载体，该启动子以其取代植物表达载体pCAMBIA1301上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载体在茎杆中表达，且其启动活性高于CaMV35S启动子；该启动子的获得，为甘蔗的转基因及甘蔗分子生物学的研究提供了一个有效的工具，特别是为利用甘蔗作为生物反应器生产具有高附加质的生物产品的研究和开发创造了必要的条件。因此，该启动子的获得，具有重要的理论和实践意义。

附图说明

图1为用载体pCAMBIA1900包裹的钨粉轰击甘蔗茎杆后的GUS染色图。

图2为用载体pCAMBIA1301包裹的钨粉轰击甘蔗茎杆后的GUS染色图。

图3为用水包裹的钨粉轰击甘蔗茎杆后的GUS染色图。

图4为用载体pCAMBIA1900包裹的钨粉轰击甘蔗叶片后的GUS染色图。

图5为用载体pCAMBIA1301包裹的钨粉轰击甘蔗叶片后的GUS染色图。

图6为用水包裹的钨粉轰击甘蔗叶片后的GUS染色图。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

1.甘蔗叶片基因组DNA的提取

取甘蔗叶片约1g，用液氮研磨成粉末状，加入2ml已预热的2％CTAB提取缓冲液中，65℃温浴1小时；4℃、5000r/min离心2-3分钟，将上清转至另一离心管中，加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，10000r/min离心10分钟；取上清液加入等体积的异丙醇沉淀，室温放置30min；12000r/min离心10min，以70％的酒精洗涤2次，晾干，溶于加有RNAse的TE缓冲液中，37℃温浴30min；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻颠倒、混匀，12000r/min离心10min；取上清液加酚∶氯仿∶异戊醇重复抽提1次；在上清中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置半小时，12000r/min离心10分钟，去上清，沉淀用70％的酒精洗涤2次，晾干，溶于50μl TE缓冲液中。

2.基因组DNA步行和扩增

用几种限制性内切酶HindIII、EcoRI、PstI、XbaI分别对甘蔗基因组DNA进行酶切消化。50μl反应体系含1×反应缓冲液，5μgDNA和20u的限制性内切酶，37℃保温12小时；加入等体积的氯仿，颠倒混匀，室温、12,000r/min离心5min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，混匀，-20℃静置30min，15,000r/min离心15min；沉淀用70％乙醇洗涤两次，晾干，10μl灭菌蒸馏水溶解；取5μl用于连接，连接体系为：基因组酶切产物5μl，Cassette接头2.5μl，Ligation Solution I 15μl，LigationSolution II 7.5μl，总体积30μl，混匀后16℃连接过夜，反应完成后，用乙醇沉淀回收DNA，连接后的产物溶于10μl灭菌蒸馏水，该加接头的甘蔗基因组酶切产物作为以下PCR扩增的模板。

进行初级PCR。50μl反应体系包含：2μl DNA连接产物，1×反应缓冲液，0.5μl LA Tap酶(5U/μl)，8μl dNTPs(各2.5mM)，1μl引物S1，1μl引物C1。反应程序为：1个循环，94℃ 5min；30个循环，94℃ 1min，55℃ 2min，72℃ 4min；1个循环，72℃ 7min。将初级PCR产物稀释50倍。

进行次级PCR。50μl反应体系包含：1μl稀释的初级PCR产物，1×反应缓冲液，0.5μl LA Tap酶(5U/μl)，8μl dNTPs(各2.5mM)，1μl引物S2，1μl引物C2。反应程序为：1个循环，94℃ 5min；30个循环，94℃ 1min，56℃ 2min，72℃ 4min；1个循环，72℃ 7min。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果由HindIII产生的DNA库中扩增出约2000bp的片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

3.序列分析

通过Promoter predictions等软件进行基础启动子的分析，结果表明在540~590bp、908~958bp、1575~1625bp、1652~1702bp、1894~1944bp存在五处基础启动子区。该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒、转录起始位点及其他调控元件(表1)。

4.茎杆特异植物表达载体pCAMBIA1900的构建

根据已测序的PST2a基因启动子序列，设计在5’端加上BamH I酶切位点的上游引物P1(5’-GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3’)和在3’端加上酶NcoI切位点的下游引物P2(5’-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3’)。通过PCR反应扩增启动子目的片段，50μl反应体系包含：1μlDNA稀释的初级PCR产物，1×反应缓冲液，0.5μl LA Tap(5U/μl)，8μl dNTPs(各2.5mM)，1μl引物P2，1μl引物P2。反应程序为：1个循环，94℃ 5min；30个循环，94℃ 1min，56℃ 2min，72℃ 4min；1个循环，72℃ 7min。回收PCR产物，经测序无误后再用BamH I和NcoI双酶切该产物和植物表达载体pCAMBIA1301，50μl反应体系包含：回收PCR产物或pCAMBIA1301质粒DNA10ul，Buffer E 5ul，BamHI 5ul，NcoI 5ul，BSA(100)0.5ul，用无菌水将反应体系补充至50μL。37℃水浴反应3小时后，用QIAquick Gel Extraction Kit回启动子片段和pCAMBIA1301双酶切载体大片段，1％琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。将酶切获得的含有两个酶切位点的启动子片段和pCAMBIA1301载体大片段连接获得含有PST2a基因启动子的植物表达载体。反应体系如下：7ul启动子目的片段DNA，1ul pCAMBIA1301双酶切载体，2ul10×ligase buffer，1ul T4 DNA连接酶。16℃连接过夜后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用BamH I和NcoI双酶切鉴定重组子，命名为pCAMBIA1900。

PST2a基因启动子的功能鉴定

1.基因枪法转化甘蔗

取甘蔗的叶、茎杆用75％酒精浸泡30S，灭菌蒸馏水冲洗数次，将甘蔗叶、茎杆切成0.5cm×0.5cm小块，置于MS培养基上。

微弹制备：称取6mg钨粉于1.5ml离心管，加入75％乙醇0.5ml，充分涡旋5min，钨粉微粒在75％乙醇中保持15min，10000rpm离心3min，弃上清。重复以下步骤3次：加0.3ml无菌水，涡旋1min，静置1min，10000rpm/min离心15S，弃上清。洗过3次的钨粉，重新悬浮到100μl的无菌水或50％甘油中，并转移到新的无菌的1.5ml离心管，置于冰上。把钨粉分装成10管，每管按以下顺序加入10μl钨粉微粒(0.6mg)、质粒DNA(1μg/μl)1μl、2.5mol/LCaCL₂10μl、0.1mol/L亚精胺4μl；充分涡旋10min，静置1min，10000rpm/min离心5min，弃上清。加入140μl 75％乙醇，10000rpm/min离心10S，弃上清。加入140μl 100％乙醇，10000rpm/min离心5S，弃上清。加入10μl 100％乙醇，手指轻弹振荡后，涡旋5S，备用。

基因枪轰击前，用75％酒精擦拭放有基因枪的超净工作台及基因枪内壁和可裂圆片安装帽，然后用紫外灯灭菌0.5h。大载片、大载片架、可裂圆片、阻挡网、镊子、培养皿等121℃，高温灭菌20min。基因枪轰击参数为：氦气压1100psi，真空压26inchesHg，靶距6cm。每样品打两枪，每枪上样量约为0.5mg钨粉。基因枪轰击后，材料转入MS固体培养基(不含任何选择压力)26℃暗培养72h后进行GUS组织染色。

1、组织化学染色法检测GUS活性

将培养好的甘蔗组织放入10ml大离心管中，加入GUS染色液[2.0mmol/L K₃[Fe(CN)₆]，2.0mmol/L K₄[Fe(CN)₆]，10mmol/LEDTA-Na₂，0.1％TritonX-100，0.5mg/ml X-Gluc，氯霉素100μg/m，以50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)配制，甘蔗组织要全部浸泡在染液中，盖好盖子防止挥发。37℃培养箱中温育2h至过夜(时间可延长至1-2天)。取出材料转入70％酒精中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色为止。取出材料放在载玻片上，置于载物台上，进行光学显微观察，在白色背景下的蓝色斑点即为GUS表达位点，照相。染色材料可浸入FAA固定液(70％酒精90ml，福尔马林5ml，冰醋酸5ml)中保存。

在瞬时表达试验中，ddH₂O为阴性对照转化甘蔗材料，在茎杆(附图3)和叶片(附图6)中未见蓝色斑点，以植物表达载体pCAMBIA1301(含35S启动子与GUS基因编码区相连构建物)为阳性对照，在甘蔗材料的茎杆(附图2)和叶片(附图5)中均能观察到蓝色斑点，说明组成型表达的启动子可以驱动GUS基因在甘蔗的叶片和茎杆中表达。用含有甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a启动子区的表达载体pCBI1900转化甘蔗材料，只有在甘蔗茎杆(附图1)中有蓝色斑点，叶片(附图4)中未见蓝色斑点，且茎杆的蓝色较植物表达载体pCAMBIA1301轰击的茎杆更蓝。说明该启动子是一个驱动能力较35S启动子更强的茎杆特异性启动子。

本研究从PST2a基因启动子的分离、测序、植物表达载体的构建、基因枪转化甘蔗组织、GUS染色定位等作了系统的研究，获得了一个甘蔗茎杆特异高效表达的启动子。此发明为甘蔗分子生物学和甘蔗生物反应器的研究提供了有效的调控元件，经过查找证实国内外未见报道。

序列表

<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120>甘蔗茎杆特异表达启动子及其植物表达载体

<160>1

<210>1

<211>1968

<212>DNA

<213>甘蔗(Saccharum officinarum L)

<400>1

1 AGCTTCCGAT TGCAATAATG AGAACATATA GGTGGCATCT CGGCTTTCTA

51 CGTGGACTAA TGACAAAGAG AAGATGCACA TCATGCCGCA TATAATTCAA

101 TGGACTAATG ATGGTTTATC GGCTCAAGCA TTAACAATAG ACATCAGTGG

151 ATTGGGAAGG CAGACCCAGC ATCTTCTTTC ATGAGATAGA ACACGCAATG

201 GTGACCCAAA GTAAGTATAT TCTCTCTCGA TTTCTTCCTT TCATCCCAGG

251 CCCAACCAAA TCATGATGTT GTAGGATGAT GTGTTACACC ATCAGAACAA

301 GAAGATCTTT CTTTTTTTTT TCTCGAGCGA GGTTAGAGCA CATACAAGGT

351 ATAATATCAG CTGCCTGTAA GAGTTGCCAC GTAGGATTTC TAGCGATGCA

401 AAGAGGTTAT AATGAGGAGA GAGATTGTTG TCTCTTGACG AAATGACTAT

451 CTATAATATA AGAAAAGAGT CGAGATGTGT CTTGTAGGAT ATCTACTATG

501 AGGCAACAAC AATAGATTGT GGGTTATACA AGCTGTCATT TGAATTGCCT

551 AAAAATGACA TGTACAGTGT ATAGACAGCA GCCATTTCAA CTGTTGTATG

601 TATCCTTACA GAATGATAGA AGTAAAACTC TCATGCAACA AATGCTTGAC

651 AAGGGCTCTA GAGTTTACGC GGTGTGCATG CCTAGACTCA ACTCATAAGC

701 TACCCTATTT GGTCTTGCCA TGTAAATTAA ATACGGTAAT TATTATCTTG

751 GGATACATGT CAGAATATGA TGTAATTATT ACTTGTTCAA AAGAATATCT

801 TCAATTTGGC ATTGTCTTTT TCGTTCGAAC TAACTCTGAC TGTTAATGAC

851 TATCAATACA TACTGACAGG ATGTACCTGT CTTTCTTGAT CGGAAGACAT

901 GGACAGTTAA CCTTGAATAT ATTTGGGCGA CACATACATT GCATTATTCT

951 TTTTGACGGC TGGGAGAAGC CGTACCATAC CGAATAGCCA TGAAATATGT

1001 TAGGTTCCTA GCACGGTTTT AAAATTCTAA TGTCGTTTTG GCTGTCCCTC

1051 AATAAACCCA GCTACTTGGT GATAATCTGA AAGCGTTACA TTGACACATG

1101 AATAAGACAG CACACCACAT TGCATTATTC TTTTTGACGG CTGGGAGAAG

1151 CCATACCATA CCGAATAGCC ACGAAAAATG TTAGATTCGT AGCACGGTTT

1201 TAAAATTCTA ATATCGTTTT GGCTGTCCCT CAATAAACCC AGCTACTCGG

1251 TGACATTATG AAAGCATTAC ATTGACACAT GAATGAGACA GCACACCACA

1301 TTGCATTATT CTTTTTGACG GCTGGGAGAA GCCATACCAT ACCGAATAGC

1351 CATGAAATGT GTTAGATTCC TAGCACGGTT TTAAAATTCT AATACTTCCT

1401 CCGTTCATTT ATCTCCATCA TTTTAGCCTT CGGCGTAGTG ACCAAGGAGC

1451 AGAGTAAAAC CACTCAGTTT GCATTTAATC ATTGCGTGCT GAGCGCATAC

1501 GAGGAGTCAC AGGTTAGGAA TAACCAATGA ACAGTAAAGA GACAATAAAT

1551 GCAAACGGGT GGTAGCCAAT GAGCAGCAAA CAGAAAATAA ATACGGGCAA

1601 GTCCCAATCT AATATGAAGG AGATTTTTGA ATAAAAAGTT TTTGCTTAGA

1651 TGAAGGAGAT AAATAAATGG AGGGAATATC GTTTTAGCTG TCCCTCAATA

1701 AACCCAACTA CTCGGTGACA ATCCGAAAGC GTTATATTGA CACATGACTG

1751 AGACAGCACA CCATCCTCTT TCCCCTATCG CTTGGCTCCA TCTCCATAAC

1801 TTCCCAGGGG CCAGGGGCCA AATAGGAGCG GGCAAATAAT GGACAAAAAT

1851 TACTTCTTTA ATCGAATGCC CACCCTGCCA AATTCCAAGG ATTCCTTCCT

1901 CCAGATATAA GAGTCATCGT CCATGGGTTT CTTGGCCGCA GCTCCTTCAG

1951 TTGGCTCTTG GTCGGCTT

Claims

1.一种甘蔗茎杆特异表达启动子，其特征在于具有序列表中<400>1项下的序列。

2.一种甘蔗茎杆特异表达载体，其特征在于利用了权利要求1所述的甘蔗茎杆特异表达启动子驱动目的基因表达的植物表达载体。

3.根据权利要求2所述的甘蔗茎杆特异高效表达载体，其特征在于用权利要求1所述的甘蔗茎杆特异表达启动子置换植物表达载体pCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成在启动子下游含有GUS基因的甘蔗茎杆特异高效表达载体。