CN101270390B - 线粒体测序用26对pcr引物及基于该引物的分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种核酸检测方法，特别是公开了一种线粒体全部碱基序列分型及其测定方法，具体而言是线粒体测序用26对PCR引物及基于该引物的分型方法。本发明选用的26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2针对中国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物24-1对应的扩增片段最小，为420bp；引物22对应的扩增片段最大，为1162bp；所有PCR片段大小适中，均适宜PCR扩增。本发明的26对PCR引物已在申请人的实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，已向GENEBANK数据库提交了中国人群线粒体全序列资料。结果表明，本发明完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种核酸检测方法，特别是一种线粒体全部碱基序列分型及其测定方法，，具体而言是线粒体测序用26对PCR引物及基于该引物的分型方法。
背景技术
线粒体(mtDNA)碱基分型，目前最常用的是应用多聚酶链式反应(PCR)扩增出需要的DNA片断，将扩增产物进行直接测序，并根据片段的碱基序列与线粒体标准序列进行比对得到结果。对于PCR产物的直接测序可用PAGE结合银染，以及荧光标记序列仪自动分析系统。对线粒体的研究在国内还集中于线粒体特定高变区，目前国际上线粒体已完成了全部碱基序列测定并予以公布，但在生物医学研究及法医学应用实践中存在以下问题：
(1)已有的线粒体碱基序列测定方法没有统一的方案，需要人为选择。
(2)这些线粒体碱基序列都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)测定而获得的资料，其中有些基因位点，在中国群体的基因频率分布较差，并不能反映出中国群体的线粒体序列特点。
(3)国外公布的线粒体测定方法仍在改进，不同实验室之间无法达到结果的标准化。
上述缺点限制了线粒体遗传标记在国内的应用，不利于进一步在基层推广。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供适合中国群体的线粒体测序用PCR引物，以及基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，该方法方便进行中国群体遗传学及法医学应用研究。
线粒体是人类第二套基因组，mtDNA具有严格的母系遗传特点，线粒体DNA的突变率高于核DNA的5～10倍，因此，线粒体DNA与核DNA序列相比，可以在较短进化时期内积累更多的核苷酸变化的信息，在追踪民族起源方面有着其它遗传标记无法比拟的优势，为现代人类的起源、人类迁移规律和进化提供了大量的证据。另外，线粒体DNA全序列仅一万多个碱基，其多态性集中体现在D-环区，仅1100多个碱基，DNA序列测定较为简便，成为法医检案中一种新的检测手段。在法医学个体识别中，通过mtDNA序列分析可实现一定程度的认定作用，尤其在特定人群的个体识别中(空难、遗骸的鉴定)发挥重要作用。
本发明提供了一种线粒体测序用26对PCR引物，选用的26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长(表1)，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2针对中国人群重新设计，对中国人群的分型具有针对性；引物24-1对应的扩增片段最小，为420bp；引物22对应的扩增片段最大，为1162bp；所有PCR片段大小适中，均适宜PCR扩增。
表1PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列5′-3′ | 3′结合位置(碱基) | 片段大小(bp) | 覆盖长度(bp) |
| 1F | CTCCTCAAAGCAATACACTG | 611 | ||
| 1R | TGCTAAATCCACCTTCGACC | 1411 | 840 | 202 |
| 2F | CGATCAACCTCACCACCTCT | 1245 | ||
| 2R | TGGACAACCAGCTATCACCA | 2007 | 802 | 204 |
| 3F | GGACTAACCCCTATACCTTCTGC | 1854 | ||
| 3R | GGCAGGTCAATTTCACTGGT | 2669 | 860 | 196 |
| 4F | AAATCTTACCCCGCCTGTTT | 2499 | ||
| 4R | AGGAATGCCATTGCGATTAG | 3346 | 887 | 208 |
| 5F | TACTTCACAAAGCGCCTTCC | 3169 | ||
| 5R | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | 3961 | 832 | 215 |
| 6F | TGGCTCCTTTAACCTCTCCA | 3796 | ||
| 6R | AAGGATTATGGATGCGGTTG | 4854 | 898 | 203 |
| 7F | ACTAATTAATCCCCTGGCCC | 4485 | ||
| 7R | CCTGGGGTGGGTTTTGTATG | 5420 | 975 | 207 |
| 8F | CTAACCGGCTTTTTGCCC | 5255 | ||
| 8R | ACCTAGAAGGTTGCCTGGCT | 6031 | 814 | 201 |
| 9F | GAGGCCTAACCCCTGTCTTT | 5855 | ||
| 9R | ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT | 6642 | 827 | 214 |
| 10F | CTCTTCGTCTGATCCGTCCT | 6469 | ||
| 10R | AGCGAAGGCTTCTCAAATCA | 7315 | 886 | 211 |
| 11F | ACGCCAAAATCCATTTCACT | 7148 |
| 11R | CGGGAATTGCATCTGTTTTT | 8095 | 987 | 205 |
| 12F | ACGAGTACACCGACTACGGC | 7937 | ||
| 12R | TGGGTGGTTGGTGTAAATGA | 8797 | 900 | 196 |
| 13F | TTTCCCCCTCTATTGATCCC | 8621 | ||
| 13R | GTGGCCTTGGTATGTGCTTT | 9397 | 816 | 214 |
| 14F | CCCACCAATCACATGCCTAT | 9230 | ||
| 14R | TGTAGCCGTTGAGTTGTGGT | 10130 | 940 | 205 |
| 15-1F | CTTCTATTGATGAGGGTCTT | 9991 | ||
| 15-1R | GGTGTTGAGGGTTATGAGA | 10622 | 670 | 218 |
| 15-2F | AAGGATTAGACTGAACCGAA | 10404 | ||
| 15-2R | CTGATTGTGAGGGGTAGGA | 10992 | 627 | 135 |
| 15-3F | CAACCACCCACAGCCTAA | 10857 | ||
| 15-3R | TTGAGAATGAGTGTGAGGCG | 11512 | 693 | 198 |
| 17F | TCACTCTCACTGCCCAAGAA | 11314 | ||
| 17R | GGAGAATGGGGGATAGGTGT | 12076 | 802 | 196 |
| 18F | TATCACTCTCCTACTTACAG | 11948 | ||
| 18R | AGAAGGTTATAATTCCTACG | 12772 | 866 | 166 |
| 19F | AAACAACCCAGCTCTCCCTAA | 12571 | ||
| 19R | TCGATGATGTGGTCTTTGGA | 13507 | 977 | 242 |
| 20F | ACATCTGTACCCACGCCTTC | 13338 | ||
| 20R | AGAGGGGTCAGGGTTCATTC | 14268 | 970 | 207 |
| 21F | GCATAATTAAACTTTACTTC | 14000 | ||
| 21R | AGAATATTGAGGCGCCATTG | 14998 | 938 | 206 |
| 22F | TGAAACTTCGGCTCACTCCT | 14856 |
| 22R | AGCTTTGGGTGCTAATGGTG | 15978 | 1162 | 180 |
| 23F | TCATTGGACAAGTAGCATCC | 15811 | ||
| 23R | GAGTGGTTAATAGGGTGATAG | 5 | 765 | 190 |
| 24-1F | CATTATCCCGCACAAGAGTG | 16419 | ||
| 24-1R | TGGAAAGTGGCTGTGCAGACAT | 250 | 420 | 160 |
| 24-2F | CTTTGATTCCTGCCTCATCC | 132 | ||
| 24-2R | TAGAAAGGCTAGGACCAAACCT | 652 | 540 | 100 |
本发明所选26对PCR引物已在西安交通大学卫生部法医学重点实验室应用于中华民族群体遗传资料调查，经数据处理证明，应用所提供的26对PCR引物扩增目的片段，通过直接测序的方法可以得到中国人群线粒体全碱基序列资料。另外在新设计引物区域，使用国外已有的线粒体序列测定方法无法获得中国人群稳定的实验结果，显示出中国人群存在独特的线粒体序列特点，根据本发明所述线粒体分型方法得到的结果，实验室已向GENEBANK数据库提交了中国人群线粒体全序列资料共6条(检索号：DQ519035、DQ462234、DQ462233、DQ462232、DQ418488、DQ437577)。结果表明，本发明所提供的线粒体测序用PCR引物和基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法完全可以应用在法医学、人类学、遗传学和疾病等领域的个体识别、亲子鉴定以及基因诊断等方面。
本发明的另一个技术方案是：基于所述线粒体测序用26对PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100μMOL/L，作为母液，取出10μl稀释到5μMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20μL，含1×反应缓冲液，1.5mMOL/L Mgcl2，0.5UTaq酶，0.25μMOL/L引物，200μMOL/L dNTP，DNA20～200ng；引物的PCR扩增基础参数为：95℃变性30s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72℃延伸60s，共计35个循环；纯化PCR扩增产物；
测序反应体系为10μl，反应混合物中含：纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-Dye Terminator Ready Reaction mix(ver.3.1，美国应用生物系统公司)0.7μl，测序引物0.3μM；测序PCR条件为：96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，共循环25次；纯化测序反应产物；
纯化后的测序反应产物使用直接测序法检测；将26对PCR引物测序获得的碱基序列拼接得到样本线粒体全碱基序列，将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。
本发明带来的技术优点是，利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法进行分型，所需仪器和设备及操作均可达到标准化，且方案成熟，适合应用于中国人群。本发明可以填补国内没有实用化的线粒体全序列检测技术和方案的空白，并在中国多个民族中获得满意的结果，利用这种技术制备的线粒体全序列分型试剂盒，可进行商业化生产并推广为国内各个实验室使用。该技术克服了需要人为选择线粒体碱基序列测定方法，对实验人员技术和经验要求较高的缺陷，可以应用于亲子鉴定、个体识别、线粒体遗传致病基因定位、易感基因的检出、发病的分子遗传机理研究、药物的设计及使用等方面，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为线粒体测序用26对PCR引物对应位点示意图。
具体实施方式
本发明线粒体测序用PCR引物见表1。
本发明基于所述线粒体测序用PCR引物的分型方法，利用覆盖线粒体基因组全长的26对PCR引物扩增目的片段，直接测序检测，并进行分型。
1.设计引物序列
PCR引物序列设计参照Genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)发布的线粒体标准序列，上下游引物序列见表1。线粒体DNA序列为环形，引物设计策略见图1。
选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100μMOL/L，作为母液，取出10μl稀释到5μMOL/L，作为工作液。
2.PCR扩增
PCR反应体系总体积20μl，含1×反应缓冲液，1.5mMol/LMgCl2，0.5UTaq酶，0.25μMol/L引物，200μMol/L dNTP，DNA20～200ng。使用PE9600扩增仪，PE9700扩增仪(美国应用生物系统公司)，其它类型扩增仪也可以得到较好的结果。目前各种方法提取的DNA模板，均适合线粒体碱基序列的扩增。
本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。PCR扩增参数见表2。
表2PCR扩增条件
| 引物名称 | 变性温度/时间 | 退火温度/时间 | 延伸温度/时间 | 循环次数 |
| 1 | 95℃30s | 54℃30s | 72℃60s | 35 |
| 2 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 3 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 4 | 95℃30s | 54℃30s | 72℃60s | 35 |
| 5 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 6 | 95℃30s | 54℃30s | 72℃60s | 35 |
| 7 | 95℃30s | 55℃30s | 72℃60s | 35 |
| 8 | 95℃30s | 55℃30s | 72℃60s | 35 |
| 9 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 10 | 95℃30s | 54℃30s | 72℃60s | 35 |
| 11 | 95℃30s | 52℃30s | 72℃60s | 35 |
| 12 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 13 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 14 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 15-1 | 95℃30s | 55℃30s | 72℃60s | 35 |
| 15-2 | 95℃30s | 55℃30s | 72℃60s | 35 |
| 15-3 | 95℃30s | 55℃30s | 72℃60s | 35 |
| 17 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 18 | 95℃30s | 52℃30s | 72℃60s | 35 |
| 19 | 95℃30s | 54℃30s | 72℃60s | 35 |
| 20 | 95℃30s | 57℃30s | 72℃60s | 35 |
| 21 | 95℃30s | 52℃30s | 72℃60s | 35 |
| 22 | 95℃30s | 56℃30s | 72℃60s | 35 |
| 23 | 95℃30s | 52℃30s | 72℃60s | 35 |
| 24-1 | 95℃30s | 53℃30s | 72℃60s | 35 |
| 24-2 | 95℃30s | 58℃30s | 72℃60s | 35 |
3.PCR扩增产物的纯化
使用Multiscreen 96 PCR puification plate(美国密理博公司)纯化PCR扩增产物。
4.mtDNA的测序反应
反应体系为10μl，反应混合物中含：纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-DyeTerminator Ready Reaction mix(ver.3.1)0.7μl，测序引物(使用相应的PCR引物，即相应工作液)0.3μM。
测序反应使用PE9600扩增仪，PE9700扩增仪，PCR条件为：变性96℃10秒，退火50℃5秒，延伸60℃4分钟，循环次数为25次。
5.测序反应后产物的纯化
使用酒精沉淀的方法纯化测序产物。
6.mtDNA测序分析
上样
每个纯化后的测序产物使用10μl高纯度甲酰胺(Hi-Di Formamide)溶解，95℃变性10分钟后，立即放置于冰上，5分钟后将每个样本移至序列分析仪专用96孔上样板中。
电泳检测
将96孔上样板放入3730型DNA序列分析仪(美国应用生物系统公司)，仪器设定为标准测序程序(默认值)，上样电泳。电泳结束后，即得到电泳扫描结果。在其它类型DNA序列分析仪上操作也可获得同样的扫描结果。
7.序列分析
使用Sequence Analysis 5.1软件(美国应用生物系统公司)处理电泳扫描结果，得到碱基序列文件。将26对PCR引物测序获得的碱基序列文件拼接起来即可得到样本线粒体全碱基序列文件。将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。
综上所述，利用本发明所述的26对PCR引物将线粒体全碱基序列分段扩增，直接测序检测，拼接获得的碱基序列文件即可得到线粒体全碱基序列文件，与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。
Claims (3)
1. 线粒体测序用26对PCR引物，包括
引物1 1F CTCCTCAAAGCAATACACTG 3′结合位点611
1R TGCTAAATCCACCTTCGACC 3′结合位点1411
引物2 2F CGATCAACCTCACCACCTCT 3′结合位点1245
2R TGGACAACCAGCTATCACCA 3′结合位点2007
引物3 3F GGACTAACCCCTATACCTTCTGC 3′结合位点1854
3R GGCAGGTCAATTTCACTGGT 3′结合位点2669
引物4 4F AAATCTTACCCCGCCTGTTT 3′结合位点2499
4R AGGAATGCCATTGCGATTAG 3′结合位点3346
引物5 5F TACTTCACAAAGCGCCTTCC 3′结合位点3169
5R ATGAAGAATAGGGCGAAGGG 3′结合位点3961
引物6 6F TGGCTCCTTTAACCTCTCCA 3′结合位点3796
6R AAGGATTATGGATGCGGTTG 3′结合位点4854
引物7 7F ACTAATTAATCCCCTGGCCC 3′结合位点4485
7R CCTGGGGTGGGTTTTGTATG 3′结合位点5420
引物8 8F CTAACCGGCTTTTTGCCC 3′结合位点5255
8R ACCTAGAAGGTTGCCTGGCT 3′结合位点6031
引物9 9F GAGGCCTAACCCCTGTCTTT 3′结合位点5855
9R ATTCCGAAGCCTGGTAGGAT 3′结合位点6642
引物10 10F CTCTTCGTCTGATCCGTCCT 3′结合位点6469
10R AGCGAAGGCTTCTCAAATCA 3′结合位点7315
引物11 11F ACGCCAAAATCCATTTCACT 3′结合位点7148
11R CGGGAATTGCATCTGTTTTT 3′结合位点8095
引物12 12F ACGAGTACACCGACTACGGC 3′结合位点7937
12R TGGGTGGTTGGTGTAAATGA 3′结合位点8797
引物13 13F TTTCCCCCTCTATTGATCCC 3′结合位点8621
13R GTGGCCTTGGTATGTGCTTT 3′结合位点9397
引物14 14F CCCACCAATCACATGCCTAT 3′结合位点9230
14R TGTAGCCGTTGAGTTGTGGT 3′结合位点10130
引物17 17F TCACTCTCACTGCCCAAGAA 3′结合位点11314
17R GGAGAATGGGGGATAGGTGT 3′结合位点12076
引物18 18F TATCACTCTCCTACTTACAG 3′结合位点11948
18R AGAAGGTTATAATTCCTACG 3′结合位点12772
引物19 19F AAACAACCCAGCTCTCCCTAA 3′结合位点12571
19R TCGATGATGTGGTCTTTGGA 3′结合位点13507
引物20 20F ACATCTGTACCCACGCCTTC 3′结合位点13338
20R AGAGGGGTCAGGGTTCATTC 3′结合位点14268
引物21 21F GCATAATTAAACTTTACTTC 3′结合位点14000
21R AGAATATTGAGGCGCCATTG 3′结合位点14998
引物22 22F TGAAACTTCGGCTCACTCCT 3′结合位点14856
22R AGCTTTGGGTGCTAATGGTG 3′结合位点15978
引物23 23F TCATTGGACAAGTAGCATCC 3′结合位点15811
23R GAGTGGTTAATAGGGTGATAG 3′结合位点5
其特征在于，还包括：
引物15-1 15-1F CTTCTATTGATGAGGGTCTT 3′结合位点9991
15-1R GGTGTTGAGGGTTATGAGA 3′结合位点10622
引物15-2 15-2F AAGGATTAGACTGAACCGAA 3′结合位点10404
15-2R CTGATTGTGAGGGGTAGGA 3′结合位点10992
引物15-3 15-3F CAACCACCCACAGCCTAA 3′结合位点10857
15-3R TTGAGAATGAGTGTGAGGCG 3′结合位点11512
引物24-1 24-1F CATTATCCCGCACAAGAGTG 3′结合位点16419
24-1R TGGAAAGTGGCTGTGCAGACAT 3′结合位点250
引物24-2 24-2F CTTTGATTCCTGCCTCATCC 3′结合位点132
24-2R TAGAAAGGCTAGGACCAAACCT 3′结合位点652
该26对PCR引物覆盖了线粒体基因组全长，其中引物15-1、15-2、15-3、24-1、24-2对中国人群的分型具有针对性。
2. 根据权利要求1所述用于线粒体测序的26对PCR引物，其特征在于，所述26对PCR引物中，引物24-1对应的扩增片段最小，为420bp；引物22对应的扩增片段最大，为1162bp；并且所有PCR引物片段大小适中，均适宜PCR扩增。
3. 基于权利要求1所述线粒体测序用26对PCR引物的分型方法，其特征在于，包括以下步骤：
选用所述线粒体测序用26对PCR引物，将上下游引物稀释成100μMOL/L，作为母液，取出10μl稀释到5μMOL/L，作为工作液；PCR扩增体系的体积为20μL，含1×反应缓冲液，1.5mMOL/L Mgcl2，0.5UTaq酶，0.25μMOL/L引物，200μMOL/L dNTP，DNA20～200ng；引物的PCR扩增基础参数为：95℃变性30s，根据PCR引物不同确定退火温度进行30s，72℃延伸60s，共计35个循环；纯化PCR扩增产物；
测序反应体系为10μl，反应混合物中含：纯化后的PCR扩增产物10ng、Big-Dye Terminator Ready Reaction mix(ver.3.1)0.7μl，测序引物0.3μM；测序PCR条件为：96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，共循环25次；纯化测序反应产物；
纯化后的测序反应产物使用直接测序法检测；将26对PCR引物测序获得的碱基序列拼接得到样本线粒体全碱基序列，将样本碱基序列与线粒体标准序列比对即可获得样本碱基序列差异，从而完成线粒体分型。
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