CN101250549B

CN101250549B - 一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法

Info

Publication number: CN101250549B
Application number: CN2008100309630A
Authority: CN
Inventors: 邓子牛; 谢玉明; 熊兴耀; 张家银; 杨莉; 胡新喜; 袁飞荣; 罗赛男; 戴素明
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2008-04-01
Filing date: 2008-04-01
Publication date: 2011-08-10
Anticipated expiration: 2028-04-01
Also published as: CN101250549A

Abstract

一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法，其包括如下步骤：(1)成年态材料消毒，在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5wt％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭3～4次，然后再将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，在无菌条件下切割成4～5cm的茎段，用10wt％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡20～35min，无菌水冲洗3～4次，切割成1～1.5cm的节间茎段备用；(2)转化；(3)抗性芽再生；(5)温室二次嫁接；(6)抗性芽和抗性植株鉴定，采用公知的PCR分析法进行鉴定。本发明柑橘成年态材料消毒效果好，污染率低；不定芽诱导率达48％；抗性芽嫁接成活率达80％以上；再生转化植株没有嵌合现象。特别适合于冰糖橙、脐橙、椪柑等柑橘主栽品种的成年态节间茎段遗传转化。

Description

一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法

技术领域

本发明涉及一种柑橘成年态节间茎段遗传转化方法，尤其是涉及一种适应于冰糖橙、脐橙、椪柑等品种成年态节间茎段的遗传转化体系。

背景技术

柑橘是世界第一大水果，世界柑橘年产量超过1.1亿吨；柑橘及其产品的年贸易额达近百亿美元，在农产品贸易额中居第三位。2006年我国柑橘面积已超过170万公顷，居世界第一位，产量近1800万吨，居世界第二位。但我国优良柑橘品种较为缺乏，国际竞争力较弱。由于柑橘本身的特性，导致常规育种进展缓慢。而利用转基因技术进行柑橘品种改良，具有目的基因来源广、转化系统不受基因型限制、定向改变目标性状等优点。但目前在柑橘的遗传转化受体系统中，主要以幼年态材料作为转化受体，所获得的转基因植株童期长，一般要8-10年才开始结果，严重阻碍了利用转基因技术改良柑橘品种的进程。若采用成年态材料作为转化受体，所获得的转化植株没有童期，2-3年便可结果，可以大大缩短育种周期，提高育种效率。目前存在的问题是，由于柑橘成年态材料离体培养时污染严重、分化困难等因素，导致柑橘成年态节间茎段遗传转化难以获得成功，从而也限制了柑橘转基因实用化进程。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以缩短育种周期，提高育种效率的柑橘成年态节间茎段再生和遗传转化方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的。

其包括如下步骤：(1)成年态材料消毒，在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5wt％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭3～4次，然后再将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，在无菌条件下切割成4～5cm的茎段，用10wt％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡20～35min，无菌水冲洗3～4次，切割成1～1.5cm的节间茎段备用；(2)转化，将携带目的基因之农杆菌划线培养在含有100mg/l卡那霉素的YEB固体培养基上，26～ 30℃(优选28℃)黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26～28℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD₆₀₀＝0.6～1.0，离心分离，除去上清液，再用悬浮液悬浮备用；将经消毒处理后的节间茎段，浸入到农杆菌悬浮液中10～20min，随后转到无菌滤纸上，以便吸掉多余的菌液；(3)抗性芽再生，将农杆菌菌液侵染后的成年态节间茎段接种在共培养基：MS+2ip(异戊烯腺嘌呤)2mg/l+2.4-D(2.4-二氯化苯氧乙酸)2mg/l培养基上共培养3d后，转至筛选培养基MS+6BA(6-苄基腺嘌呤)1～3mg/l+NAA(α-萘乙酸)0～0.5mg/l+Cef(头孢霉素)500mg/l+Km(卡拉霉素)30mg/l进行选择培养，诱导抗性芽的产生，培养温度26～28℃，光照强度1200～1600lx，光照时间每天14～16h；(4)抗性芽微芽嫁接成苗，用卡里佐枳橙种子，经75％(体积)酒精消毒30～45s，再用0.1％的升汞消毒6～8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MS固体培养基上，在26～28℃黑暗条件下恒温培养12～16d的黄化苗用作砧木；将培养的黄化苗切去上胚轴留1.5～2cm长，切去下胚轴留4～6cm长，然后剥取抗性芽茎尖微芽0.5～1mm，采用微芽嫁接法嫁接于砧木上，置于MS液体培养基中光照培养；(5)温室二次嫁接，待抗性芽长到1.5～2.5cm(微芽嫁接后42～48d)，进行温室二次嫁接，选用一年生盆栽枳壳为砧木，采用劈接法，外套塑料袋，内置吸足水的脱脂棉保湿，塑料袋外套纸袋遮光，待成活后去除套袋；(6)抗性芽和抗性植株鉴定，采用公知的PCR分析法进鉴定。

本发明的优点是：柑橘成年态材料消毒效果好，污染率低；不定芽再生效率高，不定芽诱导率高达48％；共培养基和筛选培养基能适合多品种和多种类型基因的遗传转化；抗性芽嫁接成活率高，成活率达80％以上；再生转化植株没有嵌合现象。特别适合于冰糖橙、脐橙、椪柑等柑橘主栽品种的成年态节间茎段遗传转化。

具体实施方式

下面结合优选实施例对本发明作进一步描述。

实施例1 冰糖橙成年态节间茎段转化例

供试材料为冰糖橙，(1)在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭4次，然后在将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，装入洁净塑料袋中，带回室内，切割成5cm的茎段，用10％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡30min，无菌水冲洗4次，切割成1cm左右的节间茎段100个，备用；(2)将携带目的基因chit42的农杆菌(gene bank登记号：AF027497)划线培养在含有100mg/l卡那霉素的YEB培养基上，28℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，28℃振荡培养22h，达到菌对数生长期，OD₆₀₀＝0.6～1.0，然后以5000rpm离心10min，除去上清液，再用悬浮液悬浮备用；将经消毒处理后的1cm左右节间茎段，浸入到农杆菌悬浮液中15min，随后转到无菌滤纸上以便吸掉多余的菌液；(3)将农杆菌菌液感染后的成年态节间茎段接种在共培养基：MS+2ip 2mg/l+2.4-D 2mg/l培养基上共培养3d后，转至筛选培养基MS+6BA 3mg/l+Cef 500mg/l+Km 30mg/l进行选择培养，诱导抗性芽的产生，培养温度26～28℃，光照强度1400lx，光照时间每天16h；抗性芽诱导率高达48％；(4)抗性芽微芽嫁接成苗，用卡里佐枳橙种子，经75％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒7min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MT固体培养基上，在27℃黑暗条件下恒温培养14d的黄化苗用作砧木；在无菌条件下，将培养的黄化苗切去上胚轴留1.5～2cm长，切去下胚轴留4～6cm长，然后剥取抗性芽茎尖微芽0.5～1mm，采用微芽嫁接法嫁接于砧木上，置于MS液体培养基中光照培养；(5)待抗性芽长到1.5～2.5cm(微芽嫁接45d)，进行温室二次嫁接，选用一年生盆栽枳壳为砧木，采用劈接法，外套塑料袋，内置吸足水的脱脂棉保湿，塑料袋外套纸袋遮光，待成活后去除套袋；(6)从温室抗性植株上取叶片提取DNA，采用chit42基因专一引物(购自上海生工生物工程有限公司)进行PCR鉴定。获得转chit42基因成年态冰糖橙植株5株，转化植株在温室中生长良好。

实施例2纽荷尔脐橙成年态节间茎段转化例

供试材料为纽荷尔脐橙，待转目的基因为chit42，方法同实施例1，通过此方法，采用100个节间茎段，获得38个抗性芽，共获得转基因纽荷尔脐橙10株。

实施例3椪柑成年态节间茎段转化例，

供试材料为椪柑，消毒和转化方法同实施例1(1)、(2)。共培养方法同实施例1(3)，但筛选培养基选用MS+6BA 1mg/l+NAA 0.5mg/l+Cef 500mg/l+Km 30mg/l。PCR鉴定同实施例1(4)～(6)。待转目的基因为phyB基因(gene bank登记号：AF443799)，通过此方法，采用100个节间茎段，获得12个抗性芽，共获得转基因椪柑3株。

Claims

1.一种柑橘成年态节间茎段遗传转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)成年态材料消毒，在温室中选取半木质化的新梢，在采枝梢前一周，每隔一天用5wt％的次氯酸钠溶液擦拭枝梢一遍，共擦拭3～4次，然后再将次氯酸钠溶液擦拭过的枝梢剪下，在无菌条件下切割成4～5cm的茎段，用10wt％的次氯酸钠溶液加2～3滴吐温浸泡20～35min，无菌水冲洗3～4次，切割成1～1.5cm的节间茎段备用；(2)转化，将携带目的基因之农杆菌划线培养在含有100mg/l卡那霉素的YEB固体培养基上，26～30℃黑暗培养，待长出菌落后，挑取单菌落于YEB液体培养基中，26～28℃振荡培养20～25h，达到菌对数生长期，OD₆₀₀＝0.6～1.0，离心分离，除去上清液，再用悬浮液悬浮备用；将经消毒处理后的1cm左右节间茎段，浸入到农杆菌悬浮液中10～20min，随后转到无菌滤纸上以便吸掉多余的菌液；(3)抗性芽再生，将农杆菌菌液侵染后的成年态节间茎段接种在共培养基：MS+异戊烯基腺嘌呤2mg/l+2.4-二氯化苯氧乙酸2mg/l培养基上共培养3d后，转至筛选培养基MS+6-苄基腺嘌呤1～3mg/l+α-萘乙酸0～0.5mg/l+头孢霉素500mg/l+卡拉霉素30mg/l进行选择培养，诱导抗性芽的产生，培养温度26～28℃，光照强度1200～1600lx，光照时间每天14～16h；(4)抗性芽微芽嫁接成苗，用卡里佐枳橙种子，经75％(体积)的酒精消毒30～45s，再用0.1％的升汞消毒6～8min后，于无菌条件下去内外种皮，播种于MS固体培养基上，在26～28℃黑暗条件下恒温培养12～16d的黄化苗用作砧木；将培养的黄化苗切去上胚轴留1.5～2cm长，切去下胚轴留4～6cm长，然后剥取抗性芽茎尖微芽0.5～1mm，采用微芽嫁接法嫁接于砧木上，置于MS液体培养基中光照培养；(5)温室二次嫁接，待抗性芽长到1.5～2.5cm，进行温室二次嫁接，选用一年生盆栽枳壳为砧木，采用劈接法，外套塑料袋，内置吸足水的脱脂棉保湿，塑料袋外套纸袋遮光，待成活后去除套袋；(6)抗性芽和抗性植株鉴定，采用公知的PCR分析法进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的柑橘成年态节间茎段遗传转化的方法，其特征在于，所述第(1)步，所述浸泡时间为30min。

3.根据权利要求1或2所述的柑橘成年态节间茎段遗传转化的方法，其特征在于，所述第(2)步，所述黑暗培养温度为28℃。