CN101240015B - 一种具有生理活性的核肽复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从海产螺中提取制备天然的生理活性复合物，以及该复合物在医药方面的应用，属于生物医药技术领域。本发明保护一种生理活性核肽复合物及其制备方法与应用，该生理活性复合物是从海洋螺类生物组织中提取，具有独特的生理活性，可显著提高PADAM患者血中睾丸酮的水平。

Description

一种具有生理活性的核肽复合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种从海产螺中提取制备天然的生理活性的核肽复合物，以及该复合物的制备方法与在医药方面的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

男性自50岁开始，随着年龄增长睾丸代谢生理性衰退，雄激素合成功能减退，严重者引起中老年男性部分雄激素缺乏综合征(Partial Androgen Deficiency in AgingMale，PADAM)，该综合征的特征为身体和智力领域的变化，该改变与雄激素环境有关，并能通过调节雄激素环境加以纠正。

2002年国际老年男子研究学会(ISSAM)将这一综合征重新命名为迟发性睾丸功能减退(late onset hypogonadism in males，LOH)，把这种疾病界定为发生在中老年男子的一种与年龄相关的睾丸功能减退，并得到了国际男科学学会和欧洲泌尿科学会的认同。他们认为PADAM、男性雄激素缺乏症(ADAM)、雄激素缺乏症或继发性睾丸功能减退是一种症状群，主要临床表现特征是：(1)早期征象是性欲和勃起质量减退；(2)情绪改变伴有脑力和空间定向能力下降，容易疲劳、抑郁和易怒；(3)瘦体量减少伴肌肉容积和肌力下降；(4)体毛减少和皮肤改变；(5)骨矿密度下降，引起骨量减少和骨质疏松；(6)内脏脂肪增加。上述症状不一定全部出现，其中某一种或几种症状可能更为突出。

PADAM最典型的生化特征是血清雄激素水平随年龄老化而降低，不管是否存在基因组的敏感性降低，可出现多个器官或系统功能异常的症状和导致生活质量下降。雄激素中最主要的为睾丸酮，睾丸酮通过中枢神经系统和阴茎海绵体局部的作用调节性欲和勃起功能，外伤、手术或药物去势可导致性欲丧失和勃起功能障碍(ED)。在排除年龄、性激素结合球蛋白和雌二醇的影响后，睾丸酮有独立的调节阴茎海绵体平滑肌松弛的作用。除了性分化和生殖器官的生长和发育外，睾丸酮对骨骼、肌肉、脂肪、情绪和认知功能、性功能、血液和心血管等器官和系统都有重要的生理作用，睾丸酮缺乏将会导致这些器官和系统功能失常，出现一系列病理生理学改变。

在本发明中，PADAM、ADAM与LOH的定义表述不影响本发明的限定，换言之，本发明的内容涵盖了用于改善和/或治疗PADAM、ADAM与LOH所述的所有临床症状。

据统计，中国男子LOH的患病率随年龄的增长而增高，40~49岁约为13％，50~69岁约为30％，70岁以上约为47％。

目前，国际提倡PADAM患者进行睾丸酮补充治疗，如睾丸酮的脂肪酸酯(安特尔)、甲基睾丸酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙，通过外源性睾丸酮结构类似物补充提高血中睾丸酮水平，维持正常的性活动。

由于涉及到不良的副作用，雄激素仅谨慎地用于治疗和激素补充。事实上，雄激素通常仅用于对确诊为原发性或继发性雄激素缺失的男性进行治疗。

显然，雄激素的补充治疗并非理想的可供长期使用的理想治疗方案。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种从海洋螺类生物组织中提取的核肽复合物，该复合物具有天然的生理活性。

本发明还提供核肽复合物的制备方法及其在医药领域的应用。

本发明技术方案如下：

一种具有生理活性的核肽复合物，其特征在于，该核肽复合物是从海洋螺类生物组织中提取的，其成分包括每毫升含有：无机氮820-980μg，无机磷61-85μg，不饱和脂质0.2-1.0μg，水解氨基酸100.0-180.0μg，鸟嘌呤0.15-1.12μg，次黄嘌呤2.82-7.08μg，尿嘧啶4.90-12.85μg。

以上列出的各类成分为本发明核肽复合物发挥生物效应的主要物质，其余为与治疗作用无关或者暂时未知的杂质成分，这部分物质的存在经过实验证明并不会对本发明所述的治疗作用带来不良影响。

优选的，上述核肽复合物中还可添加有维生素E，使维生素E在终产品中的重量百分比为0.02-0.05％。

一种具有生理活性的核肽复合物的制备方法，具体步骤如下：

将海洋螺类生物的组织原料捣碎或粉碎，用溶剂提取，合并提取液，降温使提取液温度低于提取时的温度，析出沉淀，取上层清液，浓缩去除溶剂，净化处理，然后使用色谱柱层析分离洗脱得到核肽复合物。

所述的海洋螺类生物为软体动物门新腹足目骨螺科生物；优选脉红螺、红螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺；所述海洋螺类生物的组织为除螺壳外的全部组织，优选其中的躯干组织、肝脏组织和/或生殖器官组织。

所述原料可以为新鲜状态，也可以为冷冻状态。在确保原料生物活性的条件下，为使原料利于生物组织粉碎，优选的原料处理温度在0℃以下。

所述的溶剂提取，提取次数不少于2次，以充分提尽所需物质。

所述的溶剂提取在10-40℃范围内进行，以保证不破坏原料中所含成分的生物活性。例如可以在室温状态进行，也可在低于室温的状态下进行。

所述的降温使低提取液温度低于提取时的温度，能够使一类极性较小的杂质析出，达到去除杂质的作用，采用降低温度的方法，方法简便，成本低廉，是在一系列的试验基础上摸索到的去除杂质的优选方法，优选的，析出沉淀的温度控制在0-10℃。

所述溶剂提取首次提取采用高浓度醇溶液，优选的，用80-100％的乙醇提取，重复提取时采用较低浓度的醇溶液，优选的，用30-60的％乙醇提取。

本发明研究发现采用不同的梯度浓度溶剂进行提取，其提取效果要优于使用相同浓度的溶剂，高浓度乙醇的溶解域较宽，第一次可提取大部分活性复合物，如果继续用高浓度乙醇提取，提取液中活性复合物比例降低，绝大部分为杂质。从尽量减少杂质混入的角度考虑，后续提取选用低浓度乙醇继续提取较好。

优选的，所述溶剂提取步骤中溶剂调节为酸性，pH4.0-6.5为佳。这样，一方面可保证活性复合物提取完全，另一方面尽量控制杂质混入提取液中。可以用盐酸或有机酸调节溶剂为酸性，本发明优选采用有机酸调节提取溶剂为酸性，具体优选的有机酸为乙酸或甲酸。

溶剂调节为酸性时提取效果很好，可有效去除糖类、色素、胆固醇氧化产物及其酯等杂质部分。

本发明具有生理活性的核肽复合物的制备方法，所述的净化处理分两步，先用净化剂与提取液以体积比(1-5)∶1混合，除去极性最小的一部分杂质，然后用活性炭处理，脱去色素。

优选的，净化剂选自正己烷、环己烷、石油醚之一或组合，净化处理中活性炭用量为1-5％wt，进一步优选的，活性炭用量为2％wt。

优选的，在净化处理后，加入维生素E，使维生素E在终产品组合物中的重量百分比为0.02-0.05％。这样可以保护复合物在制备过程中不受氧化破坏。

本发明具有生理活性的核肽复合物的制备方法，柱层析吸附材料为葡聚糖凝胶，优选的，柱层析吸附材料为葡聚糖凝胶LH20(sephadex LH20)。该吸附材料具有样品损失少，分离效果好的优点。

本发明具有生理活性的核肽复合物的制备方法，柱层析洗脱液为醇-水复合溶剂，优选的，醇为甲醇、乙醇或丙醇，进一步优选使用甲醇，其中，复合溶剂中甲醇与水的体积比为5∶(1-5)。优选的，调节洗脱液为酸性，可以大幅度提高洗脱效率。优选用乙酸调节洗脱液为酸性。

本发明具有生理活性的核肽复合物在医药方面的应用，其特征在于是在制备用以治疗、预防、改善PADAM患者的症状的药用物质中的应用。

本发明的发明人在研究中老年男性部分雄激素缺乏综合征过程中出乎意料的发现，源自海洋生物的一类核肽复合物具有强大的生理活性。这种生理活性集中体现在能够调节机体自身有效促进血循环中雄激素，特别是雄激素中最主要的睾丸酮的释放，通过给男性患者施予该复合物及以该复合物的制剂，可有效治疗、预防、改善、抑制或减少该患者由于PADAM引起的性功能障碍、性欲减退、勃起功能障碍、性腺机能减退、少肌症、骨质减少、骨质疏松症、认知和情绪变化、抑郁症、贫血、毛发脱落、良性前列腺增生或前列腺癌的症状。

本发明提供的核肽复合物可单独应用，也可将核肽复合物与其他药物组合应用。还可通过采用药学上可接受的辅料组合制成药学上可以接受的各种制剂，如片剂、胶囊、贴剂、膜剂、凝胶剂、鼻喷剂、注射剂等。

本发明具有生理活性的核肽复合物在医药方面的应用，可采用医学上可以接受的任何方式，如口服、透皮吸收、注射(静脉注射、肌肉注射、皮下注射)、黏膜吸收、腔道吸收等。

在本发明中，所述的核肽复合物以单独使用、与其他药物联合使用、添加辅料制成制剂的使用时，可以在治疗期连续每日给药，也可以间歇给药。核肽复合物有效剂量以每日服用多少毫克核肽复合物来计算，一名正常体重的男性患者可采用每日剂量为10mg/天～2000mg/天，给药途径的不同会导致给药剂量的不同，例如注射使用的剂量比口服使用该复合物药剂的剂量小。

为了更好说明本发明核肽复合物的独特性，对复合物的成分进行化学分析，分析数据见下表1。

            表1：本发明提供的核肽复合物的成分分析(n＝6)

项目	无机磷(μg/ml)	无机氮(μg/ml)	不饱和脂质(mg/ml)	嘌呤和嘧啶(mg/g)	水解氨基酸(μg/ml)
						核肽复合物	61～85	820～980	0.2～1.0	鸟嘌呤0.15～1.1，次黄嘌呤2.82～7.08，尿嘧啶4.90～12.85	100.0～180.0

从上表中显示，本发明核肽复合物的构成有别于现有的所有药物。核肽复合物中的磷、嘌呤和嘧啶反映了其中含有的核苷酸；氮、水解氨基酸反映了其中含有的蛋白成分；此外该复合物中还含有一定量的不饱和脂质。

本发明提供的具有生理活性核肽复合物及其方法的优良效果在于：

1.采用了温度控制的提取设备，通过在原料预处理、提取、净化过程温度的调节，一方面保证了生物原料的活性不受破坏，另一方面达到了去除杂质的目的；

2.所选择的复合物净化、精制的方法为不同方式的组合，操作简便，且净化效果显著。

3.采用溶剂提取和色谱层析的方法联用，保证了原料中生物活性成分的利用完全，并且获得纯度较高的核肽复合物，显示了极其显著的生理性特性。

4.本发明的特点还于本发明提供的核肽复合物本身并非激素，与雄激素补充疗法具有本质不同；本发明核肽复合物可以显著提高血循环中游离睾丸酮水平。

具体实施方式

下面通过具体实例对本发明进行阐述，但并不以任何形式限制本发明的范围。

实施例1

取100g红螺组织(躯干、肝脏、生殖器官)在冷冻状态下捣碎，加10倍量95％乙醇提取1h，过滤，再用50％酸性乙醇搅拌提取3h，过滤，合并两次提取液，放冷，析出沉淀，倾出上层清液，浓缩，用3倍量己烷处理，弃去己烷层，下层脂蛋白层用2％活性炭纯化，超滤，浓缩，操作温度始终保持低于40℃，加入维生素E使终浓度到0.03％，减压浓缩去除溶剂，得到粗品，再用sephadex LH20柱层析分离，体积比为5∶3甲醇-水复合溶剂(用乙酸调节洗脱液为酸性)洗脱得到核肽复合物。

经化学分析检测，所得到核肽复合物成分包括每毫升含有：无机氮900μg，无机磷85μg，不饱和脂质0.8μg，水解氨基酸120.0μg，鸟嘌呤0.15μg，次黄嘌呤2.82μg，尿嘧啶5.90μg。

实施例2

取100g脉红螺全部组织在冷冻状态下捣碎，加10倍量50％乙醇，用乙酸调pH值不小于4.5，在一个带有混合搅拌功能的容器中提取2h，过滤，浓缩，放冷析出沉淀，倾出上清液，用3倍量己烷处理，弃去己烷层，下层脂蛋白层用2％活性炭纯化，超滤，浓缩，操作温度始终保持低于40℃，加入0.02％维生素E，减压浓缩去除溶剂，得到粗品，再用sephadexLH20柱层析分离，体积比为5∶2甲醇-水复合溶剂洗脱得到核肽复合物。

经化学分析检测，所得到核肽复合物成分包括每毫升含有：无机氮850μg，无机磷85μg，不饱和脂质0.5μg，水解氨基酸160.0μg，鸟嘌呤1.10μg，次黄嘌呤5.82μg，尿嘧啶10.85μg。

实施例3

取100g骨螺组织(躯干、肝脏、生殖器官)在冷冻状态下捣碎，加8倍量80％乙醇，用乙酸调pH值不小于4.5，搅拌提取3h，过滤，浓缩至原体积的1/10，放冷析出沉淀，倾出上清液，用3倍量己烷处理，弃去己烷层，下层脂蛋白层用2％活性炭纯化，超滤，浓缩，操作温度始终保持低于40℃，加入0.03％维生素E，减压浓缩去除溶剂，得到粗品，再用sephadex LH20柱层析分离，体积比为5∶4乙醇-水复合溶剂(用乙酸调节洗脱液为酸性)洗脱得到核肽复合物。

经化学分析检测，所得到核肽复合物成分包括每毫升含有：无机氮830μg，无机磷70μg，不饱和脂质0.6μg，水解氨基酸120μg，鸟嘌呤1.0μg，次黄嘌呤7.08μg，尿嘧啶12.85μg。

实施例4：实施例1的核肽复合物药用制剂

核肽复合物10mg；淀粉17mg；糖粉18mg；糊精15mg；47％乙醇适量(制软材用)；硬脂酸镁0.6g，制成片剂。

实施例5：实施例2的核肽复合物药用制剂

核肽复合物2mg，加入0.02％维生素E，加入10％乙醇溶液溶解，超滤，灭菌，灌装入2ml安瓶，-30~-40℃冻干，封口，制成注射冻干粉。

实施例6：动物实验例

所用核肽复合物为实施例1-3获得的产品。

考察本发明提供的核肽复合物对老年大鼠睾丸酮水平的影响。取老年雄性大鼠，每日肌内注射药物0.1mg/kg体重，给药10天，同时取成年大鼠按照相同剂量给药，对照组每日按照相同剂量给予生理盐水。用放射免疫法测定血中睾丸酮水平。在正常情况下，老年大鼠和成年大鼠的睾丸酮水平都在nmol/l级，老年大鼠的血中睾丸酮水平约为成年大鼠正常值的十分之一。实验见表2，结果表明在给予本发明核肽复合物后，老年大鼠的血中睾丸酮相比给药前水平提高了10倍，达到了与成年雄鼠相当甚至更高的水平。另外试验中令人惊喜地发现该核肽复合物并不影响正常成年大鼠的睾丸酮水平。结果提示本发明药物可以明显提高PADAM的血浆睾丸酮水平，这种作用与雄激素补充疗法不同，是通过调节机体自身睾丸酮的释放达到改善PADAM患者的临床症状，体现了不同于已有抗PADAM药物的独特机理，并且服药方便，效果显著。同时试验发现，该复合物安全性高，并不会影响正常动物的荷尔蒙水平。

            表2：核肽复合物对大鼠血浆睾丸酮水平的影响

*P＜0.001

Claims (13)

1.一种具有生理活性的核肽复合物的制备方法，具体步骤如下：

将海洋螺类生物的组织原料捣碎或粉碎，用溶剂提取，合并提取液，降温使提取液温度低于提取时的温度，析出沉淀，取上层清液，浓缩去除溶剂，净化处理，然后使用色谱柱层析分离洗脱得到核肽复合物；

所述的溶剂提取，在10-40℃范围内进行，提取次数不少于2次；所述溶剂提取步骤中溶剂调节pH4.0～6.5；所述的净化处理分两步，先用净化剂与提取液以体积比(1-5)∶1混合，然后用活性炭处理，脱去色素；所述的柱层析吸附材料为葡聚糖凝胶；所述的柱层析洗脱液为醇-水复合溶剂。

2.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的海洋螺类生物为软体动物门新腹足目骨螺科生物；所述海洋螺类生物的组织为除螺壳外的全部组织。

3.如权利要求2所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述软体动物门新腹足目骨螺科生物为：脉红螺、红螺、骨螺、棘螺或疣荔枝螺。

4.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的溶剂提取，首次提取采用80-100％的高浓度醇溶液提取，重复提取时采用较低浓度的30-60％的醇溶液。

5.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤中，选用盐酸或有机酸调节溶剂为酸性。

6.如权利要求5所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述溶剂提取步骤中的有机酸为乙酸或甲酸。

7.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的净化处理中净化剂选自正己烷、环己烷、石油醚之一或组合，活性炭用量为1-5％wt。

8.如权利要求7所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的净化处理中活性炭用量为2％wt。

9.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，在净化处理后，加入维生素E，使维生素E在终产品组合物中的重量百分比为0.02-0.05％。

10.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的葡聚糖凝胶为葡聚糖凝胶LH20。

11.如权利要求1所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的醇-水复合溶剂中醇为甲醇、乙醇或丙醇。

12.如权利要求11所述的具有生理活性的核肽复合物的制备方法，其特征在于，所述的醇-水复合溶剂中醇为甲醇，复合溶剂中甲醇与水的体积比为5∶(1-5)。

13.权利要求1所述制备方法制得的具有生理活性的核肽复合物在制备用以治疗、预防、改善PADAM患者的症状的药用物质中的应用。