CN110859847B - 一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合及其应用。本发明首次提供了人参皂苷在制备治疗高血糖症合并动脉粥样硬化药物中的应用，同时提出了关于包含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的组合物在制备治疗高血糖症合并动脉粥样硬化及II型糖尿病合并动脉粥样硬化的药物中的应用，本发明中提供的药物组合由人参皂苷Rb1和Rg1以质量比5:1组合而成。实验证明本发明治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合不仅有降血糖和改善胰岛素抵抗的药效，而且能抑制动脉粥样硬化斑块形成，同时可与他汀药物联合用药发挥协同对抗高血糖症合并动脉粥样硬化的作用，为临床糖尿病相关疾病以及心血管疾病的预防和治疗提供了新的有效治疗方案。

Description

一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合及其应用

技术领域

本发明属于医药范畴，具体涉及人参皂苷在制备高血糖症合并动脉粥样硬化的药物中的应用及其药物组合物。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心脏病和中风的主要诱因，后两者在世界致死因素上分别排名第一和第三[Global,regional,and national age-sexspecific all-cause and cause-specific mortality for 240causes of death,1990-2013:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013,Lancet.2015Jan 10；385(9963):117-71.]。根据流行病学调查，大约2/3的糖尿病患者的死因是动脉粥样硬化性心血管病[Excess Mortality among Persons with Type2Diabetes.N Engl J Med.2015Oct 29；373(18):1720-32.]。临床数据表明，当空腹血糖水平高于105mg/dL时，每18mg/dL的血糖升高会造成12％升高的动脉粥样硬化性心血管病发病的风险[Diabetes mellitus,fasting blood glucose concentration,and risk ofvascular disease:a collaborative meta-analysis of 102prospectivestudies.Lancet.2010Jun 26；375(9733):2215-22.]。同时，当空腹血糖水平高于100mg/dL时，每18mg/dL的血糖升高会造成13％升高的动脉粥样硬化性心血管病的死亡风险[Diabetes mellitus,fasting glucose,and risk of cause-specific death.N Engl JMed.2011Mar 3；364(9):829-841.]。ACC/AHA Guideline已提出高血糖症及II型糖尿病的治疗可作为心血管疾病的初级预防策略[Clinical Update:Cardiovascular Disease inDiabetes Mellitus:Atherosclerotic Cardiovascular Disease and Heart Failure inType 2Diabetes Mellitus-Mechanisms,Management,and Clinical Considerations.Circulation.2019Mar17:CIR0000000000000678.]。对于高血糖症合并动脉粥样硬化的患者，在服用降糖药物的同时，目前多以降胆固醇药物或者抗血小板治疗来控制动脉粥样硬化症状，其中他汀类药物治疗为主要控制方式。然而，由于他汀类药物的明显的肌毒性不良反应，仍然存在再狭窄的情况，患者远期获益有限。临床数据显示，他汀治疗能够微弱地升高糖尿病发病率[Statins and risk of incident diabetes:a collaborative meta-analysis of randomised statin trials.Lancet.2010Feb 27；375(9716):735-42.]。此外，以阿司匹林为代表的抗血小板治疗近期被证实对心血管疾病没有初级预防作用，即不会对未发生心血管事件的高血糖症合并动脉粥样硬化的患者产生临床获益。[Effects ofAspirin for Primary Prevention in Persons with Diabetes Mellitus.N Engl JMed.2018Oct 18；379(16):1529-1539.]。因此，对高血糖症合并动脉粥样硬化的患者来说，能够在降血糖的基础上同时对其进行有效且副作用小的降胆固醇治疗可能是一种更为优选的策略。

中医理论将动脉粥样硬化归为“淤血”和“痰浊”，认为活血化瘀、扶正祛邪和化浊降脂是其主要的三种治疗手段。活血化瘀，即直接作用于血管，促进血流正常化，抑制血管内膜动脉粥样硬化斑块形成。扶正祛邪即采用补气生津的方法，作用于全身，恢复整个机体的正常糖脂代谢和免疫状态，达到补气以通淤的效果。化浊降脂则为降低血脂和血胆固醇，抑制动脉粥样硬化前期的脂质代谢紊乱。人参、三七等中药分别具有扶正祛邪和活血化瘀的功效，具有明显的心血管保护作用。由于中医理论中人参补气生津和三七的活血化瘀的功效，两者常常在中医治疗中被用于治疗各种动脉粥样硬化引起的缺血性心血管疾病。II型糖尿病在中医理论中被称为消渴症，而临床上治疗消渴症的方法即为益气养阴。因此人参由于其益气功效，常常与养阴药物如麦冬等配伍使用治疗II型糖尿病。

人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1分别是人参中重要成分二醇型人参皂苷和三醇型人参皂苷的代表。然而，目前关于包含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的药物组合并未在高血糖症及II型糖尿病合并动脉粥样硬化的治疗上被报导过。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明旨在基于传统中药药效明确、活性物质基础不明确的问题，通过阐明人参药效物质基础，提炼出其活性成份并形成强效药物组合，本发明提供一种人参皂苷在制备治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物中的应用及其药物组合物。本发明中提供的一种药物组合由人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1以质量比5:1组合而成。实验证明，本发明治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合不仅有较强的降血糖和改善胰岛素抵抗的药效，而且能抑制动脉粥样硬化斑块形成，同时可以与他汀药物联合用药发挥协同对抗高血糖症合并动脉粥样硬化的作用；特别适用于高血糖症或者II型糖尿病合并动脉粥样硬化的治疗，为临床代谢性疾病与心血管疾病的预防和治疗提供了新的有效治疗方案。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1在制备治疗高血糖症合并动脉粥样硬化或者II型糖尿病合并动脉粥样硬化的药物中的应用。

其中，所述高血糖症合并动脉粥样硬化或者II型糖尿病合并动脉粥样硬化包括的适应症为：动脉粥样硬化症、高血糖症、高血糖症合并动脉粥样硬化、高胰岛素血症、高胰岛素血症合并动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化。

其中，所述人参皂苷组合药物中人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1以质量比为1:10-10:1。

作为优选，所述人参皂苷组合药物中人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1以质量比为5:1。

本发明所述一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物，由二醇型人参皂苷(Ⅰ)和三醇型人参皂苷(Ⅱ)组成(其中，R取代基为各类糖基，包括葡萄糖基、鼠李糖基)。

优选的，所述二醇型人参皂苷为人参皂苷Rb1(CAS：41753-43-9)，所述三醇型人参皂苷为Rg1(CAS：22427-39-0)，其质量组成比为Rb1：Rg1＝5:1。

进一步地，所述高血糖症合并动脉粥样硬化的适应症包括动脉粥样硬化、高血糖症、高血糖症合并动脉粥样硬化、高胰岛素血症、高胰岛素血症合并动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化。

其中，所述人参皂苷Rb1及其结构类似物通过激动PXR强效调节胆汁酸代谢稳态及血糖稳态，人参皂苷Rg1及其结构类似物通过调节肠道免疫屏障改善心血管炎症，二者组合可有效缩小动脉斑块面积、维持血糖稳态制成治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物。

作为优选，所述适应症为高血糖症合并动脉粥样硬化、II型糖尿病合并动脉粥样硬化。

本发明所述的治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物与他汀类药物联合用药在制备能够强效治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物。

本发明所述的治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合物，主要成份包含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，其中Rb1：Rg1质量比为5:1，其它成份为药学上可接受的其它成份或辅料。

作为优选，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

进一步地，一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物制剂，主要成份为上述药物组合(人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1质量比为5:1)，还包括药学上可以接受的载体、赋形剂及其它辅料，制成口服固体、口服半固体、口服液体制剂或者注射液制剂。

本发明中动脉粥样硬化常常是作为高血糖症或II型糖尿病的并发症产生。本发明人参皂苷组合物除了降血糖作用，同时还有抑制其并发症动脉粥样硬化的作用。本发明确切疗效：在高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型中具有以下效果：1、显著降低空腹血糖水平：治疗高血糖症方面；2、显著降低空腹胰岛素水平和胰岛素抵抗评价指数HOMA-IR水平：治疗II型糖尿病方面；3、显著减小主动脉根斑块面积：治疗动脉粥样硬化方面；微弱降低血清TC、LDL-c水平：治疗动脉粥样硬化方面；联用阿托伐他汀钙协同降低上述(1)-(3)指标，并降低血清TG水平。以上结果证明，本发明的人参组合物能够治疗高血糖症合并动脉粥样硬化以及II型糖尿病合并动脉粥样硬化。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次提供了人参皂苷在制备治疗高血糖症合并动脉粥样硬化药物中的应用，同时提出了关于包含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的组合物在制备治疗高血糖症及II型糖尿病合并动脉粥样硬化的药物中的应用；此外证明了对于包含质量比为5∶1人参皂苷单体Rb1和人参皂苷单体Rg1的组合物，在治疗以动脉粥样硬化为代表的心血管疾病以及治疗高血糖症的确切疗效方面，尤其是，高血糖症合并动脉粥样硬化、II型糖尿病合并动脉粥样硬化的确切疗效。而包括本发明的人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的药物组合物可以成为新型的治疗高血糖症合并动脉粥样硬化药物，治疗包括高血糖症合并动脉粥样硬化、II型糖尿病合并动脉粥样硬化等多种代谢性疾病。

临床上对高血糖症合并动脉粥样硬化的患者在服用降糖药物治疗的同时，以他汀类药物或抗血小板药物来控制动脉粥样硬化症状。本发明提供的药物组合是一种治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物，由人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1以质量含量比5:1组成。经药效学研究证实，具有显著的抗动脉粥样斑块形成的作用，而且能改善胰岛素抵抗、高血糖症。可以用于动脉粥样硬化、高血糖症，尤其是高血糖症合并动脉粥样硬化、高胰岛素血症合并动脉粥样硬化、Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化等糖脂代谢紊乱病症的治疗。其中，人参皂苷Rb1通过激动PXR强效调节胆汁酸代谢稳态及血糖稳态，人参皂苷Rg1通过调节肠道免疫屏障改善心血管炎症，二者组合而成的药物组合物能够有效糖脂代谢稳态、减轻心血管炎症反应、抑制动脉粥样硬化斑块面积。本药物组合与他汀类药物联合用药能够协同降低血糖水平、抑制胰岛素抵抗、减小动脉粥样硬化斑块面积，有效治疗高血糖症合并动脉粥样硬化。

附图说明

图1为人参皂苷提取物的各人参皂苷单体含量示意图(其中，横坐标Rd、Rb1、Rb2/3、Rc、Re、Rg1、Rg3、Rf、Rg2分别为人参皂苷提取物中检测出的人参皂苷单体名称，纵坐标表示提取物中相应皂苷单体的含量)；

图2为人参皂苷提取物对LDLR^-/-高血糖症合并动脉粥样硬化模型小鼠疾病严重程度的影响示意图；LDLR^-/-小鼠每组代表性样本的主动脉根油红O染色图(A)以及主动脉根斑块面积(B)、主动脉根斑块相对动脉管腔面积(C)和主动脉根斑块坏死面积(D)的定量结果(其中，横坐标Chow代表低脂饮食对照组，Vehicle代表高脂高胆固醇饮食模型组，TGS代表人参皂苷提取物治疗组，ATV代表阿托伐他汀钙治疗组，TGS+ATV代表人参皂苷提取物联用阿托伐他汀钙治疗组，纵坐标分别为小鼠主动脉根斑块面积、主动脉根斑块相对动脉管腔面积和主动脉根斑块坏死面积)；*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图3为人参皂苷提取物对LDLR^-/-小鼠血清生化指标及血糖水平影响示意图：血清总胆固醇(TC)(A)、甘油三酯(TG)(B)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)(C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)(D)、空腹血糖(E)、空腹胰岛素水平(F)及HOMA-IR指数(G)；(其中，横坐标为图2所示的各组别，纵坐标分别为小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图4为人参皂苷提取物对LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠肝脏胆固醇和胆汁酸代谢影响示意图；血清(A)和肝脏(B)胆汁酸(β-MCA+α-MCA+Tβ-MCA+Tα-MCA)/(CDCA+TCDCA)比值。(其中，横坐标为图2所示的各组别，纵坐标分别为小鼠血清和肝脏(β-MCA+α-MCA+Tβ-MCA+Tα-MCA)/(CDCA+TCDCA)比值)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图5为人参皂苷提取物对LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠肝脏胆固醇和胆汁酸代谢相关基因mRNA水平以及代谢酶活性影响示意图；肝脏Pxr(A)，CDCA代谢酶Cyp3a11(B)和Cyp2c70(C)以及胆固醇代谢关键酶Cyp7a1(D)mRNA水平；(其中，横坐标为图2所示的各组别，纵坐标分别为小鼠肝脏Pxr、Cyp3a11、Cyp2c70和Cyp7a1 mRNA水平)；*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle。LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠肝微粒体体外温孵底物d₄-CDCA，产物d₄-α-MCA酶动力学曲线(E)(其中，曲线横坐标为底物d₄-CDCA浓度，纵坐标为产物d₄-α-MCA产生速率，采用Michaelis-Menten方程拟合)；

图6为人参皂苷提取物对LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠肠道胆汁酸代谢和排泄影响示意图；粪便游离型胆汁酸/结合型胆汁酸水平比值(A)及粪便胆汁酸排泄量(B)(其中，横坐标为图2所示的各组别，纵坐标分别为小鼠粪便游离型胆汁酸/结合型胆汁酸水平比值及粪便胆汁酸排泄量)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图7为人参皂苷提取物对LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠盲肠内容物乳杆菌丰度影响示意图；(其中，横坐标为图2所示的各组别，纵坐标分别为小鼠盲肠内容物乳杆菌相对丰度)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图8为给予人参皂苷提取物的LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠血浆(A)和粪便(B)人参皂苷水平(其中，横坐标为检测出的血浆及粪便中的人参皂苷单体，纵坐标为人参皂苷水平)；

图9为人参皂苷Rb1对HepG2细胞胆汁酸代谢相关基因，包括PXR(A)及CYP3A4(B)mRNA水平影响(其中横坐标Control为空白培养基组，Vehicle为单给棕榈酸组，Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK、PPD组为相应的二醇型皂苷组，SR12813组为阳性对照，纵坐标为PXR及CYP3A4 mRNA水平)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图10为人参皂苷提取物及人参皂苷单体对小鼠盲肠内容物微生物BSH活性和其中乳杆菌丰度的影响示意图；预先24h给予人参皂苷提取物及人参皂苷单体的体外盲肠内容物温孵底物d₄-TCA，产物d₄-CA水平(A)(其中，横坐标Control为空白培养基不加底物组，Vehicle为空白培养基+底物组，Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK、PPD组为相应的二醇型皂苷+底物组，Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT组为相应的三醇型皂苷+底物组，TGS为人参皂苷提取物+底物组，纵坐标为产物d₄-CA水平)；体外盲肠内容物温孵人参皂苷提取物及人参皂苷单体，乳杆菌属相对丰度变化(B)(其中，横坐标Vehicle为空白培养基组，Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK、PPD组为相应的二醇型皂苷组，Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT组为相应的三醇型皂苷组，TGS为人参皂苷提取物，纵坐标为乳杆菌属相对丰度)；*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图11为人参皂苷Rg1对LDLR^-/-动脉粥样硬化模型小鼠肠道通透相关的基因，包括结肠Muc2(A)、Tff2(B)、Occludin(C)、ZO-1(D)mRNA水平影响(其中，横坐标Chow代表低脂饮食对照组，Vehicle代表高脂高胆固醇饮食模型组，Rb1代表人参皂苷Rb1治疗组，Rg1代表人参皂苷Rg1治疗组，纵坐标分别为结肠Muc2、Tff2、Occludin、ZO-1的mRNA水平)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图12为人参皂苷Rg1恢复高脂高胆固醇饮食诱导的肠道通透性升高的作用示意图，包括血清FITC-Dextran荧光强度(A)、回肠组织细菌浸润数量(B)、结肠组织细菌浸润数量(C)、血清内毒素水平(D)、血清C反应蛋白水平(E)；(其中，横坐标Chow代表低脂饮食对照组，Vehicle代表高脂高胆固醇饮食模型组，Rg1代表人参皂苷Rg1治疗组，纵坐标分别为血清FITC-Dextran荧光强度、回肠组织细菌菌落数、结肠组织细菌菌落数、血清内毒素水平、血清C反应蛋白水平)；*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图13为人参皂苷Rb1和Rg1的单独给药对LDLR^-/-小鼠动脉粥样硬化疾病严重程度的影响示意图；LDLR^-/-小鼠每组代表性样本的主动脉根油红O染色图(A)以及LDLR^-/-小鼠主动脉根斑块面积(B)、主动脉根斑块相对动脉管腔面积(C)和主动脉根斑块坏死面积(D)的定量结果(其中，横坐标Chow代表低脂饮食对照组，Vehicle代表高脂高胆固醇饮食模型组，Rb1代表人参皂苷Rb1治疗组，Rg1代表人参皂苷Rg1治疗组，纵坐标分别为小鼠主动脉根斑块面积、主动脉根斑块相对动脉管腔面积和主动脉根斑块坏死面积)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图14为人参皂苷Rb1和Rg1的药物组合对LDLR^-/-小鼠血清生化指标及血糖水平影响示意图：血清总胆固醇(TC)(A)、甘油三酯(TG)(B)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)(C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)(D)、空腹血糖(E)、空腹胰岛素水平(F)及HOMA-IR指数(G)(其中，横坐标为图13所示的各组别，纵坐标分别为小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle；

图15为人参皂苷Rb1和Rg1的药物组合对LDLR^-/-小鼠动脉粥样硬化疾病严重程度的影响示意图；LDLR^-/-小鼠每组代表性样本的主动脉根油红O染色图(A)以及LDLR^-/-小鼠主动脉根斑块面积(B)、主动脉根斑块相对动脉管腔面积(C)和主动脉根斑块坏死面积(D)的定量结果(其中，横坐标Chow代表低脂饮食对照组，Vehicle代表高脂高胆固醇饮食模型组，Rb1+Rg1代表人参皂苷药物组合治疗组，ATV代表阿托伐他汀钙治疗组，TGS+ATV代表人参皂苷组合物联用阿托伐他汀治疗组，纵坐标分别为小鼠主动脉根斑块面积、主动脉根斑块相对动脉管腔面积和主动脉根斑块坏死面积)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vsVehicle；

图16为人参皂苷Rb1和Rg1的药物组合对LDLR^-/-小鼠血清生化指标及血糖水平影响示意图：血清总胆固醇(TC)(A)、甘油三酯(TG)(B)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)(C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)(D)、空腹血糖(E)、空腹胰岛素水平(F)及HOMA-IR指数(G)(其中，横坐标为图15所示的各组别，纵坐标分别为小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数)。*p＜0.05,**p＜0.01,***p＜0.001,vs Vehicle。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

人参皂苷提取物治疗高血糖症合并动脉粥样硬化药效确证

1.实验材料

1.1仪器与设备

Shimadzu LC-30AD液相色谱仪(Shimadzu,日本)、AB SCIEX Triple TOF^TM5600质谱系统(AB SCIEX,美国)、AB SCIEX Triple Quad^TM 5500LC/MS/MS质谱系统(AB SCIEX,美国)、Agilent ZOEBAX Eclipse Plus C18 column(2.1×150mm，3.5μm)(Agilent,美国)、Waters XBridge^TM C18(2.1mm×100mm，3.5μm)(Waters，美国)、岛津AW120型电子分析天平(Shimadzu，日本)、岛津AUW 120D型电子分析天平(Shimadzu，日本)、Synergy TM2多功能酶标仪(BioTek，美国)、Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore，美国)、Thermo SPD-2010真空离心浓缩装置(Thermo，美国)、Genie Vortex-2振荡器(Genie，美国)、HitachiCR22G III低温高速离心机(Hitachi，日本)、CFX96 Real-Time PCR系统(Bio-Rad，美国)、Optima XPN-80超高速离心机(Beckman，美国)、SZN71连续变倍体视显微镜(舜宇光学科技有限公司)、Leica CM1520冰冻切片机(Leica，德国)、Leica DMI 3000B荧光倒置显微镜(Leica，德国)、FreeZone12L冻干机(LABCONCO，美国)、小鼠代谢笼(苏州冯氏实验动物设备有限公司)。

1.2试剂

标准品：人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2、F2、CK、原人参二醇(PPD)、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1、原人参三醇(PPT)(南京景竹生物科技有限公司)，胆汁酸标准品：CA、β-MCA、CDCA、DCA、LCA、TCA、TCDCA、TDCA、GCA、dhCA、d4-CDCA(Sigma-Aldrich，美国)，α-MCA、γ-MCA、UDCA、HDCA、Tα-MCA、Tβ-MCA、TUDCA、THDCA、TLCA(Steraloids，美国)。

试剂：人参皂苷提取物(80％UV)(吉林长青参业有限公司)，阿托伐他汀钙(98％)(大连美仑生物有限公司)，油红O、NADP、G6P、PDH(Sigma-Aldrich，美国)，TC、TG、LDL-c、HDL-c、葡萄糖检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，甲醇、乙腈(GR)(Merck，美国)，RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂、SYBR Premix Ex TaqTM II、细菌基因组DNA提取试剂盒(Takara，日本)，DEPC水、BCA试剂(南京碧云天生物技术有限公司)，小鼠胰岛素ELISA测定试剂盒(上海吉泰依科赛生物科技有限公司)，PBS(北京奥博森生物技术有限公司)，苏木精(江苏凯基生物技术股份有限公司)，甘油(AR)、正丁醇(AR)、异丙醇(AR)、氯仿(AR)、蔗糖、乙醇(AR)多聚甲醛、MgCl₂(南京化学试剂股份有限公司)。

1.3动物来源

SPF级6周龄雄性LDLR^-/-小鼠，购买自南京大学模式动物研究所。合格证号：SCXK(苏)2015-0001。

1.4动物饲料

低脂对照饲料(TP26322，含4％脂肪)、高脂高胆固醇饲料(TP26301，含21％脂肪+0.2％胆固醇)，含阿托伐他汀钙的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+ATV，含21％脂肪+0.2％胆固醇+30mg阿托伐他汀钙/kg饲料)，实验动物饲料及定制的含药饲料均购买自南通特洛菲饲料科技有限公司。

2.实验方法

2.1溶液与药物配制

含人参皂苷提取物的饮水配制：使用饮用水水配制浓度2.5mg/mL的含药溶液。

人参皂苷单体标准品溶液配制：使用DMSO溶解人参皂苷各单体，配制成1mg/mL的标准品溶液。

胆汁酸标准品溶液配制：使用甲醇溶解各种胆汁酸，配制成1mg/mL的标准品溶液。

d4-CDCA体外温孵底物溶液配制：使用DMSO溶解d4-CDCA，配制3.125，6.25，12.5，25，50，100，200mM的梯度底物溶液。

2.2高血糖症合并动脉粥样硬化动物模型建立

本实验采用高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型。方法为：取6周龄LDLR^-/-小鼠，给予12周高脂高胆固醇饲料，同时给予人参皂苷提取物或阳性药阿托伐他汀钙干预。具体分组为：对照饲料组(Chow)、高脂高胆固醇饲料组(Vehicle)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷提取物组(TGS，其中TGS给药剂量为300mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+阿托伐他汀钙组(ATV，其中ATV给药剂量为3mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷提取物+阿托伐他汀钙组(TGS+ATV，其中TGS给药剂量为300mg/kg小鼠体重，ATV给药剂量为3mg/kg小鼠体重)。对照组小鼠给予TP26322，Vehicle和TGS组小鼠给予TP26301，ATV和TGS+ATV小鼠给予定制饲料TP26301+ATV。TGS和TGS+ATV组小鼠同时给予含人参皂苷提取物的饮水。每笼小鼠每天放置相应组别的饲料25g(如TP26322或者TP26301)。

2.3主动脉根斑块油红O染色及斑块面积定量

将已进行12周高脂高胆固醇饲料建立高血糖症合并动脉粥样硬化的LDLR^-/-小鼠处死后剖开胸腔，从左心室下方将PBS(pH＝7.4)灌流心脏、主动脉。在解剖显微镜下分离主动脉，取心脏上端到主动脉弓处，用4％多聚甲醛固定过夜。PBS洗2min后置于4℃，20％蔗糖-PBS中脱色12h。使用OCT包埋，冷冻，从心室中部到主动脉弓切一系列10μm的切片，切片用油红O的丙二醇溶液和苏木精染色，甘油明胶封片。切片在显微镜下拍照后，使用ImagePro 6.0软件定量统计斑块面积占管腔的百分比和坏死中心面积。

2.4小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c、血糖、胰岛素水平测定和HOMA-IR指数的计算

通过眼角静脉丛穿刺取血的方法取得LDLR^-/-小鼠全血，室温静置2h后，进行6000rpm/10min离心，取得的上层清液即为小鼠血清。小鼠血清加入5倍体积的生理盐水稀释后，使用TC、TG、LDL-c、HDL-c及葡萄糖测定试剂盒，按说明书的步骤进行指标的测定。小鼠血清不经生理盐水稀释，采用小鼠胰岛素测定ELISA试剂盒，按说明书的步骤进行指标的测定。HOMA-IR指数＝空腹血糖(mg/dL)×空腹胰岛素(μU/mL)]/405。

2.5基于LC-Q-TOF/MS的小鼠血清、肝脏、粪便胆汁酸测定

(1)样品预处理：样本预处理：LDLR^-/-小鼠处死后，解剖剪下肝脏组织。称取组织30mg，加入500μL生理盐水，匀浆，经7000rpm/10min离心后取上层清液即为组织匀浆液。小鼠处死前12h使用代谢笼收集粪便。将粪便经冻干机冻干处理后粉碎，称取粉末20mg，加入200μL 70％乙醇，超声提取0.5h后，经7000rpm/10min离心后取上层清液即为粪便提取液。每50μL血清、组织匀浆液或粪便提取液，加入500μL含内标为50ng/mL dhCA的0.05％甲酸，震荡10min后，1800rpm离心10min。取上层清液进行固相萃取。最后使用1400μL甲醇洗脱，接着使用真空浓缩装置挥干，加入140μL含内标甲醇复溶。18000rpm离心10min两次后，取上层清液50μL至进样瓶。色谱柱：Ailgent ZOEBAX Eclipse Plus C18(2.1×150mm，3.5μm)。进样体积为10μL。

(2)色谱方法：流速：0.2mL/min。流动相：A相：2.6mmol/L醋酸铵溶液(氨水调节pH至6.8)，B相：乙腈。梯度：0min：20％A→5.0min：80％A→11.0:75％A→20.0:50％A→25.0：45％A→29.0min：45％A→31.0min：20％A→34.0min：20％A。

(3)质谱方法：离子源：APCI，离子极性：负离子模式，Gas1：50，Gas2：60，CurtainGas：30，喷雾电压：4500，温度：500，DP：80，CE：40，CES：±15。

(4)数据处理：Analyst TF1.5.1色谱工作站进行定性和定量分析。

2.6胆汁酸代谢酶mRNA表达和活性评价

(1)代谢酶mRNA表达：取LDLR^-/-小鼠肝脏组织，每20mg组织加入1mL Trizol，进行RNA提取。加入200μL氯仿，剧烈摇晃15s，静置5min，12000g离心15min；上层水相250μL，加入250μL冰异丙醇，混匀，静置10min，12000g离心10min；弃上层清液，加入1mL 75％乙醇，12000g离心5min；弃上层清液，空气干燥，加入20μL DEPC水溶解，定量并稀释。将提取的RNA逆转录至cDNA。用SYBR Green荧光染料法，通过定量PCR扩增cDNA。采用Gaphd为内参，计算肝脏Pxr、Cyp3a11、Cyp2c70、Cyp7a1等基因mRNA水平。

引物序列：

(2)代谢酶活性测定：肝微粒体制备：取LDLR^-/-小鼠肝脏组织，称取肝脏组织120mg，剪碎，加入480μL冰PBS使用均质器匀浆至液体澄清且无细胞团块。上述匀浆液在4℃以9000g高速离心20min后，得到的上层清液即为S9。将S9转移至超高速离心管中，精密配平后100,000g/4℃超高速离心1h，弃上层清液，所得粉红色沉淀即为小鼠肝微粒体。用400μL冰30％甘油-PBS缓冲液悬浮，吹打均匀。取少量稀释40倍后采用BCA法蛋白定量。稀释到4mg/mL，备用。温孵体系：体系1：PBS、底物d4-CDCA、肝微粒体；体系2：NRS溶液(40mmol/LNADP，200mmol/L G6P，20U/mL PDH，200mmol/L MgCl₂)。体系1和体系2在37℃恒温摇床中预热5min，然和合并启动反应，待30min后加入1mL含内标dhCA浓度为50ng/mL的甲醇溶液(4℃冰浴预冷)终止反应。震荡10min，18000rpm/10min离心。上层清液挥干，加100μL甲醇复溶，18000rpm/10min离心2次后准备进样。采用2.5所描述的方法检测产物d4-α-MCA，绘制酶动力学曲线。

2.7盲肠内容物细菌相对丰度考察

LDLR^-/-小鼠处死后解剖获取小鼠回盲瓣，在超净台中挤出内容物，加入1mL PBS(pH＝7.4)，混匀。3000rpm/5min离心后，取上层液体，再次进行3000rpm/5min离心。弃去层液体后收集沉淀。沉淀使用细菌基因组DNA提取试剂盒，进行DNA的提取。采用定量PCR的方法，对小鼠盲肠内容物的细菌丰度进行测定。

引物序列：

2.8基于LC-MS的人参皂苷提取物及小鼠血浆和粪便人参皂苷单体含量测定

(1)样品预处理：样本预处理：LDLR^-/-小鼠处死前12h使用代谢笼收集粪便。将粪便经冻干机冻干处理后粉碎，称取粉末20mg，加入200μL超纯水，超声提取0.5h后，经7000rpm/10min离心后取上层清液即为粪便提取液。取50μL血清或粪便提取液，加入1mL水饱和正丁醇，震荡10min后，1800rpm离心10min。取上层清液使用真空浓缩装置挥干，加入100μL含内标25％乙腈复溶。18000rpm离心10min两次后，取上层清液50μL至进样瓶。提取物称取5mg，加入500μL超纯水，超声提取0.5h后，1800rpm离心10min，去上层清液加入1000倍体积的超纯水稀释，再次进行1800rpm离心10min，取上层清液50μL至进样瓶。色谱柱：WatersXBridge^TM C18(2.1mm×100mm，3.5μm)。进样体积为10μL。

(2)色谱方法：流速：0.2mL/min。流动相：A相：0.1mM氯化铵溶液，B相：乙腈。梯度：0-1.5min：75％A→12.0min：55％A→16.0:10％A→19.0:10％A→20.0：75％A→23.0min：75％A。

(3)质谱方法：离子源：ESI，离子极性：负离子模式，Gas1：50，Gas2：60，CurtainGas：30，喷雾电压：4500，温度：500，DP：80。

(4)数据处理：Analyst TF1.5.1色谱工作站进行定性和定量分析。

3.实验结果：

3.1人参皂苷提取物对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型药效指标的影响

人参皂苷提取物中各人参皂苷单体含量如图1所示。与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠主动脉根斑块面积和斑块坏死面积显著增加。与模型组相比，人参皂苷提取物能够显著减小主动脉根斑块面积和斑块坏死面积。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物能够进一步减小斑块面积和斑块坏死面积(图2)。与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠血清TC、TG、LDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数显著升高。与模型组相比，人参皂苷提取物能够显著降低小鼠血清TC、TG、LDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物能够显著降低TG和空腹血糖、空腹胰岛素水平和HOMA-IR指数(图3)。

3.2人参皂苷提取物对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型胆固醇及胆汁酸代谢通路的影响

在小鼠中CDCA和TCDCA经肝脏羟化代谢为α-MCA、β-MCA和Tα-MCA、Tβ-MCA。与低脂饲料对照组相比，模型组小鼠血清和肝脏(β-MCA+α-MCA+Tβ-MCA+Tα-MCA)/(CDCA+TCDCA)的比值显著降低，提示模型组小鼠CDCA和TCDCA肝脏羟化代谢过程被抑制。与模型组相比，人参皂苷提取物能够显著增加血清和肝脏(β-MCA+α-MCA+Tβ-MCA+Tα-MCA)/(CDCA+TCDCA)的比值。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物，同样能够增加血清和肝脏(β-MCA+α-MCA+Tβ-MCA+Tα-MCA)/(CDCA+TCDCA)的比值(图4)。

对肝脏CDCA羟化代谢酶及其转录调控因子Pxr mRNA水平进行考察。与低脂饲料对照组相比，模型组小鼠肝脏Cyp3a11 mRNA水平显著下调，Pxr及Cyp2c70 mRNA水平微弱下调，进一步提示模型组小鼠CDCA和TCDCA肝脏羟化代谢过程被抑制。此外，与低脂饲料对照组相比，模型组小鼠肝脏Cyp7a1 mRNA水平显著下调，提示模型组小鼠胆固醇向胆汁酸代谢过程被抑制。人参皂苷提取物能够显著上调Pxr、Cyp3a11和Cyp2c70及Cyp7a1 mRNA水平。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物，同样能够显著上调Pxr、Cyp2c70及Cyp7a1 mRNA水平，微弱上调Cyp3a11 mRNA水平(图5A-D)。

使用各组小鼠肝脏，制备肝微粒体，温孵底物d4-CDCA。由Michaelis-Menten方程的拟合曲线可以看出，低脂饲料对照组相比，模型组小鼠肝微粒体代谢d4-CDCA的代谢酶活性更弱。与模型组相比，人参皂苷提取物组小鼠肝微粒体代谢d4-CDCA的代谢酶活性更强。与阿托伐他汀钙组相比，阿托伐他汀钙同时给予人参皂苷提取物组的小鼠，其肝微粒体代谢d4-CDCA的代谢酶活性相对更强(图5E)。

肝脏生成的牛磺酸或甘氨酸结合型胆汁酸经胆汁排泄进入肠道后，部分会被肠道菌群水解代谢形成游离型胆汁酸。结合型胆汁酸在肠道扮演信号分子的作用。牛磺酸结合型胆汁酸TCDCA、TCA、TDCA等能够通过FXR-FGF15轴抑制肝脏CYP7A1 mRNA及蛋白水平表达，抑制肝脏胆固醇代谢。对粪便牛磺酸结合型和游离型胆汁酸粪便含量和排泄量进行考察。与低脂饲料对照组相比，模型组小鼠粪便游离型胆汁酸与结合型胆汁酸的比值及胆汁酸排泄量显著降低，提示模型组小鼠肠道结合型胆汁酸水解代谢过程及胆汁酸排泄过程被抑制。与模型组相比，人参皂苷提取物能够显著增加粪便游离型胆汁酸与结合型胆汁酸的比值和胆汁酸排泄量。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物，能够微弱增加粪便游离型胆汁酸与结合型胆汁酸的比值和胆汁酸排泄量(图6)。

肠道表达胆盐水解酶(BSH)的细菌负责上述结合型胆汁酸水解功能。对小鼠盲肠内容物中表达BSH的细菌丰度进行考察，与低脂饲料对照组相比，模型组小鼠盲肠内容物中文献报导BSH活性较强的乳杆菌Lactobacillus spp.各菌种丰度，整体而言低于低脂饲料对照组，提示乳杆菌介导的肠道结合型胆汁酸水解代谢在模型组小鼠中被抑制。具体而言L.acidophilus,L.salivarius,L.fermentum丰度在模型组小鼠中显著低于对照组，L.brevis,L.murinus丰度在模型组小鼠中略低于对照组。与模型组相比，人参皂苷提取物能够显著增加升高乳杆菌属各菌种的丰度，包括L.acidophilus,L.salivarius,L.fermentum，L.brevis,L.murinus，L.delbrueckii,L.helveticus,L.helveticus，提示人参皂苷提取物诱导乳杆菌属介导的结合型胆汁酸水解代谢。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷提取物，能够增加L.salivarius,L.fermentum，L.murinus丰度(图7)。

3.3人参皂苷各单体在LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型体内暴露量及粪便水平研究

对人参皂苷提取物组小鼠血浆人参皂苷水平进行测定，血浆中以二醇型皂苷占绝对优势，包括Rb1、Rb2/3、Rc、Rd、CK、PPD，三醇型皂苷并没有检测到。对小鼠粪便中人参皂苷水平进行测定，粪便中以三醇型皂苷占主导，其中以人参皂苷Rg1和人参皂苷Rh1含量最高(图8)。

本实施例证明：人参皂苷提取物具有治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药效作用。与阿托伐他汀钙同时用药后，具有协同治疗作用。人参皂苷提取物能够恢复高血糖症合并动脉粥样硬化胆固醇及胆汁酸代谢通路紊乱，具体来说，恢复疾病状态下肝脏CDCA被抑制的羟化代谢解毒和肠道结合型胆汁酸水解代谢两方面作用。与阿托伐他汀钙同时用药后，具有协同改善疾病状态下胆固醇及胆汁酸代谢通路紊乱。根据人参皂苷体内暴露量和粪便含量测定结果，二醇型皂苷体内暴露量高，可能介导肝脏CDCA羟化代谢；三醇型皂苷在粪便中含量高，可能在肠道发挥其药理活性。

实施例2

人参皂苷活性单体筛选

1.实验材料

1.1仪器与设备

Shimadzu LC-30AD液相色谱仪(Shimadzu,日本)、AB SCIEX Triple TOF^TM5600质谱系统(AB SCIEX,美国)、AB SCIEX Triple Quad^TM 5500LC/MS/MS质谱系统(AB SCIEX,美国)、Agilent ZOEBAX Eclipse Plus C18 column(2.1×150mm,3.5μm)(Agilent,美国)、岛津AW120型电子分析天平(Shimadzu,日本)、岛津AUW 120D型电子分析天平(Shimadzu,日本)、Synergy TM2多功能酶标仪(BioTek,美国)、Milli-Q Gradient A10超纯水器(Millipore，美国)、Thermo SPD-2010真空离心浓缩装置(Thermo，美国)、Genie Vortex-2振荡器(Genie，美国)、Hitachi CR22G III低温高速离心机(Hitachi,日本)、CFX96 Real-Time PCR系统(Bio-Rad，美国)、Bugbox Plus厌氧工作站(Ruskinn，英国)、HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)。

1.2试剂

标准品：人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK、PPD、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT(南京景竹生物科技有限公司),dhCA、d4-TCA、d4-CA(Sigma-Aldrich，美国)。

试剂：甲醇、乙腈(GR)(Merck，美国)，棕榈酸、FITC-Dextran(4kDa)(Sigma-Aldrich，美国),SR12813(Selleck，美国)，刃天青、氯化血红素、维生素K1、氨苄青霉素(阿拉丁试剂有限公司)，胰蛋白胨、酵母提取物(青岛海博生物技术有限公司)RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Kit逆转录试剂、SYBR Premix Ex TaqTM II、细菌基因组DNA提取试剂盒(Takara，日本)，DEPC水、fatty-free BSA(南京碧云天生物技术有限公司)，PBS(北京奥博森生物技术有限公司)，DMEM高糖培养基(gibco，美国)，甘油(AR)、正丁醇(AR)、异丙醇(AR)、氯仿(AR)、乙醇(AR)、丙二醇(AR)、多聚甲醛、CaCl₂、MgSO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄、NaHCO₃、NaCl(南京化学试剂股份有限公司)。葡萄糖检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司)，小鼠胰岛素ELISA测定试剂盒、小鼠C反应蛋白ELISA测定试剂盒(上海吉泰依科赛生物科技有限公司)，LAL试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.3动物来源

6周龄雄性LDLR^-/-小鼠，购买自南京大学模式动物研究所，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。6周龄雄性C57BL/6小鼠，购买自南京大学模式动物研究所，合格证号：SCXK(苏)2015-0001。

1.4动物饲料

低脂对照饲料(TP26322，含4％脂肪)、高脂高胆固醇饲料(TP26301，含21％脂肪+0.2％胆固醇)，含人参皂苷Rb1的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rb1，含21％脂肪+0.2％胆固醇+400mg人参皂苷Rb1/kg饲料)，含人参皂苷Rg1的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rg1，含21％脂肪+0.2％胆固醇+80mg人参皂苷Rg1/kg饲料)，实验动物饲料及定制的含药饲料均购买自南通特洛菲饲料科技有限公司。

1.5细胞来源

HepG2细胞，购买自中科院上海细胞库。

1.6细菌来源

pUC118-amp/DH5α，购买自北京北纳创联生物技术研究院。

2.实验方法

2.1溶液与药物配制

人参皂苷单体标准品溶液配制：使用DMSO溶解人参皂苷各单体，配制成浓度为1mg/mL的标准品溶液。

胆汁酸标准品溶液配制：使用甲醇溶解各种胆汁酸，配制成浓度为1mg/mL的标准品溶液。

人参皂苷细胞给药溶液配制：使用DMSO溶解人参二醇型皂苷各单体，配置成浓度为25mM的母液。

PY培养基配制：胰蛋白胨1g,酵母提取物1g，半胱氨酸1g，0.25mg/mL刃天青溶液0.4mL，500μg/mL氯化血红素溶液1mL，0.005％维生素K1乙醇溶液0.02mL，盐溶液(0.2mg/mLCaCl₂，0.2mg/mL MgSO₄,1.0mg/mL K₂HPO₄,1.0mg/mL KH₂PO₄,10.0mg/mL NaHCO₃,2.0mg/mLNaCl水溶液)4mL,超纯水100mL，调节pH为7.2-2.4。高压蒸汽灭菌后备用。

人参皂苷体外温孵溶液配制：使用DMSO溶解人参皂苷各单体，配置成浓度为250mM的母液；使用超纯水溶解人参皂苷提取物，配置成浓度为2.5mg/mL的母液。

d4-TCA体外温孵底物溶液配制：使用DMSO溶解d4-TCA，配制浓度为5mg/mL的底物溶液。

棕榈酸细胞给药溶液配制：使用乙醇溶解棕榈酸，配制成浓度为100mM的母液。在含5％BSA的DMEM中加入千分之一体积的棕榈酸乙醇溶液，60℃水浴加热30min，制备浓度为100μM的棕榈酸的脂质培养基。

SR12813溶液配制：使用DMSO溶解SR12813，配制浓度为50μM的溶液。

2.2人参二醇型皂苷调控肝脏胆汁酸代谢的体外作用考察

HepG2细胞被分为Control组、Vehicle组、人参二醇型皂苷各单体组(Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3、CK、PPD)以及SR12813组。除了Control、Vehicle组给予空白培养基外，其余组别给予相应药物。其中Rb1、Rb2、Rc、Rd、F2、Rg3剂量为25μM，CK、PPD剂量为2.5μM，SR12813剂量为50nM。12h后，除Control组外，给予细胞脂质培养基，继续孵育12h。提取细胞RNA，逆转录成cDNA后，PCR考察PXR和CYP3A4 mRNA水平。

引物序列：

2.3人参皂苷调控肠道菌群胆汁酸代谢体外作用考察

C57BL/6小鼠处死后解剖获取小鼠回盲瓣，立即送至厌氧工作站中，用酒精棉球将回盲瓣表面的血擦干净，剪去多余脂肪组织，剪开回盲瓣一端，将内容物挤压至已装有30mLPY培养基的50ml EP管中吹打混匀，制备菌液，分装。分别给予分装后的菌液相应组别的药物，分组为Control、Vehicle、人参皂苷提取物组、各皂苷单体组(人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK、PPD、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1、F1、PPT)，其中人参皂苷提取物终浓度为2.5mg/mL，Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、F2、Rg1终浓度为250μM，Rg3、CK、PPD、Re、Rf、Rg2、Rh1、F1、PPT终浓度为50μM。置于厌氧工作站培养24h后，吸取一部分菌液加入底物d4-TCA，其终浓度为50μg/mL。摇床150rpm/min，反应20min。加入含1mL dhCA 500ng/mL冰甲醇，震荡10min，18000rpm/10min离心2次后取上层清液，使用实施例1所述的LC-Q-TOF/MS胆汁酸分析方法进行产物的测定。剩下菌液使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行PCR分析。

引物序列

2.4基于肠道通透性的人参三醇型皂苷Rg1活性研究

(1)本实验采用高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型。方法为：取6周龄LDLR^-/-小鼠，给予12周高脂高胆固醇饲料，同时给予人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1干预。具体分组为：对照饲料组(Chow)、高脂高胆固醇饲料组(Vehicle)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷Rb1组(Rb1，其中Rb1的给药剂量为40mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷Rg1组(Rg1，其中Rg1的给药剂量为8mg/kg小鼠体重)。对照组小鼠给予对照饲料TP26322，Vehicle组小鼠给予高脂高胆固醇饲料TP26301，人参皂苷Rb1组和人参皂苷Rg1组小鼠给予含相应单体的高脂高胆固醇定制饲料TP26301+Rb1和TP26301+Rg1。每笼小鼠每天放置相应组别的饲料25g。

(2)本实验采用高脂高胆固醇饮食诱导的C57BL/6小鼠肠道屏障破坏模型。具体分组为：对照饲料组(Chow)、高脂高胆固醇饲料组(Vehicle)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷Rg1组(Rg1)。对照组小鼠给予对照饲料TP26322，Vehicle组小鼠给予高脂高胆固醇饲料TP26301，人参皂苷Rg1组小鼠给予含相应单体的高脂高胆固醇定制饲料TP26301+Rg1。每笼小鼠每天放置相应组别的饲料25g。总计给予8周。禁食12h后，灌胃给予400mg/kg FITC-Dextran溶液。4h后，心脏穿刺取全血。全血经6000rpm/10min离心后，取上层清液，于多功能酶标仪下测定FITC荧光强度。另取一批相同模型的小鼠，灌胃给予pUC118-amp/DH5α，剂量为2×10⁹CFU/mL，每只小鼠给予0.2mL。4h后，处死小鼠，解剖取回肠和结肠组织，无菌PBS清洗后，无菌环境匀浆。6000prm/5min离心后，取上层匀浆液，涂布与含氨苄青霉素的LB培养平板上。培养24h后，进行菌落计数。再取一批相同模型的小鼠，禁食12h后在超净台内眼眶静脉丛穿刺取全血，置于无菌试管中。全血经6000rpm/10min离心后，取上层清液，使用LAL试剂盒和小鼠C反应蛋白ELISA试剂盒分别测定血清内毒素和CRP水平。

3.实验结果：

3.1人参二醇型皂苷调控肝脏胆汁酸代谢的体外作用考察

实验结果显示，与Control组相比，给予脂质培养基后，HepG2细胞PXR和CYP3A4mRNA水平显著下调。预先给予12h人参皂苷Rb1及PPD能够显著上调PXR和CYP3A4 mRNA水平(图9)。提示人参皂苷Rb1和PPD促进了PXR下游代谢酶介导的CDCA羟化代谢。

3.2人参皂苷调控肠道菌群胆汁酸代谢体外作用考察

实验结果显示，与Vehicle组相比，预先温孵人参皂苷提取物和部分二醇型人参皂苷后，其盲肠内容物菌液BSH活性显著增加。这部分具有增强菌液BSH活性的二醇型皂苷括人参皂苷Rb1、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK。而PPD以及人参三醇型皂苷并未表现出增强菌液BSH活性的能力(图10A)。细菌相对丰度测定结果显示，人参皂苷Rb1、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2、CK显著升高盲肠内容物菌液中乳杆菌属的水平(图10B)，提示这部分人参皂苷促进了乳杆菌介导的结合型胆汁酸水解代谢。

3.3基于肠道通透性的人参三醇型皂苷Rg1活性研究

高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型的实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠结肠黏蛋白Muc2、Tff2 mRNA水平和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA显著降低。与模型组相比，人参皂苷Rg1干预能显著上调结肠黏蛋白Muc2、Tff2 mRNA水平和紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 mRNA水平(图11)。

高脂高胆固醇饮食诱导的C57BL/6小鼠肠道屏障破坏模型的实验结果显示，与对照组相比，模型组小鼠血清FITC荧光强度显著更高，回肠和结肠匀浆液培养后的菌落数量显著更高，提示模型组小鼠肠道屏障被破坏，通透性显著升高，条件致病菌浸润加剧。与模型组相比，人参皂苷Rg1干预能显著降低小鼠血清FITC荧光强度及结肠的匀浆液培养后的菌落数量，微弱降低回肠匀浆液培养后的菌落数量，提示人参皂苷Rg1能够发挥抑制肠道通透性的活性(图12A-C)。与对照组相比，模型组小鼠血清内毒素和CRP水平显著更高，提示模型组小鼠肠道屏障被破坏，条件致病菌易位加剧，心血管炎症反应加剧。与模型组相比，人参皂苷Rg1干预能显著降低血清内毒素和CRP水平，进一步提示人参皂苷Rg1能够发挥抑制肠道通透性，抑制心血管炎症反应的活性(图12D-E)。

本实施例证明：人参二醇型皂苷中，人参皂苷Rb1具有同时调控肝脏胆汁酸羟化代谢和促进肠道细菌胆汁酸水解代谢的活性。人参皂苷Rg1能够抑制高脂高胆固醇饮食对肠道屏障的损伤，抑制肠道通透性，抑制条件致病菌浸润。以上结果证明了人参皂苷Rb1和Rg1治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药理学基础，为两者组合使用治疗疾病提供了依据。根据实施例1的结果，人参皂苷提取物中，人参皂苷Rb1和Rg1的近似比例为5:1，因此，下面准备单独提出人参皂苷Rb1和Rg1的药物组合，沿用提取物中的比例，并设定两者剂量为实施例1中发现药效的人参皂苷提取物中的含量，进行高血糖症合并动脉粥样硬化药效确证。

实施例3

治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药物组合的药效确证

实验材料同实施例1。

其中动物饲料为：低脂对照饲料(TP26322，含4％脂肪)、高脂高胆固醇饲料(TP26301，含21％脂肪+0.2％胆固醇)，含人参皂苷组合物的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rb1+Rg1，含21％脂肪+0.2％胆固醇+400mg人参皂苷Rb1/kg饲料+80mg人参皂苷Rg1/kg饲料)，含阿托伐他汀钙的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+ATV，含21％脂肪+0.2％胆固醇+30mg阿托伐他汀钙/kg饲料)，含人参皂苷组合物和ATV的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rb1+Rg1+ATV，含21％脂肪+0.2％胆固醇+400mg人参皂苷Rb1/kg饲料+80mg人参皂苷Rg1/kg饲料+30mg阿托伐他汀钙/kg饲料)，含人参皂苷Rb1的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rb1，含21％脂肪+0.2％胆固醇+400mg人参皂苷Rb1/kg饲料)，含人参皂苷Rg1的高脂高胆固醇定制饲料(TP26301+Rg1，含21％脂肪+0.2％胆固醇+80mg人参皂苷Rb1/kg饲料)，实验动物饲料及定制的含药饲料均购买自南通特洛菲饲料科技有限公司。

实验方法和实验结果如下。

1.实验方法

1.1高血糖症合并动脉粥样硬化动物模型建立

(1)人参皂苷Rb1和Rg1单独给药对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化症状药效评价：本实验采用高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型。方法为：取6周龄LDLR^-/-小鼠，给予12周高脂高胆固醇饲料，同时给予人参皂苷提取物或阳性药阿托伐他汀钙干预。具体分组为：对照饲料组(Chow)、高脂高胆固醇饲料组(Vehicle)、高脂高胆固醇饲料+人参Rb1组(Rb1，其中Rb1的给药剂量为40mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷Rg1组(其中Rg1的给药剂量为8mg/kg小鼠体重)。对照组小鼠给予对照饲料TP26322，Vehicle组小鼠给予高脂高胆固醇饲料TP26301，Rb1和Rg1小鼠分别给予含Rb1和Rg1的高脂高胆固醇定制饲料TP26301+Rb1、TP26301+Rg1。每笼小鼠每天放置相应组别的饲料25g。

(2)人参皂苷Rb1和Rg1的药物组合对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化症状药效研究：本实验采用高脂高胆固醇饮食诱导的LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型。方法为：取6周龄LDLR^-/-小鼠，给予12周高脂高胆固醇饲料，同时给予人参皂苷提取物或阳性药阿托伐他汀钙干预。具体分组为：对照饲料组(Chow)、高脂高胆固醇饲料组(Vehicle)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷组合物组(Rb1+Rg1，其中组合物给药剂量为48mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+阿托伐他汀钙组(ATV，其中阿托伐他汀钙的给药剂量为3mg/kg小鼠体重)、高脂高胆固醇饲料+人参皂苷组合物+阿托伐他汀钙组(Rb1+Rg1+ATV，其中组合物给药剂量为48mg/kg小鼠体重,阿托伐他汀钙的给药剂量为3mg/kg小鼠体重)。对照组小鼠给予对照饲料TP26322，Vehicle组小鼠给予高脂高胆固醇饲料TP26301，Rb1+Rg1组小鼠给予含组合物的高脂高胆固醇定制饲料TP26301+Rb1+Rg1。Rb1+Rg1+ATV组小鼠给予含组合物和阿托伐他汀钙的高脂高胆固醇定制饲料TP26301+Rb1+Rg1+ATV。每笼小鼠每天放置相应组别的饲料25g。

2.2主动脉根斑块油红O染色及斑块面积定量

小鼠处死后剖开胸腔，从左心室下方将PBS灌流心脏、主动脉。在解剖显微镜下分离主动脉，取心脏上端到主动脉弓处，用4％多聚甲醛固定过夜。PBS洗2min后置于4℃，20％蔗糖-PBS中脱色12h。使用OCT包埋，冷冻，从心室中部到主动脉弓切一系列10μm的切片，切片用油红O的丙二醇溶液和苏木精染色，甘油明胶封片。切片在显微镜下拍照后，使用ImagePro 6.0软件定量统计斑块面积占管腔的百分比和坏死中心面积。

2.3小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c、血糖、胰岛素水平测定

小鼠血清加入5倍体积的生理盐水稀释后，使用TC、TG、LDL-c、HDL-c、葡萄糖测定试剂盒、小鼠胰岛素ELISA测定试剂盒，按说明书的步骤进行指标的测定。

3.实验结果

3.1人参皂苷Rb1和Rg1单独给药对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型药效指标的影响

与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠主动脉根斑块面积和斑块坏死面积显著增加。与模型组相比，人参皂苷Rb1能够显著减小主动脉根斑块面积，而人参皂苷Rg1只能微弱减小斑块面积。对斑块坏死面积，单独给予人参皂苷Rb1或Rg1只能对其有微弱的减小作用。(图13)。

与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠血清TC、TG、LDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数显著升高。与模型组相比，人参皂苷Rg1能够略微降低小鼠血清TC、LDL-c水平。两者对空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数的降低都比较微弱。(图14)。

3.2人参皂苷组合物对LDLR^-/-小鼠高血糖症合并动脉粥样硬化模型药效指标的影响

根据人参皂苷提取物中人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1的质量比，设置人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1以质量比5:1组合而成人参皂苷组合物。与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠主动脉根斑块面积和斑块坏死面积显著增加。与模型组相比，人参皂苷组合物能够显著减小主动脉根斑块面积和斑块坏死面积。人参皂苷组合物对斑块形成以及斑块坏死的抑制作用明显强于单独给予人参皂苷Rb1或Rg1。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷组合物能够进一步减小斑块面积和斑块坏死面积。

(图15)。

与低脂饲料对照组相比，模型组经高脂高胆固醇饲料喂养12周后，小鼠血清TC、TG、LDL-c、空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数显著升高。与模型组相比，人参皂苷组合物能够略微降低小鼠血清TC、TG、LDL-c水平，显著降低空腹血糖、空腹胰岛素水平及HOMA-IR指数。人参皂苷组合物降血糖和改善胰岛素抵抗的作用明显强于单独给予人参皂苷Rb1或Rg1。与阿托伐他汀钙组相比，在给予阿托伐他汀钙的同时给予人参皂苷组合物能够显著降低TG、空腹血糖水平、空腹胰岛素水平和HOMA-IR指数(图16)。

本实施例证明：人参皂苷Rb1与人参皂苷Rg1质量比5:1构成的人参皂苷组合物具有治疗高血糖症合并动脉粥样硬化的药效作用，明显强于单独给予人参皂苷Rb1或Rg1；与阿托伐他汀钙同时用药后，具有协同治疗作用。

Claims (5)

1.人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1在制备治疗Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化的药物中的应用，所述人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1的质量比为5:1。

2.一种治疗Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物，其特征在于，由人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1以质量比5:1组成。

3.一种权利要求2所述的治疗Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化的人参皂苷组合物与他汀类药物联合用药在制备Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化的药物中的应用。

4.一种治疗Ⅱ型糖尿病合并动脉粥样硬化药物组合物，其特征在于，主要成份包含人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1，其中Rb1:Rg1质量含量比为5:1，其它成份为药学上可接受的其它成份或辅料。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

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