CN101230386B

CN101230386B - 检测CYP2E1基因的单核苷酸多态性位点rs2480256的引物在制造用于评估系统性红斑狼疮易感性的试剂盒的用途

Info

Publication number: CN101230386B
Application number: CN2007100089091A
Authority: CN
Inventors: 张�浩; 沈南; 廖凌虹; 吴汪黔生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-04-28
Filing date: 2007-04-28
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2027-04-28
Also published as: CN101230386A

Abstract

本发明涉及检测在2个人类异源物质代谢酶基因：ABCG2和CYP2E1上的4个与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)相关联的单核苷酸多态性(SNP)位点，以及应用这些单核苷酸多态性位点预测系统性红斑狼疮的易患性及筛选治疗系统性红斑狼疮的药物。本发明所提供的信息有助于预防系统性红斑狼疮及开发有效的新疗法。

Description

检测CYP2E1基因的单核苷酸多态性位点rs2480256的引物在制造用于评估系统性红斑狼疮易感性的试剂盒的用途

技术领域

本发明涉及检测2个人类异源物质代谢酶基因：ABCG2和CYP2E1上的4个与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)相关联的单核苷酸多态性(SNP)位点，以及应用这些单核苷酸多态性位点预测系统性红斑狼疮的易患性。本发明也提供了一种有助于预防系统性红斑狼疮的方法，也可应用于筛选针对不同类型系统性红斑狼疮的适当疗法。

背景技术

系统性红斑狼疮是一种慢性自身免疫性疾病，该病的一个显著特征是产生可导致多组织炎症的自身抗体。SLE可能影响身体的任何部分，但是最常见的是心脏，关节，皮肤，肺部，血管，肝脏，肾脏及神经系统的损伤。SLE主要影响育龄期的妇女，女性患者和男性患者的比例大约是9比1。过去认为SLE是一种罕见的疾病，但是从上世纪60年代开始，更多SLE的病例随着人们对它的认识的增加而被发现。目前，单是美国，就估计有大约27万至150万人患有红斑狼疮。而在世界范围，保守的估计有超过500万的患者。虽然SLE的准确致病机理现在还不明确，但是越来越多证据显示多种遗传和环境的因素都可能影响发病。到目前为止，已发现多种化学物质，包括：芳香胺，肼类化合物，硅，硅氧烷，氯乙烯，有机溶剂和重金属，与SLE的发生有关。与这些化学物质接触可能诱导自身反应性T细胞和自身抗体，并且刺激前炎性细胞因子和抗炎细胞因子的产生，还可能引起靶器官的损伤(Sarzi-puttini P，Atzeni F，Iaccarino L，andDoria P，2005.Environment and systemic lupus erythematosus：An overview.Autoimmunity，November；38(7)：465-472)。此外，统计数据显示吸烟者更加容易患上SLE。近期的研究还发现机体内反应性氧(reactiveoxygen species ROS)对SLE的发生有重要作用(Ahsan H，Ali A and Ali R，2003.Oxygen free radicals andsystemic autoimmunity.Clin Exp Immunol；131：398-404)。

异源物质代谢酶(XMEs)

异源物质是非人体固有的天然或人工合成的物质，包括药物，工业产物，杀虫剂，污染性物质，生物碱，及由细菌，真菌，植物和动物产生的毒素。许多异源物质本身或其经生物转化后的形式具有毒性或致癌性。异源物质代谢酶(XMEs)能导致各种致癌物，致癌物前体，毒素和药物的活性化，它们也能参与宿主对异源物质的防御反应。由于治疗性药物对人体而言也是异源物质，因此某些异源物质代谢酶也被称为药物代谢酶(DMEs)。参与异源物质的氧化反应和连接反应的酶分别被称为I相和II相异源物质代谢酶。I相异源物质代谢酶，例如细胞色素P450s(CYPs)基因家族，催化多种内源性和外源性的异源物质(从类固醇到污染物)的氧化反应，在这些氧化过程中可能产生亲电的和可致突变的中间产物。II相异源物质代谢酶通常以氧作为进一步代谢反应的位点，比如接上协同因子使物质变得更亲水进而有利于该物质的排出。除了I相和II相异源物质代谢酶，ATP-结合盒(ABC)转运子，利用ATP水解的能量完成多种化合物的跨膜运输，亦促使异源物质的代谢。在肠壁，血脑屏障和胎盘里存在着大量的异源物质代谢酶和ABC，暗示这些酶能限制异源物质进入主要系统并在宿主的防御机制中发挥重要作用(Jonker JW，BuitelaarM，Wagenaar E，et al.，2002.The breast cancer resistance protein protects against a major chlorophyll-derived dietary phototoxin andprotoporphyria.Proc Natl Acad Sci U S A.99：15649-54.)。

ABCG2(ABCP，MXR1，BCRP)基因是最新发现的ABC药物排出转运子，它是由几间不同实验室分别发现的。通过分析那些对米托蒽醌(mitoxantrone)有抗性，但没有超量表达ABCB1或ABCC1基因的细胞系找到了ABCG2基因。如果将ABCG2基因转到细胞中，可以使这些细胞获得对化疗药物的抗性。ABCG2蛋白是一个半转运子，它与对癌症化疗中常使用的结构与机理并不相关的各种药物的交叉抗性有关(Gottesman MM，Fojo T and Bates SE.，2002.Multidrug resistance in cancer；role of ATP-dependent transporters.Nat Rev Cancer 2，48-58)。对哺乳动物各种组织中ABCG2的分布在RNA和蛋白质水平上进行分析，显示ABCG2广泛的分布在许多正常组织中，包括小肠和结肠的肠绒毛上皮细胞腔面以及许多组织的毛细管内皮细胞(Doyle LA，and Ross DD，2003.Multidrug resistance mediated by the breast cancer resistance proteinBCRP(ABCG2).Oncogene.22：7340-58)。ABCG2分布在小肠和结肠上皮的顶端，这种现象暗示着ABCG2对防止异源物质侵入起到一定的作用(Maliepaard M，Scheffer GL，Faneyte IF，et al.，2001. Subcellularlocalization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in no

CYP2E1酶主要负责活化和代谢多种低分子量化合物，例如芳香型部分卤化的碳水化合物，N-亚硝胺，苯胺，氯乙烯和氨基甲酸乙脂，这些化合物中有一些对机体有毒害作用。CYP2E1酶是由酒精诱导产生，是引致酒精氧化的主要细胞色素酶，可产生活化了的氧物质并造成氧化应激反应。在引发对乙酰氨基酚(acetaminophen)肝中毒的一连串过程中，CYP2E1是启动及限速酶，缺少此酶时中毒现象仅在高浓度毒素情况下发生。CYP2E1还被发现与酒精肝及非酒精性脂肪肝的肝脏病理变化有关联(Gonzalez FJ.2005.Role of cytochromes P450 in chemical toxicity and oxidative stress：studies with CYP2E1.Mutat Res.569：101-10)。CYP2E1在对DNA产生氧化应激反应的过程中是必不可少的，因此，CYP2E1在酒精相关的肝癌形成中可能起到关键的作用(Bradford BU，Kono H，Isayama F，et al.，2005.Cytochrome P450 CYP2E1，but not nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，is required for ethanol-induced oxidative DNAdamage in rodent liver.Hepatology.41：336-344)。实验证实CYP2E1的遗传多态性是造成异源物质对人体毒性作用有个体差异的原因之一(Hanioka N，Tanaka-Kagawa T，Miyata Y et al.，2003.Functionalcharacterization of three human cytochrome p450 2E1 variants with amino acid substitutions.Xenobiotica.33：575-586)。在有铁作催化剂的情况下，CYP2E1可以产生诸如hydroxyl radical的强氧化剂(Kessova I，Cederbaum AI.2003.CYP2E1：biochemistry，toxicology，regulation and function in ethanol-induced liver injury.Curr Mol Med.3：509-518)。三氯乙烯是一种工业上常用的有机溶剂，在相关的流行病学调查中发现它可以诱发SLE和其他的自身免疫性疾病，如：硬皮病(scleroderma)(Kilburm KH，Warshaw RH.1992.Prevalenceof system lupus erythematosus(SLE)and fluorescent antinuclear antibodies associated with chronic exposures totrichloroethylene and other chemical in well water.Environ Res.54：1-9)。在机体内，三氯乙烯主要是通过CYP2E1酶代谢为毒性中间产物再由II相异源物质代谢酶催化进行连接反应成为毒性较低的代谢物。Griffin等人的研究还证明了抑制的CYP2E1活性可以逆转三氯乙烯所激发的免疫效应。这说明三氯乙烯需要在机体内经过CYP2E1催化的活化作用才能诱导免疫调节(Griffin JM，Gilbert KM，Pumford NR.2000.Inhibitionof CYP2E1 reverses CD4+ T-cell alterations in trichloroethylene-treated MRL+/+ mice.Toxicol Sci.54：383-389)。CYP2E1基因位于10号染色体的q24.3区至末端，基因全长11,413bp，有9个外显子。

单核苷酸多态性(SNP)

人类基因组中DNA序列的差异导致了个体的不同特征，包括每个人接触了异源物质(污染物，毒素和药物)后不同的反应。基因组中的单个核苷酸(A，G，C或T)发生变化就产生了单核苷酸多态性(SNP)，在传代的过程中单核苷酸多态性逐渐趋于稳定。大家越来越认识到大量已定位SNP的收集将为人类遗传学的研究提供有力的工具。此外，SNP还能作为遗传标记用于家系的连锁分析，特定人群的连锁不平衡分析以及疾病关联性分析来寻找与疾病有关的基因。像系统性红斑狼疮这样的多基因病，与疾病有显著关联的SNP就可以作为诊断工具来辨别对疾病有较高易感性的个体。而对患系统性红斑狼疮的病人进行基因检测则有可能揭示一些未知的遗传病因并且优化疾病的管理和治疗。

当系统性红斑狼疮病人和健康对照组的SNP被发现和检测后，需要分析有关数据来确定某个SNP与系统性红斑狼疮之间是否存在显著的联系。这是基于：即使某个SNP“X”能直接影响系统性红斑狼疮的易感性，拥有这个SNP“X”也不是得系统性红斑狼疮的充分必要条件，但是这个SNP“X”在病人中的出现频率一定高于正常人。同样地，与此SNP“X”呈连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)的其它SNP也会出现这种情况。因此，对SNP与疾病的关联性的研究可以在两个方向上进行：直接检测一个有功能影响的SNP或者用这个SNP作为连锁不平衡(LD)的标记物进行关联性分析。

发明内容

本发明的目的是提供位于2个异源物质代谢酶基因：ABCG2和CYP2E1上的4个单核苷酸多态性位点，这些位点与系统性红斑狼疮易感性有关联，它们可运用于开发一些新的方法在早期临床阶段对系统性红斑狼疮进行辅助诊断。

本发明给出了一条独立的多核苷酸片断，它的序列与SEQ ID NO：1的序列相同。该多核苷酸片断为人类ABCG2基因的一部分，包括外显子10和2个多态性位点：51523T＞G和rs2231148。

本发明还给出了一套PCR引物可用于扩增出如同SEQ ID NO：1的多核苷酸片断。该套引物中的第一条引物的序列与SEQ ID NO：2所示相同，或与SEQ ID NO：2互补；第二条引物的序列与SEQ ID NO：3所示相同，或与之互补。

本发明给出了一条独立的多核苷酸片断，它的序列与SEQ ID NO：4的序列相同。该多核苷酸片断为人类CYP2E1基因的包括内显子2的部分序列和1个多态性位点：rs8192772。

本发明还给出了一套PCR引物可用于扩增出如同SEQ ID NO：4的多核苷酸片断。该套引物中的第一条引物的序列与SEQ ID NO：5所示相同，或与之互补；第二条引物的序列与SEQ ID NO：6所示相同，或与之互补。

本发明给出了一条独立的多核苷酸片断，它的序列与SEQ ID NO：7的序列相同。该多核苷酸片断为人类CYP2E1基因的一部分包括外显子9的部分序列和1个多态性位点：rs2480256。

本发明还给出了一套PCR引物可用于扩增出如同SEQ ID NO：7的多核苷酸片断。该套引物中的第一条引物的序列与SEQ ID NO：8所示相同，或与之互补；第二条引物的序列与SEQ ID NO：9所示相同，或与之互补。

此发明的另一部分给出了一种可以预测一个个体是否更容易或者更不容易得系统性红斑狼疮的方法。此方法包括：(a).检测该个体的核酸序列；(b).选择并确定以下4个SNP位点：ABCG2基因新发现的51523T＞G位点，及在dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)中已经报告的ABCG2基因的rs2231148位点，CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256位点中的一个或多个位点的核苷酸序列；或检测与上述4个SNP中一个或多个位点处于相同的单倍型或连锁不平衡(LD)的其它遗传标记。

此发明还给出了一种检测系统性红斑狼疮病人基因型的方法，该方法可以为病人的药物治疗提供在药学基因组学方面的指导，包括：(a).检测病人的核酸样本的序列；(b).选择并确定以下4个SNP位点：ABCG2基因的51523T＞G和rs2231148位点，CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256位点中的一个或多个位点的核苷酸序列，或检测与上述4个SNP中一个或多个位点处于相同的单倍型或连锁不平衡(LD)的其它遗传标记。

此发明也给出了一种筛选药物的方法，可应用于鉴定治疗或预防系统性红斑狼疮的药物。此方法包括： (a).转染一个载体到真核细胞表达系统，该载体至少含有人类异源物质代谢酶基因ABCG2，CYP2E1中的部份片段，而该片段包含以下4个SNP位点中的一个或几个：ABCG2基因的51523T＞G位点，在dbSNP数据库中已经报导的ABCG2基因的rs2231148，CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256位点，或者包含与上述4个SNP中一个或多个位点处于相同的单倍型或连锁不平衡(LD)的其它遗传标记；(b).在细胞表达系统中表达该载体；(c).在这个细胞系统中加入被筛选的药物；(d).分析异源物质代谢酶基因的表达来研究被筛选的药物在该细胞系统中对基因表达的影响；(e).确定那些能够改变异源物质代谢酶基因表达的药物。

附图说明

以下这些图表将令该项发明的特点在后面的详细叙述中更加浅显易懂。

图1是部分基因组ABCG2基因的示意图，显示了单核苷酸多态性位点rs2231148，551523T＞G的位置和与其邻近的外显子的相对位置。

图2是部分基因组CYP2E1基因的示意图，显示了单核苷酸多态性位点rs8192772和rs2480256的位置和与其邻近的外显子的相对位置。

具体实施方式

术语的定义：

在本发明的说明书和权利要求书中使用了以下各种术语，它们的定义如下所述：

术语“等位基因”(allele)指一段核苷酸序列的不同变化形式。

术语“互补的”(complementary)与“互补”(complement)指一段核苷酸序列可以通过碱基配对的原则与另一条多核苷酸序列在可以配对的区域配对。

术语“基因型”(genotype)指生物体的遗传物质组成。更确切地说，它是指个体中所含有的等位基因的类型。如某个体的两条姐妹染色单体上的特定位置核苷酸序列均为A，则该个体在此特定位点的基因型为A/A；如某个体的两条姐妹染色单体上的特定位置核苷酸序列分别为A和C，则该个体在此特定位点的基因型为A/C。对一个个体或一份DNA样本进行基因型检测“(Genotyping)”是指在核苷酸的水平上来确定一个个体在特定多态性位点的等位基因序列。

术语“多态性”(polymorphism)指某个基因或基因的某个部分在人群中存在多于一种的形式。“多态的，多态性的”(polymorphic)指在某一人群中可找到有两种以上的基因序列变异。“多态性位点”(polymorphic site)指核苷酸序列发生变异的基因座。

术语“寡核苷酸”(oligonucleotide)和“多核苷酸”(polynucleotide)在这里指的是在长度上多过一个核苷酸的RNA、DNA或者RNA/DNA杂交的序列。这些序列可以单链或双链的形式存在。通常将小于50个核苷酸残基组成的核酸称为寡核苷酸，大于50个核苷酸残基称为多核苷酸。

术语“聚合酶链式反应”(PCR)是一种扩增DNA序列的方法，它通过热稳定的聚合酶和一对引物，其中一条引物与正链的一端互补结合，另一条与负链的另一端互补结合，来进行DNA扩增。新合成的DNA片断可以作为模板，与同样的引物结合，经过退火，延伸和解链三个步骤的循环迅速而特异地扩增出目的序列。

术语“引物”(primer)指的是短的单链寡核苷酸。它可与DNA样本中的互补序列配对结合。引物是依赖模板的DNA合成的起始点。DNA聚合酶可在一条引物的末端位置添加脱氧核糖核酸。“一对引物”(primer pair)或“一套引物”(primer set)指的是两条引物中包含有可杂交于被扩增序列5’端位置的某条链的一条引物，和可杂交于被扩增片断3’端位置的另一条链的引物。

术语“外显子”(exon)指的是基因中编码蛋白质的DNA序列。

术语“内含子”(intron)指的是那些打断基因中编码蛋白质的DNA序列的序列。内含子序列可以被转录为RNA，但是在RNA翻译为蛋白质之前会被切除。

本发明特别关系到与系统性红斑狼疮有联系的单核苷酸多态性(SNPs)。已经发现如果个体ABCG2和CYP2E1基因或与其互补的序列呈现特定的多态性，则该个体可能具有相对高的系统性红斑狼疮易感性。

一方面本发明给出了一些与系统性红斑狼疮有联系的特定的SNP位点：ABCG2基因的rs2231148位点，CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256位点。以上这些SNP位点虽然之前已经发现了，但是从未将它们与系统性红斑狼疮相联系。

另一方面，本发明还给出了一个与系统性红斑狼疮有联系的之前从未被发现的SNP位点：ABCG2基因的51523T＞G位点。

此发明现给出有关上述4个SNP位点的详细描述。SEQ ID NO：1的序列为人类基因组ABCG2基因序列的一部分，包括了此基因的外显子10及其侧翼序列。对于SNP 51523T＞G，它的参考等位基因是如SEQID NO：1所示，核苷酸变化是发生在第103碱基上，由鸟嘌呤(G)代替参考碱基胸腺嘧啶(T)。对于SNPrs2231148，它的参考等位基因是如SEQ ID NO：1所示，核苷酸变化是发生在第169碱基上，由胸腺嘧啶(T)代替了参考碱基腺嘌呤(A)。

SEQ ID NO：4序列是人类基因组CYP2E1基因的部分DNA序列，它包含有内含子2的部分序列。对于SNP：rs8192772，它的参考等位基因序列如SEQ ID NO：4所示，在变化的等位基因序列中，核苷酸的变化发生在第170个碱基上，由胞嘧啶(C)代替参考碱基胸腺嘧啶(T)。

SEQ ID NO：7序列是人类基因组CYP2E1基因的部分DNA序列，它包含有外显子9的部分序列。对于SNP：rs2480256，它的参考等位基因序列如SEQ ID NO：7所示，在变化的等位基因序列中，核苷酸的变化发生在第231个碱基上，由鸟嘌呤(G)代替了参考碱基腺嘌呤(A)。

以下部分将给出确认这些与系统性红斑狼疮相关联的单核苷酸多态性位点的方法。

本发明所分析的所有健康人和系统性红斑狼疮病人均为中国汉族人。系统性红斑狼疮病人均经由组织病理学检查确认。健康对照组在性别与年龄上与病人组相匹配。每一个经挑选的参与者贡献5ml外周血。我们使用国际通用的GFXTM血液基因组DNA纯化试剂盒(Amersham Biosciences，NJ，USA)提取样本血液基因组DNA。用常规DNA测序的办法检测碱基突变。我们使用应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA)的热启动

Gold DNA扩增试剂盒和Eppendorf公司的

梯度扩增仪扩增基因组DNA。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确认并纯化后，使用应用生物系统公司(Applied Biosystems，CA，USA)的

Terminator v3.1测序试剂盒在

3100遗传分析仪(Applied Biosystems，CA，USA)上测序。我们使用标准的卡方分析查找系统性红斑狼疮与多态性位点的关联性。计算优势比(odds ratios，OR)与95％置信区间(95％CI)时我们使用了对年龄参数作校正的逻辑回归分析。所有统计学分析均使用SPSS 12.0统计软件包(SPSS Inc.，Chicago，IL)。

表1显示了上述SNP与系统性红斑狼疮相关性的分析及系统性红斑狼疮患者在等位基因和基因型频率上的关系。在表1中“SLE”表示系统性红斑狼疮病人，“CON”表示正常人。统计学分析显示：；ABCG2基因上的SNP 51523T＞G(p＝0.046)，rs2231148(p＝0.021)，CYP2E1基因上的SNP rs2480256(p＝0.002)在人群中在等位基因水平上与系统性红斑狼疮显著相关；同时，ABCG2基因上的SNP 51523T＞G(p＝0.044)和rs2231148(p＝0.003)，CYP2E1基因上的SNP rs8192772(p＝0.009)和rs2480256(p＝0.00005)在人群中在基因型水平上与系统性红斑狼疮显著相关。

表1：异源物质代谢酶基因的SNP与系统性红斑狼疮相关性(P＜＝0.05)的统计分析。

相应地，本发明也给出了检测以下SNP的方法来对系统性红斑狼疮的易感性作出诊断，这些SNP为：ABCG2基因的51523T＞G和rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256。同时也给出了对系统性红斑狼疮病人进行基因型检测的方法，以及将ABCG2和CYP2E1基因作为有用的潜在目标来制造防治系统性红斑狼疮的药物。

图1展示了人类ABCG2基因的基因组核酸序列上外显子的排布情况。图2为人类CYP2E1基因的基因组核酸序列上外显子的排布情况。在本发明中，那些可用于判断个体系统性红斑狼疮易感性的SNP的位置也同时在以上附图中标明了。

为了检测SNP 51523T＞G和rs2231148，要使用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的引物来扩增一段与SEQ ID NO：1相同的基因组DNA片段。然后用SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示引物对扩增片段进行测序。为了检测SNP rs8192772，要使用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的引物来扩增一段与SEQ IDNO：4相同的基因组DNA片段。然后用SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示引物对扩增片段进行测序。为了检测SNP rs2480256，要使用SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物来扩增一段与SEQ ID NO：7相同的DNA片段。然后用SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示引物对扩增片段进行测序。

上述图表和基因型检测方法对与系统性红斑狼疮相关的SNP位点都作了描述。

另一方面，此发明也给出了一种测定和诊断系统性红斑狼疮病人的基因型的方法。

这种方法通过分析ABCG2和CYP2E1等基因的部分序列来确定ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256；或这些SNP位点中的一个或几个位点的等位基因和(或)基因型。应用该方法首先要取得足够的人类DNA来进行序列和(或)基因型的分析才能够确定以上SNP位点中的某一个或几个的序列。此方法包括一些目前普遍使用的技术，如PCR，就象后面的范例中所描述的，用与范例相同的引物在相同的条件下检测与系统性红斑狼疮相关的单核苷酸多态性。也可以对这4个SNP位点使用不同于本发明中所述的引物进行检测，这些引物可以由具有相关经验的人勿须经过太多实验而设计。其它对单核苷酸多态性位点的基因型检测分析有帮助的方法都可以用于检测上述4个SNP位点和与这4个SNP位点处于连锁不平衡的其它位点。

本发明的范例还提供了筛选和(或)诊断系统性红斑狼疮的方法。概括地说，此发明显示，在人群中，ABCG2基因51523T＞G位点的“G”等位基因可能增加个体患系统性红斑狼疮风险的作用，优势比(OR)为2.384，(95％置信区间：0.990-5.739)，p＝0.046。对于SNP rs2231148，基因型“a/a”的携带者患系统性红斑狼疮的风险大约是“t/t”或“t/a”携带者的1.453倍，(95％置信区间：1.135-1.862)，p＝0.003。

对于CYP2E1基因的rs8192772来说，基因型数据分析显示基因型“c/c”携带者比“t/t”和“t/c”携带者有较高的患系统性红斑狼疮的风险(OR＝2.193，95％置信区间：1.197-4.108，p＝0.009)。对于CYP2 E1基因的SNP rs2480256而言，不论是基因型数据还是等位基因数据都显示“A”等位基因携带者有较高的患系统性红斑狼疮的风险(OR＝1.276，95％置信区间：1.093-1.491，p＝0.002)；而“a/a”基因型携带者的患系统性红斑狼疮的风险大约是“g/g”或“g/a”携带者的1.82倍(95％置信区间：1.360-2.435)，P＝0.00005。

以上所述的SNP位点可以用于诊断性检测来鉴别那些接触异源物质时更容易得系统性红斑狼疮的个体。某些遗传多态性不仅影响系统性红斑狼疮的发生也影响系统性红斑狼疮的发展，为此本发明提供了系统性红斑狼疮的诊断病理学与易感基因遗传多态性之间的联系。这些诊断检测可以使用一些已知的技术，包括：基因芯片的方法(比如：Affymetrix公司的GenFlexTMTag，Pamgene，Inc.公司的PamChip等)，把DNA固定在基质上(比如：Marligen Bioscience公司的SIGNETTM Y-SNP Identification System)，ABI公司的SNPaPshotTM Multiplex系统(Applied Biosystems Inc.)，分子信标技术(Sanya Tyagi，Public HealthResearch Institute，New York，USA)和PyrosequencingTM技术(Pyrosequencing AB)。诊断检测也可以使用以下方法来完成：用等位基因特异性引物，等位基因特异性探针直接对目标区域进行测序，单链构象多态性(SSCP)和变性梯度胶电泳(DGGE)。综上所述，本发明给出了一个检测有患系统性红斑狼疮趋势的人的方法，它是通过对ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256；这些SNP位点进行检测来实现的。

作为本发明的另一部分，人工合成的或重组的DNA分子都可以用于诊断。这些DNA分子序列包含以下4个SNP位点的任意组合：ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256。序列可以是它们的任意一种等位基因形式和其侧翼序列，也可以是和这些SNP位点连锁不平衡的基因座。这些DNA分子序列可以是这6个异源物质代谢酶基因的一条或两条DNA链。

此外，本发明还提供了一种对治疗系统性红斑狼疮所用药物进行评价的方法，该方法是基于上述SNP位点与系统性红斑狼疮的相关性。因为有些位点处于基因的启动子区或外显子和内含子的交界区，它们可以影响这些基因mRNA的调控，合成和剪接。为了检测这种影响，可以将这些SNP的不同等位基因形式依不同组合方式组成一条新序列，再将序列克隆到合适的表达载体上，并在一些合适的哺乳动物细胞系中表达。转染的方法可用目前普遍使用的转染试剂盒如：CellPhect转染试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Inc.，USA)和

哺乳动物转染系统(Promega Coporation)。转染效率可用一些已知的试剂如：磷酸钙(Life Technologies Inc.)等来提高。

如果以上一个或几个SNP位点与系统性红斑狼疮相关的等位基因形式会改变基因表达和(或)同族基因的结构特征，则以上提到过的细胞系也可用来筛选一些能够使基因表达恢复正常的化合物。这样的化合物在治疗和预防系统性红斑狼疮方面可作为非常有潜力的候选药物。

本发明进一步提供了检测与系统性红斑狼疮有关的SNP位点的检测试剂盒；也提供了明确无误的DNA测试方法以应用于系统性红斑狼疮遗传易感性的检测。

用DNA测序或其它基因型检测方法检测感兴趣的SNP位点，首先需要用PCR扩增含有以下一个或者多个SNP位点的DNA片段。这些SNP位点包括：ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256。所获得的PCR产物可用于之后的DNA测序或别的基因型检测方法来检测多态性位点的不同等位基因形式，如：连接依赖性的多探针扩增(multiplex ligation dependent probeamplification)，单碱基延伸(single base-base extension)，或基因芯片上的序列特异性探针杂交(microarray-based sequence-specific oligonucleotide probe hybridization)，单链构象多态性(single strandconformation polymorphism)，寡核苷酸芯片上的固相PCR(solidphase PCR on oligonucleotide microarrays)，直接在寡核苷酸芯片上的复合PCR(direct multiplex PCR on oligonucleotide microarrays)等。检测结果可以用软件包，比如POLYPHARDTM和CONCEDTM等合适的软件进行分析。一个能够用于以上检测的试剂盒可能包括下列组分中的一个或几个：PCR引物，等位基因特异性探针，DNA聚合酶，PCR反应缓冲液，氯化镁，PCR反应或引物延伸所需的4种脱氧核糖核酸。如果需要测序的话，该试剂盒还可能需要含有：测序引物，DNA聚合酶，4种标记的双脱氧核糖核酸和4种未标记的脱氧核糖核酸。

当基因型检测方法中不需要对DNA进行扩增时，被检测的DNA可直接用于检测上述4个SNP或检测与任何一个SNP相关的单倍型。

此方法给出了一个筛选药物的办法，其步骤包括：

(a)将一载体转入一个真核细胞表达系统，该载体必须含有人类ABCG2和CYP2E1基因的一部分或全部，可以是单独的某一基因也可以是两个基因在一起。

(b).在细胞表达系统中表达该载体；

(c).在这个细胞系统中加入被筛选的药物；

(d).分析基因的表达情况，此基因可以是ABCG2或者CYP2E1基因的SNP位点上的所有等位基因的可能组合方式。同时也分析该细胞系统中相同家族的异源物质代谢酶基因的表达与活性。

(e).确定那些被筛选的化合物在该细胞体系中对同族的异源物质代谢酶基因表达和活性的影响。

依照以上方法，得到的化合物或制备的细胞表达体系可作为治疗和预防系统性红斑狼疮的潜在的候选药物。

新发现的人类ABCG2基因上的单核苷酸多态性位点51523T＞G不仅它本身可以单独或同时用于诊断，开发药物或疾病预防，而且，与它处于连锁不平衡或同一单倍型的其它遗传标志也可有同样的用途。

更进一步，不仅如范例1中所述的PCR与DNA测序方法可以用于检测被测DNA样本的如下单核苷酸多态性位点：ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148；CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256，还有其它一些类似的测序方法也可用于这一用途。比如：多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation dependent probeamplification，MLPA)，pyrosequencing测序(Pyrosequencing AB)，单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，SSCP)，或者变性梯度胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)。另有一些方法可达到此目的，这些方法包括：使用DNA芯片的方法(比如Affymetrix公司的GenFlexTMTag，Pamgene，Inc.公司的PamChip等)；把DNA固定在基质上的方法(比如Marligen Bioscience，Inc.公司的SIGNETTMY-SNP Identification System)；ABI公司的

SNPaPshotTM Multiplex System(Applied BiosystemsInc.)；或者是分子信标技术(Sanya Tyagi，Public Health Research Institute，美国纽约)。

以下将举例说明本发明。但正如一些熟知此技术领域的人所显而易见的那样，这并不意味着将本发明局限于以下的示例。

实施例1：检测本发明中新发现的单核苷酸多态性位点51523T＞G

本发明新发现了位于ABCG2基因内含子9上的单核苷酸多态性位点51523T＞G，检测此位点的方法介绍如下：

可用软件Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3)设计一些特异性引物用于查找相关区域的多态性位点。用BLASTTM 程序(National Center for BiotechnologyInformation-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)检测所设计的引物相对于人类基因组序列的特异性。不论是正向还是反向引物，只有当它们在BLAST程序的特定条件下所找到的相似性序列少于5条时才会被认为是特异性的并被采纳。

用

Gold聚合酶试剂盒(Applied Biosystems，CA，美国)和

Gradient热循环仪(Eppendorf，Hamburg，德国)进行聚合酶链式反应(PCR)。聚合酶链式反应总体积为20微升，包括1.5mM镁离子，200μM四种碱基，每条引物各0.3μM，模板基因组DNA 10ng，和0.5U的聚合酶。首先用呈梯度温度变化的聚合酶链式反应来为每一对引物寻找最合适的退火温度。表2列出了一对引物序列的例子及其退火温度。聚合酶链式反应程序为：95度10分钟(1个循环)，接着进行45个循环的94度30秒，60度30秒和72度30秒。最后为72度延伸2分钟。产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色进行分析确认为所需长度，然后将扩增产物用MultiScreenTMPCR96纯化试剂盒(Millipore Corporation，Bedford，美国)纯化除去剩余的反应物。

表2：检测单核苷酸多态性位点51523T＞G基因型的引物与其最佳退火温度。

我们采用对PCR产物的双链分别测序的方法来查找感兴趣区域的单核苷酸多态性位点。采用的试剂盒为

Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，CA，USA)。采用的测序仪器为

3100 Genetic Analyzer(Applied Biosystems，CA，USA).每一个样本至少测序两次。

将测序结果输入到BioEdit软件中作序列比对与分析，以此确定单核苷酸多态性位点。

实施例2：检测人类ABCG2和CYP2E1基因上与系统性红斑狼疮相关的单核苷酸多态性位点

此范例描述了一个用于检测并确定上文所述的一个或几个单核苷酸多态性位点的方法。人类的ABCG2基因和CYP2E1基因的部分目标区域将用作模板来合成PCR产物。表3列出了几对特异性引物，每对可分别用于扩增特定目标区域。

表3：用于ABCG2和CYP2E1基因的PCR和DNA测序的引物

单核苷酸多态性位点名称	正向引物	反向引物	测序引物	最佳退火温度
					51523T＞G和 rs2231148	CTACCACTCTCCCCAAAGCA(SEQ ID NO：2)	CGTGGTGGTGGATGTCTGTA(SEQ ID NO：3)	SEQ ID NO：2	60℃
rs8192772	GTTCTTGGTTTTCCCAGCTCT(SEQ ID NO：5)	CTGAGTCTTCCCCATGCTACATAA(SEQ ID NO：6)	SEQ ID NO：5	60℃
					rs2480256	GAAAACGAGTGTGTGCTGGAGA(SEQ ID NO：8)	GCAAAGAAAGGAATCAGTTTGAG(SEQ ID NO：9)	SEQ ID NO：8	60℃

含有单核苷酸多态性位点片段的PCR扩增与扩增产物的测序

以下试剂用于PCR扩增感兴趣的片段：1.5mM镁离子，200μM四种碱基，每条引物各0.3μM，模板基因组DNA 10ng，和0.5U的聚合酶，聚合酶链式反应总体积为20微升。

聚合酶链式反应使用

Gradient热循环仪(Eppendorf，Hamburg，德国)按以下步骤进行：95度10分钟(1个循环)，接着进行45个循环的94度30秒，60度30秒和72度30秒。最后为72度延伸2分钟。

PCR扩增产物用MultiScreenTMPCR96纯化试剂盒(Millipore Corporation，Bedford，美国)纯化后直接用

Terminator v3.0 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，CA，USA)试剂盒测序。测序反应条件为 96度1分钟(1个循环)，接着进行25个循环的96度10秒，50度5秒和60度4分钟。

测序产物用含有DNA纯级别SephadexTMG-50的AutoSeq96TMPlates平板(Amersham PharmaciaBiotech，Inc，USA)纯化。纯化产物经加入5μl Hi-Di Formamide(Applied Biosystems，CA，USA)95摄氏度变性。变性的测序产物用ABI公司提供的方法在

3100Genetic Analyzer(Applied Biosystems，CA，USA)测序仪上分析。将测序结果输入到BioEdit软件中作序列比对与分析。

表4列出了用此方法的测序统计结果。表格分别列出了在基因型与等位基因型的水平上正常人与系统性红斑狼疮病人在多个单核苷酸多态性位点上的序列情况。

表4：在ABCG2和CYP2E1基因中与系统性红斑狼疮相关的单核苷酸多态性的表格

虽然以上只介绍了一种检测与系统性红斑狼疮有关联的多态性位点的方法，任何熟知此方面工作的人都知道可以使用其它方法达到此目的。比方说，设计等位基因特异性探针，等位基因特异性引物延伸反应，或者使用单碱基延伸反应来检测。

实施例3：检测ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148和CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256的试剂盒

此范例描述了一个试剂盒，该试剂盒用于检测并确定上文所述的一个或几个单核苷酸多态性位点的序列，从而得到被测个体的基因型。检测结果可运用于对该个体对系统性红斑狼疮的易感性作出预测。

该试剂盒包含以下引物：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SED ID NO：5，SED ID NO：6，SED ID NO：8和SED ID NO：9。该试剂盒还包含以下试剂用于PCR扩增ABCG2和CYP2E1基因的片段：1.5mM镁离子，200μM四种碱基，阳性对照人类模板基因组DNA，和聚合酶。运用试剂盒时，聚合酶链式反应总体积为20微升，聚合酶链式反应使用热循环仪按以下步骤进行：95度10分钟(1个循环)，接着进行45个循环的94度30秒，60度30秒和72度30秒。最后为72度延伸5分钟。

PCR扩增产物可用测序等方法来确定ABCG2基因的51523T＞G，rs2231148和CYP2E1基因的rs8192772和rs2480256的序列。

核酸序列的清单

<110>廖凌虹，沈南，张浩

<120>人类异源物质代谢酶基因的单核苷酸多态性在诊断和治疗系统性红斑狼疮方面之应用

<160>9

<210>1

<211>593

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(103)

<223>单核苷酸多态性位点51523T＞G，n＝t或g

<220>

<221>misc_feature

<222>(169)

<223>单核苷酸多态性位点rs2231148，n＝a或t

<400>1

ctaccactct ccccaaagca cagataactt aatttttaac ttaggaagca gtctaaataa 60

tgtatgctgt tttattttct cccagggacg ttggccaagc cattgagtgt ttatcttaat 120

ggagagatct gattatgtaa ccatatatta tactaataaa tggtgtgtat aagtttttat 180

ctctaattga aactcttccc ctttttttgc atttttcttt ttgaaaagat cattgtcaca 240

gtcgtactgg gactggttat aggtgccatt tactttgggc taaaaaatga ttctactgga 300

atccagaaca ggtaagtaaa tttggatctt gattttcaga aaatgctgtt actttcttca 360

agcttattga aatccattaa gaatttgaat ttaagacaag tatagtgtaa atgtcattct 420

tttattgagg gtaggatgag tcagtttatt tttgagacag agtcatgctc tgttgcccag 480

gctggagtgc agtgacgcga tctcagctca ctgcaatctc cgcctcccgg gttcaagcaa 540

ttctcctgcc tcagcttccc aagtagcctc gactacagac atccaccacc acg 593

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用来检测人类ABCG2基因等位基因的变化类型的人工合成DNA序列。

<400>2

ctaccactct ccccaaagca 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>3

cgtggtggtg gatgtctgta 20

<210>4

<211>241

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(170)

<223>单核苷酸多态性位点rs8192772，n＝t或c

<400>4

gttcttggtt ttcccagctc tgatgctttg cacagtcact tgtgtgacct gcaagatttt 60

agtgaagaaa cttgctgtgg agtcggaaag ctgcaagttg aggtgtgtgt ggtgtgaggg 120

ttaaaaatct gtgagaacag aatgaatggc ttttcaagaa tgttgtcgat agataggaaa 180

gaggtgggag gtgttcttgg agtggccata tgtggtttta tgtagcatgg ggaagactca 240

g 241

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用来检测人类CYP2E1基因等位基因的变化类型的人工合成DNA序列。

<400>5

gttcttggtt ttcccagctc t 21

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>6

ctgagtcttc cccatgctac ataa 24

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<211>275

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(231)

<223>单核苷酸多态性位点rs2480256，n＝g或a

<400>7

gaaaacgagt gtgtgctgga gaaggcctgg ctcgcatgga gttgtttctt ttgttgtgtg 60

ccattttgca gcattttaat ttgaagcctc tcgttgaccc aaaggatatc gacctcagcc 120

ctatacatat tgggtttggc tgtatcccac cacgttacaa actctgtgtc attccccgct 180

catgagtgtg tggaggacac cctgaacccc ccgctttcaa acaagttttc aaattgtttg 240

aggtcaggat ttctcaaact gattcctttc tttgc 275

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

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gaaaacgagt gtgtgctgga ga 22

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<400>9

gcaaagaaag gaatcagttt gag 23

Claims

1.检测CYP2E1基因的单核苷酸多态性位点rs2480256的引物在制造用于评估系统性红斑狼疮易感性的试剂盒的用途，CYP2E1基因的单核苷酸多态性位点rs2480256，即，SEQ ID NO：7序列第231个碱基处的单核苷酸由A变成G，引物序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。