CN101229179A - 含有余甘根苷b的药物组合物及其药物用途 - Google Patents
含有余甘根苷b的药物组合物及其药物用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种以倍半萜类化合物余甘根苷B(Phyllaemblinin B)为活性成分的药物组合物，该化合物可从叶下珠属药用植物余甘子中提取分离，本发明还提供该药物活性成分在制备抗柯萨奇病毒B3药物中的应用，以及在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
Description
技术领域：本发明属于药物领域，具体地，涉及一种以从叶下珠属药用植物余甘子中分离提取的倍半萜类余甘根苷B(Phyllaemblinin B)为有效成分的药物组合物，及其在制备抗柯萨奇病毒B3药物中和在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
背景技术：柯萨奇病毒B3是正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，肠道病毒属。柯萨奇病毒B3是引起病毒性心肌炎的主要病原体，可经呼吸道和消化道感染。病毒性心肌炎是以心肌细胞变性坏死、间质单个核细胞浸润为主要病变的一种临床常见病，在儿童和青少年中高发，严重危害人类健康。目前，西医临床治疗病毒性心肌炎的主要方法是使用普通抗病毒药、免疫抑制剂、干扰素及心肌细胞营养剂等，但疗效并不理想。近年来大量研究表明，中药在病毒性心肌炎的临床治疗中显示出极大优势。目前临床上针对病毒性心肌炎的中成药只有个别品种，大多为医生自拟的处方汤药或复方粗提物，急需开发出有针对性，有效成分清楚，作用机制明确，疗效肯定，剂型先进，服用携带方便，质量稳定可控的中药制剂。现有技术中未见有从中药中分离出来的倍半萜类成分余甘根苷B(Phyllaemblinin B)具抗柯萨奇病毒B3及治疗病毒性心肌炎的药理作用的报道。
发明内容：本发明的目的在于提供以从叶下珠属药用植物余甘子中分离提取的倍半萜类余甘根苷B(Phyllaemblinin B)为有效成分的药物组合物，及其在制备抗柯萨奇病毒B3药物中和在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
药物组合物，其中含有治疗有效量的余甘根苷B，和/或药物学上可接受的载体。
化合物余甘根苷B在制备抗柯萨奇病毒B3药物中的应用。
化合物余甘根苷B在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
本发明以柯萨奇病毒B3毒株(CVB3)和HeLa细胞为实验对象进行药效试验。在HeLa细胞上进行的体外抗病毒试验结果表明，本发明药物的TC50为50.30μg/mL，对CVB3病毒的IC50为7.75μg/mL，治疗指数(TI)为6.49，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。
采用不同给药方式观察倍半萜类成分余甘根苷B的对抗柯萨奇病毒B3的活性。结果证明，(1)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3感染的细胞具有预防作用；(2)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3感染的细胞具有治疗作用；(3)倍半萜类成分余甘根苷B对CVB3具有直接杀伤作用。
基于上述研究结果，本发明证实了倍半萜类成分余甘根苷B具有预防和治疗柯萨奇病毒B3感染引起的疾病的新用途，可用于制备抗柯萨奇病毒B3及治疗病毒性心肌炎的药物。
附图说明
图1为正常细胞对照组的显微镜图(100x)；
图2为病毒对照组的显微镜图(100x)；
图3为阳性药物病毒唑对照组的显微镜图(100x)；
图4为倍半萜余甘根苷B试验组显微镜图(100x)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实质性内容做进一步阐述，但不以此对本发明有任何限定。
实施例1：从余甘的根中提取制备甘根苷B(Phyllaemblinin B)。
(1)余甘根原料去杂、洗净、烘干、粉碎成过30目筛的粗粉。
(2)上述粗粉1.77kg用80％含水丙酮冷浸提取3次，每次浸提取时间2天，过滤、合并滤液、减压浓缩、回收溶剂(可用于反复提取)。
(3)上述残留水溶液，进一步浓缩至小体积后，用正丁醇(n-BuOH)萃取3次，合并正丁醇层液、减压浓缩、回收溶剂。
(4)上述正丁醇萃取物(30.6g)，以薄层层析法检测指导洗脱(薄层层析的条件为：氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)为展开剂，10％的硫酸水溶液为显色剂，加热显色)，通过多种柱层析手段，包括硅胶G柱层析(氯仿-甲醇-水梯度洗脱)，以及Diaion HP20SS、SephadexLH-20、MCI gel CHP20P、Chromatorex ODS等反相柱层析(以不同浓度的甲醇梯度洗脱)，从中得到余甘根苷B(Phyllaemblinin B)(80mg)。
上述余甘根苷B(Phyllaemblinin B)的物理常数和光谱数据：
余甘根苷B(Phyllaemblinin B)：
分子式：C33H44O19
分子量：744
结构式：
性状：淡黄色粉末；易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水。
旋光：[α]D 26 10.4°(c 0.58，MeOH)
红外光谱νmax(KBr)cm-1：
3206，2933，1778，1718，1604，1452，1294，1124，1012。
紫外光谱λmax(MeOH)nm(logε)：
279(2.91)，272(2.99)。
质谱(FAB+-MS)：767[M+Na]+，745[M+H]+
元素分析：for C33H44O19·5/2 H2O，计算值：C 50.13％，H 5.91％；
实测值：C 50.19％，H 6.25％。
1H NMR(氘代甲醇中，500MHz)：δ8.16(2H，dd，J＝7.5，1.5Hz，H-3′，7′)，7.66(1H，br t，J＝7.5Hz，H-5′)，7.57(2H，br t，J＝7.5Hz，H-4′，6′)，5.36(1H，q，J＝3.0Hz，H-10)，4.29(1H，br s，H-5)，4.03(1H，t，J＝11.0Hz，H-12a)，3.93(1H，br s，H-1)，3.58(1H，br d，J＝11.0Hz，H-12b)，2.94(1H，tt，J＝13.5，2.5Hz，H-3)，2.36(1H，br d，J＝13.5Hz，H-4a)，2.28(1H，dd，J＝15.0，3.0Hz，H-9a)，2.18(1H，m，H-11)，2.01(1H，dd，J＝15.0，3.0Hz，H-9b)，2.04(1H，br d，J＝13.5Hz，H-2a)，1.90(1H，dt，J＝13.5，4.0Hz，H-4b)，1.77(1H，dt，J＝13.5，2.5Hz，H-2b)，0.89(3H，d，J＝7.0Hz，H-14)；inner glucose：5.59(1H，d，J＝8.0Hz，glc H-1)，4.08(1H，dd，J＝9.0，8.0，glc H-2)，3.89(1H，dd，J＝12.0，2.5Hz，glc H-6a)，3.75(1H，dd，J＝12.0，5.0Hz，glc H-6b)，3.62(1H，t，J＝9.0Hz，glc H-3)，3.46(1H，dd，J＝9.5，9.0Hz，glc H-4)，3.39(1H，m，glc H-5)；terminal glucose：4.18(1H，d，J＝8.0Hz，glcH-1)，3.62(1H，dd，J＝12.0，2.5Hz，glc H-6a)，3.56(1H，dd，J＝12.0，4.5Hz，glc H-6b)，3.25(1H，dd，J＝9.5，9.0Hz，glc H-4)，3.23(1H，dd，J＝9.5，9.0Hz，glc H-4)，3.11(1H，dd，J＝9.0，8.0，glc H-2)，2.76(1H，m，glc H-5)。
13C NMR(氘代甲醇中，125MHz)：δ213.7(C-7)，175.8(C-13)，167.8(C-1′)，134.4(C-5′)，132.1(C-2′)，130.8(C-3′，7′)，129.9(C-4′，6′)，100.5(C-8)，76.3(C-5)，75.4(C-6)，71.5(C-1)，70.9(C-10)，63.4(C-12)，34.3(C-11)，32.7(C-9)，32.2(C-2，3)，29.3(C-4)，13.1(C-14)；inner glucose：93.7(glc C-1)83.1(glc C-2)，78.9(glc C-5)，77.8(glcC-3)，70.8(glc C-4)，62.3(glc C-6)；terminal glucose：105.9(glc C-1)，77.7(glc C-3)，77.6(glc C-5)，75.9(glc C-2)，70.7(glc C-4)，62.0(glcC-6)；
下述的制剂实施例是按实施例1的方法先制得化合物余甘根苷B，按常规制成注射液、粉针剂、口服液以及加入赋形剂的粉剂、制粒压片、胶囊。
[制剂实施例1]片剂
按照本领域已知的方法制备片剂，每片含有下述成分：
化合物余甘根苷B 50mg
乳糖 70mg
硬脂酸镁 3mg
聚乙烯吡咯烷酮 7mg
合计 130mg
若需要，片剂可用羟丙基甲基纤维素、滑石和着色剂进行膜包覆。
[制剂实施例2]胶囊：
按照本领域已知的方法制备胶囊剂，每个胶囊中含有下述成分：
化合物余甘根苷B 50mg
乳糖 70mg
玉米淀粉 25mg
硬脂酸镁 1mg
聚乙烯吡咯烷酮 4mg
合计 150mg
[制剂实施例3]注射剂：
按实施例1-8的方法先制得本发明化合物余甘根苷B，取余甘根苷B按本领域已知的方法制备注射剂，加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
[制剂实施例4]粉针剂：
按实施例1的方法先制得余甘根苷B，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
[制剂实施例5]粉剂：
将所分离得到的余甘根苷B与赋形剂重量比为9∶1的比例加入赋形剂，制成粉剂。
[制剂实施例6]口服液：
按实施例1的方法先制得余甘根苷B，按常规口服液制法制成口服液。
[制剂实施例7]：
按实施例1的方法先制得余甘根苷B按其与赋形剂重量比为5∶1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。
下述的试验例可进一步说明本发明所述倍半萜类成分余甘根苷B及其药物组合物的有益效果，试验例包括了本发明的药效学试验等。
试验例1：
倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染HeLa细胞的影响试验。
细胞毒性试验：
将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入细胞维持液100μL；
阳性药物病毒唑对照组：每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液100μL，每个稀释度四个复孔；
给药组：加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液100μL/孔，每个稀释度四个复孔；
在倒置相差显微镜下观察细胞生存情况，按照四甲基偶氮唑蓝(MTT)法计算本发明药物对HeLa细胞的TC50。
抗柯萨奇病毒B3试验：
将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入细胞维持液100μL；
病毒对照组：每孔加入CVB3病毒液100μL，设四个复孔；
阳性药物病毒唑对照组：每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液和CVB3病毒液各50μL，每个稀释度四个复孔；
给药组：每孔加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液和CVB3病毒液各50μL，每个稀释度四个复孔。
培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病毒感染后，呈现典型的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象，给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。按照四甲基偶氮唑蓝(MTT)法计算本发明药物对HeLa细胞的IC50。
结果：倍半萜类成分余甘根苷B和病毒唑的TC50分别为50.30μg/mL和425.97μg/mL，对CVB3病毒的IC50分别为7.75μg/mL和20.30μg/mL，治疗指数(TI)分别为6.49和20.98，表明本发明药物体外对CVB3病毒有显著抑制作用。
试验例2.
倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式对柯萨奇病毒B3(CVB3)感染HeLa细胞的影响试验。
倍半萜类成分余甘根苷B对细胞的保护作用：
将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入细胞维持液100μL；
病毒对照组：每孔加入细胞维持液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100μL/孔培养，设四个复孔；
阳性药物病毒唑对照组：每孔加入梯度稀释的病毒唑溶液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100μL/孔，每个稀释度四个复孔；
给药组：每孔加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入CVB3病毒液100μL/孔，每个稀释度四个复孔。
培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病毒感染后，呈现典型的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象，给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观察记录结果。
CPE(cytopathic effect，细胞病变效应)，是指常规于倒置显微镜下观察试验细胞病变状态。
倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3增殖的影响：
将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入细胞维持液100μL；
病毒对照组：每孔加入CVB3病毒液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入细胞维持液100μL/孔培养，设四个复孔；
阳性药物病毒唑对照组：每孔加入CVB3病毒液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的病毒唑溶液100μL/孔，每个稀释度四个复孔；
给药组：每孔加入CVB3病毒液100μL，孵育1小时，弃去上清，用PBS溶液清洗三次，加入梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液100μL/孔，每个稀释度四个复孔。
培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病毒感染后，呈现典型的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象，给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观察记录结果。
倍半萜类成分余甘根苷B对柯萨奇病毒B3的直接杀伤作用：
将培养生长良好的HeLa细胞经胰酶消化后，加入96孔培养板中待其贴壁，24小时后弃去培养液。分组如下：
正常对照组：每孔加入细胞维持液100μL；
病毒对照组：细胞维持液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37℃作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，设四个复孔；
阳性药物病毒唑对照组：梯度稀释的病毒唑溶液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37℃作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，每个稀释度四个复孔；
给药组：梯度稀释的倍半萜余甘根苷B溶液与CVB3病毒液各50ul混合后，置37℃作用1小时后，将孵育液加入细胞孔中培养，每个稀释度四个复孔。
培养48小时后在倒置相差显微镜下观察，HeLa细胞被CVB3病毒感染后，呈现典型的细胞皱缩、变圆、碎裂、脱落等细胞病变现象，给药后如药物有效，就可以降低被病毒感染细胞的死亡率。CPE法观察记录结果。
结果：倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式均能降低HeLa细胞由柯萨奇病毒B3引起的细胞病变，见表1。
表1：倍半萜类成分余甘根苷B不同加药方式抗柯萨奇病毒B3的活性实验结果
| 浓度(ug/ml) | 预防作用 | 治疗作用 | 直接杀伤作用 | |||
| 余甘根苷B | 病毒唑 | 余甘根苷B | 病毒唑 | 余甘根苷B | 病毒唑 | |
| 200100502512.56.253.131.560.78 | NDNDND+++++++++++++++++ | +++++++++++++++++++NDNDND | NDNDND++++++++++++++ | +++++++++++++++NDNDND | NDNDND++++++++++++++ | +++++++++++++++NDNDND |
病毒对照组：++++，正常对照组：-
注：“ND”为没设的浓度；CPE等级：“+”为细胞病变25％以下；“++”为细胞病变25％～50％“+++”为细胞病变50％～75％“++++”为细胞病变75％以上。
Claims (3)
1.药物组合物，其中含有治疗有效量的余甘根苷B和/或药物学上可接受的载体。
2.权利要求1化合物余甘根苷B在制备抗柯萨奇病毒B3药物中的应用。
3.权利要求1化合物余甘根苷B在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
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