CN108164545B - 一种倍半萜类衍生物及其在制备治疗乙肝疾病药物中的应用 - Google Patents

一种倍半萜类衍生物及其在制备治疗乙肝疾病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种倍半萜类衍生物及其在制备治疗乙肝疾病药物中的应用，所述倍半萜类衍生物具有下调肝细胞核因子4α(HNF‑4α)，显著抑制乙型肝炎病毒的作用，可用于预防和/或治疗/和或辅助治疗乙型肝炎病毒导致的肝系统疾病和病症以及用作肝保护剂。另外，合成的倍半萜类衍生物，也可用于预防或治疗流感病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒等病毒感染性疾病和病症。同时也涉及了合成的倍半萜类衍生物为原料制备成片剂、胶囊、滴丸等口服剂型或吸入剂、注射剂等非口服剂型等临床上可接受的药物制剂。

Description

一种倍半萜类衍生物及其在制备治疗乙肝疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种有益于治疗乙型病毒感染型肝炎和病毒感染导致肝损伤系统疾病和病症的倍半萜类衍生物。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)可引起人类急、慢性肝炎，诱发肝硬化或肝癌，影响了全世界超过20亿人的生命和生活。虽然，1982年乙肝疫苗研制成功使用，但是全世界依然有超过3.5亿的HBV携带者，每年有50万至150万人死于乙肝病毒感染，其中50％的来源于亚太平洋地区。中国是最大的乙肝病毒感染国，约有1.3亿人为HBV携带者，每年约有30万人死于HBV感染。核苷类药物作用于HBV的DNA聚合酶，虽然有明显抗乙肝病毒作用，但是不能彻底清除患者体内的病毒，长期应用易产生耐药性。因此，抗乙肝病毒药物结构类型有限，作用靶点单一，临床应用中毒性大、易产生耐药性。同时也存在生物利用度低，代谢过快的问题。
天然产物作为原型药或先导化合物在抗病毒药物研究中发挥着重要作用。80年代，人们首次发现苦味叶下珠提取物具有抗病毒的活性，从此往后，叶下珠属成为了抗病毒研究的热点。从叶下珠属的西印度醋栗中，我们通过提取分离得到了其中的抗乙肝病毒主要成分西印度醋栗酸酯类衍生物，具有较好的抗乙肝病毒活性，但是毒性非常大。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种倍半萜类衍生物及其在制备治疗乙肝疾病药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：一种倍半萜类衍生物，它具有以下结构式I、II、III或IV所示结构：
Figure BDA0001583907410000021
其中，结构式(I)和结构式(II)中，R1各自独立地选自苯甲酸酯基、对羟基苯甲酸酯基、氢；结构式(III)和结构式(IV)中，R1各自独立地选自正己氨基、正庚氨基、正辛氨基、苯乙氨基、异丙氧基丙氨基、乙氧基丙氨基、正己酯基、正庚酯基、正辛酯基、苯乙酯基、异丙氧基丙酯基、乙氧基丙酯基。
进一步地，优选具有结构式I所示结构，其中，R1优选为苯甲酸酯基或对羟基苯甲酸酯基。
本发明还提供了一种上述倍半萜类衍生物在制备治疗乙肝疾病的药物中的应用。
进一步地，所述乙肝疾病包括乙型病毒感染型肝炎、乙型肝炎病毒感染导致肝损伤疾病。
进一步地，所述倍半萜类衍生物可与药用载体和/或食用载体组合。
进一步地，所述倍半萜类衍生物以治疗有效剂量包含于所述药物中。
进一步地，所述治疗有效剂量足够下调肝细胞核因子4α。
进一步地，所述药物包括口服制剂和非口服给药制剂；所述口服制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸、口服液体；所述非口服给药制剂包括注射剂、气雾剂、栓剂、皮下给药剂型。
本发明的有益效果是，本发明涉及在实验动物中乙型肝炎病毒感染疾病中表现出活性的倍半萜类衍生物西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物的医药新用途。具体的涉及含西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物，合成或半合成的含西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物的混合物的组合物下调肝细胞核因子4α(HNF-4α)，具有显著抑制乙型肝炎病毒活性。与目前治疗乙肝病毒感染的药物相比，所述西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物提高/改善的毒理学安全性(即毒性降低)、提高/改善的代谢稳定，较长的半衰期和/或较小的副作用，同时产生类似或提高的生物活性(药效)。可用于预防或治疗乙型肝炎病毒感染疾病和病症以及用作肝脏保护剂，如乙肝、酒精肝导致的肝损伤、脂肪肝导致的肝损伤。此外，可用于与肝细胞核因子4α(HNF-4α)相关的乙肝感染或肝损伤系统疾病作用机制和病毒生物学研究的化学工具药物。
最近，我们合成了结构通式I，II，III和IV及其中间体的合成和应用，其中衍生物PA-XY1和PA-XY2能有效抑制乙肝病毒表面e抗原和s抗原，半数有效量分别为530nM和10nM，远远强于阳性对照拉米夫定和白赛诺，且在500μM高浓度下不显示细胞毒性。进一步研究显示，小鼠体内水平半数有效量为20mg/kg，小鼠单日单次最大给药剂量2000mg/kg，连续观察7天，未出现毒性反应。且抗乙肝病毒治疗效率随着浓度的增加而基本呈线性增加的药理特点。表明该药物为高效低毒的抗乙肝病毒药物。可用于制备治疗乙型肝炎、慢性肝硬化等疾病的药物。
附图说明
图1是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY1在细胞模型中的对乙肝病毒表面抗原的抑制活性示意图；
图2是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY1在细胞模型中的抗乙肝病毒e抗原的抑制活性示意图；
图3是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY1在细胞模型中的抗乙肝病毒活性示意图；
图4是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY2在细胞模型中的抗乙肝病毒表面抗原的抑制活性示意图；
图5是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY2在细胞模型中的抗乙肝病毒e抗原的抑制活性示意图；
图6是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY2在细胞模型中的抗乙肝病毒活性示意图；
图7是西印度醋栗戊烷酰胺PA-XY1下调肝细胞核因子4α(HNF-4α)示意图。
具体实施方式
本申请发明人发现，许多肝脏系统疾病的病理状态，例如丙肝、肝损伤、肝癌等，至少有一种症状能通过下调肝细胞核因子4α(HNF-4α)而得以减轻。因此，患有这种疾病的个体可接受含有本发明中涉及的西印度醋栗戊烷酯或酰胺(或作为主要活性成分之一的在结构上与西印度醋栗戊烷酯或酰胺相关的类似物及同类物之一)的组合物。
此外，研究肝细胞核因子4α(HNF-4α)，是探讨肝脏系统疾病，如乙肝、丙肝、肝损伤等疾病发病机制的重要手段。本发明中涉及的西印度醋栗戊烷酯或酰胺可以显著肝细胞核因子4α(HNF-4α)。因此，本发明中涉及的西印度醋栗戊烷酯或酰胺(或作为主要活性成分之一的在结构上与西印度醋栗戊烷酯或酰胺相关的类似物及同类物之一)可用于探讨肝脏或病毒新肝炎系统疾病发病机理的研究。
乙肝是乙型肝炎病毒导致的病毒感染性疾病，该疾病具有病史长、反复发作的特点，由此引发的后遗症甚至能造成肝硬化、肝癌，最后导致死亡。一旦患上乙肝，就很难根治。目前临床没有有限抑制乙肝病毒的药物。抗乙肝药物治疗将是终身的。
临床主要有核苷类和干扰素类药物。干扰素类药物副作用大，长期服用会对身体造成较大的影响。核苷类存在耐药性的问题，例如，治疗乙肝的第一线用药拉米夫定，该药会产生耐药性，且不能完全清除乙肝病毒感染中产生的cccDNA，不能有效治疗乙肝。而中成药产品存在疗效不显著、靶点不清楚等特点，没有市场竞争力。
迄今为止国内没有创新性的乙肝药物投产上市。目前国内的乙肝药物市场被进口药物所占据，价格偏高，一般病人难以承受，长期服用带来的经济问题，也难以解决我国乙肝病就医率低的问题。同时，现有的药物副作用都较大或耐药性显著，长期服用造成较大影响。
本发明可用来治疗乙肝病症。也就是说，本发明的西印度醋栗戊烷酯或酰胺组合物以及药物制剂和组合物显示出显著“抗乙肝病毒活性”，其通过乙肝感染动物模型中病毒复制和肝脏损伤减少得到证明。因此，所述本发明中西印度醋栗戊烷酯或酰胺组合物以及药物配方和组合物应当可用于治疗诸如但不限于以下的病症：乙型肝炎、肝损伤。
本发明的西印度醋栗戊烷酯或酰胺具有8个手性立体中心，因此，西印度醋栗戊烷酯或酰胺可作为外消旋(或非对映异构体)混合物、R和S对映体(或非对映体)混合物或纯对映体(R或S)(或非对映体)而证实具有更好的生物活性。当一种纯对映体显示出更好的生物活性时，即为优对映体(eutomer)，而生物活性较低的该对映体称为劣对映体(distomer)。
本发明的西印度醋栗戊烷酯或酰胺具有3个游离羟基，因此，西印度醋栗戊烷酯或酰胺可作为盐和/或酯而证实具有更好的生物活性和/或更优的代谢参数。
本发明的有效药物制剂和组合物可用来治疗乙肝疾病和病症以及肝损伤疾病和病症。虽然这些药物制备通常用于人患者的治疗，但它们也可以用于治疗其他动物的相似或相同的疾病，所述其他动物例如灵长类动物、家禽(如鸡、鸭、鹅))、农场动物(如猪、牛)、体育用动物(如赛马)和宠物(如狗和猫)。
本发明所述可药用载体包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、蔗糖、葡萄糖、乳糖、果糖、木糖醇、山梨醇、淀粉、淀粉糊、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、氯化钠、糊精、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、植物油、聚乙二醇、无菌磷酸盐缓冲盐水、盐水、林格氏溶液以及它们的组合。
本发明所述可药用盐类包括钠盐、钾盐、锂盐、锌盐、铝盐、钙盐和镁盐。
本发明的所述口服剂型包括但不局限于固体口服剂型(如肠溶衣片、滴丸、口服片、咀嚼片、颗粒剂、粉末或胶囊)或液体口服剂型(如糖浆或酊剂)。此外，本发明中的西印度醋栗戊烷酯或酰胺及其衍生物或组合物还可以添加到食物和饮料中，用于口服施用。此外，本发明中的西印度醋栗戊烷酯或酰胺及其衍生物或组合物也可以配制成口香糖，以促进口服递送和吸收。
本发明所述的非口服剂型包括但不局限于通过注射或其他全身途径给药，所述其它全身途径例如经皮施用或经粘膜施用(例如经鼻、舌下、口含、经阴道或直肠，通过栓剂)。其他施用途径(例如可在兽医应用中使用的)包括肠内和胃肠外递送，包括肌肉、皮下和/或髓内注射，以及鞘内注射、直接脑室注射、静脉内注射、腹膜内注射、鼻内注射或眼球内注射。
本发明涉及的西印度醋栗戊烷酯或酰胺及其衍生物或组合也可与其他药物活性成分联用，以制备其他的新药物组合物。
本发明的西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物或其组合用以缓解上述症状的证实性疗效和治疗相关活性，是通过小鼠动物乙型肝炎病毒感染模型试验和筛选方法进行证实的。
上述本发明西印度醋栗戊烷酯或酰胺或其任意衍生物或其组合的治疗作用、良好的药物代谢参数和通常无毒性使得本发明化合物成为用于治疗上述病症的理想药物。
本发明倍半萜类衍生物的结构式如下所示：
Figure BDA0001583907410000061
Figure BDA0001583907410000071
所述倍半萜类衍生物的制备包括如下步骤：
1、10kg西印度醋栗(Phyllanthus acidus)的根茎经甲醇回流提取三次得浸膏429g，粗提物用5.5L H2O分散，分别用等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，正丁醇萃取层浓缩至干，甲醇溶解，大孔树脂柱Diaion HP20SS柱层析，用CH3OH/H2O(0-100)(V/V％)洗脱，得到5个部分。合并2和3部分，经Sephadex LH20(CH3OH 0-100％)柱层析得到5个部分。合并前两个部分(41.0g)再经正相硅胶柱层析(CHCl3-CH3OH-H2O，9:1:0-7:3:0.5)、反相RP-8(CH3OH 30％-80％)和凝胶树脂柱Toyopearl HW 40C(CH3OH 0-30％)柱反复柱层析以及制备高效液相色谱(CH3CN 15％-30％)得到西印度醋栗酸苷A(phyllanthacidoid A)(10g)和B(phyllanthacidoid B)(1g)。
2、西印度醋栗酸苷A和B(1.27*10-5mol)分别溶于1ml的0.72M碳酸钾水溶液中，60℃温度下水解两个小时生成西印度醋栗酸苷苷元A和B。
3、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量的正戊胺反应12小时生成化合物PA-XY1。
4、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正戊胺反应12小时生成化合物PA-XY2。
5、将PA-XY1或PA-XY2分别溶于2M氢氧化钠溶液中，溶剂为1:1二氧六环和水，70℃下水解6小时，分离纯化得PA-XY3。
6、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正戊醇反应12小时生成化合物PA-XY4。
7、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于1ml的0.72M碳酸钾溶液，常温下与367倍摩尔当量正戊醇反应生成化合物PA-XY5。
8、将PA溶于1ml的2M氢氧化钠溶液中，70℃下水解1小时，除去溶剂，常温下与1倍摩尔当量1-溴代正戊烷反应，分离纯化得PA-XY6。
9、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正己胺反应12小时生成化合物PA-XY7。
10、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正己醇反应12小时生成化合物PA-XY8。
11、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正庚胺反应12小时生成化合物PA-XY9。
12、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正庚醇反应12小时生成化合物PA-XY10。
13、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正辛胺反应12小时生成化合物YHY11。
14、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正辛醇反应12小时生成化合物PA-XY12。
15、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量苯乙胺反应12小时生成化合物PA-XY13。
16、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量苯乙醇反应12小时生成化合物PA-XY14。
17、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量乙氧基丙胺反应12小时生成化合物PA-XY15。
18、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量乙氧基丙醇反应12小时生成化合物PA-XY16。
19、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量异丙氧基丙胺反应12小时生成化合物PA-XY17。
20、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量异丙氧基丙醇反应12小时生成化合物PA-XY18。
21、将西印度醋栗酸苷苷元A溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正己胺反应12小时生成化合物PA-XY19。
22、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正己醇反应12小时生成化合物PA-XY20。
23、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正庚胺反应12小时生成化合物PA-XY21。
24、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正庚醇反应12小时生成化合物PA-XY22。
25、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量正辛胺反应12小时生成化合物YHY23。
26、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量正辛醇反应12小时生成化合物PA-XY24。
27、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量苯乙胺反应12小时生成化合物PA-XY25。
28、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量苯乙醇反应12小时生成化合物PA-XY26。
29、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量乙氧基丙胺反应12小时生成化合物PA-XY27。
30、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量乙氧基丙醇反应12小时生成化合物PA-XY28。
31、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与20倍摩尔当量异丙氧基丙胺反应12小时生成化合物PA-XY29。
32、将西印度醋栗酸苷苷元B溶于有机溶剂，常温下与367倍摩尔当量异丙氧基丙醇反应12小时生成化合物PA-XY30。
以上步骤中，没有特别说明的比例均为摩尔比。
下面以本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1：PA-XY1的合成
步骤(1)：将大约10mg的西印度醋栗酸苷A(phyllanthusol A，PA)置于反应管中，加入1ml的0.72M碳酸钾溶液。溶解后，放入60℃油浴锅，磁力搅拌两个小时，反应至原料消失。用1M的盐酸将溶液中和至酸性，PH值约为2。将溶液加入一定量食盐水至体积约为4.5ml，用4.5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压蒸馏除掉溶剂，得产物；步骤(2)：取步骤(1)中得到的产物10mg溶解于1ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的正戊胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到PA-XY1，产率约为51％。
PA-XY1的波谱数据：ESI-MS:m/z 508[M+H]+；1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.86(ddd,J＝8.8,2.7,2.0Hz,2H,H-16,H-20),6.73(ddd,J＝8.8,2.7,2.0Hz,2H,H-17,H-19),5.12(brd,J＝2.6Hz,1H,H-10),4.01(t,J＝3.2Hz,1H,H-5),3.93(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.79(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.65(s,1H,H-7),3.49(dd,J＝11.1,4.5Hz,1H,H-12b),3.01–2.92(m,2H,H-1'),2.33(ddd,J＝15.1,11.3,5.6Hz,1H,H-3),2.10–2.03(m,1H,H-9a),2.02–1.95(m,2H,H-11,H-9b),1.88(ddd,J＝14.6,11.7,3.2Hz,1H,H-2a),1.69(dt,J＝14.0,5.7Hz,1H,H-4a),1.59(ddd,J＝14.4,5.3,3.5Hz,1H,H-4b),1.46(dt,J＝13.9,9.8Hz,1H,H-2b),1.31(dt,J＝14.8,7.2Hz,2H,H-2'),1.25–1.17(m,2H,H-3'),1.16–1.09(m,2H,H-4'),0.79(t,J＝7.3Hz,3H,H-5'),0.78(d,J＝6.9Hz,3H,H-13)。
实施例2：PA-XY2的合成
步骤(1)：将10mg的西印度醋栗酸苷B(phyllanthusol B,PB)置于反应管中，加入1ml的0.72M碳酸钾溶液。溶解后，放入60℃油浴锅，磁力搅拌两个小时，反应至原料消失。用1M的盐酸将溶液中和至酸性，PH值约为2。将溶液加入一定量食盐水至体积约为4.5ml，用4.5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，减压蒸馏除掉溶剂后，得产物；步骤(2)：取步骤(1)中得到的产物10mg溶解于1ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的正戊胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到PA-XY2，产率约为44％。
PA-XY2的波谱数据：ESI-MS:m/z 514[M+Na]+；1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),5.18(brd,J＝2.6Hz,1H,H-10),4.02(t,J＝3.3Hz,1H,H-5),3.95(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.79(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H,H-1),3.65(s,1H,H-7),3.51(dd,J＝11.1,4.4Hz,1H,H-12b),3.00–2.89(m,2H,H-1'),2.33(ddd,J＝15.1,11.3,5.6Hz,1H,H-3),2.09(dd,J＝14.8,3.2Hz,1H,H-9a),2.05–1.97(m,2H,H-11,H-9b),1.89(ddd,J＝14.7,11.6,3.3Hz,1H,H-2a),1.68(dt,J＝14.0,5.6Hz,1H,H-4a),1.58(ddd,J＝14.4,5.4,3.6Hz,1H,H-4b),1.47(dt,J＝14.0,9.9Hz,1H,H-2b),1.30(dt,J＝14.4,7.2Hz,2H,H-2'),1.24–1.17(m,2H,H-3'),1.12(tdd,J＝9.6,7.0,3.7Hz,2H,H-4'),0.80(t,J＝7.2Hz,3H,H-5'),0.79(d,J＝7.2Hz,3H,H-13)。
实施例3：PA-XY7的合成
将实施例1中步骤(1)得到的产物(原料PA用量约10mg)溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的正己胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为60％。
PA-XY7的波谱数据：ESI-MS:m/z 544[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.94(brd,J＝8.7Hz,2H,H-16,H-20),6.81(brd,J＝8.7Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brd,J＝1.9Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝2.9Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.2,4.5Hz,1H,H-12b),3.05(td,J＝7.1,2.6Hz,2H,H-1'),2.37–2.29(m,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.8,3.0Hz,1H,H-9a),2.11–2.02(m,2H,H-11,H-9b),2.00–1.93(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.8,5.7Hz,1H,H-4a),1.71–1.64(m,1H,H-4b),1.55(dt,J＝13.9,10.0Hz,1H,H-2b),1.42–1.36(m,2H,H-2'),1.35–1.21(m,6H,H-3',H-4',H-5'),0.92–0.84(m,6H,H-6',H-13).
实施例4：PA-XY9的合成
将实施例1中步骤(1)得到的产物(原料PA用量约10mg)溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的庚胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为71％。
PA-XY9的波谱数据：ESI-MS:m/z 572[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.94(brd,J＝8.7Hz,2H,H-16,H-20),6.80(brd,J＝8.7Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brs,1H,H-10),4.09(brs,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.4,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.1,4.2Hz,1H,H-12b),3.05(t,J＝7.0Hz,1H,H-1'),2.41(dq,J＝16.2,5.5Hz,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.7,2.9Hz,1H,H-9a),2.07(dd,J＝14.8,2.4Hz,2H,H-11,H-9b),2.00–1.92(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.7,5.6Hz,1H,H-4a),1.72–1.64(m,1H,H-4b),1.55(dt,J＝13.8,10.0Hz,1H,H-2a),1.40(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H,H-2'),1.35–1.20(m,10H,H-3',H-4',H-5',H-6',H-7'),0.95–0.83(m,6H,H-13,H-8').
实施例5：PA-XY11的合成
将研究实例1中步骤(1)得到的产物(原料PA用量约10mg)溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的辛胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为65％。
PA-XY11的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 536[M+H]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.93(brd,J＝8.8Hz,2H,H-16,H-20),6.79(brd,J＝8.8Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brd,J＝2.2Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝3.1Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.58(dd,J＝11.0,4.5Hz,1H,H-12b),3.05(t,J＝7.1Hz,2H,H-1'),2.48–2.37(m,1H,H-3),2.17–2.11(m,1H,H-9a),2.12–2.03(m,2H,H-11,H-9b),2.01–1.92(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.9,5.6Hz,1H,H-4a),1.68(ddd,J＝14.4,5.2,3.6Hz,1H,H-4b),1.62–1.50(m,1H,H-2a),1.39(dq,J＝14.2,7.1Hz,2H,H-2'),1.36–1.18(m,8H,H-3',H-4',H-5',H-6'),0.94–0.82(m,6H,H-7',H-13).
实施例6：PA-XY13的合成
将实施例1中步骤(1)得到的产品(原料PA用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的苯乙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为74％。
PA-XY13的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 564[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.94(brd,J＝8.7Hz,2H,H-16,H-20),7.22(t,J＝7.4Hz,2H,H-3',H-5'),7.18–7.12(m,3H,H-2',H-4',H-6'),6.82(brd,J＝8.7Hz,2H,H-17,H-19),5.20(brs,1H,H-10),4.08(brs,1H,H-5),4.01(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.86(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H,H-1),3.72(s,1H,H-7),3.58(dd,J＝11.0,4.2Hz,1H,H-12b),3.36–3.24(m,4H,H-8',overlap with methanol),2.69(t,J＝7.3Hz,2H,H-7'),2.37(dq,J＝16.2,5.4Hz,1H,H-3),2.14(dd,J＝14.7,2.9Hz,1H,H-9a),2.11–2.01(m,2H,H-11,H-9b),1.96–1.87(m,1H,H-2a),1.75(dt,J＝13.7,5.5Hz,1H,H-4a),1.68–1.62(m,1H,H-4b),1.51(dt,J＝13.8,10.1Hz,1H,H-2b),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13).
实施例7：PA-XY15的合成
将实施例1中步骤(1)得到的产物(原料PA用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的乙氧基丙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为61％。
PA-XY15的相关波谱数据：1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.95(brd,J＝8.8Hz,2H,H-16,H-20),6.81(brd,J＝8.8Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brd,J＝2.2Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝3.1Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.74(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.1,4.5Hz,1H,H-12b),3.56–3.49(m,1H,H-4'),3.39(t,J＝6.2Hz,2H,H-3'),3.20–3.10(m,1H,H-1'),2.41(qd,J＝11.2,5.6Hz,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.8,3.1Hz,1H,H-9a),2.11–2.03(m,1H,H-11,H-9b),2.01–1.94(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.9,5.7Hz,1H,H-4a),1.72–1.60(m,3H,H-4b,H-2'),1.56(dt,J＝13.9,9.9Hz,1H,H-2a),1.10(dd,J＝6.1,3.4Hz,6H,H-5',H-6'),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13).
实施例8：PA-XY17的合成
将实施例1中步骤(1)得到的产品(原料PA用量约10mg)溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的异丙氧基丙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为60％。
PA-XY17的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 546[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ7.95(brd,J＝8.7Hz,2H,H-16,H-20),6.81(brd,J＝8.7Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brs,1H,H-10),4.10(brs,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.4,5.6Hz,1H,H-1),3.74(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝10.9,4.2Hz,1H,H-12b),3.43(q,J＝7.0Hz,2H,H-4'),3.38(t,J＝6.2Hz,1H,H-3'),3.15(ddq,J＝20.3,13.5,6.9Hz,2H,H-1'),2.41(tt,J＝11.1,5.5Hz,1H,H-3),2.14(dt,J＝10.5,5.3Hz,1H,H-9a),2.11–2.03(m,2H,H-11,H-9b),2.00–1.93(m,1H,H-2a),1.79(dt,J＝13.7,5.6Hz,1H,H-4a),1.72–1.62(m,3H,H-4b,H-2'),1.56(dt,J＝13.8,10.0Hz,1H,H-2b),1.14(t,J＝7.0Hz,3H,H-5'),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13)。
实施例9：PA-XY19的合成
将实施例2中步骤(1)得到的产物(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的正己胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为60％。
PA-XY19的波谱数据：ESI-MS:528[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),5.21(brd,J＝1.9Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝2.9Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.2,4.5Hz,1H,H-12b),3.05(td,J＝7.1,2.6Hz,2H,H-1'),2.37–2.29(m,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.8,3.0Hz,1H,H-9a),2.11–2.02(m,2H,H-11,H-9b),2.00–1.93(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.8,5.7Hz,1H,H-4a),1.71–1.64(m,1H,H-4b),1.55(dt,J＝13.9,10.0Hz,1H,H-2b),1.42–1.36(m,2H,H-2'),1.35–1.21(m,6H,H-3',H-4',H-5'),0.92–0.84(m,6H,H-6',H-13).
实施例10：PA-XY21的合成
将实施例2中步骤(1)得到的产物(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的庚胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为71％。
PA-XY21的波谱数据：ESI-MS:m/z 556[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),,5.21(brs,1H,H-10),4.09(brs,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.4,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.1,4.2Hz,1H,H-12b),3.05(t,J＝7.0Hz,1H,H-1'),2.41(dq,J＝16.2,5.5Hz,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.7,2.9Hz,1H,H-9a),2.07(dd,J＝14.8,2.4Hz,2H,H-11,H-9b),2.00–1.92(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.7,5.6Hz,1H,H-4a),1.72–1.64(m,1H,H-4b),1.55(dt,J＝13.8,10.0Hz,1H,H-2a),1.40(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H,H-2'),1.35–1.20(m,10H,H-3',H-4',H-5',H-6',H-7'),0.95–0.83(m,6H,H-13,H-8').
实施例11：PA-XY23的合成
将研究实例2中步骤(1)得到的产物(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的辛胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为65％。
PA-XY23的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 520[M+H]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),,5.21(brd,J＝2.2Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝3.1Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.73(s,1H,H-7),3.58(dd,J＝11.0,4.5Hz,1H,H-12b),3.05(t,J＝7.1Hz,2H,H-1'),2.48–2.37(m,1H,H-3),2.17–2.11(m,1H,H-9a),2.12–2.03(m,2H,H-11,H-9b),2.01–1.92(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.9,5.6Hz,1H,H-4a),1.68(ddd,J＝14.4,5.2,3.6Hz,1H,H-4b),1.62–1.50(m,1H,H-2a),1.39(dq,J＝14.2,7.1Hz,2H,H-2'),1.36–1.18(m,8H,H-3',H-4',H-5',H-6'),0.94–0.82(m,6H,H-7',H-13).
实施例12：PA-XY25的合成
将实施例2中步骤(1)得到的产品(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的苯乙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为74％。
PA-XY25的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 548[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),,6.82(brd,J＝8.7Hz,2H,H-17,H-19),5.20(brs,1H,H-10),4.08(brs,1H,H-5),4.01(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.86(dd,J＝10.5,5.5Hz,1H,H-1),3.72(s,1H,H-7),3.58(dd,J＝11.0,4.2Hz,1H,H-12b),3.36–3.24(m,4H,H-8',overlap withmethanol),2.69(t,J＝7.3Hz,2H,H-7'),2.37(dq,J＝16.2,5.4Hz,1H,H-3),2.14(dd,J＝14.7,2.9Hz,1H,H-9a),2.11–2.01(m,2H,H-11,H-9b),1.96–1.87(m,1H,H-2a),1.75(dt,J＝13.7,5.5Hz,1H,H-4a),1.68–1.62(m,1H,H-4b),1.51(dt,J＝13.8,10.1Hz,1H,H-2b),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13).
实施例13：PA-XY27的合成
将实施例2中步骤(1)得到的产物(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的乙氧基丙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为61％。
PA-XY27的相关波谱数据：1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),,5.21(brd,J＝2.2Hz,1H,H-10),4.09(t,J＝3.1Hz,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.5,5.6Hz,1H,H-1),3.74(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝11.1,4.5Hz,1H,H-12b),3.56–3.49(m,1H,H-4'),3.39(t,J＝6.2Hz,2H,H-3'),3.20–3.10(m,1H,H-1'),2.41(qd,J＝11.2,5.6Hz,1H,H-3),2.15(dd,J＝14.8,3.1Hz,1H,H-9a),2.11–2.03(m,1H,H-11,H-9b),2.01–1.94(m,1H,H-2a),1.78(dt,J＝13.9,5.7Hz,1H,H-4a),1.72–1.60(m,3H,H-4b,H-2'),1.56(dt,J＝13.9,9.9Hz,1H,H-2a),1.10(dd,J＝6.1,3.4Hz,6H,H-5',H-6'),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13).
实施例14：PA-XY29的合成
将实施例2中步骤(1)得到的产品(原料PB用量约10mg(1倍摩尔当量))溶解于1-1.5ml的3A分子筛干燥后的DMF置于反应管中，加入20倍摩尔当量的异丙氧基丙胺。然后分别加入10倍摩尔当量HOSU、EDCI以及两倍摩尔当量DMAP，常温下反应过夜，以TLC监测原料反应情况，通常在12小时后反应完毕。反应完毕后，反应液加入10％柠檬酸至4-5ml，用5×3ml乙酸乙酯萃取，合并有机相，浓缩，再用大约7ml的二氯甲烷溶解，如有沉淀可加入极少量甲醇助溶(甲醇含量少于5％)，用氨基硅胶分离纯化，得到产品，产率约为60％。
PA-XY29的相关波谱数据：ESI-MS:m/z 530[M+Na]+，1H NMR(600MHz,MeOD)δ8.00(brdd,J＝8.3,1.3Hz,2H,H-16,H-20),7.49(brt,J＝7.4Hz,1H,H-18),7.37(brt,J＝7.8Hz,2H,H-17,H-19),,5.21(brs,1H,H-10),4.10(brs,1H,H-5),4.02(t,J＝11.4Hz,1H,H-12a),3.88(dd,J＝10.4,5.6Hz,1H,H-1),3.74(s,1H,H-7),3.59(dd,J＝10.9,4.2Hz,1H,H-12b),3.43(q,J＝7.0Hz,2H,H-4'),3.38(t,J＝6.2Hz,1H,H-3'),3.15(ddq,J＝20.3,13.5,6.9Hz,2H,H-1'),2.41(tt,J＝11.1,5.5Hz,1H,H-3),2.14(dt,J＝10.5,5.3Hz,1H,H-9a),2.11–2.03(m,2H,H-11,H-9b),2.00–1.93(m,1H,H-2a),1.79(dt,J＝13.7,5.6Hz,1H,H-4a),1.72–1.62(m,3H,H-4b,H-2'),1.56(dt,J＝13.8,10.0Hz,1H,H-2b),1.14(t,J＝7.0Hz,3H,H-5'),0.87(d,J＝6.9Hz,3H,H-13)。
实施例15：抗乙肝病毒体外活性测试
材料与方法：体外细胞模型:HepG2 2.215细胞；Elaisa法检测样品对抗原的抑制阳性药物对照:拉米夫定。
试验过程：药液配制：药物先用DMSO溶解为40mg/mL的母液，临用前用细胞培养液将母液稀释为200、100、50、25和12.5μg/mL五个工作浓度；药物的细胞毒性检测：HepG22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，观察药物对HepG2 2.2.15细胞的毒性。
药物对HBV病毒抑制作用检测：HepG2 2.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用ELISA方法检测样品对HBV表面抗原和e抗原的抑制。结果如下表1所示。其中，如图1，2，3，所示，PA-XY1能显著抑制乙肝病毒表面抗原(图1)和e抗原(图2)，半数抑制率为530nM(图3)。如图4，5，6，所示，PA-XY2也能显著抑制乙肝病毒表面抗原(图4)和e抗原(图5)，半数抑制率为10nM(图6)。
表1
样品编号 IC<sub>50</sub>(μM) TC50 SI
PA-XY1 0.53 >500μM >943
PA-XY2 0.01 >500μM >50000
PA-XY3 10.61 >500μM >47
PA-XY4 28.44 >500μM >18
PA-XY5 13.87 >500μM >36
PA-XY6 16.09 >500μM >31
PA-XY7 17.05 >500μM >29
PA-XY8 31.13 >500μM >16
PA-XY9 15.08 >500μM >33
PA-XY10 40.32 >500μM >12
PA-XY11 9.31 >500μM >53
PA-XY12 23.06 >500μM >21
PA-XY13 14.81 >500μM >34
PA-XY14 35.26 >500μM >14
PA-XY15 28.44 >500μM >18
PA-XY16 52.10 >500μM >10
PA-XY17 47.66 >500μM >10
PA-XY18 76.10 >500μM >6
PA-XY19 1.75 >500μM >286
PA-XY20 3.13 >500μM >159
PA-XY21 1.51 >500μM >331
PA-XY22 4.38 >500μM >114
PA-XY23 0.93 >500μM >537
PA-XY24 3.06 >500μM >163
PA-XY25 1.48 >500μM >337
PA-XY26 3.53 >500μM >174
PA-XY27 2.87 >500μM >174
PA-XY28 10.09 >500μM >49
PA-XY29 7.84 >500μM >64
实施例16：抗乙肝病毒体内活性测试
实验材料：400ug/ml HBV1.2质粒、生理盐水；6-8周龄C57小鼠，
Figure BDA0001583907410000191
，20只
给药方法：每天给药一次，灌胃给药共给药一周；给药剂量：HBV1.2质粒10ug/只，且0.1mg/g小鼠体重；
检测:①时间点：给药2天后
②采血：眼眶取血50ul
③方法：鼠血离心，分离上清，Elisa测HBsAg与HBeAg水平；肝组织切片
实验结果：研究结果表明，与模型组比较，PA-XY1和PA-XY2组及拉米夫定组在20mg/Kg均能显著抑制乙肝病毒，且PA-XY1和PA-XY2组优于拉米夫定组；能有效抑制乙肝病毒感染小鼠血清及肝组织HBsAg，但是不影响HBV-DNA水平，有效保护乙肝病毒对肝脏的损伤。
实施例17：抗乙肝病毒作用机制研究
材料与方法：体外细胞模型:HepG2 2.215细胞；蛋白印迹法法检测样品对肝细胞核因子4α(HNF-4α)的影响。
试验过程：药液配制：药物先用DMSO溶解为40mg/mL的母液，临用前用细胞培养液将母液稀释为200、100、50、25和12.5μg/mL五个工作浓度；药物的细胞毒性检测：HepG22.2.15细胞在96孔细胞培养板中培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，观察药物对HepG2 2.2.15细胞的毒性。
药物对HNF-4α作用检测：HepG2 2.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用蛋白印迹法法检测样品对肝细胞核因子4α(HNF-4α)的影响。
结果：研究结果表明PA-XY1和PA-XY2均能显著下调肝细胞核因子4α(HNF-4α)的表达。其中，如图7所示PA-XY1能显著下调肝细胞核因子4α(HNF-4α)以及乙肝核心抗原(HBcAg)的表达，提示PA-XY1有可能是一种具有新作用机制的治疗慢性乙型肝炎疾病的药物。
实施例18：PA-XY1的急性毒性测试
昆明雌性小鼠，6～8周龄，重量24～31g。饲养室为人工光源，12h明，12h暗。食物为标准饲料，自由饮水。随机选取三只小鼠随机分为3组，同时灌胃服用待测药品，溶剂为10％乙醇/生理盐水；给药剂量分别为：50mg/kg，～300μL，一次给药；500mg\kg，～300μL，一次给药；2000mg/kg。～900ul，分三次给药，间隔3h，每次300μL。观察小鼠皮肤，被毛，眼睛，呼吸，运动，精神状态，黏膜，排泄物等。结果：三组小鼠无毒性反应，无死亡，状态良好，体重增长。随后，再随机选取四只小鼠灌胃服用待测药品，给药剂量为2000mg/kg，～900μL，分三次给药，间隔3h，每次300μL。实验组小鼠无毒性反应，状态良好，实验结束后，全部测试组小鼠加两只正常空白实验小鼠戊巴比妥钠麻醉，冰PBS经心脏灌流，取肝脏，4％多聚甲醛固定。病理切片，研究结果表明，PA-XY1和PA-XY2在2000mg/kg剂量下，不显示急性毒性
实施例19：PA-XY1片剂的制备
PA-XY1 1000g,药用淀粉100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，经整粒机整粒，压片，每片0.30g，口服，每次1-2片，每日两次。
实施例20：PA-XY1胶囊剂的制备
PA-XY1 1000g,药用淀粉100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，经整粒机整粒，装0#胶囊，每粒0.30g，口服，每次1-2粒，每日两次。
实施例21：PA-XY1颗粒剂的制备
PA-XY1粒机整粒，分装即得，口服，每次5g，每日两次
实施例22：PA-XY1饮料的制备
PA-XY1 100g,食用纯净水1000mL，糖粉500g，适当稳定剂和调香剂，混合均匀，，分装即得，口服，每次10mL，每日两次。
实施例23：PA-XY2片剂的制备
PA-XY2 1000g,药用淀粉100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，经整粒机整粒，压片，每片0.30g，口服，每次1-2片，每日两次。
实施例24：PA-XY2胶囊剂的制备
PA-XY2 1000g,药用淀粉100g，混合均匀，用适量乙醇作为粘合剂制粒，干燥，经整粒机整粒，装0#胶囊，每粒0.30g，口服，每次1-2粒，每日两次。
实施例25：PA-XY2颗粒剂的制备
PA-XY2粒机整粒，分装即得，口服，每次5g，每日两次
实施例26：PA-XY2饮料的制备
PA-XY2 100g,食用纯净水1000mL，糖粉500g，适当稳定剂和调香剂，混合均匀，，分装即得，口服，每次10mL，每日两次。

Claims (8)

1.一种倍半萜类衍生物，其特征在于，它具有以下结构式I或IV所示结构：
Figure FDA0002485488760000011
其中，结构式(I)中，R1各自独立地选自苯甲酸酯基、对羟基苯甲酸酯基、氢；结构式(IV)中，R2各自独立地选自正己氨基、正庚氨基、正辛氨基、苯乙氨基。
2.根据权利要求1所述的倍半萜类衍生物，其特征在于，具有结构式I所示结构，其中，R1为苯甲酸酯基或对羟基苯甲酸酯基。
3.一种权利要求1所述倍半萜类衍生物在制备治疗乙肝疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述乙肝疾病为乙型病毒感染型肝炎。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为倍半萜类衍生物与药用载体组合。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述倍半萜类衍生物以治疗有效剂量包含于所述药物中。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗有效剂量足够下调肝细胞核因子4α。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂、非口服给药制剂；所述口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液体；所述非口服给药制剂为注射剂、气雾剂、栓剂。
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