CN101224232A - 葛根总黄酮在防治酒精性肝损伤和肠道损伤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药和保健品领域,具体涉及葛根总黄酮及其在制备防治酒精性肝损伤和肠道损伤药物中的用途。本发明从中药葛根(Radix Puerariae)——豆科(Leguminasae)属植物野葛[Pueraria lobata(Wild.)Ohwi]的根中提取得到葛根总黄酮。按常规方法制成常用制剂,包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。本发明所述的中药组分经动物试验,结果证实,能抑制酒精引起的小肠通透性的增加,降低血液中酒精浓度,减轻酒精引起的肝脏损害。能有效应用于防治酒精性肝损伤和肠道损伤。
Description
技术领域
本发明属中药领域,涉及葛根总黄酮的药用用途,具体涉及葛根总黄酮在制备防治酒精性肝损伤和肠道损伤药物中的用途。
背景技术
酗酒对人类健康和家庭、社会的危害性已是共识。大量饮酒可引起急性酒精中毒。长期酗酒可引起精神障碍、胃肠道损伤、酒精性肝病(alcoholic liverdisease,ALD)。酒精性肝病是常见的慢性肝病,迄今临床缺乏理想的药物防治手段。在欧美国家,酒精性肝病是中青年死亡的主要原因之一,是主要肝脏疾病和研究重点。在我国,随生活水平提高,近年来酒精的人均消耗量有大幅度增长,酒精性肝病的发病率也有增加趋势。因此,积极减轻酒精对人体的危害,防治酒精引起的胃肠道损伤、肝损伤,具有重要的社会和经济意义。
研究已证实,酒精作为一肝脏毒剂,可削弱正常肝细胞的代谢及肝细胞膜的稳定性,损伤线粒体功能等。乙醇进入体内后通过胃肠道吸收,仅有2%~10%由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出,其余90%在肝脏代谢。经肝脏代谢的乙醇经过肝乙醇脱氢酶(ADH)、过氧化氢体分解酶(Cat)和肝微粒体乙醇氧化酶系(MEOS)三条途径氧化为乙醛,乙醛再经过乙醛脱氢酶(ALDH)转化为乙酸,后者以乙酰CoA的形式进入三羧酸循环,氧化成二氧化碳和水。乙醇在代谢过程可使肝内耗氧增加,肝细胞氧化还原反应增高,自由基产生增多,使肝细胞的新陈代谢受到影响。此外,乙醛对于肝脏有直接毒性作用,可使肝细胞内线粒体受损,造成肝细胞损伤及坏死。
近年来,肠源性内毒素及其激活肝枯否细胞产生炎症细胞因子机制是酒精性肝损伤机理的研究热点之一。现已有大量研究阐明了酒精——内毒素——枯否细胞——TNF-α等细胞因子——肝脏炎症这一损伤途径和机制。并发现:长期酒精饮用可致使小肠通透性改变出现“肠渗漏”,这就是血中内毒素升高的重要原因。
另言之,酒精性肝损伤与酒精对肠道功能的损伤有密切的关系。提示抑制酒精引起的肠道损伤,减轻内毒素的肠道渗漏以及酒精的吸收,是预防酒精性肝损伤以及酒精性肝病防治的一个重要环节。
研究还认为,小肠黏膜上皮细胞紧密连接的破坏是酒精诱导的胃肠通透性增加的因素之一。紧密连接由一系列相互作用的蛋白所构成,主要有跨膜蛋白claudin和occludin,另外还有膜的外周蛋白Z0。紧密连接构成了小肠的屏障功能,紧密连接的破坏可导致小肠对有害物质的通透性增加,引起肠黏膜炎症。有研究表明,乙醇通过激活肌球蛋白轻链激酶(MLCK)使细胞间紧密连接发生改变。此外,乙醇代谢过程中产生的乙醛通过抑制酪氨酸磷酸酯酶,引起紧密连结蛋白酪氨酸磷酸化,进而重组细胞间隙处的紧密连接蛋白,破坏细胞间紧密连接,增加细胞通透性。
发明内容
本发明目的在于提供一种“有助解酒”的,即对酒精引起的胃病肠屏障功能的破坏和肝损伤具有保护作用的天然中药组分,涉及中药组分葛根总黄酮的新的药用用途,具体涉及葛根总黄酮在制备防治酒精性肝损伤和肠道损伤药物中的用途。
本发明所述的中药组分葛根总黄酮,从中药药材葛根(Radix Puerariae)-——豆科(Leguminasae)属植物野葛[Pueraria lobata(Wild.)Ohwi]的根中提取。其中主要含有大豆苷(daidzin)、大豆苷原(daidzein)及葛根素(Puerarin)。通过下述方法制备:
葛根原药材经8倍量70%乙醇加热提取三次,1.5h/次,滤液合并后回收溶剂,浓缩成浸膏,并干燥成粉末状,得葛根粗提物;葛根粗提物水溶后过滤,滤液过D101型大孔树脂,用蒸馏水洗脱之色淡,再用70%乙醇洗脱至TLC检测无葛根素斑点为止,收集70%乙醇洗脱液,回收溶剂并蒸干,得葛根总黄酮。得率为3.5%~4.2%;经紫外254nm处测得其总黄酮含量为75%~82%;HPLC测得其葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量分别为50%~62%,8%~15%,3%~6%。
本发明所使用的中药药材质量应符合中国药典2005年版一部相应药材项下各有关规定。
本发明所述的葛根总黄酮经反复动物模型试验,结果证实葛根总黄酮能抑制酒精引起的小肠通透性的增加,减轻内毒素肠渗漏,减轻酒精吸收,降低血液中酒精浓度,减轻酒精引起的肝脏损害。
本发明所述的葛根总黄酮可制成药物制剂,剂型包括颗粒剂、片剂、胶囊剂等口服固体制剂。
附图说明
图1是葛根素、大豆苷及大豆苷元对照品及葛根样品的HPLC色谱图。
其中,A.对照品,B.样品,1.葛根素,2.大豆苷,3.大豆苷元。
图2是慢性酒精造模8周后BAL的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;
数据表示为x±SE,n=8~10;与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起BAL的显著升高(*P<0.05);葛根总黄酮有抑制BAL升高的趋势,其中120mg/kg/d剂量组与模型组相比有显著性差异(#P<0.05)。
图3.慢性酒精造模8周后ALT的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=8~10;与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起ALT的显著升高(*P<0.05);不同剂量的葛根总黄酮显著抑制了ALT的升高(#P<0.05)。
图4.慢性酒精造模8周后AST的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF;葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=10;与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起AST的显著升高(*P<0.05);不同剂量的葛根总黄酮显著抑制AST的升高(#P<0.05)。
图5.慢性酒精造模8周后SOD的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=8~10;与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起了SOD的显著下降(*P<0.05);葛根总黄酮有抑制SOD下降的趋势,其中120mg/kg/d剂量组与模型组相比有显著性差异(#P<0.05)。
图6.慢性酒精造模8周后MDA的变化,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=8~10;与空白对照组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起MDA的显著升高(*P<0.05);不同剂量的葛根总黄酮均显著抑制了MDA的升高(#P<0.05)。
图7.慢性酒精造模8周后肝脏组织病理学变化,
A:空白对照组;B:模型组;C:葛根总黄酮120mg/kg/d组;D:葛根总黄酮40mg/kg/d组;E:慢性酒精造模引起的肝细胞点状坏死伴炎细胞侵润(箭头所指);F:慢性酒精造模引起的肝细胞灶坏死伴炎细胞侵润(箭头所指),H&E,200×。
图8.慢性酒精造模8周后在体小肠通透性的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=6;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起小肠对FD-4通透性的显著升高(P<0.05);葛根总黄酮有效的抑制了在体小肠对FD-4通透性的增加。
图9.慢性酒精造模8周后离体小肠对FD-4的Papp的变化,
其中,Control:空白对照组;Alcohol:模型组;Alcohol+RPF:葛根总黄酮给药组;数据表示为x±SE,n=6;与空白对照组相比,慢性酒精造模引起小肠粘膜FD-4的Papp的显著升高(*P<0.05);不同剂量的葛根总黄酮均有效的抑制了FD-4的Papp的增加(#P<0.05)。
图10.慢性酒精造模8周后小肠组织病理学变化,
其中,A:空白对照组;B:模型组,局部小肠壁粘膜上皮损伤脱落伴炎细胞侵润(箭头所指);C:葛根总黄酮120mg/kg/d组;D:葛根总黄酮40mg/kg/d组,H&E,100×。
图11慢性酒精造模8周后小肠组织紧密连接蛋白ZO-1变化,
其中A:空白对照组;B:模型组;C:葛根总黄酮120mg/kg/d组;D:葛根总黄酮40mg/kg/d组;荧光,200×。
具体实施方式
本发明的目的及有益效果通过下述实验证实。
实施例1 葛根总黄酮的提取分离
A.葛根总黄酮的提取分离
葛根原药材经8倍量70%乙醇加热提取三次,1.5h/次,滤液合并后回收溶剂,浓缩成浸膏,并干燥成粉末状,得葛根粗提物。葛根粗提物水溶后过滤,滤液过D101型大孔树脂,用蒸馏水洗脱之色淡,再用70%乙醇洗脱至TLC检测无葛根素斑点为止,收集70%乙醇洗脱液,回收溶剂并蒸干,得葛根总黄酮。得率为3.98%。
B.含量测定
紫外254nm处测得其总黄酮含量为80.39%。HPLC测得其葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量分别为58.93%,11.16%,4.91%。葛根素、大豆苷及大豆苷元对照品及葛根样品的HPLC色谱图见附图1。
实施例2 葛根总黄酮的提取分离
A.重复提取分离葛根总黄酮
葛根原药材经8倍量70%乙醇加热提取三次,1.5h/次,滤液合并后回收溶剂,浓缩成浸膏,并干燥成粉末状,得葛根粗提物。葛根粗提物水溶后过滤,滤液过D101型大孔树脂,用蒸馏水洗脱之色淡,再用70%乙醇洗脱至TLC检测无葛根素斑点为止,收集70%乙醇洗脱液,回收溶剂并蒸干,得葛根总黄酮。得率分别为3.5%,4.2%。
B.含量测定
紫外254nm处测得其总黄酮含量分别为75%,82%。HPLC测得其葛根素含量分别为50%,62%;、大豆苷含量分别为8%,15%;大豆苷元的含量分别为3%,6%。
实施例3
葛根总黄酮对酒精引起的大鼠小肠通透性增加及其肝损伤的防治作用实验
1方法:
1)酒精性肝损伤模型和实验分组:Wistar雄性大鼠250g左右,随机分为4组。A组(模型组):灌胃56度白酒,酒精初始剂量为5g/kg/d,1周内逐渐增加到10g/kg/d,2次/d,并维持7周。B组(空白对照组):灌胃等热量葡萄糖水溶液,2次/d,共8周。C组:在A组基础上灌胃葛根总黄酮120mg/kg/天,2次/d,共8周。D组:在A组基础上同时灌胃葛根总黄酮40mg/kg/天,2次/d,共8周。造模期间,所有动物给予糊状普通饲料灌胃(10g/kg/d),除此之外自由饮水和进食。
2)生化检测:取血清检测血液酒精浓度(BAL)、血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性。
3)肝组织和小肠病理组织学观察:HE染色。
4)在体大鼠小肠通透性的测定:动物造模结束后,禁食过夜,戊巴比妥钠麻醉(45mg/kg,i.p),颈静脉插管用于采集血样。沿腹中线切开,结扎回肠末端,并结扎双侧肾蒂,自回肠末端插管注入含有0.4mg/ml FITC-dextran 4,400(FD-4)的台氏液(50ml/kg),接着缝合腹部。在注入FD-4后0、15、30、60、90、120分钟取血样,用PBS稀释100倍,荧光法测定血样中FD-4含量,小肠粘膜通透性用由肠腔进入血液的FD-4量表示。
5)离体大鼠小肠通透性的测定:动物造模结束后,麻醉并打开腹腔,从回盲交点处向上5cm开始取长约2cm的回肠一段,置于4℃的Krebs-Ringer缓冲液(mM),将肌层和上皮下层结缔组织分离干净,保留粘膜层,剪成0.5cm面积,固定在Ussing型灌流槽(P2300型,生理仪器公司,美国)中。灌流槽分左右两腔,粘膜上皮的顶膜浸在左腔的溶液中,基侧膜浸在右腔溶液中,两腔互不相通。回肠上皮单层两侧灌流Krebs-Ringer液,在电压钳(VCCMC-2电压钳,生理仪器公司,美国)条件下,一根Ag-AgCl电极置于下腔作为引导电极,另一根Ag-AgCl电极置于左腔作为参考电极,从置于右腔的引导电极记录跨上皮电压(Vte)。粘膜上皮在Ussing型灌流槽中平衡30分钟,向粘膜槽侧加入0.1mg/ml的FD-4,在加入FD-4后的0、15、30、60、90、120分钟,从基侧侧抽取200μlKBR,通过荧光法测定KRB中FD-4含量。小肠上皮粘膜通透性由FD-4的通透性系数(Papp)表示,Papp=dQ/dt/AC,在此,dQ/dt为FD-4转运通过上皮单层速率,A是整个上皮的面积,C是左腔内FD-4的初始浓度。
6)小肠组织紧密连接蛋白ZO-1变化观察:动物处死后取下一段回肠,漂洗,置入含有4%多聚甲醛(paraformaldehyde)和2mM EGTA的PBS中,在4℃下,固定6小时。组织经PBS-EGTA漂洗,在含有2mM EGTA和0.6M蔗糖(sucrose)的PBS中,4℃下震荡过夜,然后,组织用OCT复合物包埋。将切片(5mm)固定在涂有多聚-1-赖氨酸(Poly-1-lysine)的载波片上,在-20℃下,用丙酮(acetone)脱水2分钟,并在含有2mM EGTA的PBS(PBS-EGTA)中漂洗,切片用1∶20稀释的抗ZO-1抗体标记,随后,用1∶30稀释的二抗-兔-IgG生物素抗体以及1∶20稀释的FITC-streptavidin孵育。载玻片用含有60%甘油PBS、0.4%丙基没食子酸酯(n-propylgallate)封片,通过荧光显微镜观察紧密连接蛋白ZO-1的变化。
7)统计分析:全部实验结果均以均数±标准误(x±SE)表示。用student t-检验比较两组间数据的显著性差异,用one way ANOVA检验比较多组间数据的显著性差异,P<0.05,表示差异有显著性意义。
2结果
1)葛根总黄酮降低血液中酒精浓度:
动物酒精灌胃8周后(末次给酒后1h检测),BAL显著升高(426±60.6mg/100ml)。葛根总黄酮能剂量依赖性的抑制BAL的升高(分别为331±25.1与404±39.7mg/100ml)。表明葛根总黄酮有抑制酒精吸收的作用。(见附图2)
2)葛根总黄酮减轻酒精引起的肝损伤
空白对照组ALT和AST分别为45.1±2.89与70.9±2.73U/ml,慢性酒精造模升高ALT、AST约2倍。葛根总黄酮能剂量依赖性的降低酒精引起的ALT与AST的升高(见附图3、4)。造模后血清SOD活性和MDA含量的变化。空白对照组SOD和MDA分别为341±10.6U/ml与8.62±0.55mol/l,慢性酒精造模引起了SOD的下降(288±9.57U/ml)和MDA的显著升高(15.3±2.12mol/l),同时给予不同剂量的葛根总黄酮后,SOD和MDA的变化等到了不同程度的改善,其中剂量为120mg/kg/d时效果较为显著。(见附图5、6)
慢性酒精造模引起的肝脏组织病理学变化主要为不同程度的空泡状脂肪变性(如图7B),小叶各带出现轻微的炎症和点状坏死(如图7E),个别出现灶状坏死(如图7F)。空白对照组的肝脏未出现异常(如图7A)。不同剂量的葛根总黄酮均能显著改善酒精引起的肝脏损伤,减少脂肪变性,减轻炎症和坏死(如图7C、7D)。
3)葛根总黄酮抑制酒精引起的大鼠小肠通透性的增加
在体实验观察显示,模型组大鼠小肠对FD-4的通透性较空白组显著增加,在30分钟内增加为空白对照组的5倍。葛根总黄酮能剂量依赖性地抑制酒精引起的大鼠小肠通透性地增加。(见附图8)
离体实验显示,120min内正常对照组FD-4的Papp为(1.46±0.19)×10-7cm/sec,模型组小肠粘膜对FD-4的通透性较空白对照组显著增加,Papp增加为空白对照组的2.5倍,葛根总黄酮能剂量依赖性地降低FD-4的Papp(P<0.05)。见附图9。
4)葛根总黄酮对酒精引起的小肠组织病理学改变的影响
空白对照组小肠组织未出现异常。慢性酒精造模引起了小肠轻微的组织学病变,主要为小肠组织局部粘膜上皮损伤脱落和炎细胞侵润,粘膜下层未出现水肿、溃疡等严重损伤。给予不同剂量的葛根总黄酮后,小肠损伤程度有减轻趋势。见附图10。
5)葛根总黄酮对小肠紧密连接蛋白ZO-1的影响
通过对紧密连接蛋白ZO-1进行免疫荧光标记,可以观察出酒精对小肠紧密连接的损害。如图11所示,正常对照组肠上皮细胞外围的紧密连接蛋白ZO-1呈现出连续的环状。8周的酒精造模后,ZO-1蛋白几乎被完全破坏,且不规则的分散在细胞外围。与模型组比较,葛根总黄酮给药组中ZO-1蛋白仅被局部的破坏,损伤程度较模型组有较为明显的减轻。
Claims (6)
1.葛根总黄酮在制备治疗酒精性肝损伤和肠道损伤药物中的用途。
2.葛根总黄酮在制备预防酒精性肝损伤和肠道损伤药物中的用途。
3.葛根总黄酮在制备解酒保健制剂中的用途。
4.葛根总黄酮在制备治疗酒精性肝病药物中的用途。
5.权利要求1或2或3或4的用途,其特征是所述的葛根总黄酮其紫外254nm处测得的总黄酮含量为75%~82%;HPLC测得其葛根素、大豆苷及大豆苷元的含量分别为50%~62%,8%~15%,3%~6%。
6.按权利要求5的用途,其特征是所述的葛根总黄酮通过下述方法制备:
葛根原药材经8倍量70%乙醇加热提取三次,1.5h/次,滤液合并后回收溶剂,浓缩成浸膏,并干燥成粉末状,得葛根粗提物;葛根粗提物水溶后过滤,滤液过D101型大孔树脂,用蒸馏水洗脱之色淡,再用70%乙醇洗脱至TLC检测无葛根素斑点为止,收集70%乙醇洗脱液,回收溶剂并蒸干,得葛根总黄酮。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080723 |