CN114767730A - 葛根提取物在防治肠道菌群紊乱中的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及葛根提取物在制备预防和/或治疗酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂中的应用，以及其在提升有益菌的丰度，降低有害菌的丰度的应用。本发明所述葛根提取物具有抑制酒精造成的肠道紊乱，调节酒精性肠道稳态，恢复肠道菌群物种多样性，增加益生菌含量的效果。

Description

葛根提取物在防治肠道菌群紊乱中的新应用

技术领域

本发明属于中药领域，具体是涉及葛根提取物在防治肠道菌群紊乱中的新应用。

背景技术

葛根(Puerariae Lobatae Radix)是豆科植物野葛Pueraria lobata(willd.)Ohwi的干燥根，《中国药典》记载其性甘、辛、凉，具有解酒毒、生津止渴、通筋活络、解肌退热等功能。《药鉴》记载葛根能“解中酒之苛毒,治往来之温疟”。《药性论》描述葛根“主解酒毒，止烦渴”。因其具有护肝、抗炎、抗氧化、降血糖、降血脂等多种功效，自古以来就被用于治疗酒毒、伤寒等病症。葛根也是国家卫健委批准的药食同源物质，民间常将其制成葛根茶、葛粉粥等用于醒酒健胃、清心醒脾的日常保健。

现代医学对葛根的化学成分、药理作用及安全性等进行了许多研究。成分分析发现，葛根的化学成分主要有异黄酮类、三萜类、香豆素类、生物碱类等4 类，其中异黄酮类中的葛根素、大豆苷、大豆苷元是葛根中的主要有效成分，葛根素是葛根的特有成分，也是中药材主要使用的原料；药理作用研究发现葛根具有护肝、抗炎、降血糖、降血脂、降血压等多种作用。在解酒护肝方面，葛根处理能够使在乙醇代谢过程中发挥重要作用的乙醛脱氢酶(ALDH)活性升高，促进酒精代谢，也能使酒精性肝损伤小鼠血清中的ALT、AST含量降低，改善肝细胞排列紊乱、脂滴蓄积、炎细胞浸润等现象；葛根素能使酒精性肝损伤小鼠血清中TG、ALT、AST下降，能抑制乙醛刺激导致的肝星状细胞(HSC)激活，抑制乙醛诱导的HSC凋亡，从而表现出对抗肝损伤作用；毒理学实验表明，葛根的小鼠经口LD₅₀＞21.5g/kg BW，属于实际无毒级物质，致突变性实验显示葛根未引起哺乳动物体细胞、生殖细胞和细菌基因突变，亚慢性毒性试验和长期毒性试验也确认了葛根的安全性。

生物屏障是指肠道中对外来菌株有定植抵抗作用的正常寄生菌群，正常成人肠道中存在大量细菌。近年来的许多研究表明，过量乙醇摄入可导致肠道机械屏障破坏和肠道菌群结构失调。由于疾病的发展原理和治疗方案的复杂性，尽管葛根提取物有着解酒护肝的作用，但其对酒精造成的肠道菌群紊乱是否具有作用并不清楚明了。

发明内容

基于此，本发明的目的之一是提供葛根提取物在防治肠道菌群紊乱中的新应用。

包括技术方案如下：

葛根提取物在制备防治酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂中的应用。

葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中提升乳杆菌属丰度的制剂中的应用。

葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中降低萨特氏菌丰度的制剂中的应用。

葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中提升臭杆菌、瘤胃球菌属和/ 或颤螺菌属丰度的制剂中的应用。

葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中降低别样棒菌属丰度的制剂中的应用。

在其中一些实施例中，所述葛根提取物是葛根的水提物，进一步，所述葛根提取物通过以下方法制备得到：将葛根粉碎，加入葛根重量7-9倍量的水，进行提取1.2-1.8小时，提取温度为98±2℃，过滤得提取液：再重复两或三次，收集滤液，浓缩，喷雾干燥。

在其中一些优选的实施例中，喷雾干燥时的进风温度为140-180℃，出风温度为75-85℃；和/或加入葛根重量8倍量的水，进行提取1.5小时，重复两次。

在其中一些实施例中，所述制剂是药物或者食品或者保健品。

在其中一些实施例中，所述制剂是片剂，粉剂，或者水剂，或者膏剂。

在其中一些实施例中，所述防治酒精引起的肠道菌群紊乱包括：调节肠道微生态。

在其中一些实施例中，所述调节肠道微生态包括促进肠道有益菌生长，抑制肠道有害菌繁殖，恢复肠道菌群物种多样性。

本发明的另一目的是提供一种防治酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂。

一种防治酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂，其活性成分包括葛根提取物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明以葛根提取物(水提物)为研究对象，建立小鼠酒精性肝损伤模型，研究中发现：本发明的葛根提取物具有抑制酒精造成的肠道紊乱，调节酒精性肠道稳态的效果，且能恢复酒精性肠道菌群的物种多样性，增加益生菌(乳杆菌)含量，抑制有害菌繁殖。本发明所述葛根提取物对酒精造成的肠道菌群紊乱具有预防和治疗作用，以及用于酒精引起的肠道菌群紊乱中提升有益菌的丰度，降低有害菌的丰度的应用。

附图说明

图1实验动物体重变化趋势图。

图2实验动物肝重及肝脏系数。

图3葛根提取物对肝功能指标的影响。

图4葛根提取物对氧化应激指标的影响。

图5小鼠门水平物种组成及F/B值。

图6属水平上组成变化具有统计学意义的物种。

图7肠道菌群LefSE分析图；其中,A为肠道菌群进化分支图，B为具有统计学差异的生物标志物。

图8小鼠肠道菌群alpha多样性指标。

图9小鼠肠道菌群PLS-DA分析。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明的发明人通过在酒精性肝损伤动物模型研究葛根提取物的时候，发现葛根提取物具有肝损伤保护作用，还能调节肠道稳态，恢复肠道菌群物种多样性，增加益生菌含量。将葛根提取物制备成药物或者食品或者保健品等制剂，无论是片剂，粉剂，或者水剂，或者是膏剂，都可以用于防治酒精引起的肠道菌群紊乱。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1材料与方法

1.1实验动物

SPF级雌性C57BL/6J小鼠，共48只，体重18g左右，购于广东省医学实验动物中心，所有小鼠均属同一批次(出生日期同一天)。实验动物生产许可证号：SYXK(粤)2018-0002。实验动物饲养于SPF级动物房，采用12h光照/黑暗周期，室温22℃-26℃，相对湿度40％-70％，检疫5d后使用。动物实验通过伦理委员会审批。实验室动物的管理参照《良好实验室规范》(Good Laboratory Practice,GLP)的要求。

1.2受试物及其制备

葛根提取物，以葛根(Pueraria Lobata)的根部为原材料，使用水作为提取溶剂在适当的温度和提取时间下提取得到的黄棕色精细粉末，提取比例10:1，即1g粉末相当于10g生药。

动物实验中，受试物每日现配现用。准确称量250mg(750mg)葛根提取物粉末溶解于超纯水中，定容至10ml，充分混匀后得到动物灌胃所需的低剂量葛根提取物溶液(25mg/ml)和高剂量葛根提取物溶液(75mg/ml)。

以下实验中所用葛根提取物的具体提取方法，包括如下步骤：

将葛根粉碎，加入葛根重量8倍量的水，进行提取1.5小时，提取温度为98 ±2℃，过滤得提取液：再重复两次，收集滤液，浓缩，喷雾干燥(进风温度： 140-180℃和出风温度：75-85℃)。

CPP点，按要求进行粉碎或超微粉碎，过100目，95％通过80目标准筛，采用振动筛+磁力棒或金属探测器，磁力棒磁场强度不低于10000高斯，金检精度不低于(铁：≤2.0mm、非铁：≤2.0mm、不锈钢：≤2.0mm)。

1.3主要试剂耗材与仪器设备

1.3.1主要试剂耗材

1.3.2主要仪器设备

1.4实验方法

1.4.1酒精性肝损伤动物模型的建立

将小鼠随机分为对照组、模型组(31.5％乙醇)、乙醇+葛根提取物低剂量组(250mg/kg BW)、乙醇+葛根提取物高剂量组(750mg/kg BW)。酒精性肝损伤模型的建立共包括2个阶段，即给予实验动物连续14天的乙醇(31.5％乙醇， 0.1ml/10g BW)灌胃及实验结束前的一次乙醇(31.5％乙醇，0.2ml/10g BW) 灌胃冲击(乙醇冲击剂量参考美国国家酒精滥用和成瘾问题研究所(NIAAA)的方案)。

建模期间，每日上午9:30，对照组及乙醇模型组小鼠按体重灌胃超纯水，乙醇+葛根提取物低剂量组、乙醇+葛根提取物高剂量组小鼠灌胃相应浓度的葛根提取物水溶液；每日下午2：30，除对照组小鼠外，各组小鼠按体重灌胃31.5％乙醇，对照组小鼠灌胃超纯水。第14天灌胃结束后，当晚20:00断粮，次日早 7:00，除对照组小鼠外，其余组小鼠给予一次31.5％乙醇(0.2ml/10g BW)灌胃冲击，对照组小鼠给予同等容量超纯水灌胃。

1.4.2样本收集

提前高压纱布、棉签、镊子、冻存管适量，备好干冰。建模期第14天早上8:30进入动物房(所有材料紫外照射30分钟后进入)。将纱布铺于工作台，用棉签刺激小鼠肛周促使小鼠自然排便，用冻存管接收排出粪便，冻存管标记好鼠号后放入干冰暂存。所有小鼠粪便采集完成后放-80℃冰箱保存。

实验最后一天，乙醇灌胃2小时后，麻醉动物解剖取材。

取小鼠腹主动脉血，血浆3000r/min离心15min，分离得血清样本；采血完成后，分离小鼠肝脏。称重记录后，切分成适宜小块，分装于冻存管，液氮冰冻；待解剖实验结束后，所有样品做好记录，从液氮中转移至-80℃冰箱保存。

1.4.3肝脏系数计算与肝功能指标检测

称量小鼠肝脏总重量，按照公式“肝脏系数＝肝总重量(g)/空腹体重(g) ×100％”计算小鼠肝脏系数；使用全自动生化仪检测血清样本中以下肝功能指标：乙醇(EtOH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬门氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CK)。

1.4.4肝脏氧化应激指标检测

1)肝组织蛋白含量测定。将-80℃冰箱中保存的肝组织转移到1.5ml EP管中，管中按比例(组织重量：匀浆液＝1:10)加入4℃预冷的PBS以及3颗匀浆钢珠，全自动匀浆机中充分匀浆20s后，匀浆液置于4℃预冷的冰冻离心机 12000r/min离心10min，弃去沉淀物，收集澄清上清液作为待测样品，取部分样品用BCA法进行蛋白含量测定，其余样品留做他用。蛋白含量测定方法按说明书指示进行，具体步骤如下：①制备标准品。将一安瓿的BSA标准品使用PBS 稀释到1.5ml EP管中，得到终浓度为2000、1500、1000、750、500、250、125、 25、0μg/ml的标准品溶液。②制备BCA工作液。根据待测样品数量、标准品个数以及复孔个数，计算所需的工作液总体积，将50份BCA试剂A与1份BCA试剂B混合，制备适量的工作液。③进行反应检测。在布局过的96孔板中加入稀释的标准品与样品，加入BCA工作液，在酶标仪中震荡30s以使其充分混合，然后37℃下孵育30min。待其冷却至室温后，在562nm处测定其吸光度，绘制标准曲线，计算蛋白样本浓度。

2)超氧化物歧化酶(SOD)活性检测。测定方法按说明书指示进行，具体步骤如下(该步骤所使用的样品为20倍稀释液)：①配制WST-8/酶工作液。按照每个反应160μL的体积，分别加入SOD检测缓冲液151μL，WST-8 8μL，酶溶液1μL。根据待测样品数量配制适量WST-8/酶工作液。②配制反应启动工作液。按照每1μL反应启动页(40X)加入39μL SOD缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。根据待测样品的数量，配制适量的反应启动工作液，现配现用。③所需溶液配制完成后，按表1所示使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔，依次加入待测样品和其他各种溶液。

表1 SOD酶活性检测加样表

37℃孵育30min，在450nm处测定吸光度。参考以下公式计算抑制百分率：

抑制百分率＝[(A_{空白对照1}-A_{空白对照2})-(A_样品-A_{空白对照3})]/(A_{空白对照1}-A_{空白对照2})*100％样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1-抑制百分率)units

最后根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD活力单位换算为U/mg prot。

3)丙二醛(MDA)含量检测。测定方法按说明书指示进行，具体步骤如下：定方法按说明书指示进行，具体步骤如下：①配制MDA检测工作液。称取适量 TBA，用TBA配置液配制成浓度为.0.37％的TBA储存液，储存液较难溶解，需加热到70℃，并通过剧烈涡旋促进溶解。一次检测所需的MDA检测工作液配方含有150μLTBA稀释液、50μLTBA储存液和3μL抗氧化剂。根据待测样品数量配制适量MDA检测工作液。②标准品的稀释。取适量标准品用超纯水稀释至0、1、 2、5、10、20、50μM，用于后续只做标准曲线。③样品测定。在1.5ml EP管中加入100μL PBS作为空白对照，加入100μL上述不同浓度的标准品用于制作标准曲线，加入100μL样品用于测定，随后每管加入200μL MDA检测工作液。反应体系充分混匀，100℃金属浴15min，然后冷却至室温(25℃)，1000g 室温离心10min，取200μL上清至96孔板，用酶标仪测定532nm处的吸光度。最后根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度，并用单位重量的蛋白含量来表示最初样品中的MDA含量(μmol/mg protein)。

1.4.5肠道菌群检测

将-80℃冰箱中冻存的小鼠粪便送华大基因公司进行16S-rDNA肠道菌群分析。经过样品制备、核酸质检、PCR扩增、产物纯化、文库质检等流程后，即可使用 HiSeq平台进行测序(测序区域：16S-V4)，下机数据按窗口去低质量、去除接头污染reads、含N reads及低复杂度reads，获得过滤后高质量clean data.使用软件FLASH，通过reads之间的overlap关系将reads拼接Tags(拼接条件：最小匹配长度15bp，重叠区域允许错配率0.1)，将Tags聚类成OTU并与数据库比对、物种注释(注释数据库：GreenGene)，基于OTU和注释结果进行样品物种复杂度分析、组间物种差异分析等，获得各组小鼠肠道菌群结构变化信息。

1.4.6肝脏RNA-Seq分析

在对照组、乙醇模型组、乙醇+葛根提取物高剂量组小鼠冻存的肝样品中，每组随机抽取3份肝样品送华大基因公司进行RNA-Seq分析，通过DNBSEQ平台测序，对原始数据过滤得到clean reads后，使用Bowtie2软件将clean reads 比对到参考基因序列上，使用RSEM软件计算各个样品的基因表达量，使用DEseq2 方法检测各组差异表达基因(DEGs)，通过GO分类和KEGG生物通路富集分析，筛选出与葛根护肝作用相关的信号通路。

1.5统计学分析

实验数据使用SPSS 25.0软件进行整理分析，使用GraphPad Prism 8.0.2 软件作图。定量资料用均数±标准差(mean±SD)进行统计描述，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比较时采用LSD检验；若数据不满足正态分布或方差齐性，两组间比较采用近似t检验或Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，多重比较采用秩和检验两两比较；定性资料用频数和率进行统计描述，使用非参数检验进行组间差异比较。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2实验结果

2.1一般情况

实验过程中未见动物死亡。各组小鼠毛发光泽；对照组小鼠行动正常、精神状态良好，其余组小鼠乙醇灌胃后出现轻微的醉酒步态、嗜睡等现象，但很快就恢复。

2.2实验动物体重变化

建模期间，每两天称量1次小鼠体重。为期14天的实验过程中，各个时间点，各组小鼠之间的体重差异均无统计学意义(P＞0.05)。实验动物体重变化见图1。

2.3葛根提取物对肝脏系数和肝功能指标的影响

按照公式“肝脏系数％＝肝重(g)/空腹体重(g)×100％”计算肝脏系数，结果见图2、表2。各组小鼠空腹体重差异均无统计学意义(P＞0.05)。

与对照组相比，模型组小鼠的肝重与肝脏系数显著增加(P＜0.05)；与模型组相比，两个乙醇+葛根提取物剂量组小鼠的肝重与肝脏系数虽无统计学差异，但呈下降趋势。上述现象表明乙醇模型组小鼠肝脏可能出现了肝肿大等现象，导致肝重增加；而葛根提取物对酒精引起的肝脏损伤有一定的保护作用。

表2小鼠肝重和肝脏系数变化(

n＝12)

#表示模型组与对照组间差异有统计学意义，P＜0.05

与对照组相比，模型组小鼠血清中LDH、ALT及EtOH含量显著增加(P<0.05)；与模型组相比，乙醇+葛根提取物两个剂量组的小鼠血清中ALT、AST、LDH含量显著降低(P<0.05)，各组小鼠血清中的CK含量差异无统计学意义，结果见图 3、表3。

表3葛根提取物对小鼠肝功能生化指标的影响

#表示模型组与对照组间差异具有统计学意义，P＜0.05，*表示葛根提取物剂量组与模型组间差异具有统计学意义，P＜0.05.

2.4葛根提取物对氧化应激指标的影响

使用相应试剂盒测定的肝组织中SOD酶活力及MDA含量是根据样品的蛋白浓度和稀释倍数换算过的结果，如图4、表4。与对照组相比，模型组小鼠肝脏中 MDA含量显著升高(P＜0.05)，与模型组相比，乙醇+葛根提取物高剂量组小鼠肝脏中MDA含量显著下降(P＜0.05)；与模型组相比，乙醇+葛根提取物高剂量组小鼠肝脏中SOD酶含量显著增加(P＜0.05)。

表4葛根提取物对氧化应激指标的影响(

n＝12)

#表示模型组与对照组间差异有统计学意义，P＜0.05，*表示葛根提取物剂量组与模型组间差异具有统计学意义，P＜0.05.

2.5葛根提取物对肠道菌群结构的影响

2.5.1物种分析

2.5.1.1物种组成。

得到OTU代表序列后，将其与Greengene数据库比对进行物种注释。

门水平上，各组小鼠肠道菌群均以拟杆菌门(Bacteroidetes)，厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为主要组成成分，占全部肠道菌群组成的96％以上。与对照组相比，模型组厚壁菌门丰度显著降低，拟杆菌门与疣微菌门丰度显著增加，葛根提取物处理后，上述现象表现出恢复趋势。厚壁菌门与拟杆菌门的比值(F/B)常被用作提示肠道菌群失调的指标，与对照组相比，模型组F/B值显著降低(P<0.05)，与模型组相比，葛根提取物高剂量组的F/B值表现出回升趋势(见表5、图5)。

表5门水平物种组成及丰度(％)

物种	对照组	模型组	高剂量组
				变形菌门	15.9918±7.0287	10.7048±7.5404	8.1886±6.2779
厚壁菌门	33.5984±9.9361	17.3864±9.8108<sup>#</sup>	20.3023±10.1665
				拟杆菌门	48.8154±12.6388	68.5821±14.9482<sup>#</sup>	68.5495±12.9741
疣微菌门	0.5330±0.9667	2.5987±1.3876<sup>#</sup>	1.9847±2.3303
				F/B值	76.8033±37.0508	23.2843±15.6540<sup>#</sup>	33.2595±22.6331
其他	1.0415±0.4538	0.7279±0.2083	0.9750±0.3415

属水平上，将物种丰度在所有样品均低于0.5％的物种和该分类水平未注释到的全部合并成Others后，结果显示肠道菌群共注释到13个属，其中7个属具有统计学意义和生物学意义(见表6、图6)。与对照组相比，模型组的臭杆菌 (Odoribacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、颤螺菌属(Oscillospira) 丰度显著降低，别样棒菌属(Allobaculum)、萨特氏菌(Sutterella)、阿克曼氏菌(Akkermansia)丰度显著增加；与模型组相比，葛根提取物高剂量组的乳杆菌属(Lactobacillus)丰度显著增加，其余菌属丰度向对照组方向回复。

表6属水平上组成变化具有统计学意义的物种组成及丰度(％)

2.5.1.2LEfSe分析

LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size，线性判别分析)即 LDAEffect Size分析，可用于区别两个或两个以上生物类群，发现各比较组中起到重要作用的微生物群，即生物标志物(Biomarker)。与仅仅从物种组成数量(丰度)这一角度出发的物种丰度分析不同，LEfSe分析首先使用非参数 Kruskal-Wallis秩和检验寻找组间丰度差异显著的物种，然后使用Wilcoxon秩和检验判定上一步的差异物种在不同组间子分组中的差异一致性，最后采用线性判别回归(LDA)估测每个物种丰度对差异效果的贡献。本实验使用LEfSe软件对各组肠道菌群微生物进行分析，并展示了LDA值大于2的显著差异物种(即具有统计学差异的生物标志物，见图7-B)。

由图7-A的肠道菌群进化分支图(Cladogram)可知，各组肠道菌群在各个生物分类水平上都存在较大差异。在门水平上，疣微菌门(Verrucomicrobia) 是乙醇模型组区别于对照组和葛根提取物高剂量组的重要门水平生物标志物，阿克曼氏菌(Akkermansia)、萨特氏菌(Sutterella)、别样棒菌属(Allobaculum)、双歧杆菌(Bifidobacterium)是属水平上的重要生物标志物。而放线菌门 (Actinobacteria)及乳杆菌目(Lactobacillales)、乳杆菌科 (Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)等则是葛根提取物高剂量组区别于其他两组的生物标志物。

2.5.2多样性分析

2.5.2.1 Alpha多样性

Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，常用指标包括Sobs、 Chao、Ace、Shannon、Simpson指数。如表7、图8所示，与对照组相比，模型组Shannon指数显著降低(P＜0.05)，Simpson指数显著增高(P＜0.05)，表明模型组肠道菌群的物种多样性降低，葛根提取物处理后，Simpson指数显著降低，表明葛根提取物具有恢复肠道菌群多样性的作用。

表7小鼠肠道菌群alpha多样性指标(

n＝10)

2.5.2.2 Beta多样性

Beta多样性分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小。本次实验使用β多样性分析方法中的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)样品间的肠道菌群组成差异(如图9),三组样品点显著聚集成三个类群，对照组和模型组、模型组与葛根提取物高剂量组两两分析的结果提示，这三组之间肠道菌群组成均存在明显差异。

总结分析如下：

实验过程中未见动物死亡。各组小鼠毛发光泽；对照组小鼠行动正常、精神状态良好，其余组小鼠乙醇灌胃后出现轻微的醉酒步态、嗜睡等现象，但很快就恢复。

与对照组相比，模型组小鼠血清中ALT、LDH及EtOH含量显著增加；与模型组相比，乙醇+葛根提取物两个剂量组的小鼠血清中ALT、AST、LDH含量显著降低。这表明乙醇造成小鼠肝功能损伤，而葛根提取物对此具有改善作用。

与对照组相比，模型组小鼠的肝重与肝脏系数显著增加(P＜0.05)；与模型组相比，两个乙醇+葛根提取物剂量组小鼠的肝重与肝脏系数虽无统计学差异，但呈下降趋势。这表明乙醇模型组小鼠肝脏可能出现肝肿大等病变，导致肝重增加，脏体比升高。也表明建模成功。

发明人在研究中发现，在本研究中，与对照组相比，模型组的F/B值显著降低，Shannon指数显著降低，Simpson指数显著升高，表明14d的乙醇摄入显著改变了肠道微生物稳态。在评价肠道菌群结构变化时，厚壁菌门(Firmicutes) 和拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度的比值(F/B)是一个常用指标，在代谢性疾病中F/B值往往呈升高趋势，但乙醇引起该比值变化的趋势却尚无定论。本研究发现乙醇引起F/B值降低，葛根提取物处理使其恢复，这足以体现出葛根提取物对乙醇的抵抗作用。在属水平上，与对照组相比，模型组的别样棒菌属 (Allobaculum)、萨特氏菌(Sutterella)、阿克曼氏菌(Akkermansia)丰度显著增加，臭杆菌(Odoribacter)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、颤螺菌属(Oscillospira)丰度显著降低，而与模型组相比，对照组的乳杆菌属 (Lactobacillus)丰度显著增加。LEfSe分析结果与丰度分析结果基本一致，萨特氏菌(Sutterella)、别样棒菌属(Allobaculum)等是模型组在属水平上的重要生物标志物，而乳杆菌目(Lactobacillales)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)则是葛根提取物高剂量组的生物标志物，其组内丰度显著高于模型组。乳杆菌是众所周知的有益菌，能够参与复杂碳水化合物的发酵代谢，产生的短链脂肪酸(short-chain fatty acids， SCFA)是肠上皮细胞重要的能量来源。在模型组中丰度降低的颤螺菌属、臭杆菌、瘤胃球菌属也是肠道SCFA来源，这些由肠道细菌产生的SCFA除供能外，还可促进调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)发育，不断强化肠道黏膜屏障，调节机体免疫反应。在模型组丰度增加的菌属中，萨特氏菌是一类革兰氏阴性杆菌，通常与疾病相关，例如肥胖、自闭症、炎症性肠病等，萨特氏菌能够促进炎症发生，还可过度分泌IgA蛋白酶，降低肠道中IgA浓度，损害肠道抗菌免疫功能；而模型组中丰度增加的其余两类菌属，阿克曼氏菌一般认为是一类益生菌，对于癌症、代谢紊乱等具有一定的改善作用，特异性针对别样棒菌属的研究较少。本研究从整体上看，在肠道菌群注释到的13个菌属当中，有11个菌属在模型组表现出了丰度增加或减少的现象，而经葛根提取物处理后此现象得到改善(其中别样棒菌属、萨特氏菌、阿克曼氏菌、臭杆菌、瘤胃球菌属、颤螺菌属等6个菌属丰度变化与对照组相比有统计学差异，乳杆菌属丰度变化与模型组相比有统计学意义)，结合F/B值、Shannon指数、Simpson指数、PLS-DA等多项指标，可以认为乙醇引起肠道菌群结构失衡，而葛根提取物具有改善肠道菌群稳态的作用。

综上，葛根提取物(750mg/kg BW)经口灌胃作用于C57BL/6J小鼠14d，可以抑制酒精造成的肠道紊乱，调节酒精性肠道稳态，恢复酒精性肠道菌群物种多样性，增加益生菌含量。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.葛根提取物在制备预防和/或治疗酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂中的应用。

2.葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中提升乳杆菌属丰度的制剂中的应用。

3.葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中降低萨特氏菌丰度的制剂中的应用。

4.葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中提升臭杆菌、瘤胃球菌属和/或颤螺菌属丰度的制剂中的应用。

5.葛根提取物在制备酒精引起的肠道菌群紊乱中降低别样棒菌属丰度的制剂中的应用。

6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征是，所述制剂是药物或者食品或者保健品。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述制剂是片剂，粉剂，或者水剂，或者膏剂。

8.根据权利要求1-7任一项所述的应用，其特征是，所述葛根提取物是葛根的水提物，优选所述葛根提取物通过以下方法制备得到：将葛根粉碎，加入葛根重量7-9倍量的水，进行提取1.2-1.8小时，提取温度为98±2℃，过滤得提取液：再重复两或三次，收集滤液，浓缩，喷雾干燥。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是，喷雾干燥时的进风温度为140-180℃，出风温度为75-85℃；和/或加入葛根重量8倍量的水，进行提取1.5小时，重复两次。

10.一种防治酒精引起的肠道菌群紊乱的制剂，其特征是，所述制剂的活性成分包括葛根提取物。

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