CN101212982B

CN101212982B - 作为hdac抑制剂的fk228衍生物

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Publication number: CN101212982B
Application number: CN2006800242714A
Authority: CN
Inventors: 阿拉舒·加内桑; 格雷厄姆·基思·帕克哈姆; 亚历山大·于雷克-乔治; 亚历山大·理查德·利亚姆·塞西尔
Original assignee: OF SONTHAMPTON, University of
Current assignee: OF SONTHAMPTON, University of
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2011-10-12
Anticipated expiration: 2026-06-02
Also published as: GB2442148B; IL187790A0; JP2008542347A; EP1888097A1; GB2442148A; NZ563815A; CA2609939A1; IL187790A; GB0511266D0; WO2006129105A1; BRPI0610923A2; US20090131390A1; JP5558710B2; AU2006253961A1; AU2006253961B2; US7977304B2; GB0723230D0; CN101212982A; EP1888097B1

Abstract

发现了为FK228类似物的通式(I)或(I′)的化合物、其等排物和其药学可接受的盐抑制HDAC，其中R₁、R₂、R₃和R₄相同或不同，代表氨基酸侧链部分，各R₆相同或不同，代表氢或C₁-C₄烷基。

Description

作为HDAC抑制剂的FK228衍生物

技术领域

本发明涉及作为HDAC抑制剂的特定酯肽类物质。

背景技术

组蛋白脱乙酰酶(HDAC)为催化乙酰化赖氨酸残基水解的锌金属酶。在组蛋白中，这使赖氨酸回到其正常的质子化状态，是真核转录调控的全球机制，其结果是使核小体中DNA紧密包装。此外，可逆的赖氨酸乙酰化是非组蛋白蛋白质重要的调节过程。因此，能调节HDAC的化合物具有重要的治疗学潜能。

两种天然产物酯肽FK228和Spiruchostatin A已被报道具有作为HDAC抑制剂的潜能。但化学改性这些天然产物以提供另外的类似物的可能性非常有限。

发明内容

现在我们惊奇地发现，具有下面列出的通式(I)和(I′)的化合物可作为HDAC抑制剂。因此，本发明提供了为FK228类似物的式(I)或(I′)化合物、其等排物或其药学可接受的盐在用作HDAC抑制剂的药物的生产中的用途。

其中，R₁、R₂、R₃和R₄相同或不同，代表氨基酸侧链部分，各R₆相同或不同，代表氢或C₁-C₄烷基，Pr¹和Pr²相同或不同，代表氢或硫羟保护基。

本发明还提供了如上所定义的FK228类似物或其药学可接受的盐在用作HDAC抑制剂的药物的生产中的用途。

本文中用到的术语“氨基酸侧链部分”指天然和非天然氨基酸中存在的任何氨基酸侧链。衍生自非天然氨基酸的氨基酸侧链部分的实例(其衍生源氨基酸在括号中示出)为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃(叔丁氧羰基甲基丙氨酸(analine))、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃(N_ε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸)、-(CH₂)₃-NH-C(O)NH₂(瓜氨酸)、-CH₂-CH₂OH(高丝氨酸)和-(CH₂)₂-CH₂NH₂(鸟氨酸)。特别值得一提的是-(CH₂)₃-NH-C(O)NH₂(瓜氨酸)、-CH₂-CH₂OH(高丝氨酸)和-(CH₂)₂-CH₂NH₂(鸟氨酸)。

C₁-C₆烷基基团或部分可为线型或支化的。通常其为C₁-C₄烷基基团或部分，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。优选的实例包括甲基、异丙基和叔丁基。

C₂-C₆烯基基团或部分可为线型或支化的。通常其为C₂-C₄烯基基团或部分。优选所述烯基为单或二不饱和的，更优选单不饱和的。实例包括乙烯基、烯丙基、1-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基和3-丁烯基。

亚烷基为二价的所述烷基。

所述硫羟保护基通常为：

(a)形成硫醚以保护硫羟基团的保护基，例如任选地被C₁-C₆烷氧基(例如甲氧基)、C₁-C₆酰氧基(例如乙酰氧基)、羟基和硝基取代的苄基、吡啶甲基、吡啶甲基-N-氧化物、蒽基甲基、二苯甲基、苯基、叔丁基、金刚烷基(adamanthyl)、C₁-C₆酰氧甲基(例如新戊酰氧甲基、叔丁氧基羰基氧甲基)；

(b)形成单硫、二硫或氨基硫缩醛以保护硫羟基的保护基，例如C₁-C₆烷氧基甲基(例如甲氧基甲基、异丁氧基甲基)、四氢吡喃基、苄基硫甲基、苯基硫甲基、噻唑烷、乙酰胺甲基、苯甲酰氨基甲基；

(c)形成硫酯以保护硫羟基的保护基，例如叔丁氧羰基(BOC)、乙酰基和其衍生物、苯甲酰和其衍生物；或

(d)形成氨基甲酸硫酯以保护硫羟基的保护基，例如氨基甲酰基、苯基氨基甲酰基、C₁-C₆烷基氨基甲酰基(例如甲基氨基甲酰基和乙基氨基甲酰基)。

通常，Pr¹和Pr²相同或不同，各自代表氢或形成硫醚、单硫、二硫或氨基硫缩醛、硫酯或氨基甲酸硫酯以保护硫羟基的保护基。优选Pr¹和Pr²相同或不同，各自代表氢或保护基，所述保护基选自任选地被C₁-C₆烷氧基(例如甲氧基)、C₁-C₆酰氧基(例如乙酰氧基)、羟基和硝基取代的苄基、吡啶甲基、吡啶甲基-N-氧化物、蒽基甲基、二苯甲基、苯基、叔丁基、金刚烷基、C₁-C₆酰氧甲基(例如新戊酰氧甲基、叔丁氧基羰基氧甲基)、C₁-C₆烷氧基甲基(例如甲氧基甲基、异丁氧基甲基)、四氢吡喃基、苄基硫甲基、苯基硫甲基、噻唑烷、乙酰胺甲基、苯甲酰氨基甲基、叔丁氧羰基(BOC)、乙酰基和其衍生物、苯甲酰基和其衍生物、氨基甲酰基、苯基氨基甲酰基和C₁-C₆烷基氨基甲酰基(例如甲基氨基甲酰基和乙基氨基甲酰基)。最优选Pr¹和Pr²为氢。

在一个实施方案中，所述氨基酸侧链部分为衍生自天然氨基酸的那些。衍生自天然氨基酸的氨基酸侧链部分的实例(其衍生源氨基酸在括号中示出)为-H(甘氨酸)、-CH₃(丙氨酸)、-CH(CH₃)₂(缬氨酸)、-CH₂CH(CH₃)₂(亮氨酸)、-CH(CH₃)CH₂CH₃(异亮氨酸)、-(CH₂)₄NH₂(赖氨酸)、-(CH₂)₃NHC(＝NH)NH₂(精氨酸)、-CH₂-(5-1H-咪唑基)(组氨酸)、-CH₂CONH₂(天冬酰胺)、-CH₂CH₂CONH₂(谷氨酰胺)、-CH₂COOH(天冬氨酸)、-CH₂CH₂COOH(谷氨酸)、-CH₂-苯基(苯丙氨酸)、-CH₂-(4-OH-苯基)(酪氨酸)、-CH₂-(3-1H-吲哚基)(色氨酸)、-CH₂SH(半胱氨酸)、-CH₂CH₂SCH₃(蛋氨酸)、-CH₂OH(丝氨酸)和-CH(OH)CH₃(苏氨酸)。

在一个实施方案中，各氨基酸侧链为存在于天然氨基酸中的氨基酸侧链部分或为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃(叔丁氧羰基甲基丙氨酸)、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃(N_ε-(叔丁氧羰基)-赖氨酸)、-(CH₂)₃-NH-C(O)NH₂(瓜氨酸)、-CH₂-CH₂OH(高丝氨酸)或-(CH₂)₂-CH₂NH₂(鸟氨酸)。

在本发明的优选实施方案中，各氨基酸侧链为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的部分，其中L为C₁-C₆亚烷基，A为苯基或5-到6-元杂芳基，各R′相同或不同，代表C₁-C₄烷基，各R″相同或不同，代表H或C₁-C₆烷基，各-Het-相同或不同，为选自-O-、-N(R

)-和-S-的杂原子间隔基，各R

相同或不同，代表H或C₁-C₄烷基。

当基团A为5到6元杂芳基时，其可为例如呋喃基、噻吩基、吡咯基、

唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异

唑基、异噻唑基、

二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基(pyridazyl)、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基。但通常各个A部分为苯基。

杂原子间隔基Het通常为-O-或-N(R

)-。更通常其为-O-或-N(H)-。

优选各氨基酸侧链为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R ″和-L-N(R ″)-C(O)-O-R″的部分，其中L、A和R″的定义同上。

通常本发明的化合物的氨基酸侧链部分选自-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₂-C(O)OH、-CH₂-C₆H₅、-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH和-CH(OH)CH₃。更通常所述氨基酸侧链部分选自-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH和-CH(OH)CH₃。

优选所述氨基酸侧链部分选自-H、-CH₃、-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₂-C(O)OH、-CH₂-C₆H₅、-(CH₂)₄NH₂和-CH(CH₃)₂。在本发明的一个实施方案中，所述氨基酸侧链部分选自-H、-CH₃和-CH(CH₃)₂。

通常，R₁为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的氨基酸侧链部分，其中L、R′、R ″、-Het-和R

的定义同上。优选R₁为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″的部分，其中L、A和R″的定义同上。更优选R₁为选自-H和-C₁-C₆烷基的部分。还更优选R₁为-C₁-C₄烷基，特别是异丙基。

通常，R₂为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的氨基酸侧链部分，其中L、R′、R ″、-Het-和R

的定义同上。优选R₂为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″的部分，其中L、A和R ″的定义同上。更优选R₂为选自-H和-C₁-C₄烷基的部分。还更优选R₂为-H、-CH₃或-CH(CH₃)₂。甚至更优选R₂为-H或-CH₃。

通常，R₃为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的氨基酸侧链部分，其中L、R′、R″、-Het-和R

的定义同上。优选R₃为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″的部分，其中L、A和R ″的定义同上。

更优选R₃为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₂-C(O)OH、-CH₂-C₆H₅、CH₃、-CH(CH₃)₂或-(CH₂)₄NH₂。

通常，R₄为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的氨基酸侧链部分，其中L、R′、R ″、-Het-和R

的定义同上。优选R₄为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″的部分，其中L、A和R″的定义同上。更优选R₄为氢、-C₁-C₆烷基或-C₂-C₆烯基。还更优选R₄为氢或-C₁-C₄烷基，更优选氢。

通常，各R₆相同或不同，为氢或-C₁-C₂烷基。优选各R₆为氢。

在一个实施方案中，本发明提供了如上所定义的为式(I)化合物的FK228类似物、其等排物或其药学可接受的盐。

本发明的优选化合物为如上所定义的FK228类似物(其中R₁选自-H和-C₁-C₆烷基，R₂选自-H和-C₁-C₄烷基、R₃选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″，其中L、A和R″的定义同上，R₄选自-H和-C₁-C₆烷基，各R₆相同或不同，为氢或-C₁-C₂烷基)、其等排物和其药学可接受的盐。

本发明的进一步优选的化合物为(a)式(I)化合物(其中R₁为-C₁-C₄烷基、R₂选自-H和-CH₃，R₃选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″，其中L、A和R″的定义同上，R₄为-H，各R₆为-H)、其等排物和其药学可接受的盐，和(b)式(I′)化合物(其中R₁为-C₁-C₄烷基、R₂选自-H和-CH₃，R₃选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″，其中L、A和R″的定义同上，R₄为-H，各R₆为-H，Pr¹和Pr²为氢)、其等排物和其药学可接受的盐。

还特别优选的式(I)化合物为其中

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-CH₃、R₃为-CH₃、R₄为氢、R₆为-H；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、R₄为氢、R₆为-H；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₂-C(O)-OH、R₄为氢、R₆为-H；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)-C₆H₅、R₄为氢、R₆为-H；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-CH(CH₃)₂、R₄为氢、R₆为-H；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、R₄为氢、R₆为-H；或

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₄-NH₂、R₄为氢、R₆为-H的那些；及其药学可接受的盐。

还特别优选的式(I′)化合物为其中

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-CH₃、R₃为-CH₃、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₂-C(O)-OH、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)-C₆H₅、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-CH(CH₃)₂、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H，R₃为-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢；或

R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-(CH₂)₄-NH₂、R₄为氢、R₆为-H、Pr¹和Pr²为氢的那些；及其药学可接受的盐。

优选的FK228类似物具有式(2)或(2′)。

另一优选的FK228类似物具有式(3)或(3′)。

另一优选的FK228类似物具有式(4)或(4′)。

另一优选的FK228类似物具有式(5)或(5′)。

另一优选的FK228类似物具有式(6)或(6′)。

另一优选的FK228类似物具有式(7)或(7′)。

另一优选的FK228类似物具有式(8)或(8′)。

另一优选的FK228类似物具有式(9)或(9′)。

在本发明的一个实施方案中，FK228类似物具有式(II)或(II′)，

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₆、Pr¹和Pr²的定义同上。

在本发明的另一实施方案中，FK228类似物具有式(III)或(III′)，

其中R₁、R₂、R₃、Pr¹和Pr²的定义同上。

在本发明的另一实施方案中，FK228类似物具有式(IV)或(IV′)，

其中R₁、R₂、R₃、Pr¹和Pr²的定义同上。

在本发明的另一实施方案中，FK228类似物具有式(V)或(V′)，

其中R₁、R₂、R₃、Pr¹和Pr²的定义同上。

在另一实施方案中，本发明提供了式(VI)化合物、其等排物或其药学可接受的盐在用作HDAC抑制剂的药物的生产中的用途，

其中R₁、R₂和R₃相同或不同，代表氨基酸侧链部分，R₄为氢、C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基。

通常在该实施方案中，R₁为衍生自天然氨基酸的氨基酸侧链部分。优选在该实施方案中，R₁为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃。更优选R₁为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃。最优选R₁为-CH(CH₃)₂。

通常在该实施方案中，R₂为衍生自天然氨基酸的氨基酸侧链部分。优选R₂为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃。更优选R₂为-H、-CH₃或-CH(CH₃)₂。最优选R₂为-H。

通常在该实施方案中，R₃为衍生自天然氨基酸的氨基酸侧链部分。优选R₃为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃。更优选R₃为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃。最优选R₃为-CH₃。

通常在该实施方案中，R₄为氢或C₁-C₆烷基。优选R₄为氢或C₁-C₂烷基。更优选R₄为氢。

在该实施方案中，本发明的优选化合物为式(VI)化合物，其中：

R₁为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃；

R₂为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃；

R₃为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂、-CH(CH₃)CH₂CH₃、-(CH₂)₄NH₂、-CH₂SH、-CH₂CH₂SCH₃、-CH₂OH或-CH(OH)CH₃；和

R₄为氢或C₁-C₂烷基。

在该实施方案的优选方面中，本发明提供了式(VI)化合物，其中：

R₁为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃；

R₂为-H、-CH₃或-CH(CH₃)₂；

R₃为-H、-CH₃、-CH(CH₃)₂、-CH₂CH(CH₃)₂或-CH(CH₃)CH₂CH₃；和

R₄为氢。

该实施方案的特别优选的化合物为式(VI)中R₁为-CH(CH₃)₂、R₂为-H、R₃为-CH₃、R₄为氢的那些。

该实施方案进一步优选的化合物为式(III)化合物，

其中R₁、R₂和R₃的定义同上。

该实施方案还更优选的化合物为式(IV)化合物，

其中R₁、R₂和R₃的定义同上。

本发明的化合物被认为是新型的，本发明因此提供了式(I)化合物、其等排物或其药学可接受的盐。本发明还提供了式(I)化合物或其药学可接受的盐。

本发明也提供了用于治疗人体或动物体的方法的式(I)化合物、其等排物或其药学可接受的盐。本发明还提供了用于治疗人体或动物体的方法的式(I)化合物或其药学可接受的盐。

由于其高度的疗效，本发明的化合物是特别有利的。由于四肽芯可容易地合成，从这一点来说其也是有利的。

本文中用到的药学可接受的盐为药学可接受的酸或碱的盐。药学可接受的酸包括无机酸(如盐酸、硫酸、磷酸、焦磷酸、氢溴酸或硝酸)和有机酸(如柠檬酸、延胡索酸、马来酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸、苯甲酸、乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸或对甲苯磺酸)。药学可接受的碱包括碱金属(如钠或钾)和碱土金属(如钙或镁)氢氧化物及有机碱如烷基胺、芳烷基胺或杂环胺。

本文中用到的术语“等排物”指自原子或原子团与另外的广义相似的原子或原子团交换得到的化合物。在式(I)化合物中，含等排基团的部分优选-NH-CHR₁-CO-、-NH-CHR₂-CO-O-和-NH-CO-CHR₃-NH-CO-。在式(I)化合物中，含等排基团的部分更优选-NH-CHR₁-CO-和-NH-CHR₂-CO-O-。这类等排物的实例为-NH-部分已为-CH₂、-O-或-S-所取代、-CO-部分已为-CS-或-C(＝NH)-所取代、-O-部分已为-S-、CH₂-或-NH-所取代的式(I)化合物。

本发明的化合物具有式(I)中所示的手性。但基团R₁、R₂和R₃的空间定位可导致化合物中另外的手性中心的形成。为避免疑义，本文中描绘的化学结构意在涵盖与这些另外的手性中心相关的所有立体异构构型，包括外消旋和非外消旋混合物及纯对映异构体和/或非对映异构体。

为避免疑义，本发明也涵盖在体内反应产生本发明的化合物或其等排物或其药学可接受的盐的前药。

本发明的优选化合物为光学异构体。因此，例如，仅含一个手性中心的式(I)的优选化合物包括基本纯形式的R异构体、基本纯形式的S对映体和含过量的R对映体或过量的S对映体的对映体混合物。

本发明也提供了式(I)化合物、其等排物或其药学可接受的盐和药学可接受的载体或稀释剂。

所述药物组合物通常含至多85wt％的本发明化合物。更通常其含至多50wt％的本发明化合物。优选的药物组合物是无菌、无热原的。此外，本发明提供的药物组合物所含的本发明化合物通常为基本纯的光学异构体。优选所述药物组合物包含式(I)化合物的药学可接受的盐或其等排物。

FK228类似物可通过常规路线制备，例如用下面的方案，其中基团R₁到R₄的定义同上：

在步骤(a)中，带侧链R₂的氨基酸酯与带侧链R₁的第二氨基酸缩合产生二肽。在步骤(b)中，二肽与受保护的半胱氨酸衍生物缩合产生三肽。在步骤(c)中，三肽与氨基酸偶联产生受保护的四肽。在步骤(d)中，四肽的N-端去保护，游离胺与β-羟基酸衍生物偶联，其中R₅为临时封端基团，其可被除去而产生R₅为H、X为手性助剂的化合物，如Yurek-George，A.；Habens，F.；Brimmell，M.；Packham，G.；Ganesan，A.J.Am.Chem.Soc.2004，126，1030-1031中所报道的。在步骤(e)中，酯基水解，然后在步骤(f)中环化并在(g)中形成二硫键，完成双环酯肽化合物(I)的合成。

其中R₆不是氢的本发明化合物可通过烷基化相应的其中R₆为氢的本发明化合物或中间体或通过使用适宜地取代了的起始原料获得。

式(I′)化合物可通过使上面步骤(g)的产物反应以断开二硫键而获得。二硫键的断裂通常用常用来还原处理含二硫键的蛋白质的硫醇化合物例如巯基乙醇、巯基乙酸、2-巯基乙胺、苯硫酚、对硫代甲酚和二硫苏糖醇实现。优选使用巯基乙醇和二硫苏糖醇。过量的硫醇化合物可通过例如渗析或凝胶过滤除去。作为替代方案，例如电解、四氢硼酸钠、氢化铝锂或亚硫酸盐可用来断开二硫键。

Pr¹和/或Pr²不是氢的式(I′)化合物可通过向Pr¹和/或Pr²为氢的相应化合物中引入硫羟保护基制备。在这方面，该反应中待使用的引入硫羟保护基的适宜试剂适宜根据待引入的保护基确定。实例包括相应保护基的氯化物(例如苄基氯、甲氧基苄基氯、乙酰氧基苄基氯、硝基苄基氯、吡啶甲基氯、吡啶甲基氯-N-氧化物、蒽基甲基氯、异丁氧基甲基氯、苯基硫甲基氯)和相应保护基的醇(例如二苯甲醇、金刚烷醇、乙酰胺甲醇、苯甲酰氨基甲醇)、二硝基苯、异丁烯、二甲氧基甲烷、二氢吡喃和氯甲酸叔丁酯。

本领域技术人员会理解，当R₁、R₂、R₃和R₄中的一个带有官能团如-OH、-SH、-NH₂或-COOH时，则可以优选在其引入后的一个或多个反应步骤里将该基团保护起来。这时，所讨论的基团可在引入后单独的步骤中被保护，或其可在引入时已被保护。技术人员应清楚可用于这方面的适宜的保护基。

所得FK228类似物可通过用适宜的酸或碱处理而盐化。通过任何上述方法获得的外消旋混合物可通过标准技术拆分，例如在手性色谱柱上洗脱。

本发明的优选化合物具有至少与辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)所表现出的相当的HDAC抑制活性。因此，在又一实施方案中，本发明提供了选择具有至少与SAHA所表现出的相当的HDAC抑制活性的化合物的方法，所述方法包括通过如下步骤制备式(I)或(I′)化合物：

(i)使式(VI)化合物与式(VII)化合物反应，

其中R₁和R₂的定义同上，R₇为C₁-C₄烷基或C₂-C₄烯基，Y为氨基保护基；

(ii)对所得中间体去保护并使之与式(VIII)化合物反应，

其中Y′为氨基保护基，Y″为氢或保护基；

(iii)对所得中间体去保护并使之与式(IX)化合物反应

其中R₃的定义同上，Y

为氨基保护基；

(iv)对所得中间体去保护并使之与式(X)化合物反应

其中R₄的定义同上，R₅为氢或羟基保护基，LG为离去基团，Y″″为氢或保护基；

(v)任选地，对所得中间体上的β-羟基去保护以除去R₅保护基并以H取代之；

(vi)水解和环化所得中间体；

(vii)任选地，使所得中间体反应形成二硫键，如果形成了二硫键，则任选地断开所得化合物中的二硫键，如果所得化合物含硫羟基，则任选地引入硫羟保护基；和

(viii)筛选所得化合物以测定其作为HDAC抑制剂的活性。

通常，在步骤(vi)中，酯基的水解在环化前进行。

通常在步骤(vii)中使用DTT(二硫苏糖醇)来实现二硫键的断裂。

本领域技术人员应理解，保护基Y、Y′、Y″、Y和Y″″可使用各种本体，优选的本体将取决于各情形下存在的特定基团的性质。

基团Y、Y′和Y可例如为叔-丁氧羰基(Boc)或9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。它们通常为Fmoc。

基团Y″和Y″″可例如为三苯甲基(Trt)。

本领域技术人员知晓离去基团LG的适宜本体。其可例如为手性助剂，如通过其N原子连接的噻唑烷硫酮，如Yurek-George，A-等(J.Am.Chem.Soc.2004，126，1030-1031)中所述。作为替代方案，其可为-OH基。

基团R₇通常为C₁-C₄烷基或C₁-C₄烯基。更通常地，其为甲基或烯丙基。

技术人员应理解，多种检测适于测定HDAC抑制并可用来测定自步骤(vii)所得化合物与已知的HDAC抑制剂SAHA相比的活性。因此，试验化合物对HDAC的IC₅₀可例如在体外检测中测定并与相同检测条件下SAHA的IC₅₀相比较。如果试验化合物的IC₅₀值等于或低于SAHA的，则应理解为其具有至少与SAHA所表现出的相当的HDAC抑制活性。

在优选的实施方案中，本发明提供了选择具有至少与如上所定义的SAHA所表现出的相当的HDAC抑制活性的化合物的方法，其中步骤(viii)中所述筛选步骤为体外HDAC检测。通常，所述检测包括使各种浓度的试验化合物和SAHA与经稀释的海拉细胞核提取物(HelaNuclear Extract)接触，以测定试验化合物和SAHA对海拉细胞核提取物的IC₅₀。对海拉细胞核提取物测得的IC₅₀值等于或低于相同检测条件下SAHA的IC₅₀的试验化合物应理解为具有至少与SAHA所表现出的相当的抑制活性。通常所述检测用HDAC荧光活性检测试剂盒(Biomol，UK)进行且试验化合物在分析前还原。所述检测试验可例如按下面标题“活性检测5”下所述进行。

在另一实施方案中，本发明提供了选择具有至少与SAHA所表现出的相当的人癌细胞生长抑制活性的化合物的方法，所述方法包括通过如上所定义的步骤(i)到(vii)制备式(I)或(I′)化合物，然后(viii)筛选所得化合物以测定其作为人癌细胞生长抑制剂的活性。

技术人员应理解，多种检测适于测定人癌细胞生长抑制并可用来测定自步骤(vii)所得化合物与SAHA相比的活性。因此，试验化合物对人癌细胞生长的IC₅₀可例如在体外检测中测定并与相同检测条件下SAHA的IC₅₀相比较。如果试验化合物的IC₅₀值等于或低于SAHA的，则应理解为其具有至少与SAHA所表现出的相当的抑制活性。通常在该实施方案中，步骤(viii)包括体外检测，所述体外检测包括使各种浓度的试验化合物和SAHA与MCF7乳腺癌细胞系、HUT78 T-细胞白血病细胞系、A2780卵巢癌细胞系、PC3或LNCAP前列腺癌细胞系接触以确定试验化合物和SAHA对所述细胞系的IC₅₀值。对任何这些细胞系测得的IC₅₀值等于或低于相同检测条件下SAHA的IC₅₀值的试验化合物应理解为具有至少与SAHA相当的抑制活性。通常在该实施方案中，所述检测用CyQuant^TM检测系统(Moelcular Probes，Inc.USA)进行。所述检测试验可例如按下面标题“活性检测6”和/或“活性检测1”下所述进行。

在本发明的另一优选实施方案中提供了选择具有至少与SAHA所表现出的相当的抗炎活性的化合物的方法，所述方法包括通过如上所定义的步骤(i)到(vii)制备式(I)或(I′)化合物，然后(viii)筛选所得化合物以测定其抗炎活性。

技术人员应理解，多种检测适于评估化合物的抗炎活性。试验化合物相对于SAHA的抗炎活性可例如通过测定化合物相对于SAHA在抑制由外周血单核细胞(PBMC)产生TNFα中的活性确定。因此，试验化合物抑制PBMC产生TNFα的能力可例如在检测中测定并与相同检测条件下SAHA的活性相比较。如果试验化合物对产生TNFα的体外抑制活性等于或高于相同检测条件下SAHA的，则应理解为其具有至少与SAHA所表现出的相当的抗炎活性。通常步骤(viii)用Quantikine

人-α检测试剂盒(R&D systems，Abingdon UK)进行。所述检测可例如按下面标题“活性检测7”下所述进行。

在本实施方案的另一方面，试验化合物相对于SAHA的抗炎活性可通过评估化合物相对于SAHA在抑制Balb/c小鼠炎症中的活性确定。如果试验化合物的体内抑制活性等于或高于相同试验条件下SAHA的，则应理解为其具有至少与SAHA所表现出的相当的抗炎活性。通常在该实施方案中，步骤(viii)通过评估试验化合物和SAHA在抑制化学激发诱发的Balb/c小鼠炎症中的体内活性进行。通常，所述化学激发包括局部给予小鼠oxalazone或丙酮。在该实施方案中，所研究的化合物可在化学激发前或后施用。所述抗炎活性评估可例如按下面标题“活性检测8”下所述进行。

在本发明的另一优选实施方案中提供了选择具有至少与SAHA所表现出的相当的在MCF7细胞中诱发主要的G2/M期阻滞或细胞死亡的活性的化合物的方法，所述方法包括通过如上所定义的步骤(i)到(vii)制备式(I)或(I′)化合物，然后通过(viii)筛选所得化合物以测定其相对于SAHA在MCF7细胞中诱发主要的G2/M期阻滞或细胞死亡的活性。筛选步骤(viii)可例如包括按下面标题“活性检测3”下所述进行的检测。

在上述筛选步骤中，试验化合物的优选形式取决于筛选步骤的性质。因此，如果筛选步骤为体外检测，如下面“活性检测5”下所述的，则试验化合物优选如上面所定义的式(I′)。但如果筛选步骤是针对细胞系的，则试验化合物优选式(I)。

已发现本发明的化合物是HDAC的抑制剂。本发明的化合物因此是治疗学有用的。

本发明的化合物和包含其的组合物可以多种剂型给药。在一个实施方案中，包含本发明化合物的药物组合物可配制为适于经口、直肠、肠胃外、鼻内或经皮给药或通过吸入或通过栓剂给药的形式。典型的给药途径为肠胃外、鼻内或经皮给药或通过吸入给药。

本发明的化合物可口服给药，例如以片剂、锭剂、糖锭、水或油悬剂、可分散性粉剂或颗粒剂。本发明的优选药物组合物为适于口服给药的组合物，例如片剂和胶囊剂。

本发明的化合物也可肠胃外给药，即通过皮下、静脉内、肌肉内、胸内、经皮方式或通过输注技术给药。所述化合物也可以作为栓剂给药。

一种优选的给药途径是吸入。与许多口服药物相比，吸入性药物的主要优势在于其直接递送到供血丰富的区域。因此，由于肺泡表面积巨大、有丰富的血液供应，且避免了首过代谢，其吸收非常快。

本发明的优选药物组合物因此包括适于吸入的那些。本发明也提供了含这类药物组合物的吸入装置。通常所述装置为定量吸入器(MDI)，其含药学可接受的化学推进剂以将药物推出吸入器。通常所述推进剂为碳氟化合物。

其他优选的吸入装置包括喷雾器。喷雾器为能在压力下用空气或氧气将药物的细小液雾通过装在鼻和嘴上的“罩”递送的装置。其常用来治疗不能使用吸入器的哮喘患者，包括婴儿、幼儿和所有年龄段的急性病患者。

所述吸入装置也可为例如能递送本发明的化合物而不用推进剂的旋转吸入器或干粉吸入器。

通常，所述吸入装置含隔离器(spacer)。隔离器为能让个体将更大的药量直接吸进其预期进入的下部导气管而不是进入喉部的装置。许多隔离器装在吸入器末端；有的将药物滤毒罐装进装置中。带截留室和单向阀的隔离器阻止药物逃逸到空气中。许多人，特别是幼儿和老年人，可能在协调其吸入与触发定量吸入器的喷射所需的动作上有困难。对于这些患者，使用隔离器是特别推荐的。

另一优选的给药途径是鼻内给药。鼻腔的高渗透组织非常善于接受药物并快速、高效地吸收，比片剂药物更加快速和高效。经鼻药物递送不像注射那么痛苦和具有侵袭性，在患者中造成的焦虑要少一些。药物可以通过比片剂形式递送的药物小的剂量经鼻递送。通过这种方法，吸收非常快且避免了首过代谢，因此减少了患者之间的差异。经鼻递送装置还使药物可以精确定剂量地施用。因此，本发明的药物组合物通常适于鼻内给药。此外，本发明也提供了含这类药物组合物的鼻内装置。

另一优选的给药途径是经皮给药。本发明因此也提供了含本发明的化合物或其药学可接受的盐的经皮贴剂。也优选采用舌下给药。本发明因此也提供了包含本发明的化合物或其药学可接受的盐的舌下片剂。

本发明的化合物通常配制为与药学可接受的载体或稀释剂一起给药。例如，固体口服剂型可包含与所述活性化合物一起的稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉)、润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇)、粘合剂(如淀粉、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮)、崩解剂(如淀粉、藻酸、藻酸盐或羟基乙酸淀粉钠)、泡腾混合物、着色剂、甜味剂、润湿剂(如卵磷脂、聚山梨酸酯、硫酸月桂酯)和一般在药物配方中使用的非毒性和药理学不活泼的物质。这样的药物制剂可用已知方式生产，例如通过混合、造粒、压片、糖包衣或膜包衣工艺。

口服用液体分散剂可为糖浆、乳剂和悬剂。糖浆可含例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。

悬剂和乳剂可含例如天然树胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇作为载体。肌肉内注射用悬剂或溶液可包含与所述活性化合物一起的药学可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二醇(如丙二醇)、和根据需要的适宜量的盐酸利多卡因。

注射或输注用溶液可含例如无菌水作为载体，或优选其可呈无菌的等渗盐水溶液形式。

本发明的化合物在治疗学上用于HDAC介导的疾病的治疗或预防。因此，本发明提供了式(I)化合物或其药学可接受的盐在HDAC介导的疾病的治疗或预防用药物的生产中的用途。也提供了治疗患有或易患HDAC介导的疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的式(I)化合物、其等排物或其药学可接受的盐。

在一个实施方案中，本发明的化合物可与其他已知的HDAC抑制剂如SAHA联用。在该实施方案中，可以配制联用产品，使其包含各个同时、分别或顺序使用的药物。

本发明因此提供了一种产品，所述产品含(a)如上所定义的本发明的FK228类似物或其等排物或其药学可接受的盐；和(b)同时、分别或顺序使用的其他已知的HDAC抑制剂如SAHA。

本发明因此也提供了如上所定义的本发明的FK228类似物或其等排物或其药学可接受的盐在与其他已知的HDAC抑制剂如SAHA联用的药物的生产中的用途。

技术人员知晓其他已知的HDAC抑制剂。例如US20040266769给出了适宜的实例。实例包括spiruchostatin A、FR-901228、trichostatin A和SAHA。

本发明的化合物可用于癌症的治疗和预防中，也可用于单一治疗或联合治疗中。当用于联合治疗中时，本发明的化合物通常与基于小分子化合物、辐射、抗体的疗法(例如赫赛汀(herceptin)和利妥希玛)、抗癌接种、基因疗法、细胞疗法、激素疗法或细胞因子疗法一起使用。

在本发明的优选实施方案中，本发明的化合物与其他化疗或抗肿瘤剂联合用于癌症的治疗。这类其他化疗或抗肿瘤剂的实例包括米托蒽醌、长春花属生物碱(如长春新碱和长春碱)、蒽环类抗生素(例如柔红霉素和阿霉素)、烷化剂(如苯丁酸氮芥和苯丙氨酸氮芥)、紫杉烷(如紫杉醇)、叶酸拮抗剂(如氨甲蝶呤和雷替曲塞)、表鬼臼毒素(如足叶乙甙)、喜树碱(如药薯和其活性代谢物SN38)及DNA甲基化抑制剂(如WO 02/085400中公开的DNA甲基化抑制剂)。

因此，本发明提供了一种产品，其包含本发明的化合物及其他化疗或抗肿瘤剂作为在缓解癌症中同时、分别或顺序使用的联合制剂。本发明也提供了如上面所定义的FK228类似物或其等排物或其药学可接受的盐在通过与其他化疗或抗肿瘤剂联用而缓解癌症的药物的生产中的用途。本发明的化合物和所述其他药剂可以任何顺序施用。在这两种情形下，本发明的化合物与所述其他药剂可一起施用或按医生确定的任何顺序分别给予。

HDAC被认为是若干不同疾病的病理和/或症状的原因，因此，通过抑制降低对象中HDAC的活性可用来从治疗学上解决这些病状。可用本发明的HDAC抑制剂治疗的各种疾病的实例如本文中所述。注意，随着对HDAC以各种途径起到的生物学作用的理解更加全面，可以在后来确认除了本文中所公开的之外的其他疾病。

本发明的HDAC抑制剂可用来治疗的一组适应证为涉及不希望的或不受控制的细胞增殖的那些。这类适应证包括良性肿瘤、各种类型的癌症如原发瘤和瘤转移、再狭窄(如冠状动脉、颈动脉和脑损伤)、内皮细胞的异常刺激(动脉粥样硬化)、因外科手术而致的身体组织损伤、异常的伤口愈合、异常的血管生成、产生组织纤维化的疾病、重复性运动失调、非高度血管化的组织失调和与器官移植相关的增殖反应。HDAC抑制剂更具体的适应证包括但不限于前列腺癌、肺癌、急性白血病、多发性骨髓瘤、膀胱癌、肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌、成神经细胞瘤和黑素瘤。

在一个实施方案中提供了治疗与不希望的和不受控制的细胞增殖相关的疾病的方法。所述方法包括向遭受不受控制的细胞增殖的对象施用治疗学有效量的本发明的HDAC抑制剂，以便减轻所述不受控制的细胞增殖。待使用的抑制剂的具体剂量将取决于病状的严重程度、给药途径和相关因素，这可由主治医师确定。通常，可接受的有效日剂量为足以有效减慢或消除不受控制的细胞增殖的量。

本发明的HDAC抑制剂也可与其他抑制不希望的和不受控制的细胞增殖的药剂结合使用。其他可与本发明的HDAC抑制剂结合使用的抗细胞增殖剂的实例包括但不限于类维生素A酸和其衍生物、2-甲氧基雌二醇、ANGIOSTATIN(TM)蛋白质、ENDOSTATIN(TM)蛋白质、苏拉明、角鲨胺(squalamine)、金属蛋白酶-I的组织抑制剂、金属蛋白酶-2的组织抑制剂、纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂-1、纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂-2、软骨源抑制剂、紫杉醇、血小板因子4、硫酸鱼精蛋白(鲱精蛋白)、硫酸化甲壳质衍生物(自雪花蟹壳制备)、硫酸化多糖肽聚糖复合物(sp-pg)、星孢菌素、基质代谢调节剂，包括例如脯氨酸类似物((1-氮杂环丁烷-2-羧酸(LACA)、顺式羟基脯氨酸、d，1-3，4-脱氢脯氨酸、硫代脯氨酸)、β-氨基丙腈延胡索酸酯、4-丙基-5-(4-吡啶基)-2(3H)-唑酮；氨甲蝶呤、米托蒽醌、肝素、干扰素、2巨球蛋白-血清、chimp-3、抑糜蛋白酶素、β-环糊精十四硫酸酯、eponemycin；烟曲霉素、硫代苹果酸金钠、d-青霉胺(CDPT)、β.-1-抗胶原酶-血清、α.2-抗纤维蛋白溶酶、比生群、氯苯扎利二钠、正-(2-羧苯基-4-chloroanthronilic酸二钠)或“CCA”、沙立度胺；angostatic类固醇、羧基氨基咪唑；金属蛋白酶抑制剂如BB94。其他可使用的抗血管生成剂包括抗体，优选针对这些血管生长因子的单克隆抗体：bFGF、aFGF、FGF-5、VEGF亚型、VEGF-C、HGF/SF和Ang-1/Ang-2。Ferrara N.和Alitalo，K.“Clinical application of angiogenic growthfactors and their inhibitors(血管生长因子和其抑制剂的临床应用)”(1999)Nature Medicine 5：1359-1364。

通常，良性肿瘤中的细胞保持其分化特征而不以完全不受控制的方式分裂。良性肿瘤通常是局部化的且是非转移性的。可用本发明的HDAC抑制剂治疗的特定类型的良性肿瘤包括血管瘤、肝细胞腺瘤、海绵状血管瘤、病灶性结节状增生、听神经瘤、纤维神经瘤、胆管腺瘤、胆管细胞瘤、纤维瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、间皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、结节状再生性增生、沙眼和化脓性肉芽肿。

在恶性肿瘤情形下，细胞变成无分化状态，对身体的生长控制信号无响应，并以不受控制的方式增殖。恶性肿瘤是侵袭性的，能扩散到远位(转移)。恶性肿瘤通常分为两类：原发的和继发的。原发肿瘤直接发生于其所在的组织。继发肿瘤或转移瘤为源自体内其他地方但现已扩散到远处器官的肿瘤。转移的常见途径是直接生长进相邻结构、通过血管或淋巴系统扩散和沿组织面和体隙(腹膜液、脑脊髓液等)行进。

可用本发明的HDAC抑制剂治疗的特定类型的癌或恶性肿瘤(原发的或继发的)包括但不限于白血病、乳腺癌、皮肤癌、骨癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、脑癌、喉癌、胆囊癌、胰腺癌、直肠癌、甲状旁腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、神经组织癌、头颈癌、结肠癌、胃癌、支气管癌、肾癌、基底细胞癌、溃疡和乳头型的鳞状细胞癌、转移性皮肤癌、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、网状细胞肉瘤、骨髓瘤、巨细胞瘤、小细胞肺瘤、胆石、胰岛细胞瘤、原发性脑瘤、急性和慢性淋巴细胞和颗粒细胞肿瘤、毛细胞瘤、腺瘤、增生、髓样癌、副神经节瘤、粘膜神经瘤、肠节细胞神经瘤、增生性角膜神经瘤、马方综合征体型瘤、维尔姆斯瘤、精原细胞瘤、卵巢瘤、平滑肌瘤、子宫颈非典型增生和原位癌、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、软组织肉瘤、恶性类癌瘤、局部皮肤损伤、蕈样霉菌病、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、恶性高钙血症、肾细胞瘤、真性红细胞增多症、腺癌、多形性胶质母细胞瘤、白血病、淋巴腺瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌及其他癌和肉瘤。

本发明的HDAC抑制剂也可用来治疗因外科手术中身体组织损伤引起的异常细胞增殖。这些损伤可能起因于多种外科术如关节外科、肠外科和蟹足肿癍疤形成。产生纤维化组织的疾病包括肺气肿。可用本发明治疗的重复性运动失调包括腕管综合征。可用本发明治疗的细胞增生症的实例为骨瘤。

可用本发明的HDAC抑制剂治疗的与器官移植相关的增殖反应包括影响潜在器官排斥或相关并发症的增殖反应。具体而言，这些增殖反应可能在心脏、肺、肝、肾和其他身体器官或器官系统的移植过程中发生。

可用本发明治疗的异常血管生成包括伴随类风湿性关节炎、缺血-再灌注相关脑水肿和损伤、脑皮层缺血、卵巢增生和血管过多、(多囊卵巢综合征)、子宫内膜异位、牛皮癣、糖尿病性视网膜病和其他眼血管生成病如早熟性视网膜病(晶状体后纤维形成)、黄斑变性、角膜移植排斥、neuroscular青光眼和Oster Webber综合征的那些异常血管生成。

可按本发明治疗的与不受控制的血管生成相关的疾病的实例包括但不限于视网膜/脉络膜新血管形成和角膜新血管形成。视网膜/脉络膜新血管形成的实例包括但不限于Bests病、近视、视窝、Stargarts病、Pagets病、静脉闭塞、动脉闭塞、镰状细胞性贫血、类肉瘤、梅毒、弹性假黄色瘤颈动脉阻塞病(pseudoxanthoma elasticum carotid apostructive diseases)、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分支杆菌感染、Lyme病、系统性红斑狼疮、早熟性视网膜病、Eales病、糖尿病性视网膜病、黄斑变性、Bechets病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染、类眼组织胞浆菌病、睫状体平坦部炎、慢性视网膜脱离、粘稠综合征、弓形体病、外伤和激光后并发症、与rubesis(角新血管形成)相关的疾病以及维管或纤维组织的异常增生引起的疾病(包括各种形式的增殖性玻璃体视网膜病)。角膜新血管生成的实例包括但不限于流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、隐形眼镜超戴症、特应性角膜炎、上部角膜缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、干燥综合征、红斑痤疮、小水疱病、糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、角膜移植排斥、蚕食性角膜溃疡、Terrien边缘变性、边缘性角膜炎、多动脉炎、Wegener结节病、巩膜炎、类天疱疮辐射性角膜散光症、新生血管性青光眼和晶状体后纤维形成、梅毒、分支杆菌感染、脂质变性、化学烧伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染和卡波西肉瘤。

也可用本发明的HDAC抑制剂治疗与不受控制的血管生成相关的慢性炎症疾病。慢性炎症依靠毛细管芽的连续形成来维持炎性细胞的流入。炎性细胞的流入和存在产生肉芽肿并因此维持慢性炎症状态。单独用HDAC抑制剂或与其他抗炎剂一起抑制血管生成可阻止肉芽肿的形成并因此减轻疾病。慢性炎症疾病的实例包括但不限于炎性肠病(如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、牛皮癣、结节病和类风湿性关节炎。

炎性肠病如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎以慢性炎症和在胃肠道中各位点上发生血管生成为特征。例如，克罗恩氏病作为慢性透壁炎症发生，最常影响末端回肠和结肠但也可发生在从口到肛门和肛周的胃肠道的任何部位中。患克罗恩氏病的患者通常有慢性腹泻并伴有腹痛、发热、厌食、体重减轻和腹胀。溃疡性结肠炎也是慢性的非特异性炎性和溃疡性疾病，发生在结肠粘膜中并以存在带血腹泻为特征。这些炎性肠病通常由整个胃肠道中的慢性肉芽肿炎症引起，包括炎性细胞轴突所包绕的新生毛细管芽。通过这些抑制剂对血管生成的抑制应抑制芽的形成并阻止肉芽肿的形成。炎性肠病也具有额外的肠表现如皮肤损伤。这类损伤以炎症和血管生成为特征并可发生在胃肠道的许多位点处。通过本发明的HDAC抑制剂对血管生成的抑制可减少炎性细胞的流入和阻止损伤形成。

另一种慢性炎症疾病结节病以多系统肉芽肿病为特征。该病的肉芽肿可在体内的任何地方形成。因此，症状取决于肉芽肿的位点以及该病是否是活动性的。肉芽肿由生成血管的毛细管芽引起，毛细管芽提供炎性细胞的恒定供给。通过用本发明的HDAC抑制剂来抑制血管生成，这样的肉芽肿形成可得到抑制。牛皮癣也是一种慢性复发性炎症疾病，以各种大小的丘疹和斑块为特征。单独用这些抑制剂或与其他抗炎剂结合的治疗应阻止维持特征性病变所必要的新血管的形成并减轻患者的症状。

类风湿性关节炎(RA)也是一种慢性炎症疾病，以外周关节的非特异性炎症为特征。认为关节滑膜内衬中的血管发生血管形成。除形成新的血管网络外，内皮细胞释放导致血管翳生长和软骨破坏的因子和活性氧。血管形成中涉及的因子可能积极有助于并帮助维持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。单独用本发明的HDAC抑制剂或与其他抗RA剂结合的治疗可阻止维持慢性炎症所必要的新血管的形成。

本发明的化合物还可用于治疗心/血管疾病如肥大、高血压、心肌梗塞、再灌注、缺血性心脏病、咽峡炎、心律失常、高胆固醇血症、动脉粥样硬化和中风。所述化合物还可用来治疗神经退行性疾病/CNS疾病如急性和慢性神经疾病，包括中风、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和阿尔茨海默病。

本发明的化合物也可用作抗微生物剂，例如抗菌剂。本发明因此也提供了一种用于细菌性感染治疗的化合物。本发明的化合物可用作针对病毒、细菌、真菌和寄生虫感染的抗感染化合物。感染的实例包括原虫寄生感染(包括疟原虫、小球隐孢子虫、鼠弓形虫、神经肉孢子虫和艾美球虫属)。

本发明的化合物特别适用于治疗不希望的或不受控制的细胞增殖，优选用于良性肿瘤/增生和恶性肿瘤的治疗，更优选用于恶性肿瘤的治疗，最优选用于CCL、乳腺癌和T-细胞淋巴瘤的治疗。

在本发明的优选实施方案中，本发明的化合物用于缓解癌症、心脏肥大、慢性心力衰竭、炎症、心血管疾病、血红蛋白病、地中海贫血症、镰状细胞病、CNS病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松症、MDS、良性前列腺肥大、口腔粘膜白斑、遗传相关的代谢失调、感染、Rubens-Taybi、脆性X综合征或α-1抗胰蛋白酶缺乏，或用于加速伤口愈合、用于保护毛囊或用作免疫抑制剂。

通常，所述炎症为皮肤炎症(例如牛皮癣、痤疮和湿疹)、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎(RA)、炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病或结肠炎。

通常，所述癌症为慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤或T-细胞淋巴瘤。

通常，所述心血管疾病为高血压、心肌梗塞(MI)、缺血性心脏病(IHD)(再灌注)、心绞痛、心律失常、高胆固醇血症、高脂血症、动脉粥样硬化、中风、心肌炎、充血性心脏病、原发和继发扩张性(充血性)心肌病、肥厚型心肌病、限制性心肌病、外周性血管疾病、心动过速、高血压或血栓症。

通常，所述遗传相关的代谢失调为囊性纤维化(CF)、过氧物酶体生物合成失调或肾上腺脑白质营养不良。

通常，本发明的化合物用作器官移植后的免疫抑制剂。

通常，所述感染为病毒、细菌、真菌或寄生虫感染，特别是金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌、念珠菌或曲霉所致的感染。

通常，所述CNS病为亨廷顿病、阿尔茨海默病、多发性硬化或肌萎缩性侧索硬化。

优选地，在该实施方案中，本发明的化合物用于缓解癌症、心脏肥大、慢性心力衰竭、炎症、心血管疾病、血红蛋白病、地中海贫血症、镰状细胞病、CNS病、自身免疫性疾病、糖尿病或骨质疏松症，或用作免疫抑制剂。

更优选本发明的化合物用来缓解慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、T-细胞淋巴瘤、心脏肥大、慢性心力衰竭或皮肤炎症，特别是牛皮癣、痤疮或湿疹。

本发明的化合物可用于动物的治疗，优选用于哺乳动物的治疗，更优选用于人的治疗。

合适的话，本发明的化合物可预防性地用来降低这类疾病的发生率。

本发明的化合物以治疗学有效的量施用于患者。按特定化合物的活性、接受治疗的患者的年龄、重量和状况、疾病的类型和严重性以及给药频率和途径，典型的剂量为约0.001到50mg每千克体重。优选日剂量水平为5mg到2g。

下面的实施例说明本发明。但它们不以任何方式限制本发明。在这方面，重要的是应理解实施例部分中所用的特定检测仅是为了指出抑制HDAC的活性而设计的。有许多检测方法可用来测定给定化合物作为HDAC拮抗剂的活性，因此，在任何一个特定检测中的负面结果均不是决定性的。

实施例

用如下所示方案制备(E)-(1S，7R，10S，21R)-7-异丙基-21-甲基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(pentaone)，下文称为化合物001：

[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰氨基]-乙酸甲酯(2)的制备

向搅拌的Fmoc保护的D-缬氨酸(2.70g，7.96mmol)/CH₂Cl₂(50mL)溶液中加入EDAC·HCl(1.83g，9.55mmol)、HOBt(1.30g，9.55mmol)和DIEA(3.8mL，27.86mmol)。室温下搅拌15分钟后加入甘氨酸甲酯(1，1.0g，7.96mmol)，反应混合物搅拌4小时，用CH₂Cl₂(50mL)稀释，用水(25mL)、10％HCl(25mL)、5％NaHCO₃溶液(25mL)和饱和NaCl溶液(25mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的2(2.81g，86％)：

mp＝148-150℃；[α]²² _D -7.32 (c0.50，CHCl₃)；[α]²² _D-7.32(c 0.50，CHCl₃)；IRv_max3287，1750，1690，1649，1535cm^-1；¹H NMR 400MHz 7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.57(d，J＝7.0Hz，2H)，7.39(t，J＝7.0Hz，2H)，7.28 (m，2H)，6.54(s，1H)，5.44(s，1H)，7.43 -4.38(m，2H)，4.21(t，J＝7.0Hz，1H)，4.01-3.96(m，3H) 3.72(s，3H)，2.16(m，1H)，0.96(t，J＝9.0Hz，6H)；¹³C NMR 100MHz 171.7(C)，170.1(C)，156.6(C)，143.9(C)，141.4(C)，127.8(CH)，127.2(CH)，125.2(CH)，120.1(CH)，67.2(CH₂)，60.4(CH)，52.5(CH)，47.3(CH₃)，41.2(CH₂)，31.2(CH)，19.3(CH₃)，17.9(CH)；MS m/z 432.9(M+Na)⁺，842.8(2M+Na)⁺。

{(R)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(三苯甲基硫烷基)-丙酰氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-乙酸甲酯(3)的制备

室温下向搅拌的2(1.0g，2.44mmol)/CH₃CN(48.5mL)溶液中加入Et₂NH(2.5mL)。室温下搅拌3小时后用己烷(100mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-(STrt)-D-半胱氨酸(1.70g，2.9mmol)/CH₃CN(25mL)溶液中加入EDAC·HCl(561.0mg，2.93mmol)、HOBt(396mg，2.93mmol)和DIEA(1.31mL，7.32mmol)。室温下搅拌15分钟后加入粗胺，反应混合物搅拌4小时，除去溶剂，将残留物溶解在CH₂Cl₂(100mL)中，用水(25mL)、10％HCl(25mL)、5％NaHCO₃溶液(25mL)和饱和NaCl溶液(25mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的3(1.46g，79％)：

[α]²² _D-2.35(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3267，1646，1543cm^-1；¹H NMR 400MHz 7.76 (t，J＝7.0Hz，2H)，7.54 (d，J＝6.5Hz，2H)，7.39-7.21(m 19H)，6.87(s，1H)，6.23(d，J＝8.0，2H)，5.04(d，J＝7.0，1H)，4.37(d，J＝7.0，2H)，4.29(dd，J＝8.6，J＝5.0，1H)，4.17 (t，J＝6.5，1H)，3.96 (m，1H)，3.72(dd，，J＝18.1，J＝5.0，1H)，3.65(s，3H)，3.60(m，1H)，2.70(d，J＝6.5，2H)，2.30(m，1H)，1.70(s，1H)，0.87(dd，J＝13.0，J＝7.0Hz，6H)；¹³C NMR 100MHz 170.6(C)，170.5(C)，170.1(C)，156.2(C)，144.3(C)，143.8(C)，143.7(C) 141.4(C)，129.6(CH)，128.4(CH)，128.0(CH)，127.8(CH)127.2(CH)，125.1(CH)，120.2(CH)，67.6(CH)，67.2(CH₂)，58.4(CH)，54.3(CH)，52.4(CH₃)， 47.1(CH)，40.9(CH₂)，33.6(CH₂)，30.0(CH)，19.4(CH₃)，17.4(CH₃)；MS m/z777.8(M+Na)⁺。

C₄₅H₄₅N₃O₆S分析计算值：71.50；H，6.00；N，5.56；实测值：C，71.42；H，5.99；N，5.55。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(4)的制备

室温下向搅拌的3(400mg，0.53mmol)/CH₃CN(30mL)溶液中加入Et₂NH(1.5mL)。室温下搅拌3小时后用庚烷(60mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-D-丙氨酸(198mg，0.636mmol)/CH₃CN(25mL)溶液中加入EDAC·HCl(122.0mg，0.634mmol)、HOBt(86mg，0.636mmol)和DIEA(502μl，1.91mmol)。室温下搅拌15分钟后加入粗胺，反应混合物搅拌18小时，除去溶剂，将残留物溶解在CH₂Cl₂(50mL)中，用水(15mL)、10％HCl(15mL)、5％NaHCO₃溶液(15mL)和饱和NaCl溶液(15mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的4(670mg，81％)：

mp＝195-197℃；[α]²² _D+5.1(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3267，3054，1744，1706，1635，1531.1cm^-1；¹H NMR 400MHz 7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.52(d，J＝7.0Hz，2H)，7.39(m，7H)，7.26-7.15(m，13H)，6.79(s，1H)，6.62(s，1H)，5.47(s，1H)，4.43-4.28(m，4H)，4.13(m，1H)，4.01(m，1H)，3.88(s，2H)，3.63(s，3H)，2.81(m，1H)，2.52(m，1H)，2.26，(m，1H)，1.30(d，J＝6.0Hz，3H)，0.94(d，J＝6.0Hz，3H)，0.89(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³C NMR 100MHz 172.7，171.1，170.2，156.1，144.4，143.9，143.8，141.4，129.6，128.3，127.9，127.2，127.1，125.1，120.1，58.5，52.7，52.3，50.8，47.2，41.0，33.5，30.4，19.3，19.0，17.7；MS m/z 849.2(M+Na)⁺，865.1(M+K)⁺。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(6)的制备

室温下向搅拌的4(137mg，0.166mmol)/CH₃CN(10mL)溶液中加入Et₂NH(0.5mL)。室温下搅拌5小时后用庚烷(30mL)稀释反应混合物，除去溶剂，加入CH₂Cl₂(10mL)，过滤并浓缩得到无色油状的粗胺。0℃下向搅拌的粗胺/CH₂Cl₂(4mL)溶液中加入5(84.0mg，0.149mmol，按Yurek-George，A.；Habens，F.；Brimmell，M.；Packham，G.；Ganesan，A.J.Am.Chem.Soc.2004，126，1030-1031中的程序制备)和DMAP(2.2mg，0.0176mmol)。室温下搅拌8小时后除去溶剂，残留物用快速色谱(洗脱剂30-40％的EtOAc/己烷)纯化，得到呈白色玻璃状的6(127mg，85％)：

mp＝191-193℃；[α]²² _D-18.0(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3272，3064，1758，1692，1621cm^-1；¹H NMR 400MHz(5％CD₃OD/CDCl₃)7.40(m，12H)，7.25(m，12H)，7.20(m，6H)，6.96 and 6.88(不稳定的NH，d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(dt，J＝15.0Hz，6.5Hz，1H)，5.37(dd，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，4.32(m，2H)，4.22(d，J＝6.0Hz，1H)，3.98(t，J＝7.0Hz，1H)，3.92(d，J＝18.1Hz，1H)，3.72(d，J＝17.6Hz，1H)，3.67(s，3H)，2.64(dd，J＝13.0Hz，7.5Hz，1H)，2.58(dd，J＝13.0Hz，7.5Hz，1H)，2.56-2.18(m，9H)，2.11(q，J＝6.5Hz，2H)，1.31(d，J＝7.5Hz，3H)，0.91(t，J＝7.0Hz，6H)；¹³CNMR 100MHz(5％CD₃OD/CDCl₃)173.0，172.0，171.3，170.5，170.2，144.9，144.2，132.8，129.9，129.7，129.6，129.5，128.2，128.1，127.9，127.1，126.7，69.6，67.1，66.7，58.9，58.8，52.7，52.2，50.0，49.8，49.6，49.5，49.4，49.1，43.7，40.9，40.8，33.1，31.5，31.3，30.0，19.2，17.5；MS m/z 1050.4(M+2Na)⁺。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸(7)的制备

0℃下向搅拌的6(220mg，0.222mmol)/4∶1 THF/H₂O(4.0mL)溶液中加入LiOH(11mg，0.440mmol)。搅拌1小时后，用H₂O(30ml)稀释反应混合物，用2M KHSO₄酸化至pH4-5，并用EtOAc(3×30mL)萃取。有机层用饱和NaCl溶液(15mL)洗涤，并干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩，得到白色固体，将该固体与乙醚一起研磨，得到呈白色固体的7(199.5mg，91％)，其不经处理直接用于下一步骤中：

mp＝191-193℃；[α]²² _D-18.5(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3413，1711，1678，1630，1451cm^-1；¹HNMR 400MHz(5％CD₃OD/CDCl₃)7.30(m，12H)，7.16(m，12H)，7.13 (m，6H)，5.43 (dt，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，5.30(dd，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，4.27(m，2H)，4.21(m，1H)，3.99(m，1H)，3.75(s，2H)，3.77(m，br，6H)，2.55(dd，J＝12.5Hz，6.5Hz，1H)，2.44 (dd，J＝12.5Hz，7.5Hz，1H)，2.21(m，2H)，2.12(m，3H)，2.02(m，2H)，1.23 (d，J＝7.0Hz，3H)，0.83(d，J＝7.0Hz，3H)，0.80(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³CNMR 100MHz(5％CD₃OD/CDCl₃)173.0，172.1，171.6，171.5，170.5，144.9，144.3，132.7，129.8，129.6，129.5，128.2，127.9，127.0，126.7，69.5，67.1，66.7，58.7，52.7，43.5，40.9，33.2，31.5，31.3，30.3，19.2，19.1，17.6； MS m/z 1013.2(M+Na)⁺。

(6R，9S，12R，16S)-6-异丙基-12-甲基-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-2，5，8，11，14-戊酮(8)的制备

0℃下向搅拌的羟基酸7(100mg，0.102mmol)/CH₂Cl₂(5mL)溶液中逐滴加入DCC(28.2mg，0.137mmol)/CH₂Cl₂(0.5mL)溶液。0℃下搅拌30分钟后，加入DMAP(2.5mg，0.0213mmol)/CH₂Cl₂(51mL)溶液，然后在室温下搅拌16小时。滤除固体沉淀，滤液用CH₂Cl₂(5mL)洗涤。有机层用水(10mL)、5％KHSO₄(10mL)、5％NaHCO₃溶液(10mL)和饱和NaCl溶液(10mL)洗涤，并干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩。残留物用快速色谱(洗脱剂30-50％的EtOAc/己烷)纯化，得到呈白色玻璃状的8(37mg，38％)。

(E)-(1S，7R，10S，21R)-7-异丙基-21-甲基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(化合物001)的制备

用5分钟向剧烈搅拌的I₂(37.1mg，0.146mmol)/MeOH(50mL)溶液中逐滴加入受保护的二巯基化物8(35mg，0.0365mmol)/MeOH(20mL)。再继续搅拌10分钟后，加入0.2M的抗坏血酸/0.2M柠檬酸缓冲液(4mL)并浓缩有机相，加入1∶1的EtOAc∶NaCl(20mL)，用EtOAc(5×25mL)萃取，合并有机萃取物，并干燥(Na₂SO₄)、过滤和脱除溶剂。残留物用快速色谱(洗脱剂1-6％的MeOH/CHCl₃)纯化，得到呈白色固体的化合物001(11.8mg，67％)：

[α]₂₂ ^D-98.0(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3300，2477，1734，1659，1526，1446cm^-1；¹H NMR 400MHz 7.41(d，J＝6.0Hz，1H)，7.23(d，J＝8.5Hz，1H)，6.37(s，1H)，5.94(dt，J＝16.5，7.5Hz，1H)，5.78-5.71(m，1H)，4.86(m，1H)，4.26(d，J＝7.5Hz，1H)，4.17(d，J＝14.0Hz，1H)，4.08(d，J＝14.0Hz，1H)，3.44(dd，J＝14.5Hz，10.0 Hz，1H)，3.22(d，J＝10.0Hz，1H)，2.88-2.56(m，8H)，1.49(d，J＝7.5Hz，3H)，0.98(d，J＝6.5Hz，3H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³C NMR 100MHz 173.2，171.9，170.9，170.1，168.3，129.8，70.2，64.4，55.9，51.7，41.7，38.2，37.9，35.7，31.0，26.9，20.2，19.7，15.4；HRMS m/z 509.1495(M+Na)⁺预期的509.1499。

合成式(I)所代表的类似物的一般程序

在步骤(a)中，带侧链R₂的氨基酸酯与带侧链R₁的第二种氨基酸缩合产生二肽。在步骤(b)中，二肽与受保护的半胱氨酸衍生物缩合产生三肽。在步骤(c)中，三肽与氨基酸结合产生受保护的四肽。在步骤(d)中，四肽的N-端去保护，游离胺与β-羟基酸衍生物结合。在本发明的优选实施方案中，R₄和R₅为H，X为如Yurek-George，A.；Habens，F.；Brimmell，M.；Packham，G.；Ganesan，A，J.Am.Chem.Soc.2004，126，1030-1031中所报道的手性助剂。在步骤(e)中，酯基水解，然后在步骤(f)中环化并在(g)中形成二硫键以完成双环酯肽化合物(I)的合成。

通过一般方案合成类似物9A-F。

[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰氨基]-乙酸甲酯(2A)的制备。

向搅拌的Fmoc保护的D-缬氨酸(2.70g，7.96mmol)/CH₂Cl₂(50mL)溶液中加入EDAC·HCl(1.83g，9.55mmol)、HOBt(1.30g，9.55mmol)和DIEA(3.8mL，27.86mmol)。室温下搅拌15分钟后加入甘氨酸甲酯(1A，1.0g，7.96mmol)，反应混合物搅拌4小时，用CH₂Cl₂(50mL)稀释，用水(25mL)、10％HCl(25mL)、5％NaHCO₃溶液(25mL)和饱和NaCl溶液(25mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的2A(2.81g，86％)：

mp＝148-150℃；[α]²² _D-7.32(c0.50，CHCl₃)；

IRv_max 3287，1750，1690，1649，1535cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.57(d，J＝7.0Hz，2H)，7.39(t，J＝7.0Hz，2H)，7.28(m，2H)，6.54(s，1H)，5.44(s，1H)，4.43-4.38(m，2H)，4.21(t，J＝7.0Hz，1H)，4.01-3.96(m，3H)，3.72(s，3H)，2.16(m，1H)，0.96(t，J＝9.0Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.7(C)，170.1(C)，156.6(C)，143.9(C)，141.4(C)，127.8(CHG)，127.2(CH)，125.2(CH)，120.1(CH)，67.2(CH₂)，60.4(CH)，52.5(CH)，47.3(CH₃)，41.2(CH₂)，31.2(CH)，19.3(CH₃)，17.9(CH)；MS m/z 842.8(30％，[2M+Na]⁺)，432.9(100％，[M+Na]⁺)。

{(R)-2-[(S)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-(三苯甲基硫烷基)-丙酰氨基]-3-甲基-丁酰氨基}-乙酸甲酯(3A)的制备

室温下向搅拌的2A(1.0g，2.44mmol)/CH₃CN(48.5mL)溶液中加入Et₂NH(2.5mL)。室温下搅拌3小时后用己烷(100mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-(STrt)-D-半胱氨酸(1.70g，2.9mmol)/CH₃CN(25mL)溶液中加入EDAC·HCl(561.0mg，2.93mmol)、HOBt(396mg，2.93mmol)和DIEA(1.31mL，7.32mmol)。室温下搅拌15分钟后加入粗胺，反应混合物搅拌4小时，除去溶剂，将残留物溶解在CH₂Cl₂(100mL)中，用水(25mL)、10％HCl(25mL)、5％NaHCO₃溶液(25mL)和饱和NaCl溶液(25mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的3A(1.46g，79％)：

[α]₂₂ ^D-2.35(c0.50，CHCl₃)；IRv_max3267，1646，1543cm^-1；

¹H NMR400MHz(400MHz，CDCl₃)δ7.76(t，J＝7.0Hz，2H)，7.54(d，J＝6.5Hz，2H)，7.39-7.21(m 19H)，6.87(s，1H)，6.23(d，J＝8.0，2H)，5.04(d，J＝7.0，1H)，4.37(d，J＝7.0，2H)，4.29(dd，J＝8.6，5.0，1H)，4.17(t，J＝6.5，1H)，3.96(m，1H)，3.72(dd，，J＝18.1，5.0，1H)，3.65(s，3H)，3.60(m，1H)，2.70(d，J＝6.5，2H)，2.30(m，1H)，1.70(s，1H)，0.87(dd，J＝13.0，J＝7.0Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ170.6(C)，170.5(C)，170.1(C)，156.2(C)，144.3(C)，143.8(C)，143.7(C) 141.4(C)，129.6(CH)，128.4(CH)，128.0(CH)，127.8(CH)127.2(CH)，125.1(CH)，120.2(CH)，67.6(CH)，67.2(CH₂)，58.4(CH)，54.3(CH)，52.4(CH₃)，47.1(CH)，40.9(CH₂)，33.6(CH₂)，30.0(CH)，19.4(CH₃)，17.4(CH₃)；LRMS m/z777.8(100％，[M+Na]⁺)；C₄₅H₄₅N₃O₆S分析计算值：71.50；H，6.00；N，5.56；实测值：C，71.42；H，5.99；N，5.55

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(4A)的制备

室温下向搅拌的3A(900mg，1.19mmol)/(CH₃CN/CH₂Cl₂)(1∶1，60mL)溶液中加入Et₂NH(3mL)。室温下搅拌3小时后用庚烷(60mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-D-丙氨酸(529mg，1.7mmol)/CH₂Cl₂(30mL)溶液中加入EDAC·HCl(326mg，1.7mmol)、HOBt(230mg，1.7mmol)和DIEA(627μL，3.6mmol)。室温下搅拌10分钟后加入粗胺/CH₂Cl₂(20mL)溶液，反应混合物搅拌18小时。用水(15mL)、10％HCl(15mL)、5％NaHCO₃溶液(15mL)和饱和NaCl溶液(15mL)洗涤，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的4A(810mg，0.98mmol，82％)：

mp＝195-197℃；[α]²² _D+5.1(c0.50，CHCl₃)；IRv_max 3267，3054，1744，1706，1635，1531.1cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.52(d，J＝7.0Hz，2H)，7.39(m，7H)，7.26-7.15(m，13H)，6.79(s，1H)，6.62(s，1H)，5.47(s，1H)，4.43-4.28(m，4H)，4.13(m，1H)，4.01(m，1H)，3.88(s，2H)，3.63(s，3H)，2.81(m，1H)，2.52(m，1H)，2.26，(m，1H)，1.30(d，J＝6.0Hz， 3H)，0.94(d，J＝6.0 Hz，3H)，0.89(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³CNMR(100MHz，CDCl₃)δ172.7，171.1，170.2，156.1，144.4，143.9，143.8，141.4，129.6，128.3，127.9，127.2，127.1，125.1，120.1，58.5，52.7，52.3，50.8，47.2，41.0，33.5，30.4，19.3，19.0，17.7；LRMS m/z849.2(100％，[M+Na]⁺)，865.1(20％，[M+K]⁺).

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(6A)的制备

室温下向搅拌的4A(760mg，0.92mmol)/(CH₂Cl₂/CH₃CN)(3∶2，150mL)溶液中加入Et₂NH(7.5mL)。室温下搅拌5小时后用庚烷(60mL)稀释反应混合物，除去溶剂，加入CH₂Cl₂(50mL)，过滤并浓缩得到无色油状的粗胺。室温下向搅拌的粗胺/CH₂Cl₂(30mL)溶液中加入5(672mg，1.20mmol，按Yurek-George，A.；Habens，F.；Brimmell，M.；Packham，G.；Ganesan，A.J.Am.Chem.Soc.2004，126，1030-1031中的程序制备)/CH₂Cl₂(5mL)和DMAP(15mg，0.12mmol)的溶液。室温下搅拌12小时后除去溶剂，残留物用快速色谱(洗脱剂10-100％的EtOAc/CH₂Cl₂)纯化，得到呈白色玻璃状的6A(740mg，80％)：

mp＝191-193℃；[α]²² _D-18.0(c0.50，CHCl₃)；

IR v_max 3272，3064，1758，1692，1621cm^-1；¹H NMR(400MHz，5％ CD₃OD/CDCl₃)δ7.40(m，12H)，7.25(m，12H)，7.20(m，6H)，6.96 and 6.88(labileNH，d，J＝8.0Hz，1H)，5.49(dt，J＝15.0Hz，6.5Hz，1H)，5.37(dd，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，4.32(m，2H)，4.22(d，J＝6.0Hz，1H)，3.98(t，J＝7.0Hz，1H)，3.92(d，J＝18.1Hz，1H)，3.72(d，J＝17.6Hz，1H)，3.67(s，3H)，2.64(dd，J＝13.0，7.5Hz，1H)，2.58(dd，J＝13.0，7.5Hz，1H)，2.56-2.18(m，9H)，2.11(q，J＝6.5Hz，2H)，1.31(d，J＝7.5Hz，3H)，0.91(t，J＝7.0Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，5％ CD₃OD/CDCl₃)δ173.0，172.0，171.3，170.5，170.2，144.9，144.2，132.8，129.9，129.7，129.6，129.5，128.2，128.1，127.9，127.1，126.7，69.6，67.1，66.7，58.9，58.8，52.7，52.2， 50.0，49.8，49.6，49.5，49.4，49.1，43.7，40.9，40.8，33.1，31.5，31.3，30.0，19.2，17.5； LRMS m/z1050.4 (100％，[M+Na]⁺).

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸(7A)的制备

0℃下向搅拌的6A(700mg，0.70mmol)/THF(15mL)溶液中加入LiOH(25mg，1.05mmol)/H₂O(2.4mL)溶液。搅拌1小时后，用H₂O(30ml)稀释反应混合物，用1M KHSO₄酸化至pH 3-4，并用EtOAc(3×30mL)萃取。有机层用饱和NaCl(15mL)洗涤，并干燥(Na₂SO₄)、过滤和浓缩，得到白色固体，将该固体与乙醚一起研磨，得到呈白色固体的7A(693mg，99％)，其不经处理直接用于下一步骤中：

mp＝191-193℃；[α]²² _D -18.5(c0.50，CHCl₃)；IR v_max 3413，1711，1678，1630，1451cm^-1；¹H NMR(400MHz，5％CD₃OD/CDCl₃)δ7.30(m，12H)，7.16(m，12H)，7.13(m，6H)，5.43(dt，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，5.30(dd，J＝15.5Hz，6.0Hz，1H)，4.27(m，2H)，4.21(m，1H)，3.99(m，1H)，3.75(s，2H)，3.77(m，br，6H)，2.55(dd，J＝12.5Hz，6.5Hz，1H)，2.44(dd，J＝12.5Hz，7.5Hz，1H)，2.21(m，2H)，2.12(m，3H)，2.02(m，2H)，1.23(d，J＝7.0Hz，3H)，0.83(d，J＝7.0Hz，3H)，0.80(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，5％CD₃OD/CDCl₃)δ173.0，172.1，171.6，171.5，170.5，144.9，144.3，132.7，129.8，129.6，129，5，128.2，127.9，127.0，126.7，69.5，67.1，66.7，58.7，52.7，43.5，40.9，33.2，31.5，31.3，30.3，19.2，19.1，17.6；LRMSm/z 1013.2(100％，[M+Na]⁺)。

(6R，9S，12R，16S)-6-异丙基-12-甲基-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-2，5，8，11，14-戊酮(8A)的制备

用5小时向(2-甲基-6-硝基苯甲酸酐(MNBA)(289mg，0.84mmol)+DMAP(205mg，1.68mmol))/CH₂Cl₂(160mL)溶液中逐滴加入酸7A(693mg，0.70mmol)/(CH₂Cl₂/THF)(2∶1，600mL)溶液。再过12小时后，加入1M HCl(150mL)，用CH₂Cl₂(3×100mL)萃取。合并有机相，用饱和NaHCO₃溶液(150mL)、随后用盐水(80mL)洗涤，然后干燥(MgSO₄)、过滤和浓缩。残留物用快速色谱(洗脱剂50-100％的EtOAc/己烷)纯化，得到呈白色玻璃状的8A(478mg，0.49mmol，70％)：

[α]²² _D-7.0(c0.50，CHCl₃)；IR v_max1735，1659，1526cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 7.43-7.33(m，12H)，7.32-7.13(m，20H)，6.77(d，J＝5.3Hz，1H)，6.54(d，J＝7.3Hz，1H)，5.58(dt，J＝15.1，6.8Hz，1H)，5.44-5.29(m，2H)，4.55(dd，J＝16.8，9.0Hz，1H)，4.46(dd，J＝9.5，4.3Hz，1H)，3.89(quin，(dd，J＝7.0Hz，1H)，3.77(dt，J＝8.3，5.3Hz，1H)，3.43(dd，J＝16.8，2.8Hz，1H)，3.03(dd，J＝12.6，8.3Hz，1H)，2.61-2.49(m，3H)，2.18(t，J＝7.5Hz，2H)，2.11-1.95(m，2H)，1.38(d，J＝7.0Hz，3H)，0.94(d，J＝6.8Hz，3H)，0.90(d，J＝6.8Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ174.0(C)，170.9(C)，170.8(C)，169.8(C)，169.3(C)，144.9(C)，144.3(C)，133.2(CH)，129.7(CH)，1Z9.5(CH)，128.3(CH)，128.0(CH)，127.2(CH)，126.8(CH)，72.3(CH)，67.3(C)，66.8(C)，58.3(CH)，55.9(CH)，50.5(CH)，41.7(2×CH₂)，32.5(CH₂)，31.3(CH₂)，31.2(CH₂)，28.8(CH)，19.8(CH₃)，19.8(CH₃)，17.2(CH₃)，16.7(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z996(100％，[M+Na]⁺)，974(10％，[M+H]⁺)。

(E)-(1S，7R，10S，21R)-7-异丙基-21-甲基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(9A)的制备

用30分钟向剧烈搅拌的I2(1120mg，4.42mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，1000mL)溶液中逐滴加入受保护的二巯基化物8A(430mg，0.44mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，500mL)。再搅拌30分钟后，加入0.1M的硫代硫酸钠溶液(300mL)和饱和NaCl(100mL)，用CH₂Cl₂(3×100mL)萃取。合并有机萃取物，并干燥(MgSO₄)、过滤和脱除溶剂。残留物用快速色谱(洗脱剂1-6％的MeOH/CH₂Cl₂)纯化，得到呈白色固体的9A(205mg，0.42mmol，96％)：

[α]²² _D-98.0(c0.50，CHCl₃)；

IR v_max3300，2477，1734，1659，1526，1446cm^-1；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.46(d，J＝6.5Hz，1H)，7.33(t，J＝5.3Hz，1H)，7.28(d，J＝8.8Hz，1H)，6.60(d，J＝3.8Hz，1H)，5.95(dtd，J＝16.1，6.5，2.0Hz，1H)，5.80-5.70(m，2H)，4.85(ddd，J＝9.8，8.5，3.8Hz，1H)，4.21(qd，J＝7.3，3.8Hz，1H)，4.11(d，J＝5.3Hz，2H)，3.44(dd，J＝15.6，10.0Hz，1H)，3.20(dd，J＝10.3，6.8Hz，1H)，3.01-2.95(m，2H)，2.92(dd，J＝15.6，4.0Hz，1H)，2.85-2.58(m，5H)1.49(d，J＝7.5Hz，3H)，0.98(d，J＝6.5Hz，3H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³CNMR 100MHz 173.3(C)，171.6(C)，171.0(C)，169.4(C)，168.2(C)，130.4(CH)，130.3(CH)，69.8(CH)，64.9(CH)，54.5(CH)，52.0(CH)，42.4(2×CH₂)，38.7(CH₂)，38.6(CH₂)，32.7(CH₂)，27.5(CH)，20.8(CH₃)，20.1(CH₃)，16.7(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z995(50％，[2M+Na]⁺)，509(80％，[M+Na]⁺)，487(100％，[M+H]⁺)；HRMS m/z509.1495(M+Na)⁺预期的509.1499.

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(4B)的制备

室温下向搅拌的3A(836mg，1.11mmol)/(CH₃CN/CH₂Cl₂)(1∶1，60mL)溶液中加入Et₂NH(3mL)。室温下搅拌3小时后用庚烷(60mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-D-苯丙氨酸(650mg，1.7mmol)/CH₂Cl₂(30mL)溶液中加入EDAC·HCl(326mg，1.7mmol)、HOBt(230mg，1.7mmol)和DIEA(627μl，3.6mmol)。室温下搅拌10分钟后加入粗胺/CH₂Cl₂(20mL)溶液，反应混合物搅拌12小时。随之用水(15mL)、10％HCl(15mL)、5％NaHCO₃溶液(15mL)和饱和NaCl溶液(15mL)洗涤反应，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的4B(800mg，0.89mmol，80％)：

IRv_max3264，3053，1742，1701，1636，1532cm^-1；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.75(d，J＝7.5Hz，2H)，7.46(t，J＝7.5Hz，2H)，7.41-7.31(m，8H)，7.30-7.07(m，16H)，7.01(brs，1H)，6.54(brs，2H)，5.29(brs，1H)，4.48-4.32(m，3H)，4.25-4.13(m，1H)，4.10(t，J＝8.5Hz，1H)，3.99-3.76(m，3H)，3.65(s，3H)，3.10-2.88(m，2H)，2.83-2.69(m，1H)，2.49(dd，J＝13.0，6.3Hz，1H)，2.36-2.22，(m，1H)，0.93(t，J＝7.0Hz，6H)；¹³C NMR 100MHz 171.2(C)，171.0(C)，170.2(C)，170.0(C)，156.2(C)，144.3(C)，143.9(C)，143.7(C)，141.4(C)，136.0(C)，129.5(CH)，129.3(CH)，129.0(CH)，128.3(CH)，127.9(CH)，127.4(CH)，127.2(CH)，127.1(CH)，125.2(CH)，120.1(CH)，67.3(CH₂)，58.6(CH)，56.2(CH)，52.8(CH)，52.3(CH₃)，47.2(CH)，41.0(CH₂)，38.3(CH₂)，33.5(CH₂)，30.2(CH)，19.4(CH₃)，17.7(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1828(30％，[2M+Na]⁺)，925(100％，[M+Na]⁺)。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-3-苯基-丙酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(6B)的制备

室温下向搅拌的4B(245mg，0.28mmol)/(CHCl₃/CH₃CN)(1∶1，14mL)溶液中加入Et₂NH(1mL)。室温下搅拌5小时后用庚烷(10mL)稀释反应混合物，除去溶剂，得到无色油状的粗胺。室温下向搅拌的粗胺/CH₂Cl₂(10mL)溶液中加入5(193mg，0.34mmol)/CH₂Cl₂(5mL)溶液和DMAP(4mg，0.034mmol)。室温下搅拌12小时后除去溶剂，残留物用快速色谱(洗脱剂2-4％的MeOH/CH₂Cl₂)纯化，得到呈白色固体的6B(190mg，64％)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.46-7.05(m，37H)，6.85(brs，1H)，6.34(brs，1H)，5.44(dt，J＝15.3，6.5Hz，1H)，5.29(dd，J＝15.3，6.2Hz，1H)，4.74(brd，J＝5.3Hz，1H)，4.37(t，J＝7.0Hz，1H)，4.33-4.25(m，1H)，4.20-4.08(m，1H)，3.93-3.74(m，2H)，3.65(s，3h)，3.31(brs，1H)，3.06(dd，J＝14.3，5.3Hz，1H)，2.96(dd，J＝14.3，7.3Hz，1H)，2.59(dd，J＝12.5，6.8Hz，1H)，2.33-2.08(m，5H)，2.04(q，J＝7.0Hz，2H)，0.90(t，J＝6.3Hz，6H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ171.9(C)，171.2(C)，171.1(C)，170.4(2×C)，145.0(C)，144.3(C)，136.1(C)，132.5(CH)，130.1(CH)，129.7(CH)，129.5(CH)，129.3(CH)，128.8(CH)，128.2(CH)，128.0(CH)，127.3(CH)，127.1(CH)，126.7(CH)，69.8(CH)，67.1(C)，66.8(C)，58.9(CH)，54.4(CH)，52.6(CH)，52.3(CH₃)，43.7(CH₂)，41.0(CH₂)，37.6(CH₂)，33.8(CH₂)，31.5(CH₂)，31.4(CH₂)，30.3(CH)，19.3(CH₃)，17.9(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1104(100％，[M+Na]⁺)，1082(50％，[M+H]⁺)。

(6R，9S，12R，16S)-12-苄基-6-异丙基-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-2，5，8，11，14-戊酮(8B)的制备

向甲酯6B(180mg，0.17mmol)/THF(0℃，10mL)溶液中加入LiOH(6mg，0.25)/H₂O(1.5mL)溶液。1小时后加入1M HCl(6mL)结束反应。加入CHCl₃(50mL)，分离有机相，用CHCl₃(2×10mL)萃取。有机相用盐水(15mL)洗涤，然后干燥(MgSO₄)、过滤和真空浓缩，得到呈白色固体的粗酸7B(179mg，定量(quantative))，其立即用于下一步骤中：

(ES-)mz1066(100％，[M-H]^-)。

用3小时向(MNBA(68mg，0.20mmol)+DMAP(49mg，0.40mmol))/CH₂Cl₂(40mL)溶液中逐滴加入酸7B(179mg，0.17mmol)/(CH₂Cl₂/THF)(15∶1，160mL)溶液(Nb先将酸溶于THF中，然后加入CH₂Cl₂)。再过14小时后，加入1M HCl(40mL)结束反应。分离有机相(用CH₂Cl₂萃取)并依次用NaHCO₃(30mL)和盐水(20mL)洗涤。合并有机相，干燥(MgSO₄)、过滤并真空浓缩，得到黄色油。用硅胶柱色谱纯化(30-70％的EtOAc/CH₂Cl₂)，得到呈白色固体的8B(108mg，0.10mmol，60％)：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.42-7.08(m，35H)，7.05(d，J＝7.3Hz，2H)，6.96(brs，1H)，6.54(brs，1H)，5.46(dt，J＝15.3，6.5Hz，2H)，5.21(dd，J＝15.3，6.6Hz，1H)，4.49(dd，J＝13.5，4.3Hz，1H)，4.32(dd，J＝16.8，9.0Hz，1H)，4.16-4.06(m，1H)，3.85(brq，J＝6.0Hz，1H)，3.02-2.82(m，4H)，2.65-2.53(m，2H)，2.40(dd，J＝14.6，3.3Hz，1H)，2.23(dd，J＝14.6，11.3Hz，1H)，2.10(t，J＝7.0Hz，2H)，1.97-1.84(m，2H)，0.98(d，J＝7.0Hz，3H)，0.92(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.5(C)，170.8(C)，170.7(C)，169.9(2×C)，144.9(C)，144.2(C)，136.3(C)，132.7(CH)，129.6(CH)，129.5(CH)，129.3(CH)，128.9(CH)，128.3(CH)，128.0(CH)，127.9(CH)，127.3(CH)，127.1(CH)，126.7(CH)，72.2(CH)，67.3(C)，66.7(C)，58.3(CH)，55.8(2×CH)，42.0(CH₂)，41.4(CH₂)，36.7(CH₂)，32.3(CH₂)，31.3(CH₂)，31.1(CH₂)，28.7(CH)，19.8(CH₃)，17.2(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1071(100％，[M+Na]⁺)，1066(10％，[M+NH₄]⁺)，1049(10％，[M+H]⁺)。

(E)-(1S，7R，10S，21R)-21-苄基-7-异丙基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(9B)的制备

用30分钟向剧烈搅拌的I2(254mg，1.0mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，230mL)溶液中逐滴加入双-三苯甲基化合物8B(105mg，0.10mmol)的溶液。再搅拌30分钟后，加入硫代硫酸钠(0.05M，100mL)、然后加入盐水(10mL)结束反应。分离有机相，水相用CH₂Cl₂(3×15mL)萃取。合并有机相，并干燥(MgSO₄)、过滤和真空浓缩，得到白色固体。用硅胶柱色谱纯化(1-3.5％的MeOH/CH₂Cl₂)，得到呈白色固体的双环酯肽9B(43mg，0.08mmol，75％)：

[α]²⁵ _D-98(c0.05，1∶1 MeOH/CHCl₃)；

IRv_max 3280，1732，1627，1538，1445cm^-1；¹H-NMR(400MHz，19∶1 CD₃OD/CDCl₃)δ7.35-7.18(m，5H)，5.86-5.76(m，1H)，5.74-5.66(m，2H)，4.62(dd，J＝11.3，4.0Hz，1H)，4.45(dd，J＝9.3，5.3Hz，1H)，4.28(d，J＝17.6Hz，1H)，3.77(d，J＝17.6Hz，1H)，3.39(d，J＝10.5Hz，1H)，3.27-3.17(m，2H)，3.11-2.99(m，3H)，2.97-2.83(m，2H)，2.81(dd，J＝13.6，2.0Hz，1H)，2.70-2.53(m，3H)，0.96(d，J＝6.5Hz，3H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，19∶1 CD₃OD/CDCl₃)δ173.8(C)，173.2(C)，172.9(C)，171.3(C)，169.4(C)，137.7(CH)，131.3(CH)，131.3(CH)，129.7(CH)，129.6(CH)，128.0(CH)，71.9(CH)，65.9(CH)，58.3(CH)，58.1(CH)，42.6(CH₂)，39.3(2×CH₂)，36.9(CH₂)，36.8(CH₂)，31.8(CH₂)，28.1(CH)，20.6(CH₃)，20.5(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 580(50％，[2M+Na]⁺)，563(100％，[M+NH₄]⁺)，563(10％[M+H]⁺)。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(4C)的制备

室温下向搅拌的3A(836mg，1.11mmol)/(CH₃CN/CH₂Cl₂)(1∶1，60mL)溶液中加入Et₂NH(3mL)。室温下搅拌3小时后用庚烷(60mL)稀释反应混合物并浓缩得到无色油状的粗胺。向搅拌的Fmoc-D-缬氨酸(577mg，1.7mmol)/CH₂Cl₂(40mL)溶液中加入EDAC·HCl(326mg，1.7mmol)、HOBt(230mg，1.7mmol)和DIEA(627μl，3.6mmol)。室温下搅拌10分钟后加入粗胺/CH₂Cl₂(20mL)溶液，反应混合物搅拌12小时。随之用水(15mL)、10％HCl(15mL)、5％NaHCO₃溶液(15mL)和饱和NaCl溶液(15mL)洗涤反应，经干燥(Na₂SO₄)、过滤和溶剂脱除，得到灰白色固体，用CH₃CN重结晶，得到呈白色固体的4C(734mg，0.86mmol，78％)：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.74(d，J＝7.5Hz，2H)，7.53(t，J＝7.5Hz，2H)，7.42-7.32(m，9H)，7.30-7.19(m，9H)，7.16(t，J＝7.0Hz，2H)，6.80(d，J＝8.0Hz，1H)，6.57(d，J＝7.0Hz，1H)，5.52(d，J＝8.0Hz，1H)，4.44(t，J＝8.0Hz，1H)，4.38(dd，J＝10.5，7.5Hz，1H)，4.25(dd，J＝10.5，7.0Hz，1H)，4.17-3.95(m，3H)，3.87(dd，J＝18.1，5.5Hz，1H)，3.78(dd，J＝18.1，5.5Hz，1H)，3.63(s，3H)，2.71(dd，J＝12.5，6.0Hz，1H)，2.53(dd，J＝12.5，6.0Hz，1H)，2.21(sept，J＝6.4Hz，1H)，2.07-1.93(m，1H)，0.93-0.83(m，12H)；¹³C NMR 100MHz 171.5(C)，171.1(C)，170.2(2×C)，156.6(C)，144.4(C)，144.0(C)，143.8(C)，141.4(C)，129.6(CH)，128.3(CH)，127.9(CH)，127.2(CH)，127.1(CH)，125.2(CH)，120.1(CH)，67.3(CH₂)，67.2(C)，60.3(CH)，58.5(CH)，52.5(CH)，52.3(CH)，47.3(CH)，41.0(CH₂)，33.8(CH₂)，31.5(CH)，30.5(CH)，19.2(2×CH₃)，18.0(CH₃)，17.8(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 1832(10％，[2M+Na]⁺)，877.5(100％，[M+Na]⁺)。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-3-甲基-丁酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(6C)的制备

室温下向搅拌的4C(235mg，0.28mmol)/(CHCl₃/CH₃CN)(1∶1，14mL)溶液中加入Et₂NH(1mL)。室温下搅拌5小时后用庚烷(10mL)稀释反应混合物，除去溶剂，得到无色油状的粗胺。室温下向搅拌的粗胺/CH₂Cl₂(10mL)溶液中加入5(193mg，0.34mmol)/CH₂Cl₂(5mL)溶液和DMAP(4mg，0.034mmol)。室温下搅拌12小时后除去溶剂，残留物用快速色谱(洗脱剂1-3％的MeOH/CH₂Cl₂)纯化，得到呈白色固体的6C(230mg，81％)：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.42-7.38(m，12H)，7.30-7.14(m，20H)，6.74(brs，1H)，6.39(brs，1H)，5.49(dtd，J＝15.3，6.5，0.8Hz，1H)，5.36(dd，J＝15.3，6.3Hz，1H)，4.39-4.26(m，3H)，4.16-4.06(m，1H)，3.83(d，J＝5.5Hz，2H)，3.65(s，3H)，3.33(brs，1H)，2.60(dd，J＝12.8，7.3Hz，1H)，2.54(dd，J＝12.8，6.8Hz，1H)，2.37(dd，J＝14.0，3.0Hz，1H)，2.30-2.02(m，7H)，0.90(d，J＝7.0Hz，3H)，0.89(d，J＝7.0Hz，3H)，0.88(d，J＝7.0Hz，3H)，0.85(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ172.1(C)，171.4(C)，171.2(C)，170.5(C)，170.3(C)，145.0(C)，144.3(C)，132.6(CH)，130.2(CH)，129.7(CH)，129.5(CH)，128.3(CH)，128.0(CH)，127.1(CH)，126.8(CH)，69.8(CH)，67.1(C)，66.8(C)，59.0(CH)，58.9(CH)，52.5(CH)，52.3(CH₃)，43.9(CH₂)，41.0(CH₂)，33.7(CH₂)，31.5(2×CH₂)，30.4(CH)，30.2(CH₂)，19.5(CH₃)，19.3(CH₃)，17.9(2×CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1056(100％，[M+Na]⁺)，1051(50％，[M+NH₄]⁺)。

(6R，9S，12R，16S)-6，12-二异丙基-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-2，5，8，11，14-戊酮(8C)的制备

0℃下向甲酯6B(220mg，0.21mmol)/THF(12mL)溶液中加入LiOH(7.6mg，0.32)/H₂O(2mL)溶液。1小时后加入1M HCl(6mL)结束反应。加入CHCl₃(50mL)，分离有机相，用CHCl₃(2×15mL)萃取。有机相用盐水(10mL)洗涤，然后干燥(MgSO₄)、过滤和真空浓缩，得到呈白色固体的粗酸7C(217mg，定量)，其立即用于下一步骤中：(ES^-)m/z 1017(100％，[M-H]^-)。

用3小时向(MNBA(90mg，0.26mmol)+DMAP(62mg，0.51mmol))/CH₂Cl₂(50mL)溶液中逐滴加入酸7C(217mg，0.21mmol)/(CH₂Cl₂/THF)(15∶1，200mL)溶液(Nb.先将酸溶于THF中，然后加入CH₂Cl₂)。再过14小时后，加入1M HCl(40mL)结束反应。分离有机相(用CH₂Cl₂萃取)并依次用NaHCO₃(30mL)和盐水(20mL)洗涤。合并有机相，干燥(MgSO₄)、过滤并真空浓缩，得到黄色油。用硅胶柱色谱纯化(30-70％的EtOAc/CH₂Cl₂)，得到呈白色固体的8C(130mg，0.13mmol，62％)：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.88(brs，2H)，7.42-7.34(m，12H)，7.29-7.14(m，19H)，6.20(br d，J＝7.0Hz，1H)，5.62-5.50(m，2H)，5.31(dd，J＝15.3，6.4Hz，1H)，4.36(dd，J＝17.3，8.3Hz，1H)，4.24(dd，J＝8.5，4.5Hz，1H)，4.11(t，J＝73Hz，1H)，3.65-3.56(m，1H)，3.42(d，J＝14.5Hz，1H)，2.99(t，J＝10.8Hz，1H)，2.64(dd，J＝12.0，6.3Hz，1H)，2.50(dd，J＝15.1，2.5 Hz，1H)，2.35(dd，J＝14.8，9.8Hz，1H)，2.17(t，J＝7.5Hz，2H)，2.06-1.86(m，3H)，1.84-1.72(m，1H)，0.91(d，J＝6.8Hz，3H)，0.88(d，J＝6.3Hz，6H)，0.83(d，J＝6.8Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.8(C)，172.2(C)，171.0(C)，169.5(C)，168.9(C)，145.0(C)，144.4(C)，132.7(CH)，129.7(CH)，128.2(CH)，128.1(CH)，128.0(CH)，127.0(CH)，126.8(CH)，72.2(CH)，67.3(C)，66.8(C)，58.8(CH)，58.7(CH)，58.4(CH)，42.1(CH₂)，41.9(CH₂)，32.0(CH₂)，31.5(CH₂)，31.3(CH)，31.2(CH₂)，29.4(CH)，19.6(CH₃)，19.4(CH₃)18.5(CH₃)，17.0(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1023(100％，[M+Na]⁺)，1018(60％，[M+NH₄]⁺)。

(E)-(1S，7R，10S，21R)-7，21-二异丙基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(9C)的制备

用30分钟向剧烈搅拌的I₂(305mg，1.2mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，280mL)溶液中逐滴加入双-三苯甲基化合物8C(120mg，0.12mmol)的溶液。再搅拌30分钟后，加入硫代硫酸钠(0.05M，100mL)、然后加入盐水(10mL)结束反应。分离有机相，水相用CH₂Cl₂(3×15mL)萃取。合并有机相，并干燥(MgSO₄)、过滤和真空浓缩，得到白色固体。用硅胶柱色谱纯化(1-4％的MeOH/CH₂Cl₂)，得到呈白色固体的双环酯肽9C(60mg，0.12mmol，97％)：

[α]₂₅ ^D-105.7(1∶1 MeOH/CHCl₃，c0.15)；

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ5.76-5.63(m，3H)，4.52(dd，J＝11.3，4.7Hz，1H)，3.96(d，J＝5.1Hz，1H)，3.74(d，J＝17.5Hz，1H)，3.38(d，J＝10.9Hz，1H)，3.19-3.11(m，2H)，3.09-2.96(m，3H)，2.90(dd，J＝13.6，2.5Hz，1H)，2.71-2.62(m，2H)，2.58-2.44(m，1H)，2.31-2.18(m，1H)，1.11(d，J＝7.0Hz，3H)，1.09(d，J＝7.0Hz，3H)，1.01(d，J＝6.6Hz，3H)，0.91(d，J＝6.6Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ171.8(C)，171.7(C)，170.7(C)，170.4(C)，168.3(C)，130.0(CH)，129.6(CH)，69.8(CH)，64.6(CH)，61.9(CH)，54.8(CH)，42.2(CH₂)，39.3(CH₂)，37.5(CH₂)，37.1(CH₂)，32.1(CH₂)，29.2(CH)，27.3(CH)，20.6(CH₃)，20.0(CH₃)，19.4(CH₃)，19.0(CH₃)；LRMS(ES⁺) m/z 537(100％，[M+Na]⁺)，515(90％，[M+H]⁺)。

((R)-2-{(S)-2-[(R)-6-叔丁氧羰基氨基-2-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-己酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(4D)的制备

在氩气下将三肽3A(548mg，0.7mmol)溶解在CH₂Cl₂/CH₃CN(44mL，1∶1)中，然后在搅拌下加入二乙胺(1.65mL，16mmol)，反应混合物在室温下搅拌4.5小时。然后向反应混合物中加入己烷(100mL)，真空除去溶剂，再用己烷(3×25mL)重复此过程。粗胺然后在高真空下干燥40分钟。然后在氩气中伴随搅拌向(PyBop(558mg，1.1mmol)+Fmoc-D-赖氨酸(Boc)-OH(477mg，1mmol))/CH₃CN(16.5mL)溶液中加入二异丙基乙胺(0.45mL，2.6mmol)。将所得去保护的胺3加入CH₂Cl₂(19mL)中，反应混合物在室温下搅拌16小时。然后真空除去溶剂，所形成的固体用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂6∶4的EtOAc/己烷)，得到呈白色固体的4D(571mg，0.57mmol，81％)：

R_f 0.17 EtOAc/己烷(6∶4)：[α]_D ²⁶＝+47(c0.3，MeOH)；

IR3294，1744，1646，1515，1445(m)；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ 7.74(d，J＝8.0，2H)，7.56-7.51(m，2H)，7.42-7.34(m，8H)，7.30-7.17(m，11H)，7.02(brs，1H)，6.94(brs，1H)，6.59(d，J＝8.03Hz，1H)，5.75(s，1H)，4.38-4.21(m，2H)，4.18(dd，J＝8.5，6.0Hz，1H)，4.15-4.05(m，2H)，3.87(d，J＝5.5Hz，3H)，3.55(s，3H)，3.03(br d，J＝8.0Hz，2H)，2.76-2.67(m，1H)，2.66-2.58(m，1H)，2.20-2.10(m，1H)，1.93-1.84(m，2H)，1.82-1.72(m，1H)，1.70-1.59(m，1H)，1.43(s，9H)，1.50-1.30(m，3H)，0.89(d，J＝7.02Hz，3H)，0.84(d，J＝7.03Hz，3H)，¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ172.6(C)，171.4(C)，170.6(C)，170.6(C)，156.6(C)，156.3(CO)，144.4(C)，144.3(C)，143.9(C)，143.8(C)，141.4(C)，129.7(CH)，129.5(CH)，128.3(CH)，128.2(CH)，127.2(CH)，127.1(CH)，125.2(CH)，120.0(CH)，67.4(CH₂)，47.2(CH₃)，41.1(CH₂)，40.0(CH₂)，33.5(CH₂)，31.9(CH₂)，30.3(CH₂)，29.8(CH)，28.6(CH₃)，22.5(CH₂)，19.4(CH₃)，17.9(CH₃)，52.3(CH)，52.8(CH)，55.1(CH)，59.0(CH)；LRMS(ES⁺)1007.0(100％，[M+Na]⁺).

((R)-2-{(S)-2-[(R)-6-叔丁氧羰基氨基-2-((S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-烯酰氨基)-己酰氨基]-3-三苯甲基硫烷基-丙酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-乙酸甲酯(6D)的制备

在氩气下向四肽4D(201mg，0.2mmol)/(CH₂Cl₂(13.5mL)+CH₃CN(16.5mL))溶液中加入三乙胺(1mL，9.6mmol)并将反应混合物搅拌5小时。真空除去溶剂，并用己烷(2×10mL)重复此过程。然后向粗胺/CH₂Cl₂(7mL)溶液中加入DMAP(4mg，0.03mmol)，随后加入5(158mg，0.28mmol)/CH₂Cl₂(7mL)溶液。然后搅拌反应18小时。然后真空除去溶剂，所形成的固体用硅胶柱色谱纯化(洗脱剂6∶4-7∶3的EtOAc/己烷)，得到呈白色固体的6D(136mg，0.12mmol，60％)：

mp 85-87℃；R_f 0.29 EtOAc/己烷(8∶2)；[α]²⁹ _D＝+19(c0.49，CH₂Cl₂)；

IR(薄膜)3289，1751，1687，1634，1521，1490，1443；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.42-7.35(m，15H)，7.29-7.16(m，17H)，6.95(d，J＝7.5Hz，1H)，6.80(d，J＝8.0Hz，1H)，5.48(dt，J＝15.1，6.5Hz，1H，)，5.35(dd，J＝15.1，6.0Hz，1H，)，4.65(s，1H)，4.46-4.35(m，2H)，4.21(dd，J＝8.5，6.52Hz，1H)，4.04-3.96(m，1H)，3.93(d，J＝5.5Hz，1H)，3.89-3.81(m，2H)，3.62(s，3H)，3.02(d，J＝5.5Hz，2H)，2.60-2.45(m，2H)，2.35-2.00(m，9H)，1.85-1.74(m，1H)，1.66-1.54(m，1H)，1.40(s，9H)，1.47-1.25(m，2H)，0.88(d，J＝7.0Hz，3H，)，0.84(d，J＝7.0Hz，3H)，¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ172.3(C)，172.2(C)，171.5(C)，170.7(C)，170.5(C)，156.2(C)，145.0(C)，145.0(C)，144.3(C)，132.9(CH)，129.7(CH)，129.6(CH)，129.5(CH)，129.5(CH)，128.2(CH)，128.2(CH)，128.0(CH)，127.0(CH)，126.7(CH)，69.5(CH)，67.1(CH₂)，66.7(CH₂)，58.6(CH)，52.9(CH)，52.6(CH)，52.3(CH)，52.2(CH₃)，44.2(CH₂)，41.1(CH₂)，40.1(CH₂)，33.9(CH₂)，31.4(CH₂)，31.0(CH₂)，31.0(CH₂)，30.6(CH)，29.8(CH₂)，28.6(CH₃)，22.6(CH₂)，19.3(CH₃)，18.0(CH₃)，MS(ES⁺)1185(100％，[M+Na]⁺)，1163(40％，[M+H⁺).

{4-[(6R，9S，12R)-6-异丙基-2，5，8，11，14-五氧-16-((S)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-12-基]-丁基}-氨基甲酸叔丁酯(8D)的制备

0℃下向6D(136mg，0.12mmol)/THF(1.9mL)溶液中加入LiOH(6.8mg，0.28mmol)/H₂O(0.5mL)溶液并将反应混合物搅拌55分钟。逐滴加入柠檬酸直至pH降至3～4，然后加入水(3.7mL)、随后加入EtOAc(15mL)。分离各层，产物用EtOAc(2×10mL)萃取。合并有机层，用饱和盐水(10mL)洗涤，用MgSO₄干燥，并真空除去溶剂，得到呈白色固体的粗酸7D(132mg，定量)，其立即用于下一步骤中：LRMS(ES^-)1147(100％，[M-H]^-)。

用10小时然后向(MNBA(47mg，0.14mmol)+DMAP(33mg，0.27mmol))/CH₂Cl₂(25mL)溶液中逐滴加入酸7D(132mg，0.11mmol)/CH₂Cl₂(96mL)溶液，反应混合物在室温下再搅拌9.5小时。然后加入0.2％的HCl(50mL)，分离所形成的层，有机层用硫酸氢钠(30mL)和饱和盐水(30mL)洗涤，用MgSO₄干燥并真空浓缩，得到棕色固体。然后用快速柱色谱纯化(洗脱剂为6∶4-3∶1的EtOAc/己烷)，得到呈白色固体的产物8D(52mg，0.05mmol，42％)：

R_f0.07 EtOAe/己烷(6∶4)；[α]²⁵ _D＝-76(c0.1，CH₂Cl₂)；IR(薄膜)3271 1739(m)，1683，1641，1536，1490，1444，1391；¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.54(s，1H)，7.44-7.36(m，12H)，7.30-7.17(m，19H)，6.80(d，J＝8.5Hz，1H，)，6.47(d，J＝8.5Hz，1H)，5.58(dt，J＝15.1，7.0Hz，1H，)，5.47(td，J＝6.5，2.5Hz，1H，)，5.39(dd，J＝15.1，6.5Hz，1H)，4.68(s，1H)，4.29(q，J＝7.0Hz，1H)，4.20(dd，J＝17.1，7.5Hz，1H)，4.16(dd，J＝9.0，6.0 Hz，1H)，3.53(dd， J＝17.1，5.5Hz，1H)，3.44(q，J＝7.5Hz，1H)，3.00-2.90(m，2H)，2.66(d，J＝7.5Hz，2H)，2.55-2.48(m，1H)，2.39(dd，J＝15.1，8.0Hz，1H)，2.30-2.15(m，3H)，2.13-2.01(m，4H)，1.68-1.58(m，1H)，1.51(dd，J＝13.5，7.0Hz，1H，)，1.40(s，9H)，1.45-1.34(m，2H)，1.36-1.28(m，2H)，1.31-1.23(m，2H)，0.89(d，J＝6.5Hz，3H)，0.84(d，J＝6.5Hz，3H，)，¹³C NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.1(C)，171.3(C)，1713(C)，169.8(C)，168.9(C)，156.2(C)，145.0(C)，144.5(C)，132.6(CH)，129.7(CH)，128.2(CH)，128.0(CH)，127.0(CH)，126.8(CH)，79.1(CH)，67.5(C)，66.8(C)，58.7(CH)，53.1(CH)，53.0(CH)，42.0(CH₂)，41.8(CH₂)，40.2(CH₂)，32.2(CH₂)，31.5(CH₂)，31.4(CH₂)，31.2(CH₂)，31.0(CH₂)，29.7(CH)，28.6(CH₃)，22.8(CH₂)，19.5(CH₃)，17.6(CH₃)；LRMS(ES⁺)1152(100％，[M+Na⁺]).

[4-((7R，10S，14S，21R)-7-异丙基-3，6，9，19，22-五氧-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-21-基)-丁基]-氨基甲酸叔丁酯(9D)的制备

用30分钟向搅拌的碘(117mg，0.5mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，148mL)溶液中逐滴加入8D(52mg，0.05mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，77mL)溶液，将反应混合物再搅拌30分钟，然后加入硫代硫酸钠(128mL，0.02M)。分离各层，产物用CH₂Cl₂(3×25mL)萃取，用MgSO₄干燥，并真空除去溶剂。然后用硅胶柱色谱(洗脱剂为2∶98-8∶92的MeOH/CH₂Cl₂)进行纯化，得到呈白色固体的9D(3mg，0.005mmol，10％)：R_f 0.05 MeOH/CH₂Cl₂(5∶95)，LRMS(ES⁺)666.8(100％，[M+a]⁺)。

(R)-2-((R)-2-{(R)-2-[(R)-2-((E)-(S)-3-羟基-9，9，9-三苯基-壬-4-烯酰氨基)-丙酰氨基]-5，5，5-三苯基-戊酰氨基}-3-甲基-丁酰氨基)-丙酸甲酯(6E)的制备

向H₂N-D-Ala-D-Cys(STrt)-D-Val-D-Ala-OMe(96mg，0.155mmol，购自Biopepide Co.，CA 92121-1510，USA，纯度～60％)/(CH₂Cl₂/THF)(1∶1，30mL)溶液中加入5(87mg，0.155mmol)/CH₂Cl₂(5mL)溶液，然后加入DMAP(2mg，0.02mmol)。18小时后真空浓缩反应混合物。用硅胶柱色谱(1-3.5％的MeOH/CH₂Cl₂)进行纯化，得到呈白色固体、溶解度低的双-三苯甲基化合物6E(55mg，0.054mmol，35％)：LRMS(HPLC ES⁺，用XTerra MS C₁₈柱，粒径5μm，3.0×50mm，线性梯度，用5分钟从5％甲醇(0.1％HCOOH)/H₂O到100％，1.25mL/min。然后是100％甲醇(0.1％HCOOH)5分钟，1.5mL/min)rt＝7.93min，m/z1041.7(100％，[M+Na]⁺)，1019.7(30％，[M+H]⁺)。

(3R，6R，9S，12R，16S)-6-异丙基-3，12-二甲基-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-2，5，8，11，14-戊酮(8E)的制备

0℃下向甲酯6E(81mg，0.080mmol)/THF(5mL)溶液中加入LiOH(3mg，0.12mmol)/H₂O(0.8mL)溶液。1小时后加入1M HCl(10mL)结束反应。加入CHCl₃(20mL)，分离有机相，用CHCl₃(2×10mL)萃取。有机相用盐水(15mL)洗涤、干燥(MgSO₄)并真空浓缩，得到呈白色固体的粗酸7E(80mg，定量)，其直接用于下一步骤中：LRMS(ES^-)m/z 1003(100％，[M-H]^-)。

用3小时向(MNBA(35mg，0.10mmol)+DMAP(25mg，0.20mmol))/CH₂Cl₂(20mL)溶液中逐滴加入酸7E(80mg，0.080mmol)/(CH₂Cl₂/THF)(75∶5，80mL)溶液。再过14小时后，加入1M HCl(25mL)结束反应。分离有机相(用CH₂Cl₂萃取)，并依次用NaHCO₃(30mL)和盐水(20mL)洗涤。合并有机相，并干燥(MgSO₄)和真空浓缩，得到黄色油。用硅胶柱色谱(70-100％的EtOAc/CH₂Cl₂)进行纯化，得到呈白色固体的8E(34mg，0.035mmol，43％)：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.49-7.08(m，33H)，6.31(br s，1H)，5.57(dt，J＝15.3，6.5Hz，1H)，5.47(q，J＝6.1Hz，1H)，5.36(dd，J＝15.3，6.8Hz，1H)，4.45(quin，J＝7.0Hz，1H)，4.21(quin，J＝7.0Hz，1H)，3.87(t，J＝7.3Hz，1H)，3.59(brs，1H)，2.92(dd，J＝12.5，8.5Hz，1H)，2.55(dd，J＝12.5，5.4Hz，1H)，2.51-2.36(m，2H)，2.17(t，J＝7.3Hz，2H)，2.05-1.86(m，3H)，1.36(d，J＝7.0Hz，3H)，1.33(d，J＝7.0Hz，3H)，0.88(d，J＝6.8Hz，3H)，0.83(d，J＝7.0Hz 3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.6(C)，170.8(C)，170.4(C)，170.2(C)，169.7(C)，144.9(C)，1444(C)，132.9(CH)，129.7(CH)，129.6(CH)，128.2(CH)，128.1(CH)，128.0(CH)，127.0(CH)，126.8(CH)，72.0(CH)，67.2(C)，66.8(C)，61.4(CH)，55.3(CH)，49.9(CH)，49.5(CH)，41.3(CH₂)，32.4(CH₂)，31.4(CH₂)，31.3(CH₂)，29.8(CH)，19.8(CH₃)，18.4(CH₃)，17.9(CH₃)，17.8(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z1009(100％，[M+Na]⁺)，987(10％，[M+H]⁺).

(E)-(1S，4R，7R，10S，21R)-7-异丙基-4，21-二甲基-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-3，6，9，19，22-戊酮(9E)的制备

用30分钟向I₂(87mg，0.34mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，100mL)溶液中逐滴加入双-三苯甲基化合物8E(34mg，0.034mmol)的溶液。再过30分钟后，加入硫代硫酸钠(0.05M，25mL)、然后加入盐水(10mL)结束反应。分离有机相，水相用CH₂Cl₂(3×15mL)萃取。合并有机相，干燥(MgSO₄)并过滤，之后真空浓缩，得到白色固体。用硅胶柱色谱(3-5％的MeOH/CH₂Cl₂)进行纯化，得到环化的酯肽9E(10mg，0.02mmol，60％)：

[α]²⁵ _D-51.8(c0.45，MeOH)；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.52(d，J＝6.5Hz，1H)，7.40(d，J＝6.3Hz，1H)，6.94(d，J＝9.5Hz，1H)，6.46(d，J＝3.0Hz，1H)，6.23-6.10(m，1H)，5.80-5.72(m，2H)，5.06(ddd，J＝10.0，6.8，3.7Hz，1H)，4.47(quin，J＝7.0Hz，1H)，4.20(qd，J＝7.3，3.5Hz，1H)，3.81(dd，J＝14.3，6.5Hz，1H)，2.96-2.77(m，3H)，2.76-2.64(m，5H)，2.61 (dd，J＝13.5，2.2Hz，1H)，1.49(d，J＝7.0Hz，3H)，1.48(d，J＝7.2Hz，3H)，0.95(d，J＝6.5Hz，3H)，0.93(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ174.9(C)，173.9(C)，172.4(C)，172.2(C)，172.0(C)，131.9(CH)，131.1(CH)，71.8(CH)，67.2(CH)，56.3(CH)，53.0(CH)，50.7(CH)，40.4(CH₂)，39.9(CH₂)，39.3(CH₂)，34.4(CH₂)，28.7(CH)，20.7(CH₃)，20.3(CH₃)，17.7(CH₃)，16.4(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 1024(2D0％，[2M+Na]⁺)，523(50％，[M+Na]⁺)，501(100％[M+H]⁺)。

(R)-4-((E)-(S)-3-羟基-7-三苯甲基硫烷基-庚-4-酰氨基)-4-{(S)-1-[(R)-1-(甲氧基羰基甲基-氨基甲酰基)-2-甲基-丙基氨基甲酰基]-2-三苯甲基硫烷基-乙基氨基甲酰基}-丁酸叔丁酯(6F)的制备

向H₂N-D-Glu(O^tBu)-D-Cys(STrt)-D-Val-Gly-OMe(145mg，0.2mmol，购自Biopepide Co.，CA 92121-1510，USA，纯度～60％)/CH₂Cl₂(40mL)溶液中加入5(113mg，0.2mmol)/CH₂Cl₂(10mL)溶液，然后加入DMAP(2.5mg，0.02mmol)。18小时后真空浓缩反应。用硅胶柱色谱(1-3％的MeOH/CH₂Cl₂)进行纯化，得到呈白色固体的6F(97mg，0.087mmol，44％)：

¹H-NMR(400 MHz，CDCl₃)δ7.46-7.33(m，12H)，7.32-7.13(m，20H)，7.07(brs，1H)，6.77(d，J＝8.3Hz，1H)，5.46(dt，J＝15.3，6.5Hz，1H)，5.34(dd，J＝15.3，6.3Hz，1H)，4.40-4.23(m，3H)，4.11-3.86(m，2H)，3.79(dd，J＝17.8，5.5Hz，1H)，3.70-3.58(m，1H)，3.64(s，3H)，3.06(brs，1H)，2.63(dd，J＝12.8，7.5Hz，1H)，2.53(dd，J＝12.8，5.8Hz，1H)，2.48-2.12(m，6H)，2.11-1.85(m，4H)，1.41(s，9H)，0.92(d，J＝6.7Hz，3H)，0.91(d，J＝6.7Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.7(C)，172.3(C)，171.6(C)，171.3(C)，170.4(C)，170.3(C)，145.0(C)，144.3(C)，133.6(CH)，130.3(CH)，129.7(CH)，129.5(CH)，128.2(CH)，128.0(CH)，127.1(CH)，126.7(CH)，81.5(C)，70.0(CH)，67.1(C)，66.7(C)，59.3(CH)，54.6(CH)，53.0(CH)，52.2(CH₃)，44.1(CH₂)，41.0(CH₂)，33.3(CH₂)，32.2(CH₂)，31.4(CH₂×2)，29.9(CH)，28.1(CH₃)，26.1(CH₂)，19.3(CH₃)，17.7(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 1142(100％，[M+Na]⁺)。

3-[(6R，9S，12R，16S)-6-异丙基-2，5，8，11，14-五氧-16-((E)-4-三苯甲基硫烷基-丁-1-烯基)-9-三苯甲基硫烷基甲基-1-氧杂-4，7，10，13-四氮杂-环十六烷-12-基]-丙酸叔丁酯(8F)的制备

0℃下向甲酯6F(98mg，0.088mmol)/THF(5mL)溶液中加入LiOH(3mg，0.13)/H₂O(0.8mL)溶液。1小时后加入1M HCl(15mL)结束反应。加入CHCl₃(20mL)，分离有机相，用CHCl₃(2×10mL)萃取。有机相用盐水(15mL)洗涤、干燥(MgSO₄)并真空浓缩，得到呈白色固体的粗酸7F(96mg，定量)，其直接用于下一步骤中：(ES^-)m/z 1103(100％，[M-H]^-)。

用3小时向(MNBA(36mg，0.10mmol)+DMAP(25mg，0.21mmol))/CH₂Cl₂(20mL)溶液中逐滴加入酸7F(96mg，0.087mmol)/(CH₂Cl₂/THF)(75∶2，77mL)溶液。再过14小时后，加入1M HCl(25mL)结束反应。分离有机相(用CH₂Cl₂萃取)，并依次用NaHCO₃(30mL)和盐水(20mL)洗涤。合并有机相，并干燥(MgSO₄)和真空浓缩，得到黄色油。用硅胶柱色谱(50-70％的EtOAc/CH₂Cl₂，然后+0.1％的MeOH)进行纯化，得到呈白色固体的8F(53mg，0.049mmol，56％)：

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ7.44-7.32(m，12H)，7.31-7.15(m，19H)，7.11-7.03(m，2H)，6.68(brs，1H)，5.58(dt，J＝15.6，6.5Hz，1H)，5.43(ddd，J＝9.5，7.0，3.0Hz，1H)，5.33(dd，J＝15.6，7.0Hz，1H)，4.44(dd，J＝17.0，9.6Hz，1H)，4.30(dd，J＝9.0，4.5 Hz，1H)，4.04(q，J＝7.0Hz，1H)，3.59(m，1H)，3.50(dd，J＝6.5，2.0Hz，1H)，3.07(t，J＝11.0Hz，1H)，2.60-2.45(m，3H)，2.42-2.23(m，3H)，2.22-2.12(m，2H)，2.08-1.89(m，4H)，1.40(s，9H)，0.88(d，J＝7.0Hz，3H)，0.83(d，J＝7.0Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ173.4(C)，172.6(C)，171.1(C)，170.9(C)，170.0(C)，169.0(C)，145.0(C)，144.3(C)，133.2(CH)，129.7(CH)，129.6(CH)，128.3(CH)，128.0(CH)，127.1(CH)，126.8(CH)，813(C)，72.1(CH)，67.3(C)，66.8(C)，58.7(CH)，56.8(CH)，54.1(CH)，41.9(CHz)，41.3(CH₂)，32.4(CH₂)，31.8(CH₂)，31.4(CH₂)，31.2(CH₂)，29.0(CH)，28.2(CH₃)，25.9(CH₂)，19.7(CH₃)，17.2(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 1109(100％，[M+Na]⁺)，1087(50％，[M+H]⁺).

3-((E)-(1S，7R，10S，21R)-7-异丙基-3，6，9，19，22-五氧-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-21-基)-丙酸叔丁酯(9F)的制备

用30分钟向I2(117mg，0.46mmol)/(CH₂Cl₂/MeOH)(9∶1，130mL)溶液中逐滴加入双-三苯甲基化合物8F(50mg，0.046mmol)的溶液。再过30分钟后，加入硫代硫酸钠溶液(0.05M，50mL)、然后加入盐水(20mL)结束反应。分离有机相，水相用CH₂Cl₂(3×25mL)萃取。合并有机相，干燥(MgSO₄)，真空浓缩前得到白色固体。用硅胶柱色谱(1-3％的MeOH/CH₂Cl₂)进行纯化，得到呈白色固体的双环酯肽9F(19mg，0.032mmol，69％)：

[α]²⁵ _D-76.7(c0.60，MeOH)；¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ8.15(d，J＝4.0Hz，1H)，7.35(d，J＝6.5Hz，1H)，7.23(t，J＝5.5Hz，1H)，7.11(d，J＝9.0Hz，1H)，6.05(ddt，J＝15.5，7.0，2.0Hz，1H)，5.84-5.73(m，2H)，4.97(td，J＝8.0，4.5Hz，1H)，4.18-4.01(m，3H)，3.61(dd，J＝15.1，8.0Hz，1H)，3.24(dd，J＝10.5，6.5Hz，1H)，2.95-2.75(m，5H)，2.73-2.62(m，3H)，2.51(dd，J＝13.6，2.0Hz，1H)，2.42(ddd，J＝18.0，9.0，3.5Hz，1H)，2.19-2.04(m，2H)，1.83(s，9H)，0.98(d，J＝6.5Hz，3H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CDCl₃)δ175.7(C)，171.8(C)，171.7(C)，170.9(C)，169.9(C)，168.2(C)，130.2(CH)，129.6(CH)，82.6(C)，69.4(CH)，65.4(CH)，57.6(CH)，53.8(CH)，42.4(CH₂)，40.0(2×CH₂)，38.6(CH₂)，34.1(CH₂)，33.1(CH₂)，28.2(CH₃)，27.4(CH)，24.9(CH₂)，20.6(CH₃)，20.2(CH₃)；LRMS(ES⁺)m/z 623(90％，[M+Na]⁺)，601(100％，[M+H]⁺).

3-((E)-(1S，7R，10S，21R)-7-异丙基-3，6，9，19，22-五氧-2-氧杂-12，13-二硫杂-5，8，20，23-四氮杂-双环[8.7.6]二十三碳-16-烯-21-基)-丙酸(10F)的制备

向(9F(12mg，0.02mmol)+Et₃SiH(10μL，0.06mmol))/CH₂Cl₂(1.5mL)溶液中加入TFA(150μL，2.0mmol)。6小时后除去溶剂，残留物用硅胶柱色谱(10％的甲醇/CH₂Cl₂，然后+1％的AcOH)纯化，得到呈白色固体的10F(5.6mg，0.01mmol，55％)：

[α]²⁵ _D-63.4(c0.25，MeOH)；

¹H-NMR(400MHz，CD₃OD)δ7.5(1×NH观察到的，d，J＝7.5Hz，1H)，5.81(dddd，J＝16.8，6.8，4.8，2.5Hz，1H)，5.75-5.67(m，2H)，4.62(ddd，J＝11.0，8.0，5.5Hz 1H)，4.28(d，J＝17.5Hz，1H)，4.15(dd，J＝9.0，6.0Hz，1H)，3.78(d，J＝17.5Hz，1H)，3.43(d，J＝10.5Hz，1H)，3.20-3.10(m，2H)，3.07-3.00(m，2H)，2.94-2.81(m，1H)，2.82(dd，J＝13.2，2.2Hz，1H)，2.73-2.50(m，4H)，2.38(q，J＝7.0Hz，1H)，2.23-1.99(m，2H)，0.98(d，J＝6.5Hz，3H)，0.92(d，J＝6.5Hz，3H)；¹³C-NMR(100MHz，CD₃OD)δ 176.5(C)，174.0(C)，173.5(C)，173.0(C)，171.6(C)，169.5(C)，131.4(CH)，131.3(CH)，72.1(CH)，66.0(CH)，58.5(CH)，57.0(CH)，42.7(CH₂)，39.7(CH₂)，39.4(CH₂)，36.8(CH₂)，31.8(CH₂)，31.6(CH₂)，28.2(CH₃)，26.6(CH₂)，20.6(CH₃)，20.5(CH₃)；LRMS(ES^-)m/z 543(100％，[M-H]^-).

结果

活性检测1

我们比较了辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)(一种已知的HDAC抑制剂)与化合物001(第7页上的式(2)化合物)抑制MCF7人乳腺癌细胞和正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)的生长的能力。

方法：细胞增殖检测用CyQuant^TM检测系统(Molecular Probes，Inc.USA)按生产商的说明进行。该系统使用有专利权的绿色荧光染料，其在与细胞的核酸结合时发生强烈的荧光增强，以便可确定细胞数，其线性检测范围为50-250,000个细胞。将雌激素受体阳性的MCF7乳腺癌细胞(ECAAC)和NHDF细胞(Cambrex，UK)置于96孔板中，密度为每孔中1000个细胞/100μl细胞培养基。最少5小时后加入在细胞培养基中的一系列稀释度的化合物，加入量为100μl，浓度为2倍最终浓度。六天后将板翻转于印迹纸上以除去细胞培养基，并用200μlPBS轻柔洗涤细胞一次。立即将板冷冻于-80℃下最少一小时，然后解冻。立即向每孔中加入200μl按生产商的说明制备的加染料的1xCyQuant细胞溶解缓冲液并在室温下孵育3-5分钟。然后用CytofluorII荧光多孔板读数器和CytoFluor II软件测定各孔的荧光，滤光器设置为使激发波长为480nm、最大发射波长为520nm。测定细胞增殖，得到作为相对于未处理细胞样品(＝100％)的百分数的双份样品的平均值。用生长抑制曲线推导IC₅₀值。

图1示出了化合物001和SAHA对MCF7和正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)生长的影响。MCF7和NHDF用指定浓度的化合物孵育。6天后用CyQuant^TM检测法测定相对于未处理细胞(＝100％)的细胞生长。等量的DMSO(作为溶剂对照)对细胞生长无影响(未示出)。所示数据为双份样品测定值的平均值±标准偏差，代表多个实验。

结果：化合物抑制了细胞生长。重要的是，抑制剂之间以及细胞类型之间存在差异。自多个实验计算出生长抑制的平均IC₅₀(±SD)并在下表1中给出。

表1

	化合物001	SAHA
			MCF7	121±52nM	483±109nM
NHDF	420±42nM	～2000nM^a

^a由一式两份进行的单个实验计算得到的IC₅₀

化合物001是有效的癌细胞生长抑制剂。重要的是，在目前的II期试验中，化合物001显著比SAHA有效(p＝0.003，Student’s t检验)。与NHDF相比，两种化合物均对MCF7细胞更有效，表明其对恶性细胞有选择性。用HUT78 T-细胞白血病细胞进行的类似实验(按上述进行)表明化合物001也抑制这些细胞的生长(数据未示出)。

活性检测2

我们研究了化合物001(第7页上的式(2)化合物)是否激活以前已证明响应HDAC-介导抑制的SV40启动子。

方法：我们构建了源自含有整合报告分子构建体的MCF7细胞的稳定克隆，其中SV40立即早期启动子克隆到萤光素酶基因上游。MCF7细胞使用Transfast转染剂转染pGL2-Basic(SV40/萤光素酶报告分子)(Promega，UK)和pcDNA3(表达新霉素抗性基因)。24小时后用胰蛋白酶消化收集细胞并以低密度置于板上。接下来的一天向生长培养基中加入G418。约21天后分离各耐药集落并培养。我们选择加入HDAC抑制剂后表现为高度诱导萤光素酶活性的克隆(2.1.1细胞)进行进一步的研究。为测试化合物001的效果，用各种浓度的化合物001或等量的DMSO(作为对照)孵育2.1.1细胞。接下来的一天收集细胞并用Promega萤光素酶检测系统和TopCount(Perkin-Elmer)检测萤光素酶活性。

图2示出了化合物001对响应HDAC的SV40启动子的活性的影响。用指定浓度的化合物001或DMSO(作为溶剂对照)处理含稳定整合的SV40启动子-萤光素酶报告质粒的MCF7来源细胞。约16小时后测定萤光素酶活性。所示数据是一个实验进行两次而得到的，并代表多个实验。

结果：实验表明化合物001有效地逆转HDAC介导的SV40立即早期启动子阻遏。

活性检测3

我们研究了化合物001(第7页上的式(2)化合物)和SAHA对MCF7细胞中细胞周期分布和存活的影响

方法：用指定浓度的化合物或不经处理(作为对照)孵育MCF7细胞，持续各种时间，如图例中详细给出的。收集细胞并按先前所述(Purohit et al.，Int J Ca 85，584-9 2000)的碘化丙锭染色和流式细胞术测定处于细胞周期不同阶段的细胞的比例。首先计算＜G0/G1含量(preG0)的细胞占全部细胞的比例。然后计算处于不同细胞周期阶段(G0/G1，S，G2/M)中的细胞占细胞周期中全部细胞(即全部细胞减去＜G0/G1含量的细胞)的比例。

图3示出了化合物001和SAHA对MCF7细胞中细胞周期分布和存活的影响。用指定浓度的化合物(各相当于约10倍生长抑制IC₅₀值)或DMSO(作为溶剂对照)孵育MCF7细胞24、48或72小时。用流式细胞术测定细胞周期不同阶段中细胞的比例。所示数据为得自两个单独的实验的平均值±SD，相对于未处理的细胞(归一化为1)。

结果：图中表明在相当的有效浓度下，化合物001和SAHA诱发MCF7细胞中占优势的G2/M期滞留和细胞死亡。

活性检测4

我们研究了化合物001(第7页上的式(2)化合物)对MCF7乳腺癌细胞和心肌细胞中组蛋白乙酰化的影响。

方法：心肌细胞按Chembiochem.2005 Jan；6(1)：162-70中所述制备并用指定浓度的化合物001孵育24小时。MCF7细胞用指定浓度的化合物001孵育24小时。用来自Upstate Biotech的抗体通过先前所述(Brimmell et al.Br J Cancer.1999 Nov；81(6)：1042-51)的蛋白质印迹法(Western blotting)分析总组蛋白H4乙酰化或组蛋白H4-K8或组蛋白H3-K9的特异性乙酰化的表达。

图4示出了化合物001对组蛋白乙酰化的影响。(A)MCF7细胞用化合物001孵育24小时。用免疫印迹法测定组蛋白H4的乙酰化。(B)心肌细胞用指定的化合物001孵育24小时。用免疫印迹法测定组蛋白H4乙酰化。(C)MCF7细胞用化合物001孵育24小时。用免疫印迹法测定组蛋白H3-K9和组蛋白H4-K8的乙酰化。

结果：实验表明化合物001诱导乙酰化组蛋白H4的积聚以及特异性组蛋白H3-K9和组蛋白H4-K8的乙酰化。我们也证明化合物001增加了原发性慢性淋巴细胞性白血病细胞中乙酰化组蛋白H4的水平(数据未示出)。

活性检测5

我们分析了化合物抑制体外HDAC活性的能力。体外HDAC检测用HDAC荧光活性检测试剂盒(Biomol，UK)按生产商的说明进行。分析前将化合物还原；1mM的化合物用30mM的DTT在DMSO中于室温下避光过夜还原。然后在96孔板中建立反应。对于各反应，将10μl的化合物(在检测缓冲液中，5倍于所需浓度)与15μl经稀释的海拉细胞核提取物(在检测缓冲液中稀释30倍)混合。为各化合物建立一系列稀释度。也建立仅含海拉提取物及仅含检测缓冲液的反应。向各反应中加入25μl经稀释的Fluor de Lys^TM底物(在检测缓冲液中稀释100倍)，然后将其在37℃下孵育1小时。加入50μl的Fluor de Lys^TM显色剂(在检测缓冲液中稀释20倍，另含稀释100倍的TSA)使反应停止。在室温下孵育反应10分钟，然后用CytoFluor II荧光多孔板读数器和CytoFluor II软件测定荧光，滤光器设置为使激发波长为360nm、发射波长为460nm。测定体外HDAC活性的抑制，得到一式两份样品的平均值，为相对于仅含HeLa提取物的反应而言的百分数。用GraphPad Prism软件计算IC₅₀值。

表2HDAC活性的抑制

化合物	第7、8或9页上的相应化学式	IC₅₀(nM)
			SAHA	N/A	330
9A	(2)	9.9
			9E	(3)	87
9F	(4)	8.0
			10F	(5)	1.7
9B	(6)	25
			9C	(7)	9.9

活性检测6

我们分析了化合物抑制人癌细胞体外生长的能力。细胞增殖检测用CyQuant^TM检测系统(Molecular Probes，Inc.USA)按生产商的说明进行。将MCF7乳腺癌、A2780卵巢癌和PC3及LNCAP前列腺癌细胞置于96孔板中，密度为每孔1000个细胞(对于MCF7细胞)或5000个细胞(对于A2780/PC3/LNCAP细胞)/100μl细胞培养基。最少5小时后加入在细胞培养基中的一系列稀释度的化合物，加入量为100μl，浓度为2倍最终浓度。4(A2780，PC3或LNCAP细胞)或6(MCF7细胞)天后通过将板翻转于印迹纸上以除去细胞培养基，并用200μl PBS轻柔洗涤细胞一次。立即将板冷冻于-80℃下最少一小时，然后解冻。立即向每孔中加入200μl按生产商的说明制备的加染料的1xCyQuant细胞溶解缓冲液并在室温下孵育3-5分钟。然后用Cytofluor II荧光多孔板读数器和CytoFluor II软件测定各孔的荧光，滤光器设置为使激发波长为480nm、最大发射波长为520nm。测定细胞增殖，得到一式两份样品的平均值，为相对于未处理细胞样品(＝100％)而言的百分数。用生长抑制曲线推导IC₅₀值。

表3 细胞生长抑制(IC₅₀值(nM))

化合物	第7、8或9页上的相应化学式	MCF7	PC3	LNCAP	A2780
						SAHA		483	nd	4000	595
9A	(2)	36.6	50	252	130
						9E	(3)	117	296	1189	651
9F	(4)	1.6	0.8	6.7	3
						10F	(5)	457	nd	nd	nd
9B	(6)	2.9	nd	nd	nd
						9C	(7)	5.2	nd	nd	nd

nd＝未测定

活性检测7

我们分析了化合物抑制由外周血单核细胞(PBMC)产生TNFα的能力。TNF-α免疫测定用Quantikine人TNF-α检测试剂盒(R&Dsystems，Abingdon UK)按生产商的说明进行。人全血用Ficol paque^TMPlus(GE Healthcare，Amersham，UK)分离，并将PBMC置于24孔板中，密度为每孔2.5×10⁶/500μl细胞培养基。

1小时后加入量为100μl、浓度6倍于最终浓度的化合物。五小时后加入量为10μl、浓度为60倍于最终浓度的脂多糖(LSP，Sigma，Poole，UK)。混合板并于37℃、5％CO₂下过夜。将板离心并将细胞上清液转移到新的板中。按生产商的说明制备Quantikine

检测试剂和标准品。Quantikine

检测板通过向各孔中加入50μl的检测稀释剂RD1F制备。随后加入200μl的标准品或100μl的校正稀释剂加100μl的细胞上清液；在室温(RT)下孵育2小时。用洗涤缓冲液洗涤所述板4次。最后一次洗涤后，在干净的纸巾上轻拍所述板以除去所有残留的缓冲液。向各孔中加入200μl TNF-α偶联物并在室温下孵育1小时。再像先前那样洗涤所述板。所需量的底物溶液通过避光加入等体积的显色试剂A和B制备，向各孔中加入200μl该混合物并在室温下避光孵育20分钟。按与底物溶液相同的顺序向各孔中加入50μl终止溶液，并在Biorad 680 96孔板读数器(Bio-Rad，Hemel Hempstead，UK)上于450nm下读板，在570nm下进行λ校正。测定TNF-α水平，得到一式两份样品的吸光度(以nm计)平均值，从所有结果中减去校准零值以校正检测中校准稀释剂的添加。

表4 由PBMC产生的LPS-诱导TNFα分泌的抑制

化合物	第7、8或9页上的相应化学式	浓度(nM)	抑制％
				SAHA	N/A	200	59

9A	(2)	200	69
				9E	(3)	200	84
9F	(4)	7.5	68

活性检测8

我们分析了化合物9A(第7页上的式(2)化合物)抑制小鼠炎症的能力。通过将5％(w/v)的

唑酮涂布到腹部去毛皮肤上来敏化Balb/c小鼠。7天后通过将3％(w/v)的oxalazone局部涂布于左耳上、丙酮于右耳上来激发小鼠。30分钟后，将溶解在丙酮中的试验化合物施用于双耳上(背面和腹面)。24小时后无痛处死小鼠并测定双耳的重量。抑制％用下式确定，其中W等于平均重量：

抑制％＝1-((W^{刺激物+试验物质}-W^载体×100)/(^{只有刺激物}-W^载体))

表5 体内炎症

化合物	耳重变化(mg)^a	抑制％(相对于载体)
			载体	63.5±3.8	N/A
9A(0.1％)	42.4±4.3	33.3
			9A(1％)	23.5±3.2	63.0

^a平均值±SD，每组8只动物。

Claims

1.一种化合物，其是具有式(I)或(I′)的FK228类似物或其药学可接受的盐，

其中，R₁、R₂、R₃和R₄相同或不同，代表氨基酸侧链部分；各R₆相同或不同，代表氢或C₁-C₄烷基；Pr¹和Pr²相同或不同，代表氢或硫羟保护基。

2.权利要求1的化合物，其中各氨基酸侧链为存在于天然氨基酸中的氨基酸侧链部分，或为-(CH₂)₂-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₄-NH-C(O)-O-C(CH₃)₃、-(CH₂)₃-NH-C(O)NH₂、-CH₂-CH₂OH或-(CH₂)₂-CH₂NH₂。

3.权利要求1的化合物，其中各氨基酸侧链为选自-H、-C₁-C₆烷基、-C₂-C₆烯基、-L-O-C(O)-R′、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R ″、-L-Het-C(O)-Het-R″和-L-Het-R″的部分，其中L为C₁-C₆亚烷基，A为苯基或5-到6-元杂芳基，各R′相同或不同，代表C₁-C₄烷基，各R″相同或不同，代表H或C₁-C₆烷基，各-Het-相同或不同，为选自-O-、-N(R″′)-和-S-的杂原子间隔基，各R″′相同或不同，代表H或C₁-C₄烷基。

4.权利要求3的化合物，其中A为苯基。

5.权利要求3或4的化合物，其中-Het-为-O-或-NR″′。

6.权利要求3、4或5中任一项的化合物，其中R₁为选自-H和-C₁-C₆烷基的部分。

7.权利要求3-6中任一项的化合物，其中R₂为选自-H和-C₁-C₄烷基的部分。

8.权利要求3-7中任一项的化合物，其中R₃为选自-H、-C₁-C₆烷基、-L-C(O)-O-R″、-L-A、-L-NR″R″和-L-N(R″)-C(O)-O-R″的部分。

9.权利要求3-8中任一项的化合物，其中R₄为选自-H和-C₁-C₄烷基的部分。

10.权利要求3-9中任一项的化合物，其中R₆为-H。

11.权利要求3-10中任一项的化合物，其中Pr¹和Pr²相同或不同，选自氢和保护基，所述保护基选自任选地被C₁-C₆烷氧基、C₁-C₆酰氧基、羟基和硝基取代的苄基、吡啶甲基、吡啶甲基-N-氧化物、蒽基甲基、二苯甲基、苯基、叔丁基、金刚烷基、C₁-C₆酰氧甲基、C₁-C₆烷氧甲基、四氢吡喃基、苄基硫甲基、苯基硫甲基、噻唑烷、乙酰胺甲基、苯甲酰氨基甲基、叔丁氧羰基(BOC)、乙酰基和其衍生物、苯甲酰基和其衍生物、氨基甲酰基、苯基氨基甲酰基和C₁-C₆烷基氨基甲酰基。

12.权利要求11的化合物，其中Pr¹和Pr²为氢。

13.权利要求1的化合物，其中所述化合物为式(2)、(2′)、(3)、(3′)、(4)、(4′)、(5)、(5′)、(6)、(6′)、(7)、(7′)、(8)、(8′)、(9)或(9′)化合物，

14.权利要求1至11和13中任一项的化合物，其中所述FK228类似物为式(I)化合物。

15.权利要求1-14任一项的化合物，用在治疗人体或动物体的方法中。

16.一种药物组合物，所述组合物包含如权利要求1-14任一项中所定义的化合物及药学可接受的载体或稀释剂。

17.权利要求16的药物组合物，其为适于经口、直肠、肠胃外、鼻内或经皮给药或通过吸入或通过栓剂给药的形式。

18.权利要求17的药物组合物，其为片剂、胶囊、锭剂、糖锭、水或油悬剂、可分散性粉剂或颗粒剂或舌下片剂的形式。

19.权利要求1-14中任一项的化合物在制备药物中的用途，其中所述药物用于缓解癌症、心脏肥大、慢性心力衰竭、炎症、心血管疾病、血红蛋白病、地中海贫血症、镰状细胞病、CNS病、自身免疫性疾病、糖尿病、骨质疏松症、MDS、良性前列腺肥大、口腔粘膜白斑、遗传相关的代谢失调、感染、Rubens-Taybi、脆性X综合征或α-1抗胰蛋白酶缺乏，或用于加速伤口愈合、或用于保护毛囊或用作免疫抑制剂。

20.权利要求19的用途，其中所述药物用于缓解慢性淋巴细胞性白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、间皮瘤、T-细胞淋巴瘤、心脏肥大、慢性心力衰竭或皮肤炎症，特别是牛皮癣、痤疮或湿疹。

21.一种产品，所述产品含(a)如权利要求1-14的任一项中所定义的化合物，和(b)HDAC介导病症的治疗或预防中同时、分别或顺序使用的其他HDAC抑制剂。

22.一种产品，所述产品含(a)如权利要求1-14的任一项中所定义的化合物，和(b)在癌症的治疗或预防中同时、分别或顺序使用的其他化疗或抗肿瘤剂。