CN108379585B - Hdac4抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及HDAC4抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。本发明建立了小鼠心肌梗死后心力衰竭动物模型，进行了有氧运动干预，利用PET/CT、心超及分子生物学技术，评估心功能、能量代谢及相关信号分子，发现有氧运动能提升梗死后心脏功能，增加运动耐力，改善线粒体结构功能和糖脂代谢，并降低心肌HDAC4核内基因抑制作用，提示HDAC4为有氧运动改善心肌梗死后心力衰竭的分子作用靶点，可开发促进HDAC4磷酸化或降低其表达的药物，达到与康复运动相同的效果，提高依从性，从而改善症状，提高运动耐力，降低病死率，具有重要的临床意义。本发明还提示HDAC4的磷酸化水平可作为心肌梗死后心力衰竭预后的标志物。

Description

HDAC4抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，涉及HDAC4抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。

背景技术

心力衰竭作为各种心血管疾病的严重和终末阶段，发病率高，预后差，已经成为我国乃至全世界面临的最重要公共卫生问题之一。据最新统计，我国心衰患病人数预计已超过450万，住院总费用快速增加，带来巨大的社会和经济负担。尽管近30年来，抑制神经内分泌过度激活等药物治疗使心衰患者生存率有所提高，但其生活质量以及远期预后仍然很差，1年死亡率仍高达17％。现有的治疗手段并不能预防或者逆转衰竭心肌细胞分子层面的改变，因此阐明心力衰竭发生、发展的机制，研究能够延缓甚至逆转这一病理生理进程的治疗手段显得尤为重要。

有氧运动作为药物和器械治疗之外的第三种潜在的治疗手段，越来越多地受到心衰领域研究者的重视。美国、加拿大和法国共同进行的多中心HF-ACTION研究从2009年到2017年发表了数篇论文，系统阐述了有氧运动对慢性射血分数降低的心衰患者心衰有关的症状、一般健康状况以及死亡率和因心衰再入院的改善作用。2017年美国又有一项新的REHAB-HF研究方案发表，拟针对老年急性心衰患者开展运动康复干预的多中心、随机对照研究并检验其疗效。这些都表明有氧运动已成为心衰干预研究领域的热点。

目前针对心力衰竭的康复运动虽已在少数三甲医院开展，但是，其治疗心衰的机制并不明确，并且由于存在禁忌症，患者依从性差。这也在很大程度上限制了这一潜在的有效干预方法在临床上更广泛地应用。通过直接干预有氧运动改善心肌梗死后心力衰竭的分子作用靶点，达到与康复运动相同的效果，从而改善症状，提高运动耐力，降低病死率，这种方法将具有更大的临床应用价值。

期刊文献《广东医学》，2013，34(10):1628-1631，刊出的论文“心力衰竭的分子靶向治疗进展”，公开了Ⅱ类组蛋白脱乙酰酶(HDACs)分子HDAC4(或5、7A)有抑制心肌再建的功能，它的作用机制是当PKD和CAMKⅡ通过磷酸化作用激活HDAC4时，后者与伴侣素蛋白12-3-3结合而从HDAC4-MEF2复合体上分离下来，分离的MEF2失去刺激心肌细胞生长和分化的作用，鉴于上述作用机制，用抑制HDAC4磷酸化状态的药物将能够治疗心衰。

专利文献CN101035542A，公开日2007.09.12，公开了组蛋白脱乙酰基酶的抑制剂，并可用于预防和/或治疗细胞增殖疾病如癌、自身免疫、变应性和炎症性疾病、中枢神经系统(CNS)的疾病如神经变性疾病，和用于预防和/或治疗再狭窄，关节炎症性状况的非限制性例子包括类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣性关节炎；炎症性肠病如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎；脊柱关节病；硬皮病；银屑病(包括T细胞介导的银屑病)和炎症性皮肤病，如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹；血管炎(例如坏蛆性血管炎、皮肤性血管炎和超敏反应血管炎)；嗜酸性肌炎、嗜酸性筋膜炎；具有皮肤或器官白细胞浸润的癌，缺血性损伤，包括脑缺血(由创伤、癫痫、出血或中风引起的脑损伤，其每一种都可导致神经变性)；HIV，心力衰竭，慢性、急性或恶性肝病，自身免疫甲状腺炎等等。

然而，目前关于HDAC4特异性抑制剂在制备治疗心肌梗死后心力衰竭中的作用还未见报道。

发明内容

本申请发明人建立了小鼠心肌梗死后心力衰竭动物模型，利用小动物跑步机进行有氧运动干预，利用PET/CT、心超及分子生物学技术，评估心功能、能量代谢及相关信号分子，发现有氧运动能提升梗死后心脏功能，增加运动耐力，改善线粒体结构功能和糖脂代谢，并降低心肌HDAC4表达。基于此完成了本发明。

第一方面，本发明提供了HDAC4基因或蛋白的抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。

所述的心力衰竭是心肌梗死后心力衰竭。

所述的HDAC4基因或蛋白的抑制剂是指促进HDAC4蛋白磷酸化令其失去活性或活性降低的抑制剂。

所述的HDAC4基因或蛋白的抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。

所述的小分子化合物为LMK235，英文化学名N-((6-(hydroxyamino)-6-oxohexyl)oxy)-3,5-dimethylbenzamide，分子式C₁₅H₂₂N₂O₄，分子量294.35，化学结构式为

第二方面，本发明提供了一种治疗心力衰竭的药物组合物，所述的药物组合物以HDAC4基因或蛋白的抑制剂为活性成分，并进一步包含药学上可接受的载体。

所述的心力衰竭是心肌梗死后心力衰竭。

所述的HDAC4基因或蛋白的抑制剂是指促进HDAC4蛋白磷酸化令其失去活性或活性降低的抑制剂。

所述的药物组合物的剂型为注射剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂或口服液。

第三方面，本发明提供了HDAC4作为诊断标志物在制备心力衰竭预后的试剂盒中的应用。

第四方面，本发明提供了检测HDAC4磷酸化水平的试剂在制备心力衰竭预后的试剂盒中的应用。

需要说明的是，心力衰竭因发生机制不同，分为不同的类型。从病理生理角度来看，心力衰竭大致可分为由原发性心肌损害及心脏长期容量(或)压力负荷过重，导致心肌功能由代偿最终发展为失代偿两大类。其中冠心病心肌缺血和(或)心肌梗死导致的原发性心肌损害又是引起心力衰竭最常见病因[陆再英,钟南山.内科学.第7版[M].人民卫生出版社,2008.]。心梗后心衰发生机制包括：1、心室重构：心梗后心肌和细胞外基质(ECM)发生适应不良性改变导致心室病理性重构，包括心室大小、形态、组织结构及功能状态的改变，是心梗后发展为心衰的基本病理过程。心室重构分早期重构和晚期重构，前者发生于梗死后数小时至6周，主要表现为梗死区膨胀、室壁变薄、室腔扩大。后者则在梗死后6周至大约1年发生，见于非梗死区心室整体进行性扩张和扭曲。2、心肌代谢改变：血液供应为心肌能量代谢提供底物和氧，血供的改变可直接影响心肌代谢。心梗时心肌伴随着能量和底物代谢的改变，包括高能磷酸盐的含量减少、线粒体数目和功能的改变等，使左心室收缩功能进行性恶化，左心室收缩功能的恶化又影响能量代谢的过程，从而形成恶性循环。心梗时交感神经过度激活导致儿茶酚胺浓度升高，促使肾上腺素β3受体(β3受体)上调。研究发现β3受体参与心肌能量代谢，β3受体介导产热和脂解作用，脂肪酸产生增多，而此时心肌利用脂肪酸代谢障碍，导致局部脂肪酸蓄积。脂肪酸增多具有直接细胞毒性作用，损害心肌收缩功能。3、钙循环异常：钙离子在心肌的收缩和舒张过程中发挥着重要作用。心梗时心肌细胞内钙稳态遭到破坏、钙循环异常，导致心肌舒缩功能障碍，促进心衰的发生、发展。钙循环主要包括钙释放、钙回摄和钙储存3个过程，其中任何一个过程异常都将影响心肌功能。L型钙通道功能异常、肌浆网钙容量减少和钙释放通道(RyR2)活性异常影响肌浆网钙释放。而肌浆网钙泵(SERCA2a)功能降低和钠钙交换体(NCX)表达增强影响钙回摄和钙储存[刘铭雅,魏盟.心肌梗死后心力衰竭发生机制及诊治进展[J].内科理论与实践,2014(1):21-25.]。

如本文所用，所述的“HDAC4抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够使HDAC4蛋白活性降低或丧失，或下调HDAC4的表达水平或抑制其活性。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是抑制HDAC4表达的病毒产品。作为实例，所述的抑制剂是：小分子化合物如LMK235(化学名N-((6-(hydroxyamino)-6-oxohexyl)oxy)-3,5-dimethylbenzamide，分子式C₁₅H₂₂N₂O₄，分子量294.35)，核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够使HDAC4蛋白活性降低或丧失，或下调HDAC4的表达。

如现有技术已公开某种对HDAC4具备抑制作用的物质(称为X)在制备治疗心力衰竭的药物中的应用，但现有技术并未阐明X用于治疗心力衰竭的机理在于使HDAC4蛋白活性降低或丧失，或下调HDAC4的表达，在这种情况下，本发明将把X排除在外，保护X以外的HDAC4抑制剂在制备治疗心力衰竭的药物中的应用。

本发明对HDAC4抑制剂的施药方法不作限定，作为一种优选例，可以是静脉注射，以达到改善患者心功能及运动耐量的目的。

本发明优点在于：

本发明建立了小鼠心肌梗死后心力衰竭动物模型，利用小动物跑步机进行有氧运动干预。利用PET/CT、心超及分子生物学技术，评估心功能、能量代谢及相关信号分子，发现有氧运动能提升梗死后心脏功能，增加运动耐力，改善线粒体结构功能和糖脂代谢，并降低心肌HDAC4核内基因抑制作用，提示HDAC4为有氧运动改善心肌梗死后心力衰竭的分子作用靶点，可开发促进HDAC4磷酸化或降低HDAC4表达的药物，给予心肌梗死后心力衰竭患者，达到与康复运动相同的效果，提高依从性，从而改善症状，提高运动耐力，降低病死率，具有重要的临床意义。本发明的结果还提示HDAC4磷酸化的表达水平可作为心肌梗死后心力衰竭预后的标志物。

附图说明

图1：有氧运动4周后心梗后心力衰竭小鼠心功能改善情况。结果显示：LVEF较基线水平改善。A：LVEF前后对照统计图，B：LVEF增量分析统计图，*p<0.05。

图2：运动耐力测试的跑步距离统计图。结果显示：有氧运动4周后小鼠跑步距离明显提高，*p<0.05。

图3：心肌细胞透射电镜示意图。结果显示：A：5400放大倍数下心肌梗死后心力衰竭心肌线粒体排列紊乱，数量增多。B：40000放大倍数下线粒体肿胀，嵴断裂，电子密度降低；有氧运动改善线粒体排列及结构。位于第3排第3列的图中，右边箭头：正常线粒体，左边箭头：异常线粒体。位于第3排第2列的图中，箭头：线粒体自噬小体。

图4：心肌组织ATP含量统计图。结果显示：有氧运动4周后小鼠心肌ATP含量增高，*p<0.05。

图5：FTHA PET/CT心肌脂肪酸摄取能力。结果显示：心肌梗死后心衰心肌脂肪酸摄取明显降低，有氧运动4周未影响脂肪酸摄取。A：PET/CT代表图。B：心肌FTHA最大标准摄取值统计图，*p<0.05，**p<0.01。

图6：18F-FDG PET/CT心肌葡萄糖摄取能力。结果显示：有氧运动4周明显增加心肌葡萄糖摄取。A：PET/CT代表图。B：心肌18F-FDG最大标准摄取值统计图，*p<0.05。

图7：各组心肌组织westernblot HDAC4表达。结果显示：心肌梗死后非运动组HDAC4磷酸化明显降低，有氧运动4周心肌HDAC4磷酸化明显升高。

图8：运动耐力测试的跑步距离统计图。结果显示：HDAC4抑制剂腹腔注射4周后心梗后心力衰竭小鼠跑步距离明显提高，*p<0.05，**p<0.01。

图9：HDAC4抑制剂腹腔注射4周后心梗后心力衰竭小鼠心功能改善情况。结果显示：LVEF较基线水平改善。A：LVEF四周后统计图，B：LVEF增量分析统计图，*p<0.05，***p<0.001。

图10：HDAC4抑制剂腹腔注射4周后心梗后心力衰竭小鼠心功能改善情况。结果显示：FS较基线水平改善。A：FS四周后统计图，B：FS增量分析统计图，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

我们通过建立小鼠心肌梗死后心力衰竭动物模型，利用小动物跑步机进行有氧运动干预。利用PET/CT、心超及分子生物学技术，评估心功能、能量代谢及相关信号分子，发现有氧运动能提升梗死后心脏功能，增加运动耐力，改善线粒体结构功能和糖脂代谢，并降低心肌HDAC4核内基因抑制作用。详情如下：通过结扎小鼠冠状动脉造成急性心肌梗死，并于一周后经心超确认心梗后心力衰竭模型构建成功。运用小鼠跑步机对心衰小鼠进行为期4周有氧运动后LVEF较对照组改善，同时跑步距离及运动耐力明显增加。经透射电镜发现有氧运动后心肌线粒体结构紊乱恢复、排列趋于正常、数量减少。离体心肌组织ATP含量增多。利用PET/CT发现心梗后心衰小鼠经有氧运动后，心肌18氟-氟代脱氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose，18F-FDG)明显增高，提示有氧运动刺激心肌细胞摄取葡萄糖明显增加，最后通过Western Blot检测造模心肌组织蛋白表达，发现有氧运动增加心梗后心衰降低的HDAC4磷酸化蛋白水平表达量。

本研究所涉及的小动物心超检测、透射电镜、病理切片观察、ATP含量检测、WesternBlot等方法是已经证实的、且被广泛应用的可靠方法。小鼠PET/CT成像及数据，依据3D-OSEM/MAP法重建，获得衰减校正后小鼠体内18F-FDG放射性分布融合图像，在此基础上，对于得到数据进行统计学T检验及双因素方差分析发现有氧运动降低心肌梗死后心力衰竭心肌HDAC4的表达。

具体实验方法及结果如下：

1、通过永久结扎小鼠冠状动脉，建立心肌梗死后心力衰竭模型，运用小动物跑步机有氧运动4周。

2、采用小动物心脏超声于心肌梗死后5周(有氧运动后4周)检测左室射血分数及心脏结构，比较有氧运动对左心室结构的改变情况。利用最大运动距离测试评价不同组别小鼠运动耐力情况。采用小动物PET/CT，利用18F-FDG及FTHA作为显像剂比较小鼠心肌对葡萄糖及脂肪酸的摄取能力。对干预组及对照组行Masson及HE病理染色切片，观察心肌纤维化等病理改变，运用透射电镜评价小鼠心肌线粒体形态数量及结构的变化。

(1)心脏超声检测心脏结构及功能

选择体重20-25g左右的成年雄性c57bl/6小鼠，通过永久结扎小鼠冠状动脉造成急性心肌梗死，并于一周后经异氟烷麻醉经心脏超声检测小鼠心脏功能以确认小鼠心梗后心力衰竭模型构建成功。运用小鼠跑步机对心衰小鼠进行为期4周康复有氧运动。康复运动结束后，继续采用小动物心脏超声仪分别对干预组及对照组检测LVEF、FS及心脏结构，比较有氧运动对左心室结构的改变情况。

(2)小鼠PET/CT成像及数据重建

①18F-FDG及FTHA显像剂合成

放射活性18F-FDG及FTHA由复旦大学附属肿瘤医院核医学科PET中心基于德国Siemens公司ExploraFDG4合成模块制作，放化纯在95％以上。

②小鼠心肌糖脂代谢成像

小动物PET/CT为德国Siemens公司生产的Inveon PET/CT。禁食禁水4小时后将小鼠用2.0％的异氟烷麻醉，经腹腔注射200μCi单位的18F-FDG或FTHA。1小时后置于PET/CT检查床上，移动检查床使之置于PET视野内，开始采集PET图像，进行用于PET数据衰减校正的CT采集，最后进行高分辨率CT采集，用时约30min。全过程中小鼠均处于保温麻醉状态。记录小鼠体重，取药时间、浓度，注射时间，空针时间、浓度。3D-OSEM/MAP法重建，获得衰减校正后小鼠体内18F-FDG放射性分布融合图像。

(3)透射电镜下心肌线粒体观察

组织块取自结扎冠脉以下支配心肌，放置在滴有2.5％戊二醛固定液的蜡片上，把组织块切成若干1mm×1mm×1mm的正方形小块，放入盛有2.5％戊二醛的小瓶中，4℃固定。继用0.1mol/L、pH 7.2的磷酸缓冲液(PB)清洗置换戊二醛固定液，然后用1％的锇酸后固定2h，PB清洗，梯度浓度的酒精、丙酮脱水，618树脂浸透包埋，切片机(型号：ReichertUltracut E，莱卡公司)切片，3％醋酸铀、枸橼酸铅染色。透射电镜(型号：CMl20，philips)观察、拍片。

3、分离心肌组织，使用sigma试剂盒检测丙酮酸脱氢酶、羟酰基辅酶A脱氢酶活性以及心肌组织ATP含量。

使用(Sigma MAK183)PDH检测试剂盒，取10mg左右心肌组织，研磨后加入PDH检测缓冲液，置于冰上10分钟后，用离心机5分钟10000G离心后取上清。取5-50μl上清置于96孔板中，PDH检测缓冲液加置50μl后分别加入PDH DEVELOPER及PDH底物。37度下水浴2-3分钟后于SPECTRA MAX190分光光度计450nm波长下检测。

4、使用Western Blot方法分析GLUT1，GLUT4，CD36，PDH，CPT，AMPK，HDAC4，MEF2，nr4a1等葡萄糖及脂肪酸代谢相关通路蛋白及信号通路分子，探明有氧运动对心力衰竭能量代谢的影响及其具体信号分子通路。

分别提取干预组及对照组小鼠心尖组织总蛋白，提取方法如下：取10mg左右组织置于RIPA裂解液，使用TIANGEN组织研磨仪及超声进一步破坏细胞膜，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。根据蛋白的上样量进行上样，蛋白电泳完成后将其转移到PVDF膜上，随后封闭液封闭1小时，一抗4℃过夜，TBST清洗后二抗孵育1小时，TBST清洗二抗后进行曝光。

实验结果如下：

实验中，我们发现对心肌梗死后心力衰竭小鼠进行4周有氧运动改善了LVEF(图1)；小鼠跑步距离增加，运动耐力测试提高(图2)；心肌线粒体结构、排列紊乱改善(图3)，离体心肌检测组织ATP含量较野生型明显升高(图4)；有氧运动明显增加心肌葡萄糖摄取(图5)；心肌梗死后心肌摄取脂肪酸降低，有氧运动未改善脂肪酸摄取(图6)；有氧运动4周心肌HDAC4磷酸化明显升高，说明有氧运动后HDAC4核外转移增多，对下游基因抑制减少(图7)。

实施例2

1.实验方法

LMK235购自ApexBio公司，将药物溶于DMSO中，稀释于生理盐水中。实验组心肌梗死后心力衰竭模型小鼠采用5mg/kg剂量，每周经腹腔注射5次，DMSO组注射同浓度及剂量的DMSO。按照实施例1所述的方法测定运动耐力和LVEF。另外通过小动物心超，控制心率在合理范围后，测定FS值的大小。

2.实验结果

结果显示：HDAC4抑制剂LMK235腹腔注射4周后，小鼠跑步距离明显提高(图8)，LVEF和FS较基线水平改善(图9和图10)，表明HDAC4抑制剂能够有效治疗心肌梗死后心力衰竭，LMK235的改善作用显著。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.检测HDAC4磷酸化水平的试剂在制备心肌梗死后心力衰竭预后的试剂盒中的应用。

2.检测HDAC4磷酸化水平的试剂在制备永久结扎小鼠冠状动脉建立的心肌梗死后心力衰竭模型心力衰竭预后的试剂盒中的应用。

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