CN101186643A - 一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101186643A CN101186643A CNA2007101784270A CN200710178427A CN101186643A CN 101186643 A CN101186643 A CN 101186643A CN A2007101784270 A CNA2007101784270 A CN A2007101784270A CN 200710178427 A CN200710178427 A CN 200710178427A CN 101186643 A CN101186643 A CN 101186643A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- val
- ala
- leu
- expression vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种心肌性能相关的蛋白及其编码基因与应用。该心肌性能相关的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与心肌性能相关的由a)衍生的蛋白质。本发明的心肌性能相关蛋白及其编码基因，以及培育心肌性能增强的转基因鱼的方法具有如下价值：有助于阐明砷导致心血管疾病的致病机理，防治砷导致心血管疾病；有助于阐明外源有毒物质导致心血管疾病的致病机理，防治外源有毒物质导致心血管疾病；对保护鱼类和人类健康具有重要意义；在鱼的育种中有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
外源有毒物质可引起人体急慢性中毒。据Bundersun and Coffin报道，砷的长期胁迫与心血管疾病相关，心血管疾病包括缺血型心脏病、脑血管疾病、颈动脉硬化。
多细胞高等动物体内不同组织器官的细胞外液浓度可以相差数十倍，原因在于细胞有一套完整的钙转移系统，主要包括存在于细胞质膜及肌浆网膜的Ca2+运送器。肌浆网钙通道(ryanodine receptor，RyR)是已知的最大的离子通道，由同源四聚体组成，目前发现三种亚型，分别是骨骼肌型(RyR1)、心脏型(RyR2)和脑型(RyR3)。RyR1基因主要在骨骼肌表达，RyR2主要在心脏表达，RyR3主要在大脑表达。心力衰竭时，心肌细胞肌浆网(SR)通过钙通道释放Ca2+的功能受损，RyR不能迅速释放Ca2+到胞浆，导致心肌细胞收缩障碍，其原因可能与RyR基因表达下调有关。
RyR是SR上的钙释放通道，也是连接很多关键性调节蛋白的蛋白质复合物，其中包括钙调素(调节RyR功能)、FK-506结合蛋白(稳定RyR通道蛋白，连接RyR单体和相邻的RyR四倍体)、PKA(改变RyR和ICa门控)、磷脂酶等，这些蛋白质均参与了调节SR释放Ca2+。
心肌细胞肌浆网Ca2+泵在细胞迅速转移Ca2+上起主要作用，其依赖水解ATP将细胞质Ca2+逆浓度梯度泵入肌浆网，使心肌细胞舒张。肌浆网Ca2+泵(SERCA)有五种异构体，分别由三种基因编码，在不同组织或器官中表达：SERCA1定位于人类染色体16p12.1，主要表达于骨骼肌，分为SERCA1a和SERCA1b；SERCA2定位于人类染色体12q23-16q24.1，分为SERCA2a和SERCA2b，SERCA2a基因主要在心室和心房的心肌表达，SERCA2b基因主要在平滑肌表达；SERCA3定位于人类染色体17p13.3，主要在肾脏、血细胞、内皮细胞、上皮细胞表达。Arai等研究发现，轻度心肌肥大的人SERCA2表达下降，与SERCA2的mRNA累积量呈正相关。Meyert等构建了SERCA2基因超表达的小鼠株系，该转基因小鼠心肌舒张性能和心肌收缩均明显提高。以CMV启动子携带SERCA2基因的腺病毒转染小鼠心肌细胞，可以使其收缩性能得到提高。
在心力衰竭的人或动物中，心肌细胞内的钙的瞬时变化(calcium transient)发生异常，与正常心肌相比，其(Ca2+)i上升速度较慢，幅度较小，而且恢复延缓，造成心肌的收缩速度减慢、强度降低和舒张迟缓，出现心功能受损。这种钙的瞬时变化异常，是由心衰时心肌细胞内钙的各种调控蛋白的变化决定的。大多数研究结果表明，在心力衰竭的人或动物中，心肌细胞的SERCA2的表达降低，功能下降。SERCA2的改变使复极时肌浆网重吸收钙作用降低，一方面直接使胞浆的Ca2+浓度下降减慢，心肌的舒张延缓，另一方面使肌浆网钙的贮存量减少，致使在除极时由肌浆网释放的Ca2+减小，心肌的收缩功能降低。
许多实验证实了SERCA2调控蛋白的原发改变对心肌细胞的钙的瞬时变化和心肌收缩功能的影响。研究者通过基因工程使SERCA2的表达增加，浆网重吸收和释放的Ca2+作用增加，心肌的收缩和舒张功能也增加，即使已经主动脉缩窄，心肌收缩功能也得到明显的保护；相反，令SERCA2基因突变，SERCA2蛋白表达减少，钙的瞬时变化的峰值下降，心肌的收缩和舒张功能受损，说明SERCA2对心肌的收缩和舒张具有决定作用。
心肌的收缩力与频率的关系可以用心肌的收缩力-频率关系(Force-frequencyrelationship，FFR)反映。FFR与心功能有关：在正常人或动物中，心肌的收缩力随着心搏频率的增加而增加，FFR呈正相关；患严重的心室肥厚、心衰等疾病的人或动物，心肌FFR可发生改变，心肌的收缩力不再随着心搏频率的增加而增加，FFR呈负相关；在心力衰竭的人或动物中，当给予治疗时，心功能好转，FFR异常变化可出现逆转。有研究发现FFR与SERCA2密切相关：当SERCA2表达减少或功能降低时FFR可出现变化，甚至呈负性，当SERCA2超表达则能纠正FFR的受损。但有些学者认为FFR的变化主要取决于PLB、SERCA2/PLB或细胞膜上的L-型钙通道等。此外也有研究报道提到，兔的转SERCA2基因心肌细胞中，虽然在相同频率的刺激下，该转基因心肌细胞的收缩力明显增加，但其FFR却呈负性。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛋白，该蛋白与动物的心肌性能相关。
本发明所提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与心肌性能相关的由a)衍生的蛋白质。
序列表中的序列2由990个氨基酸残基组成，含有一个典型的SERCA2保守域。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指在序列2的SERCA2保守域外进行取代和/或缺失和/或添加。
为了使a)中的SiSERCA2便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述b)中的SiSERCA2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的SiSERCA2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至2973位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供一种编码上述蛋白的基因。
本发明所提供的编码上述蛋白的基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列1由2973个脱氧核糖核苷酸组成，自5’末端的第1至2973位脱氧核糖核苷酸为SiSERCA2的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)。
含有上述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体具体可为在pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pGEX-SiSERCA2。
所述重组表达载体还可为在表达载体pCMVnramp的EcoR I和Sal I酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2。
含有上述基因的转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种培育心肌性能增强的转基因鱼的方法。
本发明所提供的培育心肌性能增强的转基因鱼的方法，是将上述任一种重组表达载体导入鱼的受精卵细胞中，得到心肌性能增强的转基因鱼。
上述转基因鱼具体可为鲇鱼。
实验结果表明：转入重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2的鲇鱼与转入空载体pCMVnramp的鲇鱼相比，其心肌性能显著增强。因此本发明的心肌性能相关蛋白及其编码基因，以及培育心肌性能增强的转基因鱼的方法具有如下价值：有助于阐明砷导致心血管疾病的致病机理，防治砷导致心血管疾病；有助于阐明外源有毒物质导致心血管疾病的致病机理，防治外源有毒物质导致心血管疾病；对保护鱼类和人类健康具有重要意义；在鱼的育种中有巨大的应用前景。
附图说明
图1为pGEX-SiSERCA2融合蛋白诱导表达的SDS-PAGE电泳图谱
图2为SiSERCA2的Southern杂交分析图谱
图3为Northern blot分析不同组织SiSERCA2 mRNA的转录
图4为转基因鲇鱼心脏照片
具体实施方式
实施例1、兰州鲇(Silurus lanzhouensis)cDNA文库的构建、SiSERCA2cDNA克隆及序列分析
以0.1mg/L NaAsO2诱导兰州鲇(Silurus lanzhouensis)幼苗15天，采用SuperScriptTM Plasmid System with Gateway Technology for cDNA Synthesis andCloning(Invitrogen)构建鲇鱼cDNA文库，按照InvitrogenTM Life TechnologiesInstruction Manual操作。首先利用RNAgents Total RNA Isolation System(Promega)提取鲇鱼幼苗总RNA，利用PolyATtract mRNA IsolationSystems(Promega)分离出mRNA，然后在含有Not I位点的0ligo(dT)锚定引物作为反转录引物合成cDNA第一链以及cDNA第二链，在cDNA第一链末端连接Sal I接头，然后定向插入载体中，插入DNA片段大于1Kb。鲇鱼cDNA文库的库容为1×106个克隆，重组率达97％，表明构建的鲇鱼cDNA文库的质量较好，能够用于心肌性能相关基因的分离研究。
以鼠Atp2a2 cDNA(源于Rattus norvegicus，注册号为NM 017290)为探针筛选了0.5×106未扩增斑，得到1个阳性斑，其插入片段为2973bp，具有完整的阅读框(其核苷酸序列如序列表中序列1所示)，编码由990个氨基酸残基组成的多肽(其氨基酸序列如序列表中序列2所示)。
实施例2、鲇鱼SiSERCA2基因在大肠杆菌中的体外表达鉴定
1、SiSERCA2基因的获得
提取实施例1中用0.1mg/L NaAsO2诱导兰州鲇幼苗的总RNA，反转录得到cDNA。设计一对扩增SiSERCA2基因的特异性引物，并使引物含有限制性内切酶EcoRI和Sal I的识别位点，设计的引物序列如下：
(SiSERCA2-F)：5’-ACAA
ATGGAGAACGCACACACCAAG-3’，
(SiSERCA2-R)：5’-ACCA
GACTGCTTCATGTTGTTGTAG-3’。
以上述反转录得到的cDNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增。
对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收纯化PCR产物，对该PCR产物进行测序，测序结果表明，得到的PCR产物具有序列表序列1的核苷酸序列。该核苷酸序列编码序列表中序列2的SiSERCA2蛋白。
2、SiSERCA2基因在大肠杆菌中表达
通过冷冻挤压法回收纯化PCR产物，用EcoRI和Sal I双酶切纯化后的PCR产物，纯化酶切产物。同样，用限制性内切酶EcoR I和Sal I酶切pGEX-4T-1质粒(Promega)，获得线状载体片段。通过T4 DNA连接酶连接酶切后的PCR产物和线状载体，得到含有SiSERCA2基因的重组表达载体pGEX-SiSERCA2。
将重组表达载体pGEX-SiSERCA2转化大肠杆菌XL1-Blue菌株，在含Amp的LB液体培养基中过夜培养，筛选出含有重组表达载体pGEX-SiSERCA2的阳性重组体。经鉴定，pGEX-SiSERCA2在EcoR I和Sal I位点插入了SiSERCA2基因(序列表序列1)。在阳性重组体中，目的基因整合到GST基因末端，表达产物与GST形成融合蛋白。以1％的比例重新接菌于2×YT培养基，30℃振荡培养3小时，使菌液浓度达到OD600为0.5。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)，IPTG诱导lacZ启动子下游基因表达，受lacZ启动子的调控。SDS-PAGE检测表达蛋白，见图1。图1中泳道1为Marker；泳道2为经IPTG诱导，未转入SiSERCA2基因的pGEX-4T-1；泳道3为未诱导的pGEX-SiSERCA2；泳道4为经IPTG诱导的pGEX-SiSERCA2。结果表明IPTG诱导，未转入SiSERCA2基因的pGEX-4T-1质粒中GST基因在大肠杆菌中表达；未诱导的pGEX-SiSERCA2在大肠杆菌中没有蛋白条带出现；经IPTG诱导，重组表达载体pGEX-SiSERCA2中融合蛋白在大肠杆菌中表达，此结果证实了SiSERCA2能够激活靶基因的转录表达，以调控心肌作用。
实施例3、SiSERCA2基因在鲇鱼基因组中的拷贝数分析
利用CTAB法提取兰州鲇基因组DNA，通过0.8％琼脂糖凝胶检测提取的鲇鱼基因组DNA，选择完整、纯的基因组DNA样品。选择3种限制性内切酶(HindIII、Sal I、Xho I)消化20μg鲇鱼基因组DNA，经1.2％琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，通过毛细管作用被原封不动地转移到尼龙膜(Nylon+)上，利用经同位素α-32P标记的SiSERCA2cDNA编码区为探针，进行Southern杂交分析，并经过高严谨度洗膜(高严谨度的条件是：0.5×SSC，0.1×SDS，65℃)。结果如图2所示，通过HindIII、Sal I、Xho I 3种酶消化，产生了清晰的杂交带。在SiSERCA2 cDNA中没有发现HindIII、Sal I、Xho I酶切位点，说明SiSERCA2在鲇鱼基因组DNA是以单拷贝数存在。
实施例4、鲇鱼SiSERCA2基因表达特征
提取经0.1mg/L NaAsO2诱导的兰州鲇(Silurus lanzhouensis)幼苗不同组织(肾、骨骼肌、心脏)中的总RNA，取相同质量(20μg)的各样品在变性1.2％琼脂糖凝胶中分离，将RNA分别转移至带正电荷的尼龙膜上(Nylon+)。利用经同位素α-32P标记的SiSERCA2cDNA编码区为探针(Takara labeling and detection kit，Takara BioTech(dalian)Co.Ltd)，将提取的总RNA与SiSERCA2 cDNA探针进行Northern杂交分析，结果见图3。
由图3中可以看到，SiSERCA2在心脏、骨骼肌都有表达，而且在心脏、骨骼肌SiSERCA2mRNA累积量是不同的。在心脏中转录水平高，骨骼肌转录水平低于心脏，肾中没有SiSERCA2 mRNA累积。这些结果表明，SiSERCA2主要在鲇鱼心肌或骨骼肌中表达，SiSERCA2的表达可能具有双重功能，一是心肌收缩性能得到提高；二是具有抗砷作用。
实施例5、培育心肌性能增强的转基因鲇鱼的方法
1、重组表达载体的构建
以实施例2中构建的重组表达载体pGEX-SiSERCA纳模板，以如下引物进行PCR，扩增SiSERCA2基因(序列表中的序列1)：
(CAT-F)：5’-ACAA
CCTGGTGACATCGTTGAG-3’，
(CAT-R)：5’-AACA
CATTCAGCTCTGCAAAG-3’。
将pCMVnramp质粒表达载体(Promega)用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行酶切。用EcoR I和Sal I酶切后的SiSERCA2 cDNA插入表达载体pCMVnramp的EcoR I和SalI酶切位点，得到重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2。
2、培育转基因鱼苗
采用显微注射法进行鲇鱼转化。兰州鲇(Silurus lanzhouensis)亲鱼来自宁夏水产研究所繁殖实验基地，肌肉注射激素，用LHRH-A人工催产。采集高质量成熟卵子和精子，干法受精获得大量鲇鱼受精卵，加水激活后取上层优质浮卵于10～14℃条件下培养，取1～2细胞期的胚胎用于显微注射。
显微注射DNA溶液的配制：用限制性内切酶Sal I将重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2线性化，并将其溶解于Tris-HCl(pH：7.6)溶液中，使其终浓度为l00ng/μL，再将其用0.02μm滤器过滤除菌，得到的溶液即为显微注射DNA溶液。
采用Nikon公司的拉针仪和磨针仪，制成针尖约为4～9μm注射针，针尖要求尖锐，能够刺穿受精卵膜，并且Nikon公司的显微注射仪将转基因表达载体射入兰州鲇单细胞期受精卵动物极细胞质内。每卵注射50pL上述显微注射DNA溶液(浓度为50ng/μL)。
筛选出产生绿色荧光的转基因胚胎，检测SiSERCA2基因在体内的整合和表达，证实SiSERCA2基因能够在兰州鲇胚胎内超表达。
将显微注射受精卵置于培养皿中，用Danieau’s液(1.74mol/L NaCl，21mmol/LKCl，12mmol/L MgSO4，18mmol/L CaCl2，150mmol/L HEPES，pH：7.6)培养，每5小时换培养液。孵化后转入无菌的暴气自来水中培养。得到转入重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2的仔鱼，仔鱼孵化3天后开始饲喂。
按照上述方法，将空载体pCMVnramp用限制性内切酶Sal I线性化后，转入鱼中，培育得到转入空载体pCMVnramp的仔鱼，作为对照。
3、转入重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2鲇鱼的心肌性能检测
取鱼龄为30～40天，转入重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2的兰州鲇和转入空载体pCMVnramp的兰州鲇各50尾，体长均5～8cm，体重均4～7g。进行解剖，取心脏进行如下检测：采用心肌运动指数(Tei指数)综合评价心脏的整体功能。可以看出转入重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2的兰州鲇心脏比转入空载体pCMVnramp的兰州鲇健壮、有力，即心肌舒张性能和心肌收缩均明显提高，如图4所示。
序列表
<110>宁夏回族自治区水产研究所
中国农业大学
<120>一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用
<130>CGGNARY71637
<160>2
<210>1
<211>2973
<212>DNA
<213>鲇属兰州鲇(Silurus lanzhouensis)
<400>1
atggagaacg cacacaccaa gtcccccgca gaggttatat ccttcttcgg ggtgagcgag 60
acaaccgggc ttacaccgga ccaggtcaag aggaacatgg ccaagtatgg ccccaatgag 120
ctgccagccg aggagggaaa gaccatctgg gaactggtca tcgagcagtt tgaggatctg 180
cttgtcagaa ttctgctgct cgctgcctgc atctctttcg tgcttgcttg gtttgaggaa 240
ggtgaggaga ccgtcacagc ctttgttgag ccatttgtta ttctgcttat cctcattgcc 300
aatgcagttg ttggtgtatg gcaggagcgt aatgctgaga gcgccatcga ggctctgaag 360
gagtacgagc ccgagatggg caaagtctac cgatctgaca gaaagagtgt gcagaggatc 420
aaggccagag agattgtccc tggtgacatc gttgaggttt ctgttggtga taaagtccct 480
gctgacatca gaattaccgc tatccgctcc accaccctgc gtgttgacca gtccatcctt 540
actggtgagt ctgtcagtgt gatcaagcat accgatgccg tccctgacct cagagccgtc 600
aaccaggaca agaagaacat gctgttctca ggcactaaca ttgctgctgg caaggctatt 660
ggcgtttgca tcgccactgg cgtttccacc gagatcggca agatccgtga ccagatggcc 720
gccaccgagc aggagaagac ctctctgcag cagaagttgg aggagtttgg cgagcagctc 780
tccaaagtta tctctctgat ttgcgtcgcc gtctggatga tcaacatcgg ccacttcaat 840
gatcccgtcc atggtggctc ctggatccgc ggtgctgttt actacttcaa gattgccgtc 900
gccctggctg tcgctgccat ccctgagggt ctgccagccg tcatcactac ctgcctggct 960
ctcggtaccc gtcgtatggc gaggagacgc cattgtcgtt ccctgccctc cgtgagactc 1020
tgggggtgca cctctgtatc tgctcagaca aaccgggcac tctcaccact atcagaatgg 1080
tgtgtcacaa agatgttcgt catcgacgag tggatggtga tcacggttcc tgaatgctcg 1140
atatctccgc ctctaaataa cactcccgag ggcgaggtga ccaaagggag ggttctaaag 1200
ttgactgcag tcagcacgat ggccctggta gagctcgcca ccatctgcgc cctgtgcaac 1260
gtctcctctc ttgatttcaa cgagtctaag aagatctatg agaaggttgg tgaggccact 1320
gaaaccgctc tgtgttgcct ggtggagaaa atgaacgtgt tcaagaccag cgttaacaac 1380
ctgtcctgtg tggagagagc caatgcctgc tgcagcgttg tgaagcagct gatgaagaaa 1440
aactttaccc tggagttctc ccgtgacagg aagtccatgt ctgtgtactg caccccaacc 1500
agaggagaga gcggcagcaa gatgtttgtg aagggtgccc ccgagggtgt gattgacagg 1560
tgcacctatg tgcgtgttgg ctctgcccgt gtgcccctga ctggccccat taaggacaag 1620
atcttgacta tcattaagga gtggggtact ggccgtgaca cactgcgatg ccttgccctt 1680
gccactcgtg acagtccact gaaggtcgag gagatgaaac tcgaagacgc caccaagttt 1740
gctgactatg agactgacct gacctccgtc ggctgtgtcg gcatgctgga tccccctcgt 1800
aaagaggtca gcggctccat tcagctctgc aaagatgctg gtatccgtgt catcatgatt 1860
actggcgaca acaagggaac agctgtggct atttgccgtc gcattggcat cttcagtgag 1920
gacgaggatg tgactggaag agcctacact ggccgtgagt ttgatgatct gcctcgtgct 1980
gagcagagcg aagctgtaac cagggcctgc tgctttgccc gtgtcgagcc ttcccacaaa 2040
tccaagattg ttgagtacct gcaaggccac gatgagatca ctgccatgac cggtgatggt 2100
gtgaatgatg cccctgccct gaagaaggcc gagattggca ttgccatggg ctctggcact 2160
gctgttgcca agtcagcctc tgagatggtc ctggctgatg acaacttctc ttccattgtg 2220
gctgctgttg aggagggcag agctatctac aacaacatga agcagttcat ccgctacctg 2280
atctcctcca acgtcggaga ggtcgtctgt atcttcctca ctgctgccct cggtcttcct 2340
gaggctctga ttccagtacg gctgttgtgg gtgaacctag tcactgatgg tctccctgcc 2400
accgctttgg gcttcaaccc ccctgatctg gacatcatgg gcaaagctcc ccgttccccc 2460
aaagagcccc ttatttctgg ctggctgttc ttcagatacc tggtcattgg tggatacgtc 2520
ggtgctgcca ctgttggtgc tgctgcttac tggttcctgt atgatgatga gggccccaaa 2580
gtgacctact atcagctgtc ccacttcatg cagtgccatg atgaaaatga ggactttgct 2640
ggaattgaat gtgaggtatt tgaggcagct cctcccatga ccatggccct gtctgtgctg 2700
gtcaccattg agatgtgcaa tgctcttaac agcttgtctg agaaccagtc acttattcgc 2760
atgcctccat ggagcaactt ctggctgttg gccgccatga ccctctccat gtccctgcac 2820
ttcatgatca tctacgtgga ccccctgccc atggtcttca agctgaccca cttgaacgtt 2880
gaacagtggt tggtggtgct gaaactgtcc ttccccgtca tcctcattga cgaggtgttg 2940
aagttcgttg ctcgcaacta cctggaggcc taa 2973
<210>2
<211>990
<212>PRT
<213>鲇属兰州鲇(Silurus lanzhouensis)
<400>2
Met Glu Asn Ala His Thr Lys Ser Pro Ala Glu Val Ile Ser Phe Phe
1 5 10 15
Gly Val Ser Glu Thr Thr Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val Lys Arg Asn
20 25 30
Met Ala Lys Tyr Gly Pro Asn Glu Leu Pro Ala Glu Glu Gly Lys Thr
35 40 45
Ile Trp Glu Leu Val Ile Glu Gln Phe Glu Asp Leu Leu Val Arg Ile
50 55 60
Leu Leu Leu Ala Ala Cys Ile Ser Phe Val Leu Ala Trp Phe Glu Glu
65 70 75 80
Gly Glu Glu Thr Val Thr Ala Phe Val Glu Pro Phe Val Ile Leu Leu
85 90 95
Ile Leu Ile Ala Asn Ala Val Val Gly Val Trp Gln Glu Arg Asn Ala
100 105 110
Glu Ser Ala Ile Glu Ala Leu Lys Glu Tyr Glu Pro Glu Met Gly Lys
115 120 125
Val Tyr Arg Ser Asp Arg Lys Ser Val Gln Arg Ile Lys Ala Arg Glu
130 135 140
Ile Val Pro Gly Asp Ile Val Glu Val Ser Val Gly Asp Lys Val Pro
145 150 155 160
Ala Asp Ile Arg Ile Thr Ala Ile Arg Ser Thr Thr Leu Arg Val Asp
165 170 175
Gln Ser Ile Leu Thr Gly Glu Ser Val Ser Val Ile Lys His Thr Asp
180 185 190
Ala Val Pro Asp Leu Arg Ala Val Asn Gln Asp Lys Lys Asn Met Leu
195 200 205
Phe Ser Gly Thr Asn Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ile Gly Val Cys Ile
210 215 220
Ala Thr Gly Val Ser Thr Glu Ile Gly Lys Ile Arg Asp Gln Met Ala
225 230 235 240
Ala Thr Glu Gln Glu Lys Thr Ser Leu Gln Gln Lys Leu Glu Glu Phe
245 250 255
Gly Glu Gln Leu Ser Lys Val Ile Ser Leu Ile Cys Val Ala Val Trp
260 265 270
Met Ile Asn Ile Gly His Phe Asn Asp Pro Val His Gly Gly Ser Trp
275 280 285
Ile Arg Gly Ala Val Tyr Tyr Phe Lys Ile Ala Val Ala Leu Ala Val
290 295 300
Ala Ala Ile Pro Glu Gly Leu Pro Ala Val Ile Thr Thr Cys Leu Ala
305 310 315 320
Leu Gly Thr Arg Arg Met Ala Arg Arg Arg His Cys Arg Ser Leu Pro
325 330 335
Ser Val Arg Leu Trp Gly Cys Thr Ser Val Ser Ala Gln Thr Asn Arg
340 345 350
Ala Leu Ser Pro Leu Ser Glu Trp Cys Val Thr Lys Met Phe Val Ile
355 360 365
Asp Glu Trp Met Val Ile Thr Val Pro Glu Cys Ser Ile Ser Pro Pro
370 375 380
Leu Asn Asn Thr Pro Glu Gly Glu Val Thr Lys Gly Arg Val Leu Lys
385 390 395 400
Leu Thr Ala Val Ser Thr Met Ala Leu Val Glu Leu Ala Thr Ile Cys
405 410 415
Ala Leu Cys Asn Val Ser Ser Leu Asp Phe Asn Glu Ser Lys Lys Ile
420 425 430
Tyr Glu Lys Val Gly Glu Ala Thr Glu Thr Ala Leu Cys Cys Leu Val
435 440 445
Glu Lys Met Asn Val Phe Lys Thr Ser Val Asn Asn Leu Ser Cys Val
450 455 460
Glu Arg Ala Asn Ala Cys Cys Ser Val Val Lys Gln Leu Met Lys Lys
465 470 475 480
Asn Phe Thr Leu Glu Phe Ser Arg Asp Arg Lys Ser Met Ser Val Tyr
485 490 495
Cys Thr Pro Thr Arg Gly Glu Ser Gly Ser Lys Met Phe Val Lys Gly
500 505 510
Ala Pro Glu Gly Val Ile Asp Arg Cys Thr Tyr Val Arg Val Gly Ser
515 520 525
Ala Arg Val Pro Leu Thr Gly Pro Ile Lys Asp Lys Ile Leu Thr Ile
530 535 540
Ile Lys Glu Trp Gly Thr Gly Arg Asp Thr Leu Arg Cys Leu Ala Leu
545 550 555 560
Ala Thr Arg Asp Ser Pro Leu Lys Val Glu Glu Met Lys Leu Glu Asp
565 570 575
Ala Thr Lys Phe Ala Asp Tyr Glu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Cys
580 585 590
Val Gly Met Leu Asp Pro Pro Arg Lys Glu Val Ser Gly Ser Ile Gln
595 600 605
Leu Cys Lys Asp Ala Gly Ile Arg Val Ile Met Ile Thr Gly Asp Asn
610 615 620
Lys Gly Thr Ala Val Ala Ile Cys Arg Arg Ile Gly Ile Phe Ser Glu
625 630 635 640
Asp Glu Asp Val Thr Gly Arg Ala Tyr Thr Gly Arg Glu Phe Asp Asp
645 650 655
Leu Pro Arg Ala Glu Gln Ser Glu Ala Val Thr Arg Ala Cys Cys Phe
660 665 670
Ala Arg Val Glu Pro Ser His Lys Ser Lys Ile Val Glu Tyr Leu Gln
675 680 685
Gly His Asp Glu Ile Thr Ala Met Thr Gly Asp Gly Val Asn Asp Ala
690 695 700
Pro Ala Leu Lys Lys Ala Glu Ile Gly Ile Ala Met Gly Ser Gly Thr
705 710 715 720
Ala Val Ala Lys Ser Ala Ser Glu Met Val Leu Ala Asp Asp Asn Phe
725 730 735
Ser Ser Ile Val Ala Ala Val Glu Glu Gly Arg Ala Ile Tyr Asn Asn
740 745 750
Met Lys Gln Phe Ile Arg Tyr Leu Ile Ser Ser Asn Val Gly Glu Val
755 760 765
Val Cys Ile Phe Leu Thr Ala Ala Leu Gly Leu Pro Glu Ala Leu Ile
770 775 780
Pro Val Arg Leu Leu Trp Val Asn Leu Val Thr Asp Gly Leu Pro Ala
785 790 795 800
Thr Ala Leu Gly Phe Asn Pro Pro Asp Leu Asp Ile Met Gly Lys Ala
805 8l0 815
Pro Arg Ser Pro Lys Glu Pro Leu Ile Ser Gly Trp Leu Phe Phe Arg
820 825 830
Tyr Leu Val Ile Gly Gly Tyr Val Gly Ala Ala Thr Val Gly Ala Ala
835 840 845
Ala Tyr Trp Phe Leu Tyr Asp Asp Glu Gly Pro Lys Val Thr Tyr Tyr
850 855 860
Gln Leu Ser His Phe Met Gln Cys His Asp Glu Asn Glu Asp Phe Ala
865 870 875 880
Gly Ile Glu Cys Glu Val Phe Glu Ala Ala Pro Pro Met Thr Met Ala
885 890 895
Leu Ser Val Leu Val Thr Ile Glu Met Cys Asn Ala Leu Asn Ser Leu
900 905 910
Ser Glu Asn Gln Ser Leu Ile Arg Met Pro Pro Trp Ser Asn Phe Trp
915 920 925
Leu Leu Ala Ala Met Thr Leu Ser Met Ser Leu His Phe Met Ile Ile
930 935 940
Tyr Val Asp Pro Leu Pro Met Val Phe Lys Leu Thr His Leu Asn Val
945 950 955 960
Glu Gln Trp Leu Val Val Leu Lys Leu Ser Phe Pro Val Ile Leu Ile
965 970 975
Asp Glu Val Leu Lys Phe Val Ala Arg Asn Tyr Leu Glu Ala
980 985 990
Claims (10)
1.一种蛋白，是如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与心肌性能相关的由a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述蛋白编码基因为如下1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pGEX-4T-1的EcoR I和Sal I酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pGEX-SiSERCA2。
6.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为在表达载体pCMVnramp的EcoR I和Sal I酶切位点间插入序列表中序列1所示的核苷酸序列得到的重组表达载体pCMVnramp-SiSERCA2。
7.含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系或重组菌。
8.一种培育心肌性能增强的转基因鱼的方法，是将权利要求4、5或6所述的重组表达载体导入鱼的受精卵细胞中，培养得到心肌性能增强的转基因鱼。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述转基因鱼为鲇鱼。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述心肌性能为心肌舒张性能和/或心肌收缩性能。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007101784270A CN101186643A (zh) | 2007-11-30 | 2007-11-30 | 一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNA2007101784270A CN101186643A (zh) | 2007-11-30 | 2007-11-30 | 一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101186643A true CN101186643A (zh) | 2008-05-28 |
Family
ID=39479289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA2007101784270A Pending CN101186643A (zh) | 2007-11-30 | 2007-11-30 | 一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101186643A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113956345A (zh) * | 2021-09-10 | 2022-01-21 | 北京大学 | Angpt4蛋白及其编码基因在调控心脏损伤后的修复与再生能力中的应用 |
-
2007
- 2007-11-30 CN CNA2007101784270A patent/CN101186643A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113956345A (zh) * | 2021-09-10 | 2022-01-21 | 北京大学 | Angpt4蛋白及其编码基因在调控心脏损伤后的修复与再生能力中的应用 |
| CN113956345B (zh) * | 2021-09-10 | 2024-04-23 | 北京大学 | Angpt4蛋白及其编码基因在调控心脏损伤后的修复与再生能力中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102358902A (zh) | 家蚕丝素重链基因突变序列及突变的方法和应用 | |
| CN104846011A (zh) | 利用家蚕后部丝腺合成分泌蜂王浆主蛋白1的方法 | |
| KR101825943B1 (ko) | 멜리틴 항생펩타이드를 생산하는 형질전환 누에 | |
| CN101260398B (zh) | 神经生长因子基因定位改造动物及其制备方法和应用 | |
| CN101356191B (zh) | 用于水生生物培养的神经肽 | |
| CN101182360A (zh) | 一种具有抗菌功能的融合蛋白及其应用 | |
| CN103917655A (zh) | 核心蛋白聚糖组合物及其用途 | |
| CN102061303B (zh) | 两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法 | |
| CN107602686B (zh) | 一种对革兰氏阳性菌具有抗性的多肽 | |
| CN101824435A (zh) | 一种罗非鱼神经肽y重组蛋白的表达系统 | |
| CN101186643A (zh) | 一种动物心肌性能相关蛋白及其编码基因与应用 | |
| KR20080009908A (ko) | 형광 진주 생산용 패류 형질전환체 | |
| CN103484466A (zh) | 一种小菜蛾抗菌肽moricin及其制备方法与应用 | |
| EP1686179A1 (en) | Means and methods for improving the development and maturation of eggs and/or sperm in fish using hormones produced by transplanted cells | |
| CN103864939A (zh) | mGM-CSF/βhCG融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN114316012A (zh) | 一种锦鲤用抗菌感染的免疫蛋白和应用 | |
| CN113717268A (zh) | 锦鲤血清淀粉样蛋白a5或其编码基因在调控锦鲤抗病原菌感染中的应用 | |
| CN102191270A (zh) | 以黄颡鱼β-肌动蛋白启动子和生长激素基因为元件构建的黄颡鱼本源转基因载体及其应用 | |
| CN107827968B (zh) | 一种从六线鱼中分离的多肽 | |
| CN108752459A (zh) | 半滑舌鳎igf-i蛋白及其体外表达制备方法与应用 | |
| Ayoola et al. | Biotechnology and species development in aquaculture | |
| CN104098666B (zh) | 一种抗菌肽及其在制备抗感染药物、抗肿瘤药物、免疫促进剂和饲料添加剂中的应用 | |
| CN108794645A (zh) | 一种由牛白蛋白、牛干扰素γ和牛干扰素α组成的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN102876683A (zh) | 芋螺毒素的生物学制备方法及其产品和用途 | |
| CN102321163A (zh) | 海岛棉脂质转运蛋白及其在纤维改良上的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20080528 |