CN101177440A

CN101177440A - 一种从党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法

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Publication number: CN101177440A
Application number: CNA2007100502277A
Authority: CN
Inventors: 杨兵; 张黎; 董维珍; 刘丁
Original assignee: Pusi Biological Science & Technology Co Ltd Chengdu
Current assignee: Pusi Biological Science & Technology Co Ltd Chengdu
Priority date: 2007-10-12
Filing date: 2007-10-12
Publication date: 2008-05-14
Anticipated expiration: 2027-10-12
Also published as: CN101177440B

Abstract

本发明涉及一种从党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法。它包括四步骤，1.冷浸提取：乙醇或甲醇冷浸；2.树脂粗分：上样进入经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用水、30％乙醇、50％－70％乙醇分三步分别洗脱吸附有党参炔苷的大孔树脂；3.色谱分离：用乙腈－水的流动相稀释样品后，进样，分段收集流出液；4.脱色纯化：上样到聚酰胺树脂中，浓缩水洗脱液，回收得98.5％高纯度的党参炔苷产品。本方法简单快速，溶剂消耗少，经济环保，且得率高，适合于工业化生产，具有较高的经济价值和学术价值。

Description

一种从党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法

技术领域

本发明涉及能工业化地从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的工艺方法。

背景技术

桔梗科植物党参Codonopsis pilosula(Franch.)Nannf.、素花党参Codonopsis pilosula Nannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川党参Codonopsistangshen Oliv.的干燥根为历版药典收载品种。因产地、种类不同而有多种商品，比如潞党参、台党参、东党参及文党参等，都具有补中益气，健脾益肺等功效，他们都共同含有其活性成分党参炔苷，2005版药典已经由党参多糖作为特征成分改为采用党参炔苷作为薄层鉴定的特征成分，为了更好地控制党参的内在质量，对党参炔苷的需求将会越来越大，而目前市场上仅有少数几家提供毫克级量的厂家。目前文献报道的党参炔苷的含量很低，为万分之三到千分之一，且党参炔苷不稳定，见光受热易分解。目前文献报道(贺庆等人)的党参炔苷的方法为：分部位萃取后反复柱层析，包括硅胶柱层析和葡聚糖层析等，此方法耗时长，溶剂消耗大，回收溶剂繁琐。

发明内容

本发明的目的在于提供能中药材党参中工业化地、快速地、低成本地分离高纯度党参炔苷单体的方法。

完成本发明的任务包括如下步骤：

一种从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在25℃--58℃条件下，最好是在55℃条件下进行以下步骤：

A.冷浸提取：用党参干燥块根粉与乙醇或甲醇混合浸泡24小时-36小时，冷浸过滤除渣，所得液体用减压回收除去乙醇或甲醇获得浓浸膏；混合比例是党参体积与乙醇或甲醇体积比为1∶3；乙醇浓度为95％--100％，甲醇浓度为100％。

B.树脂粗分：用水稀释上步所得浓浸膏作为样品，在大孔树脂上样之前，用200目左右的细纱布过滤，以除去沙尘等固体杂质，再上样到经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用50％--70％乙醇洗脱大孔吸附树脂，将乙醇洗脱液减压旋转蒸发除去乙醇；大孔吸附树选用D131或者D101大孔吸附树脂，可用安徽三星树脂有限公司提供的D131或者D101大孔吸附树脂。洗脱分三步：第一步用水洗至几乎没有颜色，除去大部分多糖等大极性杂质，第二步用两个柱体积的(2BV)30％乙醇洗脱，进一步除去杂质而使党参炔苷保留在树脂上，第三步用50％--70％乙醇洗脱，党参炔苷主要集中在50％--70％乙醇洗脱液中，得到党参炔苷粗品，纯度为60％左右，见图1。这种三步法洗脱使其能保证大部分极性比党参炔苷大的杂质被除去，大大提高了提取物中的党参炔苷的含量，这是本发明的要点之一。

C.色谱分离：用丙酮溶解C18(十八烷基键合硅胶，购自日本Fuji公司)填料搅拌均匀使其成匀浆状后，采用动态轴向压缩法装柱，柱规格为25cm*5cm--25cm*30cm。将党参炔苷粗品用乙腈-水的流动相稀释后进样，一次制备色谱分离循环大约持续30min，分段收集流出液即流分，用分析型高效液相色谱仪对各馏分进行纯度检测，纯度为98％以上的流分为本步骤的合格品，纯度低于95％的流分重复上述步骤，纯度98％以上的流分回收产品后，得到黄色油状物，然后进入下一个步骤。

本步骤中，乙腈-水的流动相中乙腈占水的体积比例为15％-30％，高压输液泵和UV(紫外-可见光)检测器由北京创新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有限公司联合提供。检测波长为267nm，流速为250ml/min，进样量为50ml，色谱柱为成都普思生物科技有限公司自主研制，C18反相填料装柱，C18粒径为10μm-25μm，孔径为100A。

本步骤的样品回收方法：由于流动相中含大量水，在55℃的温度下很难浓缩除去水。所以浓缩过程采取减压回收乙腈后，用D101大孔吸附树脂富集，用95％的乙醇洗脱，减压回收乙醇的方法，可以快速地，且保证党参炔苷不会因为温度过高和长久受热而分解。制备分离的在线监测图谱见图2。

D.脱色纯化：将纯度达98％以上的黄色油状党参炔苷浸膏加入聚酰胺树脂后，用水洗脱聚酰胺树脂得水洗脱液；为回收产品，将水洗脱液加入大孔吸附树脂，再用95％的乙醇洗脱大孔吸附树脂上的党参炔苷，减压回收除去乙醇，最后得到纯度高达98.5％以上的党参炔苷产品。聚酰胺树脂可选上海摩速科学器材有限公司的120目的聚酰胺树脂。见图3。

图1是D101大孔吸附树脂粗分后的HPLC图谱；

图2是制备型液相色谱分离党参炔苷的在线监测图谱；

图3是党参炔苷纯品的HPLC图谱。

本发明的优点：

1、B.树脂粗分步骤中，三步法洗脱使其能保证大部分极性比党参炔苷大的杂质被除去，大大提高了提取物中的党参炔苷的含量，这是本发明的要点之一。

2、能工业化的大量分离获得党参炔苷产品：传统用直径5cm的硅胶柱分离一次分离量小，仅为10mg左右，分离效率低，本方法用制备型高效液相色谱分离，一次可上样500mg以上，故可以工业化生产分离获得党参炔苷产品。

3、得率高：100kg党参原药材含党参炔苷50g左右，本技术最后可得到党参炔苷纯品45g，得率达到90％以上。

3、产品纯度高，纯度可达98.5％以上，为党参炔苷的含量检测和党参的质量控制打下了坚实的基础。

4、溶剂消耗少，可回收利用：采用常规方法的溶剂用量大，且用氯仿-甲醇，氯仿-甲醇-水等的混合体系，回收步骤繁琐，本方法主要用乙腈-水的体系，乙腈能有效回收再利用。

5、成本低：本发明需消耗材料包括党参原药材，溶剂(乙醇、乙腈、水等)，而现有的常规方法方法分离需消耗党参原药材，溶剂(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿、甲醇、水等)、聚酰胺等。可见本发明工艺步骤简洁，传统的方法经历了萃取，硅胶柱层析，葡聚糖层析，ODS(反相硅胶)层析等步骤，消耗大量溶剂成本和人力成本，而本方法仅经过大孔树脂粗分，制备型高效液相色谱分离和聚酰胺脱色三个步骤，耗费溶剂和人力成本都少，工艺周期短。

6、具有较高的学术价值：本发明用制备型高效液相色谱为主要设备进行分离，制备高效液相在国内外天然产物的分离纯化中应用得越来越广，对普及这一先进的技术是一种强有力的推动，而现有技术分部位萃取后反复柱层析，包括硅胶柱层析和葡聚糖层析等。

具体实施例

实例1

一种从山西产党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在55℃条件下进行以下步骤：

A.冷浸提取：用党参干燥块根粉碎过60目筛后与乙醇混合浸泡24小时小时，冷浸过滤除渣，所得液体用减压回收除去乙醇获得浓浸膏；混合比例是党参粉体积与乙醇或甲醇体积比为1∶3。乙醇浓度为95％。

B.树脂粗分：用水稀释上步浓浸膏后，在上大孔树脂之前，用200目左右的细纱布过滤，以除去沙尘等固体杂质，再通入经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用50％乙醇洗脱大孔吸附树脂，将乙醇洗脱液减压旋转蒸发除去乙醇，浓浸膏用水稀释倍数以2倍水为宜，大孔吸附树选用D131大孔吸附树脂，用安徽三星树脂有限公司提供的D131大孔吸附树脂。洗脱分三步：第一步用水洗至几乎没有颜色，除去大部分多糖等大极性杂质，第二步用两个柱体积的(2BV)30％乙醇洗脱，进一步除去杂质而使党参炔苷保留在树脂上，第三步用50％乙醇洗脱，党参炔苷主要集中在这部分洗脱液中，得到党参炔苷粗品，纯度为60％左右。

大孔吸附树脂活化处理的方法为：在层析柱中加入高于树脂层10CM的乙醇浸渍4小时，然后用乙醇淋洗，洗至流出液在试管中用水稀释不浑浊时为止。最后用水反复洗涤至乙醇含量小于1％或无明显乙醇气味后即可。

C.色谱分离：用丙酮溶解C18(十八烷基键合硅胶，购自日本Fuji公司)填料搅拌均匀使其成匀浆状后，采用动态轴向压缩法装柱，柱规格为25cm*5cm。将党参炔苷粗品用乙腈-水的流动相稀释后进样，主峰出峰时间为25.66min，从25.00min开始，至25.86min以及29.08min以后，分为前段，中段，后段三个部分分别收集流出液，由于前段和后段流出液的党参炔苷粗品(HPLC)达不到纯度为98％，则将前段和后段流出液再次进样。中段党参炔苷粗品(HPLC)一般能到达到纯度为98％，所以将中段流出液分别减压浓缩，得到黄色油状物，含党参炔苷粗品(HPLC)达到纯度为98％的浓缩收集液才进行下述步骤。

本步骤中，乙腈-水的流动相中乙腈占水的体积比例为15％，高压输液泵和UV(紫外-可见光)检测器由北京创新通恒科技有限公司和成都普思生物科技有限公司联合提供。检测波长为267nm，流速为250ml/min，进样量为50ml，色谱柱为成都普思生物科技有限公司自主研制，C18小颗粒球形反相硅胶装柱，C18粒径为10μm-30μm，孔径为100A。

本步骤的产品浓缩方法：由于流动相中含大量水，在55℃的温度下很难浓缩除去水。所以去水浓缩过程采取回收乙腈后，用D101大孔吸附树脂富集，用95％的乙醇洗脱，减压回收乙醇的方法，可以快速地浓缩，且保证党参炔苷不会因为温度过高和长久受热而分解。制备色谱的分析图谱见图2。

D.脱色纯化：将纯度达98％以上的黄色油状党参炔苷浸膏加入聚酰胺树脂后，用水洗脱聚酰胺树脂；洗脱液用D101大孔树脂富集，再用95％的乙醇洗脱大孔吸附树脂上的党参炔苷，减压回收除去乙醇，最后得到高纯度达到98.5％的党参炔苷产品。聚酰胺树脂可选上海摩速科学器材有限公司的120目的聚酰胺树脂。见图3。

实例2

一种从山西产党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在25℃条件下进行以下步骤：

A.冷浸提取：用党参干燥块根粉与乙醇混合浸泡36小时，冷浸过滤除渣，所得液体用减压回收除去乙醇获得浓浸膏；混合比例是党参粉体积与乙醇体积比为1∶3；乙醇浓度为100％，党参干燥块根粉的粒度为40目。

B.树脂粗分：用水稀释上步浓浸膏后，在上大孔树脂之前，用200目左右的细纱布过滤，以除去沙尘等固体杂质，再通入经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用60％乙醇洗脱大孔吸附树脂，将乙醇洗脱液减压旋转蒸发除去乙醇；浓浸膏用水稀释倍数以3倍水为宜，大孔吸附树选用D101大孔吸附树脂，可用安徽三星树脂有限公司提供的D101大孔吸附树脂。洗脱分三步：第一步用水洗至几乎没有颜色，除去大部分多糖等大极性杂质，第二步用两个柱体积的(2BV)30％乙醇洗脱，进一步除去杂质而使党参炔苷保留在树脂上，第三步用60％乙醇洗脱，党参炔苷主要集中在这部分乙醇洗脱液中，得到党参炔苷粗品，纯度为60％左右。

大孔吸附树脂活化处理的方法同于实例1。

C.色谱分离：本步骤所有步骤和材料同于实例1，仅乙腈-水的流动相中乙腈占水的体积比例为30％。

D.脱色纯化：将纯度达98％以上的黄色油状党参炔苷浸膏加入聚酰胺树脂后，用水洗脱聚酰胺树脂得水洗脱液，洗脱液用D101大孔树脂富集，再用95％的乙醇洗脱大孔吸附树脂上的党参炔苷，减压回收除去乙醇，最后得到高纯度达到98.5％的党参炔苷产品。聚酰胺树脂可选上海摩速科学器材有限公司的120目的聚酰胺树脂。见图3。

实例3

一种从山西产党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在58℃条件下进行以下步骤：

A.冷浸提取：用党参干燥块根粉与乙醇混合浸泡30小时，冷浸过滤除渣，所得液体用减压回收除去乙醇获得浓浸膏；混合比例是党参粉体积与乙醇体积比为1∶3；乙醇浓度为100％，党参干燥块根粉的粒度为100目。

B.树脂粗分：用水稀释上步浓浸膏后，在上大孔树脂之前，用200目左右的细纱布过滤，以除去沙尘等固体杂质，再通入经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用70％乙醇洗脱大孔吸附树脂，将乙醇洗脱液减压旋转蒸发除去乙醇；浓浸膏用水稀释倍数以3倍水为宜，大孔吸附树选用D101大孔吸附树脂，可用安徽三星树脂有限公司提供的D101大孔吸附树脂。洗脱分三步：第一步用水洗至几乎没有颜色，除去大部分多糖等大极性杂质，第二步用两个柱体积的(2BV)30％乙醇洗脱，进一步除去杂质而使党参炔苷保留在树脂上，第三步用70％乙醇洗脱，党参炔苷主要集中在这部分乙醇洗脱液中，得到党参炔苷粗品，纯度为60％左右。

大孔吸附树脂活化处理的方法同于实例1。

C.色谱分离：本步骤所有步骤和材料同于实例1，仅乙腈-水的流动相中乙腈占水的体积比例为20％。

D.脱色纯化：本步骤所有步骤和材料同于实例1，所得党参炔苷精品纯度为98.5％。

实例4、所有步骤和材料同于实例1，仅是A.冷浸提取中，用100％浓度的甲醇代替95％浓度的乙醇。

实例5、所有步骤和材料同于实例2，仅是A.冷浸提取中，用100％浓度的甲醇代替100％浓度的乙醇。

Claims

1.一种从党参药材中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在25℃--58℃条件下进行以下步骤：

A.冷浸提取：用党参干燥块根粉与乙醇或甲醇混合浸泡24小时-36小时，冷浸过滤除渣，所得液体用减压回收除去乙醇或甲醇获得浓浸膏；混合比例是党参粉体积与乙醇或甲醇体积比为1∶3；乙醇浓度为95％--100％，甲醇浓度为100％；

B.树脂粗分：用水稀释A步骤所得的浓浸膏后，上样进入经过活化处理的大孔吸附树脂柱，用50％--70％乙醇洗脱大孔吸附树脂，将乙醇洗脱液减压旋转蒸发除去乙醇，得到党参炔苷粗品；

C.色谱分离：将B步骤党参炔苷粗品用乙腈-水作流动相稀释后，进样，分段收集制备色谱仪流出的液体；将纯度能达到98％的流出液体即流分浓缩后进行下述D步骤；将纯度没有达到98％的流分重复本步骤；乙腈-水的流动相中乙腈占水的体积比例为15％-30％；

D.脱色纯化：将上步骤达98％纯度的黄色油状党参炔苷浸膏加入聚酰胺树脂后，用水洗脱聚酰胺树脂得水洗脱液；浓缩水洗脱液的水，最后得到98.5％高纯度的党参炔苷产品。

2.根据权利要求1所述的从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在B树脂粗分步骤中，洗脱分三步：第一步用水洗至几乎没有颜色，除去大部分多糖等大极性杂质，第二步用30％乙醇洗脱，进一步除去杂质而使党参炔苷保留在树脂上，第三步用50％--70％乙醇洗脱，党参炔苷主要集中在50％--70％乙醇洗脱液中。

3.根据权利要求1所述的从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，在B步骤中，大孔吸附树脂是D131或者D101型大孔吸附树脂。

4.根据权利要求1所述的从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，其特征在于：在C步骤中，色谱柱装填的填料用C18(十八烷基键合硅胶)球形反相填料装柱，粒径为10μm-25μm，孔径为100A，用丙酮稀释为匀浆后采用动态轴向压缩法装柱。色谱柱规格为25cm*5cm--25cm*30cm。

5.根据权利要求1所述的从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，其特征在于：在D.脱色纯化步骤中，所用聚酰胺为120目。

6.根据权利要求1所述的从药材党参中快速分离纯化党参炔苷单体的方法，C和D步骤浓缩产品的方法为减压回收乙腈后，用D101树脂富集和用95％的乙醇洗脱后，浓缩除去乙醇。