CN101158680B - 一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法 - Google Patents
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Abstract
一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法,属于生物化工技术领域。本发明以诺氟沙星为原料,经过诺氟沙星的衍生化和羧基保护制备半抗原N-2-乙胺-诺氟沙星,再偶联蛋白合成喹诺酮类抗生素多簇抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白。本发明成功合成了喹诺酮类抗生素多簇抗原,合成步骤简洁,经过提纯后处理,纯度可达到99%以上,完全可以用作喹诺酮类多簇酶联免疫试剂盒的应用,为今后人们的研究提供了方便的途径,可以满足国内对其研究的需要。
Description
技术领域
一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法,属于生物化工技术领域。
背景技术
喹诺酮是一类合成抗生素类药物,英文名称:quinolones(QNS)。在化学上与萘啶酮酸相关,其作用机理是直接作用于细菌的核、抑制细菌的DNA旋转酶,使酶不能在DNA双链上引入切口,破坏细菌的代谢和繁殖,迅速杀灭细菌。最初这类药物用于治疗尿道感染,现在已发展到治疗系统感染疾病,并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来,这些药物在动物组织中的残留已引起广泛的注意,我国规定牛、鸡、猪、羊、兔等动物的肌肉、脂肪、肝、肾食品中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01~1.9mg/kg,欧盟规定在动物肌肉、肝脏和肾脏中达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星(环丙沙星与恩诺沙星量之和)、麻保沙星、沙拉沙星等喹诺酮类兽药最高残留限量0.01~1.9mg/kg,日本在2002年7月1日对我国产蒲烧鳗鱼实施磺胺类抗生素检测后,又于2003年7月1日起对进口生鳗鱼及其制品进行氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留检测,并且将限量控制在方法检测限的0.05mg/kg。因此,氟喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的重视。为了建立快速检测方法有必要合成一种喹诺酮抗生素多簇抗原,到目前为止,喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法还未见国内报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种喹诺酮类抗生素多簇抗原合成方法,所合成抗原所制备的抗体可对多种喹诺酮类抗生素产生识别,为今后人们的快速检测的研究提供了方便的途径。
本发明的技术方案:一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法,以诺氟沙星为原料将其衍生化制备半抗原,进而再与牛血清蛋白采用戊二醛法偶联合成抗原;
工艺步骤为:
(1)人工半抗原的合成
合成路线:
产物1的合成:
2-溴乙胺氢溴酸盐和碳酸二叔丁酯Boc2O反应,配比控制为碳酸二叔丁酯摩尔比过量20%,以甲醇为反应介质,三乙胺为催化剂,搅拌、加热升温到60℃,反应1h,然后室温反应过夜;反应液真空浓缩,残液溶于二氯甲烷,依次用0.5N的盐酸、饱和食盐水和饱和的NaHCO3溶液洗涤,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,得淡黄色液体产物1,直接用于下一步反应;
产物2的合成:
产物1和诺氟沙星反应,配比控制为产物1摩尔比过量20%,以二甲基甲酰胺为反应介质,三乙胺为催化剂,搅拌、加热升温到80℃,反应过夜,冷至室温,滴加0.5N的盐酸控制pH至6,搅拌使体系重新冷却到室温,过滤,依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼,干燥,得粗产品产物2,用乙醇重结晶;
产物3的合成:
产物2和三氟乙酸反应,脱碳酸二叔丁酯基:室温搅拌反应3小时,真空浓缩,将残留物溶于乙醇,加入三乙胺,静止,过滤得到的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯,得产品3半抗原,命名为N-2-乙胺-诺氟沙星;
(2)人工抗原的合成:合成路线:
透析袋的前处理:取5-10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60℃的去离子水冲洗3min,保存在4℃去离子水中备用。
磷酸盐缓冲溶液的配置:0.2Mol/L磷酸二氢钠19mL,0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为ph7.4的磷酸盐缓冲液。
偶联蛋白:
取0.1mmoL的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中,搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液,滴加至使戊二醛的最终质量浓度为1.25%,成A液;
取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液;
搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中,搅拌过夜,PBS透析5天,得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白;
(3)抗原鉴定:2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比,分别在262nm、278nm处测吸光值,并计算其偶联比。
本发明的有益效果:本发明合成了喹诺酮类抗生素的多簇人工抗原,合成步骤简洁,有效,经过后处理,纯度可达99%以上,完全可用于免疫分析中,为今后人们的研究提供了方便的途径,可以满足国内对其研究的需要。
附图说明
图1半抗原的液相色谱图
图2半抗原的质谱正离子图
图3半抗原的紫外吸收图
图4抗原的紫外吸收图
具体实施方式
(1)人工半抗原的合成
合成过程:
产物1的合成:
在一个1L的圆底烧瓶中加入500mL的甲醇,2-溴乙胺氢溴酸盐(10g,49mmol),三乙胺(30mL),碳酸二叔丁酯Boc2O(13g,60mmol),搅拌、加热升温到60℃,反应1h,然后室温反应过夜。反应液真空浓缩,残液溶于500mL二氯甲烷,依次用0.5N的盐酸(250mL×2)、饱和食盐水(250mL)、饱和的NaHCO3(250mL)洗涤,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,得淡黄色液体产物1(收率63%),直接用于下一步反应。
产物2的合成:
在一个250ml的圆底烧瓶中加入诺氟沙星(5.499g,17.2mmol),DMF(70mL),搅拌均匀,加入三乙胺(4.8mL,35mmol),然后加入产物1(4.631g,20.6mmol),升温至80℃,反应过夜。反应液冷至室温,滴加0.5N的盐酸调pH至6左右,搅拌使体系重新冷却到室温,过滤,依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼,干燥,得粗产品产物2,用乙醇重结晶后,用H-nmr检测,结构正确为目标产物。
产物3的合成:
在一个250mL的圆底烧瓶中加入50mL二氯甲烷,3.763g产物3,然后加入35mL三氟乙酸,室温搅拌反应3小时,真空浓缩,将残留物溶于乙醇,加入1.4mL的三乙胺,静止,过滤的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯,纯度为97.61%。
(2)人工抗原的合成。合成过程为:
透析袋的前处理:
取5-10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60℃的去离子水冲洗3min,保存在4℃去离子水中备用。
磷酸盐缓冲溶液的配置:
磷酸盐缓冲液(Borate saline buffer):0.2Mol/L磷酸二氢钠19ml和0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为pH7.4的磷酸盐缓冲液。
偶联蛋白
取0.1mmol的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中,搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液,滴加至溶液的戊二醛终浓度为1.25%,成A液。
取0.002mmol的牛血清蛋白(BSA)溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液。
搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中。搅拌过夜,PBS透析5天。得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白;
(3)抗原鉴定
摩尔吸收系数ε:配制人工半抗原浓度为0,10,20,30μg·mL-1的20%乙醇溶液,通过紫外扫描可知人工半抗原的最大吸收波长为278nm,在278nm处测吸光值,每个浓度做平行样。摩尔吸光系数计算为:ε=吸光值/摩尔浓度。
偶联物蛋白浓度测定:配制牛血清蛋白浓度为0,40,60,80,100,120,160,200μg·mL-1的磷酸盐缓冲液1.5mL,加入5mL考马斯亮蓝染色液,立即混匀,30℃水浴温热5分钟,每个浓度做平行样。、在595nm处测吸光值,绘制牛血清蛋白曲线。估算偶联物的蛋白质浓度:蛋白质量/偶联产物的体积,以此来确定稀释比例,让稀释后的浓度在牛血清蛋白曲线以内,稀释过的样品要同牛血清蛋白曲线的测定进行同样测定,经过数据处理可得到偶联产物蛋白浓度。
偶联比测定:配制150μg·mL-1 BSA的20%乙醇溶液,将偶联产物用20%乙醇稀释到1 50 μg·mL-1,在242nm处测吸光值,以20%乙醇为空白,测出的吸光值为A1,A2,则偶联比率r为:r=[(A1-A2)/ε]/(150×10-3/65000)
其中ε为摩尔吸光系数(L·mol-1),65000为BSA分子量,150×10-3为BSA浓度(μg·mL-1)。
Claims (1)
1. 一种喹诺酮类抗生素多簇抗原的合成方法,其特征是以诺氟沙星为原料将其衍生化制备半抗原,进而再与牛血清蛋白采用戊二醛法偶联合成抗原;
工艺步骤为:
(1)人工半抗原的合成
合成路线:
产物1的合成:
2-溴乙胺氢溴酸盐和碳酸二叔丁酯Boc2O反应,配比控制为碳酸二叔丁酯摩尔比过量20%,以甲醇为反应介质,三乙胺为催化剂,搅拌、加热升温到60℃,反应1h,然后室温反应过夜;反应液真空浓缩,残液溶于二氯甲烷,依次用0.5N的盐酸、饱和食盐水和饱和的NaHCO3溶液洗涤,无水硫酸镁干燥,过滤,浓缩,得淡黄色液体产物1,直接用于下一步反应;
产物2的合成:
产物1和诺氟沙星反应,控制配比为产物1摩尔比过量20%,以二甲基甲酰胺为反应介质,三乙胺为催化剂,搅拌、加热升温到80℃,反应过夜,冷至室温,滴加0.5N的盐酸控制pH6,搅拌使体系重新冷却到室温,过滤,依次用蒸馏水、无水乙醇洗涤虑饼,干燥,得粗产品产物2,用乙醇重结晶;
产物3的合成:
产物2和三氟乙酸反应,脱碳酸二叔丁酯基:室温搅拌反应3小时,真空浓缩,将残留物溶于乙醇,加入三乙胺,静止,过滤得到的粗品用乙醇和氯仿重结晶提纯,得产物3半抗原,命名为N-2-乙胺-诺氟沙星;
(2)人工抗原的合成
合成路线:
透析袋的前处理:取5-10cm的透析袋,于沸水中煮沸5min,再用60℃的去离子水冲洗3min,保存在4℃去离子水中备用;
磷酸盐缓冲溶液的配置:0.2Mol/L磷酸二氢钠19mL和0.2Mol/L磷酸氢二钠81mL加水至2000mL混合即为pH7.4的磷酸盐缓冲液;
偶联蛋白:
取0.1mmol的产物3溶于2mL的pH7.4的磷酸盐缓冲液中,搅拌下缓慢滴加戊二醛溶液,滴加至溶液的戊二醛最终质量浓度为1.25%,成A液;
取0.002mmol的牛血清蛋白溶于10mL的pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中成B液;
搅拌条件下将A液缓慢滴加到B液中,搅拌过夜,磷酸盐缓冲液中透析5天,得人工抗原N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白;
(3)抗原鉴定:N-2-乙胺-诺氟沙星-牛血清蛋白采用紫外扫描测定其偶联比,分别在262nm、278nm处测吸光值,并计算其偶联比。
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CN104280541A (zh) * | 2014-10-21 | 2015-01-14 | 南京师范大学 | β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备 |
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王莹等.诺氟沙星间接EL ISA 检测方法的建立及初步应用.《中国兽医杂志》.2007,第43卷(第3期),52-53. * |
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