CN1731167A - 一种快速检测食品中氟喹诺酮类药物残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测食品中氟喹诺酮类药物残留的方法，该方法利用生物免疫技术，以牛血清蛋白为载体蛋白，结合氟喹诺酮类药物制备相应的特异性抗体；将制备的特异性抗体固定在压电晶体表面，形成生物识别元件；配置系列浓度的待测氟喹诺酮类药物标准溶液，然后将生物识别元件浸入其中充分反应后，测定其反应后的频率；根据反应前后频率差与待测成分含量的线性关系建立标准曲线；使生物识别元件与未知样提取液充分反应，得到反应前后频率差；根据标准曲线计算得到未知样中被测氟喹诺酮类药物的含量。本发明具有较高的灵敏度和准确度，可以满足痕量残留的检测要求；操作简便快速，有效缩短了分析时间，可应用于多种氟喹诺酮类药残的分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测食品中药物残留的方法，具体地说是涉及一种检测氟喹诺酮类药物残留的方法。
背景技术
氟喹诺酮类(FLuoroquinolones，FQs)为一族人工合成的抗生素，目前被广泛用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗，恩诺沙星(Enrofloxacin)即为其中常用的一种。由于FQs残留除了其毒副作用对人体直接危害外，更为严重的是动物性食品中残留的较低浓度药物容易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗。因此，随着FQs在养殖中的广泛应用，其残留问题已经成为目前食品安全问题的典型性表现形式之一，并引起国内外广泛的关注。
目前，国外对氟喹诺酮类药物残留的检测方法，主要包括微生物法、免疫分析法、液相色谱法及液相色谱—质谱联用法。国内的相关报道较少，主要以液相色谱法为主，在大量样品的快速筛检和现场检测技术方面仍属空白。
1.微生物法
微生物法是一种抗菌药物残留检测的快速筛选方法，其缺点是不易筛选到特别敏感的菌株，方法常受到其他抗菌药物的影响，同时微生物法不能很好的鉴别同类物质中的不同成分，多数分析周期长，一般不易于短期内取得结果。Okerman等(1998)报道了用改进的欧洲四平皿法(Four-plate Test，FPT)检测市场上零售肉中恩诺沙星和环丙沙星的残留，四平皿法虽能检测高浓度氟喹诺酮类药物的残留，但该法的检测限高于EC所规定的MRL。
2.液相色谱法(LC法)
高效液相色谱法(HPLC)是目前最为常用的色谱方法，目前国内外相关标准中基本采用该方法为检测氟喹诺酮类药物残留的标准方法。如Jeffery等(1994)报道了用HPLC法测定沙拉沙星在海峡鲇鱼肌肉中的残留。Roybsl(1997)报道了牛奶中沙拉沙星、双氟沙星、恩诺沙星与环丙沙星的HPLC检测法。其优点在于灵敏度高，检测限大多低于10ppb，精确度较高(回收率一般大于70％)，稳定性也比较好，但该法的前处理较为繁琐，而且所需的仪器昂贵，对于操作人员的专业技术要求也较高，不适用于大量样品的快速分析和现场检测。
3.液相色谱—质谱联用法(LC-MS法)
LC-MS法是新兴的大型仪器检测方法，其主要特点是检测灵敏度高，能对微量兽药残留组分进行检测，同时能对兽药残留组分进行结构确证。如Turnipseed等(1998)报道了戳鱼肌肉中恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星和双氟沙星多残留确证的LC-MS检测。但该法所需仪器设备非常昂贵，步骤烦琐，操作人员要求具有较高技能，一般仅用于残留的确认性检测。
4.免疫分析方法
目前用于氟喹诺酮类药残检测的免疫分析手段主要是酶联免疫反应(ELISA)。它具有高度的专一性和灵敏度，但是也存在一些缺陷，主要表现为：分析程序较为烦琐，对操作人员专业技能要求较高；所需设备集成化程度低，难以实现小型化和便携化；大多需要在实验室中进行，难以进行现场检测。
发明内容
针对上述方法存在的问题，本发明提出了一种利用压电免疫技术对食品中不同的氟喹诺酮类药物残留进行现场快速检测的方法。
本发明的检测方法包括以下步骤：
(1)首先利用生物免疫技术，以牛血清蛋白为载体蛋白，结合氟喹诺酮类药物偶连形成完全抗原，来制备相应的特异性抗体；
(2)以制备的特异性抗体为生物敏感材料，将其固定在压电晶体表面，形成生物识别元件，并测定其基础频率F0；
(3)配置系列浓度的待测氟喹诺酮类药物标准溶液，然后将生物识别元件浸入其中充分反应后，测定其反应后的频率F1，并求取反应前后的频率差ΔF＝F1-F0；
(4)根据反应前后频率差ΔF与待测成分含量的线性关系建立标准曲线；
(5)使生物识别元件与未知样提取液充分反应，得到反应前后频率差ΔF；
(6)根据标准曲线计算得到未知样中被测氟喹诺酮类药物的含量。
为了增强步骤(2)中形成的生物识别元件对于大分子蛋白的结合能力，在制备前利用蛋白A对压电晶体进行衍生活化。
本方法中所述的生物识别元件是可以重复使用的，再生的方法是分别用碱和酸浸泡并用双蒸水洗涤。
与其它测定方法相比较，本方明的主要优点在于：
(1)石英压电晶体谐振器被称为“微天平”，适宜条件下可以对于10μg/kg以下的目标成分产生明显的频率变化，同时它保留了免疫分析所特有的特异性，因此具有较高的灵敏度和准确度，可以满足痕量残留的检测要求；
(2)有效缩短了分析时间，操作更为简便快速，同时降低了测定过程对于实验室条件以及操作人员专业技能的依赖性；
(3)由于识别元件可重复使用，分析成本可有效降低；
(4)检测设施及操作过程的集成化程度较高，便于携带组装，能够适用于不同场所，实现现场分析或在线检测，尤其适合现场大量样品的快速筛选处理。
(5)仪器平台为通用型，通过生物识别元件的调整和更换，可应用于多种氟喹诺酮类药残的分析检测。
附图说明
图1是本发明用于检测恩诺沙星的标准曲线。
图2是本发明用于检测诺氟沙星的标准曲线。
图3是HPLC检测恩诺沙星的标准曲线。
图4是HPLC检测诺氟沙星的标准曲线。
具体实施方式
实施例1～2：猪肉中恩诺沙星和诺氟沙星残留的快速检测
1、抗体的制备
首先配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.4，简称PBS)：取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 2.0g，加双蒸水至1000mL，过0.22μm膜，室温保存。
取3mg恩诺沙星或诺氟沙星，10mg N-羟基琥珀酰胺，10mg 1-乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，依次加入到1.5mL溶有6mg牛血清白蛋白并含有33％DMF(v/v)的PBS中，在室温下振荡过夜，然后将反应物用PBS透析后，冷冻干燥，产物即为完全抗原，-80℃保存备用。
将1mg完全抗原与1.0mL生理盐水和1.0mL福氏完全佐剂混合后对新西兰兔进行背部皮下多点注射，14天后第二次免疫，剂量与方法同第一次，福氏完全佐剂换成福氏不完全佐剂，以后每隔2周进行一次免疫。第四次免疫，用纯人工抗原直接注射耳缘静脉。7天后心脏取血，离心取血清，冷冻干燥后即得到所需要的多克隆抗体，-80℃贮存备用。
2、生物识别元件的制备
取基频10MHz的两面镀金电极的压电晶体，在10mg/ml 3，3-二硫代丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(简称DTSP)的二甲亚砜(简称DMSO)溶液中活化反应2小时，取出，用DMSO和双蒸水分别洗涤晶体片2-3次，干燥后备用。以PBS配置蛋白A溶液(2mg/ml)，取50μl均匀涂抹于晶体片表面，4℃下衍生反应2小时，最后将2mg/ml的抗体(PBS溶解)涂抹于晶体表面，4℃下过夜反应，PBS洗涤2-3次后置于4℃下自然干燥，储存备用。
3、食品样品的预处理
称取5g样品置于50ml离心管中，加入适量的无水硫酸钠(一般约1-4g，可根据样本含水量情况自行调整)，反复振摇以尽量脱除其中水分，再加入30ml乙腈，匀浆，离心(5000r，5min)，将上清液转移到50ml离心管中，加入10ml正己烷，振荡分层，将下层转移至蒸馏瓶中，旋转蒸发至1ml，氮气吹干，加入1ml甲醇-水溶液(1∶1)，溶解残渣，过0.2μm的膜，得到样品提取液。
4、建立压电免疫检测的标准曲线
将干燥的免疫识别元件连接到频率检测仪上检测其频率，稳定值作为基本频率F0。然后直接浸入不同浓度沙星的标准液中(pH6.5)，在37℃恒温反应25分钟，用PBS洗涤干燥，直至频率稳定为止，记录频率值F1。求出频率变化值ΔF(ΔF＝F1-F0)。以ΔF为纵坐标，标准沙星液的浓度为横坐标，绘制工作曲线，如图1和2所示。
5、信号检测以及分析计算
样品提取液调节pH6.5，将晶体片浸入其中，同上述方法检测并记录频率变化值ΔF，根据标准曲线计算样品液中沙星的浓度。
5、识别元件的再生方法
反应后的晶体片在1.2mol/l的NaOH溶液中浸泡30-45分钟，双蒸水冲洗，再在1.2mol/l的HCl中浸泡10-20分钟，可除去晶体片表面的反应物，用双蒸水冲洗干燥后备用。
对照例1～2：用高效液相色谱法(HPLC)检测恩诺沙星和诺氟沙星
高效液相色谱为安捷伦1100，色谱柱为：Eclipxdb-C18 4.6mm×150mm，荧光检测器，Ex＝285nm，Em＝460nm。主要工作条件为：流动相为乙腈∶磷酸缓冲液(v/v，13∶87，pH＝3.0)，流速0.8mL/min，柱温为40℃。工作曲线如图3和4所示。
实施例3：本发明检测效果及其与HPLC法的比较
表1HPLC法对于加标猪肉的检测效果(n＝3)
| 加标浓度(μg/kg) | 测定值(μg/kg) | 平均回收率(％) | RSD(％) | |
| 恩诺沙星 | 525505 | 4.50±0.4525.45±0.9341.71±1.584.38±0.41 | 90.08101.7883.4287.60 | 9.943.643.809.45 |
| 诺氟沙星 | 2550 | 24.65±1.6840.66±1.59 | 98.6081.32 | 6.823.92 |
表2本发明对于加标猪肉的检测效果(n＝3)
| 加标浓度(μg/kg) | 测定值(μg/kg) | 平均回收率(％) | RSD(％) | |
| 恩诺沙星 | 510505 | 3.22±1.127.43±0.7139.44±3.032.80±1.24 | 64.474.3078.8956.03 | 34.439.547.6744.28 |
| 诺氟沙星 | 1050 | 7.63±0.8741.66±3.52 | 76.3083.32 | 11.538.45 |
表3两种方法对于市售猪肉样本的检测结果(n＝3)
| 药物 | 诺氟沙星猪肉 | 恩诺沙星猪肉 |
| HPLC检出量(μg/kg) | 9.75±0.72 | 24.06±1.03 |
| 本发明检出量(μg/kg) | 6.83±0.62 | 21.65±1.92 |
目前国内外对于食品中氟喹诺酮类药残的要求，根据不同药物品种和不同食品类型存在差异，但最低检出限一般要求在50μg/kg以上。表1-3表明，对于25μg/kg以上浓度的药物残留，本发明的平均回收率高于75％，RSD在10％以内，而且与目前公认的HPLC检测结果具有良好的相关性。这表明，该方法的主要性能，如准确度和精密度等，完全可以满足实际检测的要求；但检测时间只需要25-30分钟，明显少于HPLC；操作较为简便，不需要大型、昂贵的仪器设备，非常适合于现场大量样品的快速筛选处理。
Claims (5)
1.一种快速检测食品中氟喹诺酮类药物残留的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)首先利用生物免疫技术，以牛血清蛋白为载体蛋白，结合氟喹诺酮类药物偶连形成完全抗原，来制备相应的特异性抗体；
(2)以制备的特异性抗体为生物敏感材料，将其固定在压电晶体表面，形成生物识别元件，并测定其基础频率F0；
(3)配置系列浓度的待测氟喹诺酮类药物标准溶液，然后将生物识别元件浸入其中充分反应后，测定其反应后的频率F1，并求取反应前后的频率差ΔF＝F1-F0；
(4)根据反应前后频率差ΔF与待测成分含量的线性关系建立标准曲线；
(5)使生物识别元件与未知样提取液充分反应，得到反应前后频率差ΔF；
(6)根据标准曲线计算得到未知样中被测氟喹诺酮类药物的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于在制备生物识别元件前，利用蛋白A对压电晶体进行衍生活化，增强其对于大分子蛋白的结合能力。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于未知样中的氟喹诺酮类药物在测定前需要进行提取纯化。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的生物识别元件是可以再生的。
5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于生物识别元件的再生方法是分别用碱和酸浸泡并用双蒸水洗涤。
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