CN101157934A - 基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 - Google Patents
基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101157934A CN101157934A CNA2007100461722A CN200710046172A CN101157934A CN 101157934 A CN101157934 A CN 101157934A CN A2007100461722 A CNA2007100461722 A CN A2007100461722A CN 200710046172 A CN200710046172 A CN 200710046172A CN 101157934 A CN101157934 A CN 101157934A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- phi
- pbcfx
- sequence
- plasmid
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒(pBCFX+和pBCFX－)及其应用。该质粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC31整合酶对应attP位点串连序列的中间插入LacZ表达框架作为质粒载体(pBCFX+和pBCFX－)置换克隆位点，采用插入失活作蓝白筛选。基于该质粒的克隆方法主要包括使用PhiBT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作为定点整合催化酶，插入DNA片段依据目的要求可以通过PCR等技术在两侧附加对应的attB序列，从而决定插入片段方向性。该克隆体系可以方便操作含有特别内切酶位点的插入DNA，在大片段基因操作方面有独到优势，因为该体系不需要限制性酶，磷酸酶和连接酶操作，可以简化重组DNA操作方法。在基因工程中有广泛应用前景。
Description
技术领域
本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的质粒(pBCFX+和pBCFX-)及其基因克隆方法和应用。
背景技术
基因操作是现代生物科学与生物技术的基础。使用特定的限制序列，同源序列进行基因操作为目前广泛应用的基因操作方法。但是随着基因操作发展，上述技术表现出了一系列的问题。如使用限制酶技术，在操作基因的过程中一旦遇到基因内部具有对应的位点就会使基因操作变得十分复杂甚至变得不可能。另外，实验室配置大量繁杂的内切酶也影响了实验室的操作成本及效率。大量低效率和特别反应条件的限制酶使得实验变得更加复杂和低效。
同源重组技术在近年来也开始用于基因操作领域，从早期在基因knockout技术中的应用到最近用于基因文库的构建，多个方面均具有应用价值。但是在广泛的基因操作领域，为了包装基因的忠实性，一般采用重组缺陷的细胞作为宿主，从而使得该技术的应用与目前的主流操作平台不相容。并且依赖同源重组的效率以及可能的非预期重组限制了该技术的广泛应用。
位点特异性噬菌体整合酶可以位点特异性的转移基因片段，因为可望提高基因治疗的安全性而被引入基因操作领域。较早使用的噬菌体C31整合酶和最近报道的噬菌体BT1整合酶都在疾病模型生物和细胞水平表现出较好的应用前景。在自然情况下，噬菌体位点特异性整合酶作用于两个分别含有attP和attB的分子，结果是造成噬菌体环状分子插入宿主基因组。在基因治疗和转基因的操作中也可以采用类似的操作把含有目的基因的环状分子插入宿主基因组。但是在体外基因操作体系中，更常见的情况是把一个线性分子插入基因组中，然后再完成其它操作。使用单一的噬菌体位点特异性整合酶对于该情况就变得十分困难。联合使用和先后使用不同的噬菌体整合酶及其对应的位点，理论上可以建立定向克隆线性目的基因到载体基因组的目的。
发明内容
本发明的目的是设计并制备基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶及其对应ATT位点的质粒(pBCFX+和pBCFX-)基因操作体系和应用。本发明提供联合使用Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶对应的att位点制作质粒基因载体(pBCFX+和pBCFX-)克隆位点和目的基因识别序列接头的方法与应用。
使用本发明进行基因操作可以避免基因内在限制性位点对基因操作的干扰限制，同时本操作体系比传统的限制连接体系具有简单快速的优点，并且可以操作大片段序列。
本发明提出的上述体系制备与应用具体如下：
1、制备含Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶对应att克隆位点的质粒(pBCFX+和pBCFX-)；
以pBCPB为模板，用Sal I切除phi C31整合酶特异性attB；制备线性质粒骨架；用引物1(SEQ №1)和引物2(SEQ №2)从Phi BT中扩增含有Phi BT特异性attP的序列，并且用Sal I酶切，制备phi BT attP插入序列。将线性质粒骨架与phi BT attP插入序列用T4连接酶连接，转化细菌并抽取质粒，测序确定质粒中phi BT attP插入序列的方向，以插入方向不同可以形成含两个phi BT attP插入序列的载体，正向插入的为pBCFX+(SEQ №3)和反向插入的为pBCFX-(SEQ №4)。
2、在pBCFX+和pBCFX-定向插入目的DNA片段
在目的DNA片段希望插入方向5`通过PCR引物附加Phi C31整合酶特异性attB核心序列(SEQ №5)，3`则按照使用pBCFX+和pBCFX-不同，分别使用Phi BT1 attB核心序列正反向附加序列(SEQ №6，SEQ №7)引物，在引物3`端为目的基因特异性序列。使用上述引物扩增的目的基因可以与pBCFX+和pBCFX-在phi C31整合酶和Phi BT整合酶作用下发生定向框架交换，插入目的基因的克隆可以用蓝白筛选获得。
附图说明
图1：pBCFX+结构图。其中：
f1(+)ori： 135-441；
phiBT1 attP： 515-736；
LacZ： 764-4265；
phi C31 attP： 4260-4489；
LacZ promotor：4576-4693；
pUC ori： 4917-5584；
ChloR+： 5905-6561.
箭头代表元件方向
图2：pBCFX-结构图。其中：
f1(+)ori： 135-441；
phiBT1 attP： 515-736；
LacZ： 764-4265；
phi C31 attP： 4260-4489；
LacZ promotor：4576-4693；
pUC ori： 4917-5584；
ChloR+： 5905-6561.
箭头代表元件方向
具体实施方式
1、制备含Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶对应ATT克隆位点的质粒(pBCFX+和pBCFX-)载体
(1)制备质粒骨架：反应体系(pBCPB+10ug(5ul)，Sal I 5u(Bio lab.1ul)，10X Sal Ibuffer 5ul(Bio lab.)，H2O 39ul)37℃ 12h，采用Qiagen PCR extract kit纯化(反应物加PBBuffer(Qiagen)500ul并混匀，混合物加到PCR extract column(Qiagen)1200rpm离心1min，用0.5ml PE buffer(Qiagen)1200rpm离心1min清洗一次，再1200rpm离心1min一次，PCRextract column加50ul Elute buffer(Qiagen)，1200rpm离心1min洗脱)收集产物为质粒骨架。
(2)制备Phi BT1特异性attP片段：PCR体系(引物(SEQ №1；SEQ №2)，Pfu DNApolymerase 1u(1ul，Sagon)，Pfu DNA polymerase buffer 5ul(Sagon)，Phi BT基因组DNA 1ul，H2O 39ul)，PCR循环(94℃ 1min，94℃30sec-55℃30sec-72℃ 1min循环25次，72℃5min)，产物用Qiagen PCR extract kit纯化(如上述)；酶切(PCR纯化产物44ul，Sal I 5u(Biolab.1ul)，10X Sal I buffer 5ul(Bio lab.)，37℃ 12h)，采用Qiagen PCR extract kit纯化(如上述)获得Phi BT特异性attP片段。
(3)连接：如1)制备的质粒骨架4ul，如2)制备的Phi BT1特异性attP片段4ul，T4 ligase 1ul(Bio Lab.)，10X T4 ligase buffer 1ul，16℃，12h。
(4)转化与质粒抽提：连接产物用分子克隆所提供的常规方法转化DH5 alpha感受态细胞，筛选阳性(抗氯霉素)克隆10个，使用分子克隆所描述的常规方法抽提相应的质粒。
(5)质粒测序鉴定：采用引物1和引物2作为引物对上述质粒在ABI3700上测序分析，所得序列结果常规作Blastn分析确定插入序列(Phi BT1特异性attP片段)方向，正向插入为载体质粒pBCFX+，反向插入为载体质粒pBCFX-。
2、在pBCFX+和pBCFX-定向插入目的DNA片段
(1)5`引物合成：按常规方法设计基因特异性引物，在设计的基因特异性引物5`附加序列(SEQ №5)，常规合成引物。
(2)3`引物合成：按常规方法设计基因特异性引物，在设计的基因特异性引物3`附加序列(SEQ №6，pBCFX+；SEQ №7，pBCFX-)，常规合成引物。
(3)制备插入目的基因片段：使用上述1)/2)所描述的引物和适当的模板，DNA聚合酶以及PCR条件常规扩增插入片段，采用Qiagen PCR extract kit纯化(同上述)。
(4)框架交换：维持pBCFX+或pBCFX-与插入片段的分子数约1∶1，每种分子质量不少于100ng，在50ul整合酶反应物(50mM glycine-NaOH，pH 8.5，100mM KCl，10mMDTT，0.01％bovine serum albumin，and 0.1μMΦC31 integrase和0.1μMΦBT1 integase)22℃作用30min-12h。也可以常规用插入片段与pBCFX+或pBCFX-以及ΦC31 integrase和ΦBT1共转染实现框架交换。
(5)阳性克隆筛选：10ul框架交换产物常规转化DH5 alpha感受态细胞，涂布含X-gal和氯霉素的LB细菌培养板，37℃生长12-20h，常规蓝白筛选阳性克隆。含插入片段的克隆由于丢失LacZ而表现为白色克隆，常规抽提质粒继序列测定确定重组子的正确性。
本发明所涉及的序列
SEQ.№1：
ACGCGTCGACATGCTGGCGCCGGACGGG
SEQ.№2：
ACGCGTCGACCGCGCGTACAGGAAGACG
SEQ.№3：
CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGG
CCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAG
AGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGA
ACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGAT
TTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCG
CTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCA
TTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACATGCTGGCGCCGGACGGGG
CTTCAGACGTTTCGGGTGCTGGGTTGTTGTCTCTGGACAGTGATCCATGGGAAACTACTCAGCACCACCAATGTTCC
CAAAAGAAAGCGCAGGTCAGCGCCCATGAGCCAAGATCTAGGCATGTCGCCCTTCATCGCTCCCGACGTCCCTGAGC
ACCTTCTAGACACTGTTCGCGTCTTCCTGTACGCGCGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGCCCCTCGAGGGATCCT
CTAGAGCGGCCGCCTAGAGTCGAGGCCGAGTTTGTCAGAAAGCAGACCAAACAGCGGTTGGAATAATAGCGAGAACA
GAGAAATAGCGGCAAAAATAATACCCGTATCACTTTTGCTGATATGGTTGATGTCATGTAGCCAAATCGGGAAAAAC
GGGAAGTAGGCTCCCATGATAAAAAAGTAAAAGAAAAAGAATAAACCGAACATCCAAAAGTTTGTGTTTTTTAAATA
GTACATAATGGATTTCCTTACGCGAAATACGGGCAGACATGGCCTGCCCGGTTATTATTATTTTTGACACCAGACCA
ACTGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGGAATTCCGCCGATACTGACGGGCTCCAGGAGTCGTCGCCACCAATC
CCCATATGGAAACCGTCGATATTCAGCCATGTGCCTTCTTCCGCGTGCAGCAGATGGCGATGGCTGGTTTCCATCAG
TTGCTGTTGACTGTAGCGGCTGATGTTGAACTGGAAGTCGCCGCGCCACTGGTGTGGGCCATAATTCAATTCGCGCG
TCCCGCAGCGCAGACCGTTTTCGCTCGGGAAGACGTACGGGGTATACATGTCTGACAATGGCAGATCCCAGCGGTCA
AAACAGGCGGCAGTAAGGCGGTCGGGATAGTTTTCTTGCGGCCCTAATCCGAGCCAGTTTACCCGCTCTGCTACCTG
CGCCAGCTGGCAGTTCAGGCCAATCCGCGCCGGATGCGGTGTATCGCTCGCCACTTCAACATCAACGGTAATCGCCA
TTTGACCACTACCATCAATCCGGTAGGTTTTCCGGCTGATAAATAAGGTTTTCCCCTGATGCTGCCACGCGTGAGCG
GTCGTAATCAGCACCGCATCAGCAAGTGTATCTGCCGTGCACTGCAACAACGCTGCTTCGGCCTGGTAATGGCCCGC
CGCCTTCCAGCGTTCGACCCAGGCGTTAGGGTCAATGCGGGTCGCTTCACTTACGCCAATGTCGTTATCCAGCGGTG
CACGGGTGAACTGATCGCGCAGCGGCGTCAGCAGTTGTTTTTTATCGCCAATCCACATCTGTGAAAGAAAGCCTGAC
TGGCGGTTAAATTGCCAACGCTTATTACCCAGCTCGATGCAAAAATCCATTTCGCTGGTGGTCAGATGCGGGATGGC
GTGGGACGCGGCGGGGAGCGTCACACTGAGGTTTTCCGCCAGACGCCACTGCTGCCAGGCGCTGATGTGCCCGGCTT
CTGACCATGCGGTCGCGTTCGGTTGCACTACGCGTACTGTGAGCCAGAGTTGCCCGGCGCTCTCCGGCTGCGGTAGT
TCAGGCAGTTCAATCAACTGTTTACCTTGTGGAGCGACATCCAGAGGCACTTCACCGCTTGCCAGCGGCTTACCATC
CAGCGCCACCATCCAGTGCAGGAGCTCGTTATCGCTATGACGGAACAGGTATTCGCTGGTCACTTCGATGGTTTGCC
CGGATAAACGGAACTGGAAAAACTGCTGCTGGTGTTTTGCTTCCGTCAGCGCTGGATGCGGCGTGCGGTCGGCAAAG
ACCAGACCGTTCATACAGAACTGGCGATCGTTCGGCGTATCGCCAAAATCACCGCCGTAAGCCGACCACGGGTTGCC
GTTTTCATCATATTTAATCAGCGACTGATCCACCCAGTCCCAGACGAAGCCGCCCTGTAAACGGGGATACTGACGAA
ACGCCTGCCAGTATTTAGCGAAACCGCCAAGACTGTTACCCATCGCGTGGGCGTATTCGCAAAGGATCAGCGGGCGC
GTCTCTCCAGGTAGCGAAAGCCATTTTTTGATGGACCATTTCGGCACAGCCGGGAAGGGCTGGTCTTCATCCACGCG
CGCGTACATCGGGCAAATAATATCGGTGGCCGTGGTGTCGGCTCCGCCGCCTTCATACTGCACCGGGCGGGAAGGAT
CGACAGATTTGATCCAGCGATACAGCGCGTCGTGATTAGCGCCGTGGCCTGATTCATTCCCCAGCGACCAGATGATC
ACACTCGGGTGATTACGATCGCGCTGCACCATTCGCGTTACGCGTTCGCTCATCGCCGGTAGCCAGCGCGGATCATC
GGTCAGACGATTCATTGGCACCATGCCGTGGGTTTCAATATTGGCTTCATCCACCACATACAGGCCGTAGCGGTCGC
ACAGCGTGTACCACAGCGGATGGTTCGGATAATGCGAACAGCGCACGGCGTTAAAGTTGTTCTGCTTCATCAGCAGG
ATATCCTGCACCATCGTCTGCTCATCCATGACCTGACCATGCAGAGGATGATGCTCGTGACGGTTAACGCCTCGAAT
CAGCAACggCTTGCCGTTCAGCAGCAGCAGACCATTTTCAATCCGCACCTCGCGGAAACCGACATCGCAGGCTTCTG
CTTCAATCAGCGTGCCGTCGGCGGTGTGCAGTTCAACCACCGCACGATAGAGATTCGGGATTTCGGCGCTCCACAGT
TTCGGGTTTTCGACGTTCAGACGTAGTGTGACGCGATCGGCATAACCACCACGCTCATCGATAATTTCACCGCCGAA
AGGCGCGGTGCCGCTGGCGACCTGCGTTTCACCCTGCCATAAAGAAACTGTTACCCGTAGGTAGTCACGCAACTCGC
CGCACATCTGAACTTCAGCCTCCAGTACAGCGCGGCTGAAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACATGGAAATCGCTG
ATTTGTGTAGTCGGTTTATGCAGCAACGAGACGTCACGGAAAATGCCGCTCATCCGCCACATATCCTGATCTTCCAG
ATAACTGCCGTCACTCCAGCGCAGCACCATCACCGCGAGGCGGTTTTCTCCGGCGCGTAAAAATGCGCTCAGGTCAA
ATTCAGACGGCAAACGACTGTCCTGGCCGTAACCGACCCAGCGCCCGTTGCACCACAGATGAAACGCCGAGTTAACG
CCATCAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTCCTGTAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGT
CGGATTCTCGTGGGAACAAACGGCGGATTGACCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAACC
GTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGACGACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACCG
CTTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGG
GCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTC
CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGGATCGCGCTTGAGCAGCTCCTTGCTGGTGTCCAGACCAATGCCTCCCAGAC
CGGCAACGAAAATCACGTTCTTGTTGGTCAAAGTAAACGACATGGTGACTTCTTTTTTGCTTTAGCAGGCTCTTTCG
ATCCCCGGGAATTGCGGCCGCCGACTAGTACTGACGGACACACCGAAGCCCCGGCGGCAACCCTCAGCGGATGCCCC
GGGGCTTCACGTTTTCCCAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAGTAGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTCA
GTTGGGGGCGTAGGGCCGCCGACATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCGT
CAGTCGCGCGAGCGCGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGG
TTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAA
CATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCT
CACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGT
TTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATC
AGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCC
AGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCAC
AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTC
CCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGC
TTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCC
CCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCC
ACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGC
CTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTT
GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG
AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAG
GGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCGACCGAATAAATACCTGTGACGGAAGA
TCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAG
ACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTG
TCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTgGAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATAC
CACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAACC
AGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTATT
CACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTACGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGGA
TAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGACG
ATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGGG
TTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATAT
GGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCGA
TTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGAG
TGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTTGCTACGCCTGAATAAGTGA
TAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAGC
CGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGAG
GCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGACGATATGATCCTTTTTTTCTGATCAAAAAGTGCTCAT
CATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTC
GTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCC
GCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTA
TCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACAT
TTCCCCGAAAAGTGCCAC
SEQ.№4：
CTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGG
CCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAG
AGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGA
ACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGAT
TTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCG
CTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCCA
TTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGCGCGCATGTCCTTCTGCG
CTTGTCACAGATCTTCCACGAGTCCCTGCAGCCCTCGCTACTTCCCGCTGTACGGATCTAGAACCGAGTACCCGCGA
CTGGACGCGAAAGAAAACCCTTGTAACCACCACGACTCATCAAAGGGTACCTAGTGACAGGTCTCTGTTGTTGGGTC
GTGGGCTTTGCAGACTTCGGGGCAGGCCGCGGTCGTAGTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGCCCCTCGAGGGATCCT
CTAGAGCGGCCGCCTAGAGTCGAGGCCGAGTTTGTCAGAAAGCAGACCAAACAGCGGTTGGAATAATAGCGAGAACA
GAGAAATAGCGGCAAAAATAATACCCGTATCACTTTTGCTGATATGGTTGATGTCATGTAGCCAAATCGGGAAAAAC
GGGAAGTAGGCTCCCATGATAAAAAAGTAAAAGAAAAAGAATAAACCGAACATCCAAAAGTTTGTGTTTTTTAAATA
GTACATAATGGATTTCCTTACGCGAAATACGGGCAGACATGGCCTGCCCGGTTATTATTATTTTTGACACCAGACCA
ACTGGTAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGCTGGAATTCCGCCGATACTGACGGGCTCCAGGAGTCGTCGCCACCAATC
CCCATATGGAAACCGTCGATATTCAGCCATGTGCCTTCTTCCGCGTGCAGCAGATGGCGATGGCTGGTTTCCATCAG
TTGCTGTTGACTGTAGCGGCTGATGTTGAACTGGAAGTCGCCGCGCCACTGGTGTGGGCCATAATTCAATTCGCGCG
TCCCGCAGCGCAGACCGTTTTCGCTCGGGAAGACGTACGGGGTATACATGTCTGACAATGGCAGATCCCAGCGGTCA
AAACAGGCGGCAGTAAGGCGGTCGGGATAGTTTTCTTGCGGCCCTAATCCGAGCCAGTTTACCCGCTCTGCTACCTG
CGCCAGCTGGCAGTTCAGGCCAATCCGCGCCGGATGCGGTGTATCGCTCGCCACTTCAACATCAACGGTAATCGCCA
TTTGACCACTACCATCAATCCGGTAGGTTTTCCGGCTGATAAATAAGGTTTTCCCCTGATGCTGCCACGCGTGAGCG
GTCGTAATCAGCACCGCATCAGCAAGTGTATCTGCCGTGCACTGCAACAACGCTGCTTCGGCCTGGTAATGGCCCGC
CGCCTTCCAGCGTTCGACCCAGGCGTTAGGGTCAATGCGGGTCGCTTCACTTACGCCAATGTCGTTATCCAGCGGTG
CACGGGTGAACTGATCGCGCAGCGGCGTCAGCAGTTGTTTTTTATCGCCAATCCACATCTGTGAAAGAAAGCCTGAC
TGGCGGTTAAATTGCCAACGCTTATTACCCAGCTCGATGCAAAAATCCATTTCGCTGGTGGTCAGATGCGGGATGGC
GTGGGACGCGGCGGGGAGCGTCACACTGAGGTTTTCCGCCAGACGCCACTGCTGCCAGGCGCTGATGTGCCCGGCTT
CTGACCATGCGGTCGCGTTCGGTTGCACTACGCGTACTGTGAGCCAGAGTTGCCCGGCGCTCTCCGGCTGCGGTAGT
TCAGGCAGTTCAATCAACTGTTTACCTTGTGGAGCGACATCCAGAGGCACTTCACCGCTTGCCAGCGGCTTACCATC
CAGCGCCACCATCCAGTGCAGGAGCTCGTTATCGCTATGACGGAACAGGTATTCGCTGGTCACTTCGATGGTTTGCC
CGGATAAACGGAACTGGAAAAACTGCTGCTGGTGTTTTGCTTCCGTCAGCGCTGGATGCGGCGTGCGGTCGGCAAAG
ACCAGACCGTTCATACAGAACTGGCGATCGTTCGGCGTATCGCCAAAATCACCGCCGTAAGCCGACCACGGGTTGCC
GTTTTCATCATATTTAATCAGCGACTGATCCACCCAGTCCCAGACGAAGCCGCCCTGTAAACGGGGATACTGACGAA
ACGCCTGCCAGTATTTAGCGAAACCGCCAAGACTGTTACCCATCGCGTGGGCGTATTCGCAAAGGATCAGCGGGCGC
GTCTCTCCAGGTAGCGAAAGCCATTTTTTGATGGACCATTTCGGCACAGCCGGGAAGGGCTGGTCTTCATCCACGCG
CGCGTACATCGGGCAAATAATATCGGTGGCCGTGGTGTCGGCTCCGCCGCCTTCATACTGCACCGGGCGGGAAGGAT
CGACAGATTTGATCCAGCGATACAGCGCGTCGTGATTAGCGCCGTGGCCTGATTCATTCCCCAGCGACCAGATGATC
ACACTCGGGTGATTACGATCGCGCTGCACCATTCGCGTTACGCGTTCGCTCATCGCCGGTAGCCAGCGCGGATCATC
GGTCAGACGATTCATTGGCACCATGCCGTGGGTTTCAATATTGGCTTCATCCACCACATACAGGCCGTAGCGGTCGC
ACAGCGTGTACCACAGCGGATGGTTCGGATAATGCGAACAGCGCACGGCGTTAAAGTTGTTCTGCTTCATCAGCAGG
ATATCCTGCACCATCGTCTGCTCATCCATGACCTGACCATGCAGAGGATGATGCTCGTGACGGTTAACGCCTCGAAT
CAGCAACggCTTGCCGTTCAGCAGCAGCAGACCATTTTCAATCCGCACCTCGCGGAAACCGACATCGCAGGCTTCTG
CTTCAATCAGCGTGCCGTCGGCGGTGTGCAGTTCAACCACCGCACGATAGAGATTCGGGATTTCGGCGCTCCACAGT
TTCGGGTTTTCGACGTTCAGACGTAGTGTGACGCGATCGGCATAACCACCACGCTCATCGATAATTTCACCGCCGAA
AGGCGCGGTGCCGCTGGCGACCTGCGTTTCACCCTGCCATAAAGAAACTGTTACCCGTAGGTAGTCACGCAACTCGC
CGCACATCTGAACTTCAGCCTCCAGTACAGCGCGGCTGAAATCATCATTAAAGCGAGTGGCAACATGGAAATCGCTG
ATTTGTGTAGTCGGTTTATGCAGCAACGAGACGTCACGGAAAATGCCGCTCATCCGCCACATATCCTGATCTTCCAG
ATAACTGCCGTCACTCCAGCGCAGCACCATCACCGCGAGGCGGTTTTCTCCGGCGCGTAAAAATGCGCTCAGGTCAA
ATTCAGACGGCAAACGACTGTCCTGGCCGTAACCGACCCAGCGCCCGTTGCACCACAGATGAAACGCCGAGTTAACG
CCATCAAAAATAATTCGCGTCTGGCCTTCCTGTAGCCAGCTTTCATCAACATTAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGT
CGGATTCTCCGTGGGAACAAACGGCGGATTGACCGTAATGGGATAGGTCACGTTGGTGTAGATGGGCGCATCGTAAC
CGTGCATCTGCCAGTTTGAGGGGACGACGACAGTATCGGCCTCAGGAAGATCGCACTCCAGCCAGCTTTCCGGCACC
GCTTCTGGTGCCGGAAACCAGGCAAAGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG
GGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTT
CCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGGATCGCGCTTGAGCAGCTCCTTGCTGGTGTCCAGACCAATGCCTCCCAGA
CCGGCAACGAAAATCACGTTCTTGTTGGTCAAAGTAAACGACATGGTGACTTCTTTTTTGCTTTAGCAGGCTCTTTC
GATCCCCGGGAATTGCGGCCGCCGACTAGTACTGACGGACACACCGAAGCCCCGGCGGCAACCCTCAGCGGATGCCC
CGGGGCTTCACGTTTTCCCAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGGAGTAGTGCCCCAACTGGGGTAACCTTTGAGTTCTCTC
AGTTGGGGGCGTAGGGCCGCCGACATGACACAAGGGGTTGTGACCGGGGTGGACACGTACGCGGGTGCTTACGACCG
TCAGTCGCGCGAGCGCGACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTCCAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGG
GTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACA
ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGC
TCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGG
TTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTAT
CAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGC
CAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCA
CAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCT
CCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCG
CTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACC
CCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGC
CACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGG
CCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGT
TGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCA
GAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAA
GGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTCGACCGAATAAATACCTGTGACGGAAG
ATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGA
GACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTT
GTCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAAATGGAGAAAAAAATCACTgGAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATA
CCACCGTTGATATATCCCAATGGCATCGTAAAGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATGTACCTATAAC
CAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAAAGACCGTAAAGAAAAATAAGCACAAGTTTTATCCGGCCTTTAT
TCACATTCTTGCCCGCCTGATGAATGCTCATCCGGAATTACGTATGGCAATGAAAGACGGTGAGCTGGTGATATGGG
ATAGTGTTCACCCTTGTTACACCGTTTTCCATGAGCAAACTGAAACGTTTTCATCGCTCTGGAGTGAATACCACGAC
GATTTCCGGCAGTTTCTACACATATATTCGCAAGATGTGGCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCTATTTCCCTAAAGG
GTTTATTGAGAATATGTTTTTCGTCTCAGCCAATCCCTGGGTGAGTTTCACCAGTTTTGATTTAAACGTGGCCAATA
TGGACAACTTCTTCGCCCCCGTTTTCACCATGGGCAAATATTATACGCAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCGCTGGCG
ATTCAGGTTCATCATGCCGTTTGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCTTAATGAATTACAACAGTACTGCGATGA
GTGGCAGGGCGGGGCGTAATTTTTTTAAGGCAGTTATTGGTGCCCTTAAACGCCTGGTTGCTACGCCTGAATAAGTG
ATAATAAGCGGATGAATGGCAGAAATTCGAAAGCAAATTCGACCCGGTCGTCGGTTCAGGGCAGGGTCGTTAAATAG
CCGCTTATGTCTATTGCTGGTTTACCGGTTTATTGACTACCGGAAGCAGTGTGACCGTGTGCTTCTCAAATGCCTGA
GGCCAGTTTGCTCAGGCTCTCCCCGTGGAGGTAATAATTGACGATATGATCCTTTTTTTCTGATCAAAAAGTGCTCA
TCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACT
CGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGC
CGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTT
ATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACA
TTTCCCCGAAAAGTGCCAC
SEQ.№5：
CCGCGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTCCCCGGGCGCGTACTCC
SEQ.№6：
GCCCGCTGCCGTCCTTGACCAGGTTTTTGACGAAAGTGATCCAGATGATCCAGCTCCACACCCCGAACGCGAG
SEQ.№7：
GAGCGCAAGCCCCACACCTCGACCTAGTAGACCTAGTGAAAGCAGTTTTTGGACCAGTTCCTGCCGTCGCCCG
Claims (3)
1.一种含Phi BT1整合酶和Phi C31整合酶对应att克隆位点的质粒，包括pBCFX+和pBCFX-，前者序列为SEQ №3，后者序列为SEQ №4。
2.一种制备Phi BT1整合酶和Phi C31整合酶对应att克隆位点的质粒的方法，具体步骤如下：
以pBCPB为模板，用Sal I切除phi C31整合酶特异性attB；制备线性质粒骨架；用SEQ №1引物1和SEQ №2引物2从Phi BT中扩增含有Phi BT特异性attP的序列，并且用Sal I酶切，制备phi BT attP插入序列；将线性质粒骨架与phi BT attP插入序列用T4连接酶连接，转化细菌并抽取质粒，测序确定质粒中phi BT attP插入序列的方向，以插入方向不同可以形成含两个phi BT attP插入序列的载体，正向插入的为pBCFX+，序列为SEQ№3，反向插入的为pBCFX-，序列为SEQ №4。
3.一种如权利要求1所述质粒的应用，在所述质粒pBCFX+和pBCFX-定向插入目的DNA片断，具体步骤如下：
在目的DNA片段希望插入方向5`通过PCR引物附加PhiC31整合酶特异性attB核心序列SEQ №5，3`则按照使用pBCFX+和pBCFX-不同，分别使用Phi BT1 attB核心序列正反向附加序列SEQ №6和SEQ №7引物，在引物3`端为目的基因特异性序列；使用上述引物扩增的目的基因与pBCFX+和pBCFX-在phi C31整合酶和Phi BT整合酶作用下发生定向框架交换，插入目的基因的克隆用蓝白筛选获得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100461722A CN101157934B (zh) | 2007-09-20 | 2007-09-20 | 基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100461722A CN101157934B (zh) | 2007-09-20 | 2007-09-20 | 基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101157934A true CN101157934A (zh) | 2008-04-09 |
| CN101157934B CN101157934B (zh) | 2011-08-31 |
Family
ID=39306170
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007100461722A Expired - Fee Related CN101157934B (zh) | 2007-09-20 | 2007-09-20 | 基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101157934B (zh) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102533741A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-07-04 | 深圳华大基因研究院 | 猪假attp位点及其用途 |
| CN102604936A (zh) * | 2011-01-21 | 2012-07-25 | 上海市儿童医院 | 羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA及其应用 |
| CN102051358B (zh) * | 2009-11-10 | 2012-08-22 | 复旦大学 | 一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒及其应用 |
| CN106434734A (zh) * | 2016-06-17 | 2017-02-22 | 华中农业大学 | 用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法 |
| CN110938614A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-03-31 | 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 | 高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8304233B2 (en) * | 2002-06-04 | 2012-11-06 | Poetic Genetics, Llc | Methods of unidirectional, site-specific integration into a genome, compositions and kits for practicing the same |
| US20040115642A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-06-17 | Changlin Fu | Single-step methods for gene cloning |
| CN1827781A (zh) * | 2005-12-29 | 2006-09-06 | 复旦大学 | 用于检测整合酶φc31功能的真核细胞系统及其制备方法 |
-
2007
- 2007-09-20 CN CN2007100461722A patent/CN101157934B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102051358B (zh) * | 2009-11-10 | 2012-08-22 | 复旦大学 | 一种嵌合的肿瘤特异性基因表达调控盒及其应用 |
| CN102604936A (zh) * | 2011-01-21 | 2012-07-25 | 上海市儿童医院 | 羊基因组中被噬菌体φC31整合酶识别的DNA及其应用 |
| CN102604936B (zh) * | 2011-01-21 | 2013-09-04 | 上海市儿童医院 | 羊基因组中被噬菌体*c31整合酶识别的dna及其应用 |
| CN102533741A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-07-04 | 深圳华大基因研究院 | 猪假attp位点及其用途 |
| CN102533741B (zh) * | 2011-12-09 | 2014-09-24 | 深圳华大基因研究院 | 猪假attp位点及其用途 |
| CN106434734A (zh) * | 2016-06-17 | 2017-02-22 | 华中农业大学 | 用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法 |
| CN106434734B (zh) * | 2016-06-17 | 2019-07-05 | 华中农业大学 | 用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法 |
| CN110938614A (zh) * | 2019-12-06 | 2020-03-31 | 宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 | 高活性β-半乳糖苷酶、高通量筛选该酶的质粒及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101157934B (zh) | 2011-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105861552B (zh) | 一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法 | |
| US9982278B2 (en) | CRISPR enabled multiplexed genome engineering | |
| CN101157934B (zh) | 基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒及其应用 | |
| EP3555305B1 (en) | Method for increasing throughput of single molecule sequencing by concatenating short dna fragments | |
| CN102558309B (zh) | 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用 | |
| JP2013528058A (ja) | 高処理スクリーニング用の組合せ配列バーコード | |
| WO2013143438A1 (zh) | 基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒 | |
| Wyrwa et al. | Integration of Lupinus angustifolius L.(narrow-leafed lupin) genome maps and comparative mapping within legumes | |
| CN102409043A (zh) | 高通量低成本Fosmid文库构建的方法及其所使用标签和标签接头 | |
| US10179934B2 (en) | High-throughput detection method for DNA synthesis product | |
| US9834762B2 (en) | Modified polymerases for replication of threose nucleic acids | |
| CN109750032A (zh) | 一种构建基因多点突变和进化的方法 | |
| CN110499334A (zh) | CRISPR/SlugCas9基因编辑系统及其应用 | |
| CN100383248C (zh) | 用于t-a克隆的t载体制备方法 | |
| CN108103052B (zh) | 提高基因组覆盖度的单细胞全基因组扩增及文库构建方法 | |
| CN112746075B (zh) | 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 | |
| US20210222204A1 (en) | Catalytically inactive truncated guide rna compositions and related methods for suppression of crispr/cas off-target editing | |
| CN101575600A (zh) | 生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒及制备方法 | |
| Pold et al. | Genome sequence of Verrucomicrobium sp. strain GAS474, a novel bacterium isolated from soil. Genome Announc 6: e01451-17 | |
| CN109321583B (zh) | 一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法 | |
| CN108660146B (zh) | 一种提高PCR片段兼容性与效率的Topo1连接方法 | |
| CN109371007A (zh) | 一种快速简便的基因合成方法 | |
| US20240102029A1 (en) | Two-plasmid system for prime editing in yeast, use thereof, and method for prime editing in yeast | |
| CN103205449A (zh) | 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法 | |
| KR102301301B1 (ko) | 다중화 프로모터 엔지니어링 플랫폼 및 이의 제조 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110831 Termination date: 20140920 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |