CN101155924A - 同位素高度标记的次级微生物代谢产物的制备和其相应的代谢产物 - Google Patents

同位素高度标记的次级微生物代谢产物的制备和其相应的代谢产物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及制备真菌或细菌在液体合成培养基中的同位素标记的次级微生物代谢产物的方法和制备真菌或细菌的同位素标记的次级代谢产物。根据所述方法，通过在惰性载体上固定真菌或细菌、在液体合成培养基的加入下进行合成，所述液体合成培养基中基本上所有碳原子、氮原子和/或硫原子被稳定的同位素替代。

Description

同位素高度标记的次级微生物代谢产物的制备和其相应的代谢产物
本发明涉及制备真菌或细菌在液体合成培养基中的同位素标记的次级微生物代谢产物的方法和制备真菌或细菌的同位素标记的次级代谢产物。
目前，特别是在附带质谱检测的液相色谱技术(LCMS)中，同位素标记的物质日益重要，其允许针对高产物流量有效的质谱分析。该技术可以用于大量各种下述潜在的分析，即对分子量没有限制的、但在进一步证明中需将裂解谱和各分子峰相应归类的单一物质方面出现问题的分析。为了确保可靠的LCMS应用和方法，使用所谓的内标物质变得日益重要。内标是与目标分析物本身具有高度相似性的物质，即如果可能特别是具有一致的分子结构，而不同的分子重量。作为理想的内标，因此是目标分析物的同位素标记的分子，即在分子中的一个或多个原子被其同位素替代的分子。目前这类物质通过有机合成制备，例如通过相应的较重的同位素替代氢或碳。
在这种关联中，LCMS-分析却显示，作为内标使用的同位素内标物质具有至少为3的分子量差异是所希望的，以便于能够实现目标分析物的清楚区分且如果可能使用的物质具有尽可能少的同位素异构体。
一种制备同位素标记的、植物或微生物的代谢产物的途径是通过相应植物和/或微生物的生物合成途径。在此用放射性标记的营养物加入培养基并且营养介质成分以一定百分比构建入微生物或植物培养物的生物合成与分解代谢的循环中，以使得同位素进入代谢产物中。该方法的缺陷在于，用该方法仅仅可实现不完全的标记并且通常形成不同同位素异构体的混合物，由此这类同位素标记物质或者同位素标记的植物或微生物代谢产物的应用在作为内标的应用中看上去只是差的适用性，因为在这类物质的使用下出现不止一个标准，而是一个宽泛的同位素异构体谱，由此在LCMS质谱中目标物质的目标验证再度显得不可能或仅仅是极低的可能性。
本发明的目的在于，提供一种用于制备真菌或细菌的同位素标记的次级代谢产物的方法，其中全部或几乎全部碳原子、氮原子或硫原子在产出物中通过稳定的同位素置换并经此实现唯一的同位素标记的终产物，其中在质谱法特别是LCMS中，是容易且安全地可验证的。本发明进一步以制备可作为内标或在质谱分析方法特别是LCMS中安全且可靠应用或使用的代谢产物为目标。
该任务是依据本发明如此解决的，通过在惰性载体上固定真菌或细菌、在液体合成培养基的加入下进行合成，所述培养基中全部碳原子、氮原子和/或硫原子经稳定的同位素替代。经此，通过将真菌或细菌在惰性载体上固定，在加入液态、其中全部碳原子、氮原子和/或硫原子经稳定的同位素替代的合成培养基下进行所述合成，成功地制备真菌和细菌的同位素标记的代谢产物，该代谢产物中全部原子或至少95％的原子通过培养可能是从培养基中获取的，即通过培养基包含的同位素标记的营养物质中稳定同位素置换碳原子、氮原子或硫原子，并由此可获得同位素标记的目标产物，而不是如同先有技术多次描述的具有变化数量的同位素原子的不同等价物的混合。通过该制备方法由此可以实现同位素标记的次级代谢产物，其可目的性使用并在全部分析中或在代谢研究中可清楚且明确地验证。
根据进一步的实施方案，在所述液体合成培养基中，糖或糖醇特别是D-[U-13C6]-葡萄糖、13C-蔗糖、13C-甘油和/或13C-乙酸盐用作为碳源，15N-氨基酸、15N-硝酸盐、15N-铵化合物或15N-脲用作为氮源，33S-或34S-的硫酸盐、硫化物或氨基酸用作为硫源。通过在液体合成培养基中包含完全标记的碳源、氮源和/或硫源的方式，迫使在一种或多种真菌或细菌的代谢产物的培养中将各标记的同位素构建入代谢产物，以至于可以确保真菌或细菌的次级代谢产物高程度地(如果不能完全地)用相应的同位素进行标记或通过相应的同位素置换。
进一步的实施方案用于改善同位素标记的、真菌或细菌的次级代谢产物的产率，在所述液体合成培养基中还包含选自具有离子Na+，K+，Ca++，Mg++，Fe+++，Zn++，Cu++，B+++以及CO3 --，SO4 --，PO4 ---，NO3 -的无机盐或酸和碱。通过在所述液体合成培养基中包含具有Na+，K+，Ca++，Mg++，Fe+++，Zn++，Cu++，B+++以及CO3 --，SO4 --，PO4 ---，NO3 -的盐或酸和碱，确保全部在真菌或细菌中除了碳、氢、氮和硫可能包含的外源离子以足够的量且安全地提供，由此除了快速培养还可实现高产率。
为了进一步提高产率，将具有大的内表面积的天然或合成的载体特别是硅酸盐、层状硅酸盐、沸石、斑脱土、经烧结的粘土、硅土或塑料等用作为惰性载体。通过使用具有大的内表面积的惰性载体，根据本发明的方法相对于不用具有大的内表面积的惰性载体的传统方法能将产率提高至少50％。这种产率的提高使得本方法不仅经济地而且确保可以足够量制备经同位素标记的次级物质代谢产物的所希望的终产物。
尽可能的产率改善可以根据本发明如下实现，即作为具有大的内表面积的惰性载体以天然的或经处理的形式使用硅酸铝，例如硅土特别是硅藻土，isolute HM-N或沸石或选自云母矿物质类的层状硅酸盐特别是蛭石。在这些物质的情况下特别是表面特性，如表面张力、多孔性等适用于在载体表面的特别良好的反应。类似地可以通过使用选自泡沫材料、聚酰胺、二氧化硅、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚酯等的惰性合成载体实现相应的产率改善，在此使用具有大的内表面积的天然载体或使用合成载体以相同的方式改善产率是与待制备的代谢产物相关的。
本发明进一步提供一种尽可能快速而同时高产率的实施方案。所述制备在介于3℃和45℃，特别是在介于10℃和35℃的温度下进行。与此相关，部分有利地是不总是在保持相同温度的情况下进行制备过程，而是在给出的界限内改变温度以提高产率或加速反应或提高转换率。
为了尽可能实现纯的终产物，将本发明的方法如下实施，即将同位素标记的次级代谢产物通过提取和浓缩例如通过联合步骤如固相/液相-液相/液相萃取、离心、过滤、蒸缩、浓缩和蒸发从液体合成培养基中获取。在获取同位素标记的次级代谢产物后，有利地是将该产物进一步地进行提纯，在此根据本发明的优选方式作为纯化方法使用色谱法，特别是柱色谱法、制备型薄层色谱法、离子色谱法、亲和色谱法、排阻色谱法和/或制备型高效液相色谱法。在这样的加工过程和纯化过程后，成功获得真菌和细菌的同位素标记的次级代谢产物，其中至少95％的碳原子、氮原子和/或硫原子通过相应的稳定的同位素置换，并且由此可以获得具有与天然分析物相应质量差异的产物，以便于例如在具有质谱检测的液相色谱法(LCMS)中足够地可与天然存在的重同位素相区别并由此在这类分析中可提供例如稳定的、明确可鉴定的内标。
本发明另外提供真菌和细菌的同位素标记的次级代谢产物，其基本上完全、特别是至少95％的所有碳原子、氮原子和/硫原子经稳定的同位素置换。
这类真菌和细菌的同位素标记的次级代谢产物可以根据本发明的进一步实施方案作为内标在分析学中用于动物喂食试验中的代谢研究、用于解释代谢循环、降解途径和/或降解时间间隔以及沉积(Einlagerung)的代谢研究。对于所用所述的应用目的，实质性意义是具有包含在试验方案或降解方案中的稳定且明确的可验证的标准或明确可验证的和可再现的物质，以便于各个方法步骤或过程步骤可以明确再现。
根据进一步的实施方案，在分析方法或代谢研究、降解途径等中，真菌毒素，特别是单端孢霉烯，如雪腐镰刀菌烯醇，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，镰刀菌酮-X，T-2毒素，HT-2毒素，DAS，烟曲霉毒素如烟曲霉毒素B1、B2或B3，赫曲毒素如赫曲毒素A、B、C或D，玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌素或黄曲霉毒素如黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2用作为代谢产物。真菌毒素在动物疾病的病因学中越来越重要，并且以足够的量制备这种物质是必要的，以便随后能够使用尽可能明确的或纯的化学物质实施各种毒理学、兽医学检验。因为真菌毒素严重危害动物和人的健康，它们的分析是全球感兴趣的课题，因为特别是已经有许多国家发展了对这类物质耐受程度的标准值和界限值。通过使用内标检验或定量这类真菌毒素，所述内标是明确可检测的并由此能够量化分析各毒素，提供了在检测这类危险物质方面的重要进步。
以相同方式，量化检验或追踪毒素，特别是其相应于本发明的进一步的实施方案，内毒素和外毒素特别是大肠杆菌类(Escherichiacoli sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)或葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)的细菌毒素同样对于大众健康或检验食物和享用品中的有害物质是至关重要的。使用代谢产物如抗生素，特别是由放线菌形成的抗生素如四环素、链霉素或氨基葡糖苷，由芽孢杆菌属形成的抗生素如枯草菌肽或多霉素，由青霉菌(penizillium)形成的抗生素如青霉素或灰黄霉素，或由头孢(cephalosporium)形成的抗生素如头孢菌素，越来越重要，特别是在疾病或在食物和享用品中检验这类物质的情况下，在此对于这些物质还可确定的是，能够用以将代谢物质如抗生素进行量性检验的物质都是至关重要的。
根据进一步的实施方案，作为代谢物质使用由具有13C、15N或33S或34S完全标记的纯物质，经此一方面可以与未标记的物质或代谢产物具有明确差异，另一方面还确保与天然存在的同位素之间的差异，并最终在分析或检验方法中可以提供一种明确可追踪的物质。
以下依据实施例进一步阐明本发明，其展示高度同位素标记的代谢产物的制备。
实施例1
制备高度同位素标记的[U- 13 C 15 ]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)
用于制备完全标记的13C-DON，将镰孢菌(Fusarium-Pilz)，即禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)接种于惰性材料即蛭石上，并在合成培养基中培育，所述合成培养基由0.5g K2HPO4、2.0g NaNO3、0.7g MgSO4.7H2O、2.0g KCl、15g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O或20mg ZnSO4*7H2O和作为唯一的碳源包含的D-[U-13C6]葡萄糖构成。5星期后在约28℃下将含毒素的物质用乙酸乙酯萃取并随后借助萃取、色谱法和结晶法提出为标准质量(纯度＞98％)。
每份生产投入配备约40ml培育物。随后进一步加工产生的含毒素的物质。由1000ml起始物获得5～50mg[7.5～17.5mg]完全标记的[U-13C15]-DON。
经纯化的产物由下述分析步骤表征：
1H NMR和13C-NMR
LC-MS/MS Q Trap用于确定13C同位素份额
使用UV/VIS和HPLC-DAD确定相对于对比物质纯度和浓度
浓度调节
用UV/VIS，HPLC-DAD，LC-MS/MS Q Trap进行质量控制
这类高度同位素标记的13C15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(13C15-DON)可以例如作为内标使用。这类内标的较重的摩尔分子量准确地高出15g/Mol并且由此在质谱中显示其比分析物正好高出15amu的信号(图1)。因为13C-标记的DON的全部其它的化学和物理特征与分析物相同，这种内标准确地具有与分析物相同的片断，物质的离子化也是相同的并由此离子化产率也相同。这意味着，内标和分析物的片断或物质离子的信号高度之间绝对可比，并且因为在分析中内标的浓度是已知的，可以经此直接反推出分析物的浓度，由此这种高度完全标记的脱氧雪腐镰刀菌烯醇是几乎理想的内标。
图1显示在同一质谱中的C12-DON和C13-DON。在图1中13C15-DON和12C-DON的于295.2和310.2的分子峰旁还有化合物分布，它们是碳原子没有被完全标记的并由此不是由同一同位素类别(同位素异构体)组成的。如果天然存在的脱氧雪腐镰刀菌烯醇是13C1-DON，则相应于C12和C13之间的天然分布。
实施例2
制备高度同位素标记的 13 C-烟曲霉毒素
用于制备完全用13C标记的烟曲霉毒素，将以D-[U-13C6]葡萄糖作为唯一碳源的由0.5g KH2PO4、0.5g KNO3、0.7g MgSO4.7H2O、2.0gKCl、17.5g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O和20mg ZnSO4*7H2O组成的1000ml液体介质施加于1×1×1厘米泡沫立方块，用串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)接种并在28℃和70％相对空气湿度下在培育箱中培育。3星期后将含毒素的物质用1∶1的乙腈∶H2O的溶剂混合物萃取并随后借助萃取和色谱法步骤如离子交换色谱法、采用硅胶的快速-柱色谱法、薄层色谱法和制备型HPLC提纯至标准质量(纯度＞98％)。
每1000ml投入物应获得80-240mg13C-烟曲霉毒素(HPLC-FLD)。
实施例3
制备高度同位素标记的[U- 13 C 17 ]-3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇
用于制备高度同位素标记的[U-13C17]-3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇将包含完全同位素标记的[U-13C6]-葡萄糖作为唯一碳源的由0.5gKH2PO4、0.5g KNO3、0.7g MgSO4*7H2O、2.0g KCl、17.5g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O和20mg ZnSO4*7H2O组成的1000ml合成液体介质施加于硅藻土上，即isolute HM-N，用禾谷镰刀菌接种并在培育箱中于28℃培育9天。9天后收获包含毒素的材料，用乙腈/H2O共沸混合物萃取并随后借助萃取、色谱法、结晶法、Büchi-MPLC、和重结晶地提纯至标准质量(纯度＞98％)。从一次投入物中可以获得约15～50mg高纯度的终产物。通过采用C18-毛细柱的LC-UV分析检测纯度。
这样制备的同位素标记的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇相对于没有完全标记的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分子量高出17g/Mol。没有标记的3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分子量为M/z＝338，而完全同位素标记的产物的分子量为355。图2显示纯的13C-3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇的质谱，其中用于识别，产物的标记程度达75％且产物的同位素分布是可识别的。产物的分布和不完全标记的同位素异构体在这种情况下依赖于起始物13C6-葡萄糖的同位素纯度并可以在使用完全纯的13C6-葡萄糖的情况下更明显地向完全标记的产物的方向推移。但从图2可以清楚地识别，比13具有较少13C-原子的同位素异构体，几乎不存在，以至于13C-3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇也可以很好地用作为内标。
实施例4
制备高度同位素标记的[U- 13 C 17 ]-15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇
用于制备高度同位素标记的[U-13C17]-15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇，将由0.5g K2HPO4、2.0g NaNO3、0.7g MgSO4*7H2O、2.0g KCl、15g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O和20mg ZnSO4*7H2O组成的培养基用禾谷镰刀菌接种于纹理粗糙的页硅酸盐载体上并在培育箱中于28℃培育。9天后收获包含毒素的材料，用乙酸乙酯萃取并随后借助萃取、色谱法和结晶法提纯至标准质量(纯度＞98％)。代替结晶还可以借助制备型HPLC进行进一步的纯化步骤。
从一份发酵投入物中可获取约30-60mg高纯度目标产物。
实施例5
制备高度同位素标记的[U- 13 C 15 ]-Ni-雪腐镰刀菌烯醇或[U- 13 C 17 ]- 镰刀菌酮-X
用于制备高度同位素标记的[U-13C15]-Ni-雪腐镰刀菌烯醇或[U-13C17]-镰刀菌酮-X，将以[U-13C6]-葡萄糖作为唯一碳源的由0.5gK2HPO4、2.0g NaNO3、0.7g MgSO4*7H2O、2.0g KCl、15g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O或20mg ZnSO4*7H2O组成的液体介质和惰性页硅酸盐用雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)接种并于28℃下培育5星期。然而将包含毒素的材料用甲醇和二氯甲烷萃取并随后借助萃取、色谱法和结晶法提纯至标准质量(纯度＞98％)。代替结晶还可以借助制备型HPLC进行进一步的纯化步骤。
实施例6
制备高度同位素标记的[U- 13 C 20 ]-赫曲霉素A
用于获取目标物质，将真菌(Petromyces albertensis)在惰性页硅酸盐载体上用以包含完全13C-标记的葡萄糖作为唯一碳源的由0.5g K2HPO4、2.0g NaNO3、0.7g MgSO4*7H2O、2.0g KCl、15g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O或20mg ZnSO4*7H2O组成的合成培养基发酵。然后将培养瓶置于培育箱中于28℃和70％的空气湿度下培育6星期。然后用甲苯萃取。将目标物质如前述实施例用柱色谱法提纯并重结晶。
实施例7
制备高度同位素标记的[U- 13 C 18 ]-玉米赤霉烯酮
用于制备高度同位素标记的[U-13C18]-玉米赤霉烯酮，将以D-[U-13C6]葡萄糖作为唯-碳源的由0.5g KH2PO4、0.5g KNO3、0.7gMgSO4*7H2O、2.0g KCl、17.5g D-[U-13C6]葡萄糖、1.5g NH4H2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O和20mg ZnSO4*7H2O组成的1000ml液体介质施加于多孔的颗粒形式的焦粘土上(gebranntem Ton)，即Seramis或Lecca，用半裸镰刀菌(Fusarium semitectum)，接种并于28℃和70％相对空气湿度下于培育箱中培育。3周后，用4∶1和2∶1的纯的石油醚和石油醚/乙酸乙酯混合物萃取包含毒素的材料，并随后借助萃取和色谱法步骤诸如离子交换色谱法、使用硅胶的快速柱色谱法、薄层色谱法和制备型HPLC提纯至标准质量(纯度＞98％)。
实施例8
制备高度同位素标记的 15 N 5 -Rocquefortine C
用于制备完全用氮同位素15N标记的Rocquefortin C，将以15NH4 15NO3作为唯一氮源的由0.8g KH2PO4、0.7g MgSO4*7H2O、1.0g KCl、17.5g D-葡萄糖、1.0g15NH4 15NO3、1.5g NaH2PO4、15mg Fe(II)SO4*7H2O、20mg ZnSO4*7H2O组成的1000ml液体介质施用于粗糙硅藻土上，用普通青霉素接种并在培育箱中于12℃和70％空气湿度下培育48天后，将包含毒素的材料用由9∶1氯仿∶甲醇的有机溶剂萃取，并随后借助液-液萃取、使用硅胶的快速柱色谱法和制备型HPLC提纯至标准质量(纯度＞98％)。每1000ml配制物，获得300mg 15N5-RocquefortinC(HPLC-FLD)。
实施例9
制备高度同位素标记的 15 N 2 - 33 S-青霉素
用于制备以氮同位素15N和硫同位素33S完全标记的青霉素，将以15NH4 15NO3作为唯一氮源、Na2 33SO4作为唯一的硫源的由1.0g K2HPO4、0.2g MgCl2、20.0g D-葡萄糖、1.0g 15NH4 15NO3、0.5g Na2 33SO4、1.5g Na2HPO4、5mg Fe(II)Cl2、5mg ZnCl2组成的1000ml液体介质适用于小泡沫立方块上，用普通青霉素接种并在培育箱中于28℃和70％空气湿度下培育。30天后，将包含毒素的材料用乙酸乙酯萃取并随后借助液-液萃取、使用硅胶的快速柱色谱法和制备型HPLC提纯至标准质量(纯度＞98％)。每1000ml配制物，获得500mg 15N2-33S-青霉素(HPLC-FLD)。

Claims (14)

1.用于在液体合成培养基中制备真菌或细菌的同位素标记的次级代谢产物的方法，其特征在于，通过在惰性载体上固定真菌或细菌、在液体合成培养基的加入下进行合成，所述液体合成培养基中基本上所有碳原子、氮原子和/或硫原子被稳定的同位素替代。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，在液体合成培养基中，糖或糖醇特别是D-[U-13C6]-葡萄糖、13C-蔗糖、13C-甘油和/或13C-乙酸盐用作为碳源，15N-氨基酸、15N-硝酸盐、15N-铵化合物或15N-脲用作为氮源，33S-或34S-的硫酸盐、硫化物或氨基酸用作为硫源。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述液体合成培养基还包含选自具有Na+，K+，Ca++，Mg++，Fe+++，Zn++，Cu++，B+++以及CO3 --，SO4 --，PO4 ---，NO3 -离子的无机盐或酸和碱的混合物。
4.根据权利要求1、2或3的方法，其特征在于，将具有大的内表面积的天然或合成载体特别是硅酸盐、层状硅酸盐、沸石、斑脱土、经烧结的粘土、硅土或塑料等用作为惰性载体。
5.根据权利要求4的方法，其特征在于，将天然的或经处理的形式的硅酸铝用作为惰性载体，例如沸石或选自云母矿物质的层状硅酸盐，特别是蛭石。
6.根据权利要求4的方法，其特征在于，将泡沫材料、聚酰胺、二氧化硅、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯或聚酯等用作为惰性合成载体
7.根据权利要求1～6任一项的方法，其特征在于，所述制备在介于3和45℃之间，特别是在介于10和35℃之间的温度范围内进行。
8.根据权利要求1～7任一项的方法，其特征在于，所述同位素标记的次级代谢产物通过萃取和浓缩例如通过联合步骤如固相/液相-液相/液相萃取、离心、过滤、蒸缩、浓缩和蒸发从液体合成培养基中获取。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，作为纯化方法使用色谱法，特别是柱色谱法、制备型薄层色谱法、离子色谱法、亲和色谱法、排阻色谱法和/或制备型高效液相色谱法。
10.根据权利要求1～9任一项的方法制备的真菌或细菌的同位素标记的次级代谢产物，其用于制备在分析学中的内标以用于动物喂食试验中的代谢研究，用于解释代谢循环、降解途径和/或降解时间间隔以及沉积的代谢研究。
11.根据权利要求10的代谢产物，其特征在于，真菌毒素，特别是单端孢霉烯，如雪腐镰刀菌烯醇，脱氧雪腐镰刀菌烯醇，3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇，镰刀菌酮-X，T-2毒素，HT-2毒素，DAS，烟曲霉毒素如烟曲霉毒素B1、B2或B3，赫曲毒素如赫曲毒素A、B、C或D，玉米赤霉烯酮、串珠镰刀菌素或黄曲霉毒素如黄曲霉毒素B1、B2、G1或G2用作为所述代谢产物。
12.根据权利要求10的代谢产物，其特征在于毒素诸如内毒素和外毒素特别是大肠杆菌类(Escherichia coli sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)或葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)的细菌毒素用作为所述代谢产物。
13.根据权利要求10的代谢产物，其特征在于抗生素，特别是由放线菌形成的抗生素如四环素、链霉素或氨基葡糖苷，由芽孢杆菌属形成的抗生素如枯草菌肽或多霉素，由青霉菌(penicillium)形成的抗生素如青霉素或灰黄霉素，或由头孢(cephalosporium)形成的头孢菌素用作为所述代谢产物。
14.根据权利要求10～13任一项的代谢产物，作为纯物质用13C、15N或33S或34S的标记程度至少为95％。
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