CN101151376A - 研究、判定或评价的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过向SART应激负荷动物投入被检物质后，对其脑组织进行蛋白质组表达分析，研究、判定或评价该被检物质对纤维肌痛症的作用、镇痛作用或抗应激作用等药理作用的方法。对SART应激负荷动物的脑组织进行蛋白质组表达分析，以确认被检物质如何影响其中所发生的蛋白质表达的变化，由此能够探索对治疗纤维肌痛症和疼痛性疾病有效的物质和抗应激物质。

Description

研究、判定或评价的方法
技术领域
本发明涉及一种通过向SART应激负荷动物投入被检物质后对其脑组织进行蛋白质组表达分析，对该被检物质的药理作用，特别是对于纤维肌痛症的作用、镇痛作用或抗应激作用进行研究、判定或评价的方法。
背景技术
纤维肌痛症(Fibromyalgia)是一种慢性全身性的强烈疼痛、或者即使为局部疼痛，也是广范围的慢性疼痛为主要症状的疾病，不仅肌肉组织，而且连皮肤也感觉疼痛。在纤维肌痛症中，不仅表现出这种全身性的疼痛，而且还多伴有疲劳感、倦怠感、忧郁、焦虑感、晨间僵硬感、肌肉强直、睡眠障碍等。此外，有时还伴有头痛、颜面痛、认识障碍(记忆错误、注意力涣散)、肠胃不适(内脏痛、消化系统障碍、肠胃气胀)、尿频、腹泻、便秘、月经不调等症状。
已报告，相对于美国的一般人口，纤维肌痛症的发病率在女性为3.4％，男性为0.5％，大致多发于25～50岁的女性，约80％的患者为女性，在日本的情况认为与美国大致相同。纤维肌痛症，虽然其自觉症状各种各样，可是外界观察到的症状，除特征性的全身压痛之外，却几乎没有，除进行MRI、CT等图像检查外，即使进行肌肉疼痛部位的病理检查、各种免疫学、病毒学、内分泌学检查，也几乎不能见到异常。例如，不能观察到不同于风湿性关节炎的浮肿，尽管显示炎症程度的血液中的指标，即血沉或cAMP受体蛋白(CRP)均在正常范围之内，但患者仍主诉遍及四肢或躯干的广泛范围内的疼痛。
作为诊断方法，现在，在世界范围内使用美国风湿病学会1990年提出的分类标准。根据该标准，以脐部作为基点，在上半身和下半身、右半身和左半身、脊椎部和胸骨部的5处中的任一部位均感觉疼痛，且此疼痛至少持续3个月以上的情况，或者在规定的全身18处的压痛点加上4kg的宽的载重后，在11处以上感觉到疼痛的情况，被认定为纤维肌痛症。
关于纤维肌痛症的发病的原因和机理，现在虽然推测为应激等心理原因、病毒感染、遗传、免疫异常或神经递质的异常等，但是仍未阐明。纤维肌痛症是一种由生物体组织的损伤或可能带来损伤的侵害刺激引起的、与多数一般疼痛性的疾病大不相同的疾病，在疼痛部位无相关的病理学方面的所见。
在纤维肌痛症的治疗上，在一般的疼痛治疗中较多使用的非类固醇性抗炎症药(NSAIDs)等消炎镇痛剂的几乎无效。另外，虽然试用了肌肉松弛药、阿片样物质性镇痛药、抗焦虑剂等各种各样的药剂，但其有效性因人而异存在很大的差别，未见显著的效果。因此，目前在纤维肌痛症的治疗上，无非是开具抗忧郁药或抗忧郁药和NSAIDs的处方、向疼痛发作部位投以局部麻醉药或类固醇剂、采用按摩、运动疗法、睡眠疗法等。但是，任何治疗药剂和治疗方法，由于纤维肌痛症的原因尚未确定，且治疗效果因人而异存在很大的差别，所以均不能确立为治疗方法。
如上所述，目前，纤维肌痛症的发病原因和机理尚未阐明，因此，研究者们正在寻求研究、判定或评价对治疗该疾病有效的物质的方法。
本发明的目的在于提供一种对治疗纤维肌痛症或疼痛性疾病有效的物质进行研究、判定或评价的方法。
本发明的发明人首先着眼于纤维肌痛症与SART应激负荷动物的类似性。
所谓SART应激负荷动物，是指负荷SART(Specific Alternation ofRhythm in Temperature)应激，即反复寒冷刺激的动物，可由小鼠、大鼠、豚鼠等制作得到。制作方法可以根据喜多等的方法(日薬理誌，71：195，1975)进行。即，例如在大鼠的情况下，在上午10点至下午5点的期间内，每小时交替改变饲养环境温度24℃和-3℃，接着，在下午5点至次日早晨的上午10点的期间内，维持在4℃，使其自由摄取水和饲料，饲养4天以上，通过反复负荷寒冷刺激而能够制作。在大鼠为-3℃的低温的温度设定，在小鼠为4℃，在豚鼠为0℃，由此能够分别制作SART应激负荷小鼠、豚鼠。
已知这样制作的SART应激负荷动物具有以下特征，即，因反复寒冷刺激而造成的疼痛阈值降低(疼痛过敏)、焦虑-忧郁亢进、CRH(促肾上腺皮质素释放激素)、去甲肾上腺素、IL-1β的释放分别亢进、5-羟色胺(5-HT)的释放被抑制。另外，其体重也减少。
另一方面，已知纤维肌痛症的的患者也具有疼痛阈值降低、焦虑-忧郁亢进、CRH(促肾上腺皮质素释放激素)、去甲肾上腺素、P物质、IL-1β、IL-2、IL-6及IL-8的释放分别亢进、5-羟色胺(5-HT)的释放被抑制的特征。已经明确，在这些方面与SART应激负荷动物具有共性。
此外，迄今为止，已知牛痘病毒接种炎症组织的提取物对于SART应激负荷动物，具有疼痛阈值降低(疼痛过敏)的抑制作用(镇痛作用)、CRH(促肾上腺皮质素释放激素)、去甲肾上腺素、IL-1β的释放亢进的抑制作用、5-羟色胺(5-HT)的释放抑制、体重减少的抑制作用等的抗应激作用(基礎と臨床、15卷、5号、2459頁、1981年；応用薬理、32卷、3号、599頁、1986年及其它)，规定以牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取液为主要成分的医药品制剂(商品名：Neurotropin(神经妥乐平))，通过使用该SART应激负荷动物的镇痛效力试验而进行效价检定，作为定量试验。
牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取液制剂是一种已明确广泛适用于腰痛症、颈肩腕综合症、症状性神经痛、肩周炎、变形性关节炎、带状疱疹后神经痛等疼痛性疾病，除此以外还广泛适用于伴随皮肤疾病(湿疹、皮炎、荨麻疹)的搔痒、过敏性鼻炎、亚急性脊髓视神经症(SMON)后遗症的冷觉、异常知觉、疼痛等的非常独特的制剂，其皮下注射、肌肉注射、静脉注射用的注射剂和片剂，作为医疗用医药品已被允许制造，并在市场上出售。近年，在美国进行了关于作为难治性神经性疼痛的RSD(反射性交感神经萎缩症，CPRS-type 1)的临床试验。
另外，近年，已明确牛痘病毒接种炎症组织的提取物对纤维肌痛症有效(Arthritis Res Ther，5(Suppl 3)：S53，170，2003年及其它)。在以下专利文献中，同样记载了牛痘病毒接种炎症组织的提取物对纤维肌痛症有效。
专利文献1：国际公开WO2004/039383号公报
发明内容
本发明的发明人着眼于上述的SART应激负荷动物与纤维肌痛症患者具有共同的特征、以及牛痘病毒接种炎症组织提取物对上述二者均有镇痛作用，考虑其作用机理为改善疼痛的下行性抑制系统的功能降低，经过深入的研究，结果发明一种通过向SART应激负荷动物投入被检物质后对其脑组织进行蛋白质组表达分析，对该被检物质的药理作用，特别是对于纤维肌痛症的作用、镇痛作用或抗应激作用进行研究、判定或评价的方法。
发明的效果
本发明提供一种通过向SART应激负荷动物投入被检物质后对其脑组织进行蛋白质组表达分析，对该被检物质的药理作用，特别是对于纤维肌痛症的作用或镇痛作用进行研究、判定或评价的方法。根据该方法，能够探索对纤维肌痛症或疼痛性疾病有效的物质，对其进行疗效的判定、评价，或者对该物质的靶蛋白质进行分析。
具体实施方式
向动物接种牛痘病毒，破碎出痘的组织，加入提取溶剂除去组织碎片之后，进行除蛋白处理，使其吸附于吸附剂上，然后再将吸附成分溶出，由此得到牛痘病毒接种炎症组织提取物。
例如，可以通过以下工序制造牛痘病毒接种炎症组织提取物。
(a)采取接种牛痘病毒而出痘的家兔、小鼠等的皮肤组织，破碎出痘的组织，添加水、苯酚水溶液、生理盐水或苯酚加甘油水溶液等提取溶剂之后，通过过滤或离心分离得到提取液(滤液或上清)。
(b)将上述提取液调整至酸性的pH，加热，进行除蛋白处理。然后将除蛋白后的提取液调整至碱性，加热后进行过滤或离心分离。
(c)将得到的滤液或上清调整至酸性，使其吸附于活性碳、高岭土等吸附剂上。
(d)向上述吸附剂添加水等提取溶剂，调整至碱性的pH，将吸附成分溶出，由此能够达到牛痘病毒接种炎症组织提取物。
下面，对上述各工序进行更详细地说明。
(a)
采取向家兔等兔子接种牛痘病毒而出痘的炎症皮肤组织，将其破碎。添加其1～5倍量的提取溶剂，制成乳化悬浮液。作为提取溶剂，可以使用蒸馏水、生理盐水、弱酸性乃至弱碱性的缓冲液等，也可以适当地添加甘油等稳定剂、苯酚等杀菌防腐剂、氯化钠、氯化钾、氯化镁等盐类等。此时，也可以通过冻结融解、超声波、细胞膜溶解酶或表而活性剂等的处理破坏细胞组织，使提取容易进行。
(b)
将得到的乳状提取液通过过滤或离心分离除去组织碎片之后，进行除蛋白处理。除蛋白操作可以根据通常公知的方法进行，加热处理、使用蛋白质变性剂，例如酸、碱、尿素、胍、丙酮等有机溶剂等的处理、等电点沉淀，盐析等方法均可适用。然后，采用除去不溶物的通常方法，例如使用滤纸(纤维素、硝酸纤维素等)、玻璃滤器、西莱特(Celite)、塞氏过滤板等的过滤、超滤、离心分离等方法，由此能够除去析出的不溶蛋白质。
(c)
使用盐酸、硫酸、氢溴酸等酸，将这样得到的含有有效成分的提取液调整至酸性，优选调整至pH3.5～pH5.5，进行向吸附剂上吸附的操作。作为能够使用的吸附剂，可以列举活性碳、高岭土等。向提取液中添加吸附剂并进行搅拌，或者使提取液通过填充有吸附剂的柱子，由此能够使有效成分吸附在该吸附剂上。在向提取液中添加吸附剂的情况下，通过过滤或离心分离等除去溶液，从而能够得到吸附有有效成分的吸附剂。
(d)
为使有效成分从吸附剂中溶出(脱离)，能够通过向上述吸附剂添加提取溶剂，在室温或者适当加热进行搅拌而溶出，以过滤或离心分离等通常方法除去吸附剂而实现。作为所使用的提取溶剂，可以使用碱性溶剂，例如，调整至碱性pH的水、甲醇、乙醇、异丙醇等或这些溶剂的适当的混合溶液，优选使用调整至pH9～pH12的水。
另外，例如在上述专利文献1等中记载了更具体的制法。
实施例
首先，如下所述制作了SART应激负荷动物的脑组织试样。
(1)动物
对6周龄的Wistar系雄性大鼠负荷SART应激，制作出SART应激大鼠。使大鼠自由摄取饲料和自来水，负荷5天。自第6天起解除负荷，以供试验。
(2)牛痘病毒接种炎症组织的提取物
作为牛痘病毒接种炎症组织的提取物，使用根据上述专利文献1的实施例2制作的将从接种了牛痘病毒的兔子的炎症皮肤中提取的提取物调制为20NU/mL的物质(牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物)。所谓NU，是使用作为疼痛阈值低于正常动物的慢性应激动物的SART应激负荷大鼠，基于Randall-Selitto法进行试验，以镇痛效力的ED50值规定的。1NU表示当ED50值为100mg/kg时，牛痘病毒接种家兔炎症皮肤提取物含有镇痛活性成分1mg的活性。
(3)牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物的给药
对上述SART应激负荷大鼠，从SART应激负荷开始日起，按照每1kg体重200NU，将牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物(SART应激被检物质给药组)进行连日腹腔内给药。以相同的方案，向正常对照组和SART应激负荷对照组投入生理盐水。给药的液体量为每1kg体重10mL。分组如下：正常对照组(n＝5)、SART应激负荷对照组(n＝10)、SART应激负荷被检物质组给药组(n＝10)。
(4)疼痛阈值的测定
通过采用压力刺激镇痛效果测定装置的基于Randall-Selitto法的试验，对疼痛阈值进行测定。即，以一定的加压速度对大鼠的右后肢脚趾施加压力刺激，将动物表现出逃避或嘶叫反应时的加压重量(g)作为疼痛阈值进行测定。
由此得到以下的结果。
(1)体重的变化
SART应激负荷对照组的体重与正常对照组相比，从SART应激负荷开始1天后起，观察到有意义的体重增加抑制。SART应激负荷被检物质给药组的体重与SART应激负荷对照组相比，未观察到体重变化。
(2)牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物对SART应激负荷大鼠的疼痛阈值降低的效果
如果负荷SART应激5天，则与正常对照组相比，疼痛阈值有意义地降低。对SART应激负荷被检物质给药组，在最后给药的30分钟之后测定了疼痛阈值，结果观察到与SART应激负荷对照组相比有意义的改善。
(3)试样
如上所述，在确认SART应激负荷引起疼痛阈值的降低和牛痘病毒接种家兔炎症皮肤提取物的镇痛效果之后，从各组大鼠的脑组织中回收大脑、中脑、小脑、间脑、桥脑和延髓、脊髓后角和后根神经节。对得到的各试样，使用Polytron匀浆器，在冰冷下，在细胞裂解缓冲液(30mmol/L Tris-盐酸、2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4％CHAPS，pH8.5)[CHAPS：3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸)]中对分别取自各组的4只大鼠的试样进行匀浆，将得到的组织均浆以液氮迅速冷却，冻结保存于一80℃至使用之时。
然后，使用以上述方法得到的试样，通过荧光标记双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)法，发现在SART应激负荷动物的中枢和末梢神经中表达量发生改变的蛋白质，再采用基质辅助激光分析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)对这些蛋白质进行鉴定。以下进行详细说明。
(1)试剂
在上述荧光标记双向差异凝胶电泳中使用的试剂均为由GEHealthcare Bioscience株式会社(原Amersham Bioscience)指定的生产厂家制造的等级品。为避免在细胞裂解缓冲液、重泡胀缓冲液中使用的尿素和硫脲对实验系统造成不良影响，添加离子交换树脂Amberlite进行振荡，吸附并除去分解物后再使用。在调制试剂时使用超纯水(Milli-Q水)。
(2)荧光标记双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)法
利用根据Bradford法用牛血清白蛋白制作的标准曲线，对以上述方法得到的试样的蛋白质浓度进行定量分析。将其用作荧光标记双向差异凝胶电泳的试样，在蛋白质表达量变化的分析中，采用2D-DIGE法。
(3)使用荧光标记试剂(Cy Dye)进行的标记反应
用细胞裂解缓冲液将各试样的蛋白质浓度调整为2mg/mL或5mg/mL，并确认其液性为pH8.0～9.0的范围。制作出分别等量混合有待测的全部试样的混合试样，将其作为为内部标准。将内部标准、蛋白质试样50μg加入微量离心管内，添加1μL的Cy Dye DIGE Fluorminimal dye标记溶液(以无水二甲基甲酰胺将Cy Dye色素稀释至400pmol/μL)。搅拌后，在冰中和暗处静置30分钟，标记蛋白质。内部标准试样以Cy2色素标记，蛋白质试样以Cy3或Cy5色素标记。添加1μL 10mmol/L的赖氨酸溶液，在冰中和暗处静置10分钟，使标记反应停止。将以Cy2、Cy3和Cy5色素标记的各试样加入1个微量离心管内进行混合，用于第一向电泳。
(4)第一向电泳
第一向电泳使用Amersham Bioscience的IPG预制胶条(ImmobilineDrystrip)和等电点电泳系统(IPGphor)，进行等电点电泳。使用长度为24cm、pH范围分别为pH4～7L、4.5～5.5L、5.3～6.5L和6～9L的胶条。
在使用pH4～7L、4.5～5.5L和5.3～6.5L的胶条的情况下，同时进行胶条重泡胀和试样添加。将450μL含有试样的重泡胀缓冲液(2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4％CHAPS、1.2％DeStreak Reagent、0.5％IPGBuffer)加于24cm的胶条架上，再放置IPG胶条放置于其上。10小时重泡胀之后，以每个胶条最大50μA、最大8000V实施130,000-180,000VHr电泳。
在分离碱性侧的蛋白质的pH6～9L的胶条的情况下，重泡胀IPG胶条后再添加试样能够得到良好的结果，因此，在加入不含试样的重泡胀缓冲液......的重泡胀托盘内重泡胀IPG胶条10小时以上，然后用加样杯添加试样，以每个胶条最大....、最大8000V实施96,000VHr电泳。
在严格遮光的条件下进行试样添加后的操作，将电泳结束后的胶条保存于-80℃至实施第二向电泳。
(5)第二向电泳
第二向电泳进行24cm×20cm、1mm厚的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，丙烯酰胺浓度：12.5％)。向电泳结束的胶条添加平衡缓冲液A(50mmol/L Tris-盐酸、6mol/L尿素、30％甘油、2％SDS、1％二硫苏糖醇，pH8.8)，振荡15分钟，更换为平衡缓冲液B(50mmol/L Tris-盐酸、6mol/L尿素、30％甘油、2％SDS、2.5％碘乙酰胺，pH8.8)后，再振荡15分钟。在平衡结束之后，立即进行第二向电泳。在10℃、2W/gel、遮光状态下进行电泳，直至电泳前端距凝胶下端5～10mm的位置。
(6)分析
将电泳结束的凝胶从电泳槽中取出之后，遮光，直接以夹于玻璃片之间的状态，立即使用Typhoon 9400可变图象分析仪(variable imageanalyzer)(荧光图象分析装置)，获取Cy2、Cy3、Cy5的荧光图象(激发波长/荧光波长：Cy2：488nm/520nm，Cy3：532nm/580nm，Cy5：633nm/670nm)。应用DeCyder差异分析软件(DeCyder DifferentialAnalysis Software)，对各神经组织的6块凝胶(凝胶图像数18)进行斑点的检出、匹配、统计分析。对正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组分别进行比较，挑选出表达量之差为1.5倍以上且在t-test中p＜0.05的斑点。
(7)磷酸化蛋白质的分析
为了确认翻译后修饰的影响，在同一块凝胶中实施了使用荧光标记试剂(Cy Dye)的总蛋白质的标记，和使用磷酸化蛋白质染色试剂(Pro-Q Diamond)的磷酸化蛋白质的染色。以Cy2标记50μg试样，与450μg未标记的试样混合，与上述同样进行双向电泳。电泳结束后，为不引起Cy Dye和Pro-Q Diamond的褪色，在遮光下实施染色操作。从玻璃片中取出凝胶，在固定液(50％甲醇，10％三氯乙酸)中，室温下浸渍1小时。然后更换固定液，过夜，再更换固定液，平稳地振荡1小时，固定。用双蒸水洗净固定后的凝胶，每次15分钟，清洗4次，添加500mL染色液，振荡2小时进行染色。然后添加脱色液(20％乙腈、50mmol/L乙酸钠，pH4.0)，每次30分钟，共洗净3次。使用Typhoon 9400可变图象分析仪，Cy5色素以激发波长633nm/荧光波长670nm的条件、Pro-Q Diamond以激发波长532nm/荧光波长580nm的条件，对凝胶进行测定。
(8)采用MALDI-TOF/MS进行的蛋白质鉴定
作为试样，添加相当于蛋白质量为500μg的组织均浆，与上述同样实施双向电泳。
使用SYPRO Ruby Protein Gel和Blot Stain Kit，按照试验设计(protocol)对凝胶中的总蛋白质进行染色。从玻璃片中取出已结束电泳的凝胶，浸渍在500mL的固定液(10％甲醇，7％乙酸)中，在室温下平稳地振荡过夜，进行固定。固定后，添加500mL染色液，在遮光下，室温下平稳地振荡5小时以上，进行染色。然后添加500mL的脱色液(10％甲醇，6％乙酸)，在遮光下，室温下平稳地振荡1～2小时。使用Typhoon 9400可变图象分析仪，在激发波长457nm/荧光波长610nm的条件下，对凝胶进行测定。染色后的凝胶使用BioRadSpotCutter挑选出目的斑点，对其进行分析。
其结果如下所示。
(1)在pH4-7的范围内的蛋白质表达改变的分析
对采取的全部组织实施在pH4-7的范围内的荧光标记双向差异凝胶电泳(2D-DIGE)分析。
(1-1)大脑
分析的结果为，对正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组，分别进行了比较，均未发现表达量之差为1.5倍以上且在t-test中p＜0.05的斑点。以下，根据同样的检测标准对斑点的表达量之差进行评价。
(1-2)间脑
在正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，均未发现存在表达量存在差异的斑点。
(1-3)中脑
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，与正常对照组相比，在SART应激负荷对照组中增加了5个斑点，未发现减少的斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加1个斑点，减少4个斑点。
(1-4)桥脑
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，在SART应激负荷对照组中增加6个斑点，减少4个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加3个斑点，未发现减少的斑点。
(1-5)延髓
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，在SART应激负荷对照组中未发现增加的斑点，减少1个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中未发现增加的斑点，减少1个斑点。
(1-6)小脑
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，在SART应激负荷对照组中增加了5个斑点，减少9个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，未发现存在表达量存在差异的斑点。
(1-7)脊髓后角
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，在SART应激负荷对照组中增加1个斑点，未发现减少的斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在SART应激负荷被检物质给药组中增加1个斑点，减少1个斑点。
(1-8)后根神经节
在正常对照组和SART应激负荷对照组的比较中，在SART应激负荷对照组中增加1个斑点，未发现减少的斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，未发现存在表达量存在差异的斑点。
在至此进行的实验中发现表达量改变的斑点数量表示在表1中。
[表1]
  pH4-7
  正常对照组(INT)与SART应激负荷对照组(SART)   SART应激负荷对照组(SART)与SART应激被检物质对照组(DRUG)
  INT＜SART   INT＞SART   SART＜TEST   SART＞DRUG
  大脑   0   0   0   0
  间脑   0   0   0   0
  中脑   5   0   1   4
  桥脑   6   4   3   0
  延髓   0   1   0   1
  小脑   5   9   0   0
  脊髓后角   2   0   1   1
  后根神经   1   0   0   0
n＝4，t检验
(2)在窄pH范围(pH4.5-5.5和pH5.3-6.5)内的蛋白质表达改变的分析
对于在pH4-7的范围内能够确认多个斑点发生变化的中脑、桥脑和小脑，实施了在更窄范围(pH4.5-5.5和pH5.3-6.5)内的DIGE，再次确认在pH4-7中得到的结果，并尝试检出新的斑点。
(2-1)中脑
在pH4.5-5.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组中，在SART应激负荷对照组中增加14个斑点，减少6个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加1个斑点，减少14个斑点。在pH5.3-6.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组中，在SART应激负荷对照组中增加7个斑点，减少2个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在SART应激负荷被检物质给药组中增加2个斑点，减少6个斑点。
在中脑中，在pH4-7的范围内发现表达量发生改变的斑点，除了其中的1个之外，在pH4.5-5.5和pH5.3-6.5的范围内，仍然发生1.5倍以上有意义的改变，能够确认实验的再现性。
(2-2)桥脑
在pH4.5-5.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，均未发现表达量存在差异的斑点。在pH5.3-6.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组中，在SART应激负荷对照组中增加1个斑点，减少1个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加2个斑点，减少1个斑点。
在桥脑中，在pH4-7的范围内能够检测出改变的斑点，在pH4.5-5.5和pH5.3-6.5的范围内未能确认。
(2-3)小脑
在pH4.5-5.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组中，在SART应激负荷对照组中增加3个斑点，减少12个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加2个斑点，减少1个斑点。在pH5.3-6.5的范围内，在正常对照组和SART应激负荷对照组中，在SART应激负荷对照组中增加2个斑点，减少7个斑点。而在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，在被检物质给药组中增加1个斑点，未发现减少的斑点。
在小脑中，在pH4-7的范围的内发现的改变的斑点，除了其中的2个之外，在pH4.5-5.5和pH5.3-6.5的范围内，仍然发生1.5倍以上有意义的改变，能够确认实验的再现性。
(3)在pH6-9的范围内的蛋白质表达量改变的分析
对大脑和后根神经节进行了在pH6-9的范围内的DIGE分析，结果如下所述。
(3-1)大脑
在正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，均未发现表达量存在差异的斑点。
(3-2)后根神经节
在正常对照组和SART应激负荷对照组，以及SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质给药组中，均未发现表达量存在差异的斑点。
在窄pH范围和碱性pH范围的实验中发现变化的斑点数量表示在表2中。
[表2]
  pH4.5-5.5
  正常对照组(INT)与SART应激负荷对照组(SART)   SART应激负荷对照组(SART)与SART应激被检物质对照组(DRUG)
  INT＜SART   INT＞SART   SART＜NTP   SART＞NTP
  中脑   14   6   1   14
  桥脑   0   0   0   0
  小脑   3   12   2   1
  pH5.3-6.5
  正常对照组(INT)和SART应激负荷对照组(SART)   SART应激负荷对照组(SART)和SART应激被检物质对照组(DRUG)
  INT＜SART   INT＞SART   SART＜NTP   SART＞NTP
  中脑   7   2   2   6
  桥脑   1   1   2   1
  小脑   2   7   1   0
  PH6-9
  正常对照组(INT)和SART应激负荷对照组(SART)   SART应激负荷对照组(SART)和SART应激被检物质对照组(DRUG)
  INT＜SART   INT＞SART   SART＜NTP   SART＞NTP
  大脑   0   0   0   0
  后根神经节   0   0   0   0
所有实验均为n＝4，t检验
(4)中脑试样的磷酸化分析
一般认为，在发现翻译后修饰的影响方面，蛋白质组分析与其它方法相比更具长处。因此，使用中脑试样确认蛋白质的磷酸化。用Cy5预先标记总蛋白质，以ProQ Diamond对双向电泳后发生磷酸化的蛋白质进行染色，按各自的荧光波长获取图象，确认蛋白质磷酸化的有无。
(5)已确认发生改变的蛋白质的鉴定
对于中脑、桥脑和小脑的试样，进行双向电泳，挑选出斑点进行凝胶内消化后，采用MALDI-TOF/MS进行分析。
如上所述，根据使用2D-DIGE的蛋白质组分析，确认了在SART应激负荷动物的中脑、桥脑、小脑中的多种蛋白质发生改变。
蛋白质组分析的优点在于能够确认在基因水平上不能确认的翻译后修饰。在DIGE分析中，受到磷酸化、糖化、切断等翻译后修饰的蛋白质作为另外的斑点而能够被确认，因此，应用Pro-Q Diamond染色对斑点是否为磷酸化的蛋白质进行确认。通过组合应用Cy Dye标记和Pro-Q Diamond染色，能够确认以DIGE法确认发生改变的斑点有无磷酸化。
通过MALDI-TOF/MS对已确认发生改变的斑点进行鉴定的结果，能够鉴定的蛋白质为以下21种：CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexin 1、Complexin 2、突触蛋白2(Synapsin 2)、PGP 9.5(蛋白基因产物9.5(Protein Gene Product 9.5))、α-突触核蛋白(Alpha-synuclein)、Erk2(MAPK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK2(Ser/Thr protein kinase PAK2)、TOLLIP、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2(Actin related protein 2/3sub2)、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基4(Actin related protein 2/3sub4)、α-微管蛋白(Tubulin alpha)、Regucalcin(SMP30)、eIF5A、醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase)、琥珀酰CoA连接酶(Succinyl CoA ligase)、肌酸激酶(Creatine kinase)、柠檬酸合成酶(Citrate synthase)、ATP合成酶(ATP synthase)。当设正常对照组的表达量为1时，在SART应激负荷对照组和SART应激负荷被检物质(Drug)给药组中，各鉴定蛋白质的斑点的表达量表示在表3中。
[表3]
蛋白质名称   中脑   桥脑   小脑
SART   SART+Drug SART   SART+Drug SART   SARTDrug
  CRMP-2   1.9*   0.79+   0.64*   0.85   0.26*   0.39
  CRMP-4   0.58*   0.95+   0.64*   0.8
  Munc-18-1   2.9*   0.94+   0.30*   0.51
  Complexin 1   1.6*   1.4
  Complexin 2   1.5*   1.4
  突触蛋白2   1.5*   1.3
  蛋白基因产物9.5   0.64*   0.76
  α-突触核蛋白   1.9*   1.4
  Erk 2(MAPK)   1.3*   1.2
  丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK2 1.8* 1.5
  TOLLIP   0.14*   0.19
  肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2 1.4* 1.1
  肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基4   1.30   0.93+
  α-微管蛋白   1.9*   0.79+   0.63*   0.74
  Regucalcin(SMP30)   0.63*   1.2+
  elF5A   2.0*   1.4
  醛脱氢酶   1.4   0.8+
  琥珀酰CoA连接酶   1.6*   1.4
  肌酸激酶   1.3*   1.1
  柠檬酸合成酶   1.3*   1.1
  ATP合成酶   0.69*   0.81
设正常对照组＝1计算
*：p＜0.05(与正常对照组比较，T检验)
+：p＜0.05(与SART应激负荷对照组比较，T检验)
(6)鉴定出的蛋白质的分析
在这些鉴定出的蛋白质中，针对在中脑中的由SART应激负荷引起变化，但该变化通过投入被检物质而被抑制的CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1，以及在小脑中发现的由SART应激负荷引起变化的Complexin 1/2，进行了更详细地研究。
(A)应用realtime PCR测定CRMP-2在中脑中心灰白质中的mRNA量，未能确认由SART应激负荷和由SART应激负荷被检物质给药引起mRNA量的变化，提示CRMP-2在转录阶段中未受影响。因此，以聚丙烯酰胺凝胶将中脑均浆进行电泳后，转印至PVDF膜上，再使用抗CRMP-2抗体对其进行检测，未发现以抗CRMP-2抗体识别的条带浓度变化，提示发生通过双向电泳能够确认的翻译后修饰等变化。为了对其进行确认，从通过双向电泳分离后的凝胶中转印至PVDF膜上，使用抗CRMP-2抗体进行检测，在比通过2D-DIGE确认发生改变的斑点更高分子量的位置上发现CRMP-2的斑点。由该结果提示，以2D-DIGE确认发生改变的斑点为CRMP-2的一部分被切断而生成的切断型CRMP-2。
(B)用realtime PCR测定CRMP-4在中脑中心灰白质中的mRNA量，也未能确认由SART应激负荷和由SART应激负荷被检物质给药引起mRNA量的变化，提示CRMP-4在转录阶段中未受影响。因此，以聚丙烯酰胺凝胶将中脑均浆进行电泳后，转印至PVDF膜上，再使用抗CRMP-4抗体对其进行检测，未发现以抗CRMP-4抗体识别的条带浓度变化，提示发生通过双向电泳能够确认的翻译后修饰等变化。为了对其进行确认，从通过双向电泳分离后的凝胶中转印至PVDF膜上，使用抗CRMP-4抗体进行检测，在与通过2D-DIGE确认发生改变的斑点几乎相同的分子量检测出等电点不同的多个斑点，考虑可能发生翻译后的修饰。由SART应激负荷引起这些斑点的浓度在酸性侧降低，碱性侧增加，该变化通过投入被检物质而被抑制。已知磷酸化可作为使蛋白质的等电点发生改变的翻译后修饰，因此，与经ProQ Diamond染色的凝胶图象进行比较，可知酸性侧的斑点被磷酸化，而碱性侧的斑点未被磷酸化。由该结果提示，通过2D-DIGE发现了由SART应激负荷引起磷酸化CRMP-4的减少。
(C)采用realtime PCR测定Munc-18-1在中脑中心灰白质中的mRNA量，Munc-18-1也未能确认由SART应激负荷和由SART应激负荷被检物质给药引起mRNA量的变化，提示Munc-18-1在转录阶段中未受影响。因此，以聚丙烯酰胺凝胶对中脑均浆进行电泳之后，转录至PVDF膜上，再用可识别Munc-18-1的氨基酸58-70位的抗体对其进行检测，确认由SART应激负荷引起以新的抗Munc-18抗体识别的条带浓度位于低分子量侧，提示发生了切断等翻译后修饰。为了对其进行确认，从通过双向电泳分离后的凝胶中转印至PVDF膜上，使用抗Munc-18抗体进行检测，不仅检出了通过2D-DIGE确认发生变化的斑点，而且在高分子量侧还检出了数个斑点。进一步，尝试使用识别Munc-18-1的C末端的氨基酸580-594位的抗体对其进行检测，在高分子量侧检测出数个斑点，但未检出由2D-DIGE确认发生改变的斑点。由该结果提示，以2D-DIGE发现的斑点为将C末端从Munc-18-1中切断后的蛋白质。
(D)针对Complexin 1/2，通过双向电泳分离小脑均浆，从凝胶中转印至PVDF膜上，使用抗Complexin 1/2抗体进行检测，不仅检出了采用MALDI-TOF/MS分别鉴定出的Complexin 1和Complexin 2，而且还在几乎相同的分子量检测出等电点存在于若干酸性侧的数个斑点，考虑可能发生翻译后的修饰。这些斑点，正是虽然在2D-DIGE中发现其变化，但采用MALDI-TOF/MS却未鉴定出来的斑点，存在于同一位置的斑点在中脑中也发生了改变。在中脑中，由SART应激负荷引起这些斑点浓度在酸性侧增加，该变化通过投入被检物质而被抑制。由该结果提示，通过2D-DIGE发现了由SART应激负荷引起的翻译后修饰的变化。以上结果总结在表4中。
[表4]
蛋白质名称   中脑   小脑
SART   SART+Drug SART   SART+Drug
  低分子量CRMP-2   1.9*   0.79+   0.26*   0.39
  非磷酸化CRMP-4   0.58*   0.95+
  磷酸化CRMP-4   1.9*   1.1+
  低NW Munc-18-1   2.9*   0.94+   0.30*   0.51
  Complexin 1/2   1.6*   1.4
  低等电点Complexin 1/2   2.0*   1.1+   0.52*   0.66
设正常对照组＝1计算
*：p＜0.05(与正常对照组比较，T检验)
+：p＜0.05(与SART应激负荷对照组比较，T检验)
如上述CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1这样的通过蛋白质组分析作为发生变化的蛋白质被鉴定的蛋白质，也存在翻译后被修饰的情况。已确认发生改变的上述蛋白质，既有翻译后被修饰的蛋白质，也有翻译后不被修饰的蛋白质。作为翻译后的修饰反应，可以列举例如肽链的切断、糖链和脂肪酸的加成这种不可逆反应，和磷酸化、乙酰化、羟化、羧化、腺苷酸化、ADP核糖基化等可逆反应。
(7)鉴定出的蛋白质在生物体内的功能
从公共的数据库和公知的文献中收集发现的蛋白质相关的情报。
CRMP-1、CRMP-2和CRMP-4为同属于CRMP家族的蛋白质，分别具有70％以上的同源性。有报告，CRMP-2为一种参与轴索延伸和生长锥破坏的蛋白质，通过磷酸化抑制轴索延伸。关于本案发现的切断型CRMP-2，虽然有报告切断型CRMP-2在组织采取后随着时间的推移而增加，在内侧型侧头叶癫痫患者的已萎缩的海马中表达减少，但是它在生物体内的功能和意义尚不清楚。已知CRMP-4也具有与CRMP-2同样的功能，但尚不知道CRMP-4的功能调控等，也没有磷酸化的报告。虽然没有轴索延伸与疼痛过敏的相关性的直接性的报告，但是考虑因疼痛和温度等而可能发生神经网络的变化。
关于Munc-18-1、Complexin 1、Complexin 2和Synapsin 2，其均参与神经递质的释放。已知神经递质储存于分泌小泡内，对刺激产生反应而与细胞膜融合，发生释放。而Munc-18-1、Complexin 1和Complexin 2在作为分泌小泡与细胞膜的融合中的关键的蛋白质复合体SNARE复合体的形成中发挥重要的作用。关于被认为切断型的低分子量的Munc-18-1，虽然还不明白其在生物体内的功能和意义，但是迄今为止观察到其存在于海马和大脑皮质中。
PGP 9.5(蛋白基因产物9.5，泛素羧基末端水解酶同功酶L1(Protein gene product 9.5，Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozymeL1))和α-突触核蛋白也是已知在神经中特异表达的蛋白质。已知PGP9.5是作为神经的标记物而被广泛使用的蛋白质，具有泛素水解酶活性，认为能够防止因泛素化而引起的神经损伤，其消失可引起神经发生破坏。另外，最近还报告，PGP 9.5使P2X ATP受体活化，使ATP诱导性的电流增加。α-突触核蛋白是一种因其生理功能而在帕金森病中凝集的周知的蛋白质，已报告，α-突触核蛋白抑制参与多巴胺合成的酪氨酸磷酸化酶的活性，与多巴胺转运蛋白结合，使多巴胺向细胞内的流入。
除了这些神经特异性蛋白质之外，参与信号转导系统、细胞形态、蛋白质合成起始、能量产生等的蛋白质也已被鉴定。表5汇总了有关确认发生改变且采用MALDI-TOF/MS鉴定出的蛋白质的已知功能。
[表5]
  蛋白质名称   功能
  CRMP-2CRMP-4 轴索的延伸
  Munc-18-1Complexin 1Complexin 2突触蛋白2 神经递质的释放
  蛋白基因产物9.5   神经的保护、维护
  α-突触核蛋白   分子伴侣、控制酶活性
  Erk 2(MAPK)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK2FOLLIP 细胞内信号转导
  肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基4 细胞形态的变化、移动
  α-微管蛋白   轴索、细胞骨架的结构蛋白质
  Regucalcin(SMP30)   促进Ca2+的摄入
  elF5A   蛋白质合成起始因子
  醛脱氢酶琥珀酰CoA连接酶肌酸激酶柠檬酸合成酶ATP合成酶 线粒体酶参与能量产生
上述蛋白质有可能是SART应激负荷动物的疼痛阈值降低等的生理功能异常或者纤维肌痛症患者的病因，还有可能是牛痘病毒接种家兔炎症皮肤提取物的靶分子。因此，在被检物质使这些蛋白质的变化恢复正常的情况下，该被检物质可能成为对治疗纤维肌痛症和腰痛症、颈肩腕综合症、症状性神经痛、肩周炎、变形性关节炎、带状疱疹后神经痛等疼痛性疾病、RSD(refrex sympathetic dystrophy：反射性交感神经萎缩症)等神经性疼痛、或者因应激而造成的生理功能异常等有效的药剂。
工业实用性
如上所述，能够确认，根据本发明的方法能够检出、鉴定因SART应激负荷或投入有牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物而表达发生改变的蛋白质。因此，本发明作为一种通过向SART应激负荷动物投入被检物质后对其脑组织进行蛋白质组表达分析，对该被检物质的药理作用，特别是对于纤维肌痛症的作用、镇痛作用或抗应激作用进行研究、判定或评价的方法十分有用。

Claims (17)

1.一种对被检物质的药理作用进行研究、判定或评价的方法，其特征在于：
该方法基于对投入有被检物质的SART应激负荷动物的脑组织进行的蛋白质组表达分析。
2.如权利要求1所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
所述药理作用为对纤维肌痛症的作用、镇痛作用或抗应激作用。
3.如权利要求1或2中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
所述SART应激负荷动物为大鼠。
4.如权利要求1～3中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
所述脑组织为中脑、桥脑或小脑。
5.如权利要求1～4中任一项所述的研究、判定或评价方法，其特征在于：
所述蛋白质组表达分析是采用荧光标记双向差异凝胶电泳的分析。
6.如权利要求1～5中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
进行蛋白质组表达分析，与正常动物进行比较，将在SART应激负荷动物中表达发生改变的蛋白质作为指标。
7.如权利要求1～5中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
进行蛋白质组表达分析，与未投入被检物质的SART应激负荷动物进行比较，将在投入有被检物质的SART应激负荷动物中表达发生改变的蛋白质作为指标。
8.如权利要求6或7所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
作为表达发生改变的蛋白质，用翻译后被修饰或未被修饰的CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexin 1、Complexin 2、突触蛋白2、PGP 9.5(蛋白基因产物9.5)、α-突触核蛋白、Erk2(MAPK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK2、TOLLIP、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基2、肌动蛋白相关蛋白2/3复合体亚基4、α-微管蛋白、Regucalcin(SMP30)、eIF5A、醛脱氢酶、琥珀酰CoA连接酶、肌酸激酶、柠檬酸合成酶、ATP合成酶中的任1种或2种以上作为指标。
9.如权利要求1～8中任一项所述的研究、判定或评价的方法，其特征在于：
所述被检物质为牛痘病毒接种炎症组织的提取物。
10.如权利要求9所述的研究、判定或评价方法，其特征在于：
所述被检物质为牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物。
11.一种用权利要求1～8中任一项所述的研究、判定或评价的方法进行了研究、判定或评价的药剂。
12.如权利要求11所述的药剂，其特征在于：
所述药剂为对纤维肌痛症的治疗剂。
13.如权利要求11所述的药剂，其特征在于：
所述药剂为镇痛剂。
14.如权利要求11所述的药剂，其特征在于：
所述药剂为具有抗应激作用的药剂。
15.如权利要求11所述的药剂，其特征在于：
有效成分为牛痘病毒接种家兔炎症皮肤的提取物。
16.SART应激负荷动物在权利要求1～8所述的研究、判定或评价的方法中的使用方法。
17.SART应激负荷动物在被检物质为牛痘病毒接种家兔炎症皮肤提取物的权利要求1～8所述的研究、判定或评价的方法中的使用方法。
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