KR20080003329A

KR20080003329A - 연구, 판정 또는 평가 방법

Info

Publication number: KR20080003329A
Application number: KR1020077022760A
Authority: KR
Inventors: 쿠스키 니시오카; 토모히로 카토; 히로키 후지사와
Original assignee: 니폰 조키 세야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2005-03-07
Filing date: 2006-03-06
Publication date: 2008-01-07
Also published as: EP1865067A1; US20080194038A1; TW200643174A; EP1865067A4; CN101151376A; AU2006221453A1; EP1865067B1; WO2006095674A1; KR101346073B1; JP2013050452A; JP5607869B2; AU2006221453B2; JPWO2006095674A1; CA2600093A1

Abstract

본 발명은 SART 스트레스 부하동물에 피검물질을 투여한 후, 그 뇌조직을 발현 프로테옴 해석함으로써, 상기 피검물질의 섬유근통증에 대한 작용, 진통작용 또는 항스트레스 작용 등의 약리 작용을 연구, 판정 또는 평가하는 방법을 제공하는 것이다. SART 스트레스 부하동물의 뇌조직에 있어서 일어나고 있는 단백질 발현의 변화가 피검물질에 의해서 어떻게 영향받는지를 발현 프로테옴 해석함으로써, 선유근통증이나 동통성 질환에 유효환 물질이나 항스트레스 물질을 탐색하거나 할 수 있다.

발현 프로테옴

Description

연구, 판정 또는 평가 방법{METHOD FOR STUDY, DETERMINATION OR EVALUATION}

본 발명은, SART 스트레스 부하 동물에 피검물질을 투여한 후, 그 뇌조직을 발현 프로테옴 해석함으로써, 상기 피검물질의 약리작용, 특히 섬유근통증에 대한 작용, 진통작용 또는 항스트레스 작용을 연구, 판정 또는 평가하는 방법에 관한 것이다.

섬유근통증(Fibromyalgia)은, 만성적이고 전신성이 강한 동통, 혹은 부분적이어도 광범위한 만성동통을 주증상으로 하는 질환이며, 근육조직 뿐만 아니라 피부에 통증이 나타나는 일도 있다. 섬유근통증에서는, 이러한 전신성의 만성동통 뿐만 아니라, 피로감, 권태감, 울적함, 불안감, 조조강직(morning stiffness)감, 근육의 경직, 수면장해 등을 수반하는 일이 많다. 또한 두통, 안면통, 인식 장해(잘못된 기억, 집중력의 결여), 위장의 병(내장통, 소화기계의 장해, 가스참), 빈뇨, 설사, 변비, 월경곤란증 등의 증상을 수반하는 일도 있다.

미국의 일반 인구에 대한 섬유근통증의 유병율은 여성 3.4%, 남성 0.5%로 보고되어 있고, 대강 25∼50세의 여성에게 잘 발병하며, 환자의 약 80%가 여성이며, 일본에서도 미국과 거의 마찬가지라고 생각되고 있다. 섬유근통증은 자각증상이 다 채로운 반면, 타각 소견은 특징적인 전신의 압통 이외에는 그다지 없고, MRI, CT 등의 화상검사 외에, 근육통 부위의 병리검사, 각종의 면역학적, 바이러스학적, 내분비학적 검사를 해도 거의 이상이 보여지지 않는다. 예를 들면 류머티즘성 관절염과 달리 부종은 보이지 않고, 염증의 정도를 나타내는 혈액 중의 지표, 즉 혈침이나 CRP가 정상범위임에도 불구하고 환자는 사지나 몸통의 광범위에 걸치는 동통을 호소한다.

진단 방법으로서는, 미국 류머티즘 학회가 1990년에 제창한 분류 기준이 현재 세계적으로 사용되고 있다. 이 기준에서는, 배꼽부를 기점으로 해서 상반신과 하반신, 우반신과 좌반신, 또한 척추부 및 흉골부의 5개소의 어느 부위에나 아픔을 인정하고, 그들이 적어도 3개월이상 지속될 경우, 또는 규정된 전신 18개소의 압통점에 4kg의 완만한 하중을 가해, 11개소 이상에서 통각을 느꼈을 경우를 섬유근통증이라고 한다.

섬유근통증의 발병의 원인이나 메커니즘에 대해서는, 현재 시점에서 스트레스 등의 심리적 요인, 바이러스 감염, 유전, 면역 이상이나 신경전달물질의 이상 등이 추찰되고 있지만, 아직 해명되어 있지 않다. 섬유근통증은 생체조직의 손상 혹은 손상의 가능성이 있는 침해 자극에 의해 초래되는 대부분의 일반적 동통성 질환과 매우 다른 질환이며, 동통 부위에는 관련되는 병리학적 소견은 확인되지 않는다.

섬유근통증의 치료에는, 일반의 동통 치료에 빈번히 사용되고 있는 비스테로이드성 항염증약(NSAIDs) 등의 소염진통제의 대부분은 효과가 없다. 또한 근이완 약, 오피오이드(opioid)성 진통약, 항불안약 등 여러가지 약제가 시용되고도 있지만, 그 유효성은 개인차가 크고, 현저한 효과는 확인되고 있지 않다. 따라서, 현재, 섬유근통증의 치료에는 항우울증약 또는 이것과 NSAID의 처방, 발통 부위에의 국소마취약이나 스테로이드제의 투여, 맛사지, 운동요법, 수면요법 등이 도입되고 있는 것에 지나지 않는다. 단, 어느 쪽의 치료제, 치료방법에 있어서나 섬유근통증의 원인이 특정되어 있지 않은 것도 있고, 치료 효과의 개인차가 커서, 치료법으로서 확립되어 있지는 않다.

상술한 바와 같이, 현재 시점에서 섬유근통증의 발병의 원인과 메커니즘이 명확하지 않은 것도 있고, 이 질환에 유효한 물질을 연구, 판정 또는 평가하는 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 섬유근통증이나 동통성 질환에 유효한 물질을 연구, 판정 또는 평가하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 우선 섬유근통증과 SART 스트레스 부하 동물의 유사성에 착안했다.

SART 스트레스 부하 동물이란, SART(Specific Alternation of Rhythm in Temperature) 스트레스, 즉 반복 한냉 스트레스를 부하한 동물이며, 마우스, 래트, 기니피그 등이 제작될 수 있다. 제작 방법은 키타라 등의 방법(니치야쿠리지, 71:195, 1975)에 준해서 행할 수 있다. 즉, 예를 들면 래트의 경우에는, 사육 환경온도를 오전 10시부터 오후 5시까지는 1시간마다 24℃와 -3℃로 교대로 변경하고, 이어서 오후 5시부터 다음날 아침의 오전 10시 사이는 4℃로 유지하고, 물 및 사료 는 자유롭게 섭취시켜 4일간 이상 사육해서 반복 한냉 스트레스를 부하함으로써 제작할 수 있다. 래트에서 -3℃인 저온의 온도설정은, 마우스에서는 4℃, 기니피그에서는 0℃로 함으로써, 각각 SART 스트레스 마우스, SART 스트레스 기니피그를 제작할 수 있다.

이와 같이 하여 제작된 SART 스트레스 부하 동물에서는, 반복되는 한냉 스트레스에 의해 동통 한계값이 저하하여(동통 과민), 불안·울적함이 항진되고, CRH( 부신피질 자극 호르몬 방출 호르몬), 노르아드레날린, IL-1β의 방출이 각각 항진되며, 세로토닌(5-HT)의 방출이 억제된다고 하는 특징이 알려져 있다. 또한 체중도 감소한다.

한편, 섬유근통증의 환자에 있어서도, 동통 한계값이 저하되고, 불안·울적함이 항진되며, CRH(부신피질 자극 호르몬 방출 호르몬), 노르아드레날린, 서브스턴스 P(substance P), IL-1β, IL-2, IL-6, IL-8의 방출이 각각 항진되고, 세로토닌(5-HT)의 방출이 억제된다고 하는 특징이 알려져 있고, 이들의 점에서 SART 스트레스 부하 동물과 공통성을 갖는 것이 판명되어 있다.

그런데, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 접종 염증조직 추출물이 SART 스트레스 부하 동물에 있어서 동통 한계값의 저하(동통 과민)의 억제 작용(진통 작용), CRH(부신피질 자극 호르몬 방출 호르몬), 노르아드레날린, IL-1β의 방출 항진의 억제 작용, 세로토닌(5-HT)의 방출 억제, 체중 감소의 억제 작용 등의 항스트레스 작용을 갖고 있는 것이 과거부터 알려져 있고(기초와 임상, 15권, 5호, 2459쪽, 1981년;응용 약리, 32권, 3호, 599쪽, 1986년 외), 백시니아 바이러스 접종 집 토끼 염증 피부 추출액을 유효성분으로 하는 의약품 제제(상품명:노이로트로핀)는, 이 SART 스트레스 부하 동물을 사용한 진통 효력시험에 의해 역가검정을 행하고, 정량시험으로서 규정하고 있다.

백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출액 제제는, 요통증, 경추상완 증후군(Cervicobrachial syndrome), 증후성 신경통, 견관절 주위염, 변형성 관절증, 대상포진후 신경통(postherpetic neuralgia) 등의 동통성 질환 이외에, 피부질환(습진, 피부염, 두드러기)에 따른 가려움, 알레르기성 비염, SMON 후유증상의 냉감·이상 지각·아픔 등의 광범한 적응이 확인되고 있는 매우 유니크(unique)한 제제이며, 피하, 근육 주사, 정맥 주사용의 주사제 및 정제가 의료용 의약품으로서 제조 승인을 받아서 시판되고 있다. 최근, 난치성의 신경 원인성 동통인 RSD(반사성 교감신경성 디스트로피, CRPS-type 1)에 관해서 미국에서 임상시험이 행해지고 있다.

또한 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물이 섬유근통증에 효과를 갖는 것이 최근 판명되어 있다(Arthritis Res Ther, 5(Suppl 3):S53, 170, 2003년 외). 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물이 섬유근통증에 유효한 것은 다음 특허문헌에 기재되어 있다.

특허문헌1: 국제공개 WO2004/039383호 공보

본 발명자들은, 상기한 바와 같이 SART 스트레스 부하 동물과 섬유근통증 환자가 공통된 특징을 갖는 것, 및 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물이 그 양자에 대하여 진통작용을 갖는 것, 그 작용기서로서는 아픔의 하행성 억제계의 기능 저하의 개선에 의한다고 생각되는 것에 착안하고, 예의 연구한 결과, SART 스트레스 부하 동물에 피검물질을 투여한 후, 상기 동물의 뇌조직을 발현 프로테옴 해석 함으로써 상기 피검물질의 약리작용, 특히 섬유근통증에 대한 작용, 진통작용 또는 항스트레스 작용을 연구, 판정 또는 평가하는 방법을 발명했다.

발명의 효과

본 발명은, SART 스트레스 부하 동물에 피검물질을 투여한 후, 그 뇌조직을 발현 프로테옴 해석함으로써, 상기 피검물질의 약리작용, 특히 섬유근통증에 대한 작용이나 진통작용을 연구, 판정 또는 평가하는 방법을 제공하는 것이며, 이것에 의해 섬유근통증이나 동통성 질환에 유효한 물질의 탐색, 효과의 판정·평가, 또는 상기 물질의 표적단백질의 해석 등을 행할 수 있다.

백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은, 백시니아 바이러스를 동물에 접종해서 발두(發痘)시킨 조직을 파쇄하고, 추출 용매를 더해서 조직편을 제거한 후, 단백제거처리를 행하고, 이것을 흡착제에 흡착시키며, 이어서 흡착 성분을 용출함으로써 얻어진다.

백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물은, 예를 들면 이하의 공정으로 제조된다.

(a) 백시니아 바이러스를 접종하여 발두시킨 토끼, 마우스 등의 피부조직 등을 채취하여 발두조직을 파쇄하고, 물, 페놀수, 생리식염액 또는 페놀첨가 글리세 린수 등의 추출 용매를 첨가한 후, 여과 또는 원심분리함으로써 추출액(여과액 또는 상청)을 얻는다.

(b) 상기 추출액을 산성의 pH로 조정해서 가열하고, 단백제거처리한다. 이어서 단백질을 제거한 용액을 알칼리성으로 조정해서 가열한 후에 여과 또는 원심분리한다.

(c) 얻어진 여과액 또는 상청을 산성으로 하여 활성탄, 카올린 등의 흡착제에 흡착시킨다.

(d) 상기 흡착제에 물 등의 추출 용매를 더해, 알칼리성의 pH로 조정하고, 흡착 성분을 용출함으로써 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물을 얻을 수 있다.

상기 각 공정을 더욱 상세하게 서술하면 다음과 같다.

(a)에 대해서

백시니아 바이러스를 집토끼 등의 토끼에 접종해서 발두시킨 염증 피부조직을 채취해서 파쇄하고, 그 1 내지 5배량의 추출 용매를 더해서 유화 현탁액으로 한다. 추출 용매로서는, 증류수, 생리식염수, 약산성 내지 약염기성의 완충액 등을 사용할 수 있고, 글리세린 등의 안정화제, 페놀 등의 살균·방부제, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘 등의 염류 등을 적당하게 첨가해도 좋다. 이 때, 동결 융해, 초음파, 세포막 용해 효소 또는 계면활성제 등의 처리에 의해 세포조직을 파괴해서 추출을 용이하게 할 수도 있다.

(b)에 대해서

얻어진 유상 추출액을 여과 또는 원심분리 등에 의해 조직편을 제거한 후, 단백 제거처리를 행한다. 단백 제거조작은 통상 행해지고 있는 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 가열 처리, 단백질 변성제, 예를 들면 산, 염기, 요소, 구아니딘, 아세톤 등의 유기용매 등에 의한 처리, 등전점 침전, 염석 등의 방법을 적용할 수 있다. 이어서, 불용물을 제거하는 통상의 방법, 예를 들면 여과지(셀룰로오스, 니트로셀루로오스 등), 유리 필터, 셀라이트, 자이츠(Seitz) 여과판 등을 사용한 여과, 한외 여과, 원심분리 등에 의해 석출해 온 불용 단백질을 제거한다.

(c)에 대해서

이렇게 해서 얻어진 유효성분함유 추출액을, 염산, 황산, 브롬화수소산 등의 산을 이용하여 산성, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.5로 조정하고, 흡착제로의 흡착 조작을 행한다. 사용 가능한 흡착제로서는, 활성탄, 카올린 등을 들 수 있고, 추출액 중에 흡착제를 첨가해 교반하거나, 추출액을 흡착제 충전 칼럼에 통과시켜서 상기 흡착제에 유효성분을 흡착시킬 수 있다. 추출액 중에 흡착제를 첨가했을 경우에는, 여과나 원심분리 등에 의해 용액을 제거하고, 유효성분을 흡착시킨 흡착제를 얻을 수 있다.

(d)에 대해서

흡착제로부터 유효성분을 용출(탈리)시키기 위해서는, 상기 흡착제에 용출용매를 첨가하고, 실온 또는 적당하게 가열하거나 또는 교반해서 용출하고, 여과나 원심분리 등의 통상의 방법으로 흡착제를 제거해서 달성할 수 있다. 사용되는 용출용매로서는, 염기성의 용매, 예를 들면 염기성의 pH로 조정한 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등 또는 이들의 적당한 혼합 용액을 사용할 수 있고, 바람직하게는 pH9 내지 12로 조정한 물을 사용할 수 있다.

또, 보다 구체적인 제조법이, 예를 들면 상기 특허문헌 1 등에 기재되어 있다.

실시예

우선, 다음과 같이 SART 스트레스 부하 동물의 뇌조직 샘플을 제작했다.

(1) 동물

6주령의 Wistar계 웅성 래트에 SART 스트레스를 부하하고, SART 스트레스 래트를 제작했다. 래트에는 사료 및 수도물을 자유롭게 섭취시켜서 5일간 부하하고, 6일째에 스트레스 부하로부터 해방하고, 실험에 제공했다.

(2) 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물

백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물로서는, 상기 특허문헌 1의 실시예 2에 따라서 제조된 백시니아 바이러스를 접종한 토끼의 염증 피부로부터의 추출물을 20NU/mL로 조제한 것(백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물)을 사용했다. NU란 동통 한계값이 정상동물보다 저하된 만성 스트레스 동물인 SART 스트레스 마우스를 사용하고, Randall-Selitto 변법에 준해서 시험을 행하고, 진통 효력의 ED₅₀값으로써 규정한다. 1NU는 ED₅₀값이 100mg/kg일 때의 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물의 진통 활성함유 성분 1mg을 나타내는 활성이다.

(3) 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물의 투여

상기 SART 스트레스 부하 래트에, 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물을 체중 1kg당 200NU로 SART 스트레스 부하 개시일부터 연일 복강내 투여하였다(SART 스트레스 피검물질 투여군). 정상 대조군 및 SART 스트레스 부하 대조군에는, 생리식염액을 같은 스케줄로 투여했다. 투여 액량은 체중 1kg당 10mL로 했다. 군 편성으로서는, 정상 대조군(n=5), SART 스트레스 부하 대조군(n=10), SART 스트레스 부하 피검물질 투여군(n=10)으로 했다.

(4) 동통 한계값의 측정

동통 한계값은 압자극 진통효과 측정장치를 사용한 Randall-Selitto 변법에 준한 시험에 의해 측정했다. 즉, 래트 오른쪽 뒷다리 족척에 일정한 가압 속도로 압자극을 가해서, 동물이 도피 혹은 명체(鳴諦)반응을 나타내는 가압 중량(g)을 동통 한계값으로 측정했다.

이것에 의해 다음의 결과를 얻었다.

(1) 체중의 변화

SART 스트레스 부하 대조군의 체중은, 정상 대조군과 비교해서 스트레스 부하 개시 1일 후부터 유의한 체중증가의 억제가 확인되었다. SART 스트레스 부하 피검물질 투여군의 체중은, SART 스트레스 부하 대조군과 비교해서 변화는 보여지지 않았다.

(2) SART 스트레스 부하 래트의 동통 한계값 저하에 미치는 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물의 효과

SART 스트레스를 5일간 부하하면 동통 한계값은 정상 대조군과 비교해서 유 의하게 저하했다. SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서 최종투여 30분 후에 동통 한계값을 측정한 결과, SART 스트레스 부하 대조군과 비교해서 유의한 개선이 관찰되었다.

(3) 샘플

상기한 바와 같이, SART 스트레스 부하에 의한 동통 한계값의 저하와 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물의 진통효과가 확인된 후, 각 군의 뇌조직으로부터 대뇌, 중뇌, 소뇌, 간뇌, 교(pons)와 연수, 및 척수 후각과 후근신경절을 회수했다. 얻어진 각 샘플은, 폴리트론 호모지나이저(polytron homogenizer)를 이용하여 각각의 군으로부터 4마리분의 샘플을 빙냉하에서 세포용해 완충액(30mmol/L 트리스 염산, 2mol/L 티오요소, 7mol/L 요소, 4% CHAPS, pH8.5)〔CHAPS:3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid〕에서 호모지나이즈(homogenize)했다. 조직 호모지네이트는 액체질소로 급냉하여 사용시까지 -80℃에서 동결 보존했다.

다음에 상기 방법으로 얻어진 샘플을 이용하여, SART 스트레스 부하 동물의 중추 및 말초신경에서 발현량이 변동하고 있는 단백질을 형광표식 2차원 디퍼런스 겔 전기영동(2D-DIGE)법으로 찾아내고, 이들 단백질을 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화 시간 비행형 질량분석장치(MALDI-TOF/MS)를 이용하여 동정했다. 상세하게는 다음과 같다.

(1) 시약

상기 2차원 전기영동에 사용하는 시약은 어느 것이나 GE 헬스케어 바이오사 이언스 가부시키가이샤(구 Amersham Bioscience)가 지정하는 제조원, 등급의 것을 사용했다. 세포용해 완충액, 팽윤 완충액에 사용하는 요소 및 티오요소는 분해물에 의한 실험계로의 악영향을 피하기 위해서, 이온교환 수지 Amberlite를 첨가하여 진탕하여, 분해물을 흡착 제거한 후 사용했다. 시약의 조제에는 초순수(Milli-Q수)를 사용했다.

(2) 형광표식 2차원 디퍼런스 겔 전기영동(2D-DIGE)법

상기 방법으로 얻어진 샘플의 단백질 농도는 Bradford법에 의해 소 혈청 알부민으로 제작한 검량선을 이용하여 정량했다. 이것을 2차원 전기영동의 샘플로서 사용하고, 단백질 발현량 변화의 해석에는 2D-DIGE법을 사용했다.

(3) 형광표식 시약(Cy Dye)에 의한 표식 반응

샘플의 단백질 농도를 2 혹은 5mg/mL가 되도록 세포용해 완충액으로 조제하고, 액성이 pH8.0∼9.0의 범위인 것을 확인했다. 측정하는 전체 샘플을 등량씩 혼합한 것을 제작하고 이것을 내부표준으로 했다. 내부표준, 단백질 샘플 50㎍을 마이크로 튜브에 취하고, Cy Dye DIGE Fluor minimal dye 표식 용액(무수 디메틸포름아미드에서 Cy Dye색소를 400pmol/μL로 희석) 1μL를 첨가하고, 교반 후 얼음 속·암소에서 30분 정치해서 단백질을 표식했다. 내부 표준 샘플은 Cy2 색소로 표식하고, 단백질 샘플은 Cy3 혹은 Cy5색소로 표식했다. 10mmol/L 리신 용액 1μL를 첨가하고, 얼음 속·암소에서 10분간 정치해서 표식 반응을 정지시켰다. Cy2 , Cy3 및 Cy5로 표식된 각 샘플을 1개의 마이크로 튜브에 넣어서 혼화하고, 이것을 1차원째 전기영동에 사용했다.

(4) 1차원째 전기영동

1차원째의 전기영동은 Amersham Bioscience의 IPG precast gel(Immobiline Drystrip)과 등전점 전기영동 시스템(IPGphor)을 사용한 등전점 전기영동을 행하였다. 스트립 길이는 24cm, pH범위는 pH4-7L, 4.5-5.5L, 5.3-6.5L 및 6-9L의 것을 사용했다.

pH4-7L, 4.5-5.5L 및 5.3-6.5L의 스트립의 경우, 팽윤과 샘플 첨가를 동시에 행하였다. 샘플을 포함하는 팽윤 완충액(2mol/L 티오요소, 7mol/L 요소, 4% CHAPS, 1.2% DeStreak Reagent, 0.5% IPG Buffer) 450μL를 24cm 스트립 홀더에 싣고, 이것에 IPG 스트립을 실어서 10시간 팽윤한 후, 1스트립당 최대 50μA, 최대 8000V에서 130,000-180,000VHr 전기영동을 실시했다.

염기성측의 단백질을 분리하는 pH6-9L의 스트립의 경우, 팽윤 후에 샘플을 첨가한 편이 나은 결과가 얻어지기 때문에 샘플을 포함하지 않는 팽윤 완충액····을 실은 팽윤 트레이에서 IPG 스트립을 10시간이상 팽윤하고, 그 후 샘플 컵 을 이용하여 샘플을 첨가하고, 1스트립당 최대····, 최대 8000V에서 96000VHr 전기영동을 실시했다.

샘플 첨가 후의 조작은 최대한 차광한 조건에서 실시하고, 영동이 완료된 스트립은 2차원째 전기영동까지 -80℃에서 보존했다.

(5) 2차원째 전기영동

2차원째의 전기영동은, 24cm×20cm, 1mm 두께의 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE, 아크릴아미드 농도:12.5%)으로 실시했다. 전기영 동이 완료된 스트립에 평형화 완충액 A(50mmol/L 트리스염산, 6mol/L 요소, 30% 글리세롤, 2% SDS, 1% 디티오스레이톨, pH8.8)를 첨가해서 15분간 진탕하고, 평형화 완충액 B(50mmol/L 트리스염산, 6mol/L 요소, 30% 글리세롤, 2%S DS, 2.5% 요오드아세트아미드, pH8.8)로 변경한 후 15분간 더 진탕했다. 평형화 종료 후, 즉시 2차원째 전기영동을 실시했다. 영동은 10℃, 2W/겔, 차광 상태에서 영동 선단이 Gel 하단으로부터 5∼10mm의 위치까지 실시했다.

(6) 해석

영동이 종료된 겔은 영동조로부터 꺼낸 후 차광하고, 유리판에 끼운 채 즉시 Typhoon 9400 배리어 블루 이미지 애널라이저(형광화상 해석장치)를 이용하여 Cy2, Cy3, Cy5의 형광 이미지의 혼입을 행하였다(여기파장/형광파장:Cy2:488nm/520nm, Cy3:532nm/580nm, Cy5:633nm/670nm). 각 신경조직에 대해서 6장의 겔(겔 이미지수 18)을, DeCyder Differential Analysis Software에서 스폿의 검출, 매칭, 통계해석을 행하였다. 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군 및 SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군을 비교하고, 발현량의 차이가 1.5배이상, t-test에서 p<0.05인 스폿을 선별했다.

(7) 인산화 단백질의 해석

번역후 수식의 영향에 대해서 확인하기 위해서, 형광표식 시약(Cy Dye)을 사용한 전체 단백질의 표식과 인산화 단백질 염색 시약(Pro-Q Diamond)을 사용한 인산화 단백질의 염색을 동일 겔로 실시했다. 샘플 50㎍을 Cy2로 라벨하고, 라벨하고 있지 않은 450㎍의 샘플과 혼화해 상기와 마찬가지로 2차원 전기영동을 실시했다. 영동 종료 후, Cy Dye 및 Pro-Q Diamond의 퇴색이 일어나지 않도록 차광하에서 염색 조작을 실시했다.

유리판으로부터 겔을 꺼내 고정액(50% 메탄올, 10% 트리클로로초산)에 담그어 실온에서 1시간, 그 후 고정액을 교환해서 하룻밤, 또한 고정액을 교환해서 1시간 조용히 진탕해서 고정했다. 고정한 겔은 2차 증류수로 15분, 4회 세정하고, 염색액 500mL를 넣어서 2시간 진탕해서 염색하고, 그 후 탈색액(20% 아세토니트릴, 50mmol/L 초산나트륨, pH4.0)을 넣어서 30분, 3회 세정했다. 겔은 Typhoon 9400 배리어 블루 이미지 애널라이저를 이용하고 Cy5는 여기파장 633nm/형광파장 670nm, Pro-Q Diamond는 여기파장 532nm/형광파장 580nm에서 측정했다.

(8) MALDI-TOF/MS를 사용한 단백질의 동정

단백질량에서 500㎍에 상당하는 조직 호모제네이트를 샘플로서 첨가하고, 상기와 마찬가지로 2차원 전기영동을 실시했다.

겔 중의 전체 단백질의 염색은 SYPRO Ruby Protein Gel 및 Blot Stain kit를 사용하고, 프로토콜에 따라 염색했다. 영동이 완료된 겔은 유리판으로부터 꺼내고, 고정액(10% 메탄올, 7% 초산) 500mL에 담그어 하룻밤 조용히 실온에서 진탕해서 고정했다. 고정 후 염색액 500mL를 넣고, 차광하에서 5시간 이상 조용히 실온에서 진탕하여 염색했다. 그 후 탈색액(10% 메탄올, 6% 초산) 500mL를 넣고, 차광하에서 1∼2시간 조용히 실온에서 진탕하여 탈색했다. 겔은 Typhoon 9400 배리어 블루 이미지 애널라이저를 이용하여 여기파장 457nm/형광파장 610nm에서 측정했다. 염색 후의 겔은 BioRad SpotCutter를 이용하여 원하는 스폿을 피크로 하고, 이것을 해석했 다.

그 결과는 다음과 같았다.

(1) pH4-7의 범위에 있어서의 단백질 발현 변동의 해석

채취한 모든 조직에 있어서 pH4-7의 범위에서의 형광표식 2차원 디퍼런스 겔 전기영동(2D-DIGE) 해석을 실시했다.

(1-1) 대뇌

해석의 결과, 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군 및 SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군을 비교하고, 발현량의 차이가 1.5배이상, t-test에서 p<0.05인 스폿은 발견되지 않았다. 이하, 같은 검정 기준으로 스폿의 발현량의 차이를 평가했다.

(1-2) 간뇌

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군 및 SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서 발현량에 차이가 있는 스폿은 발견되지 않았다.

(1-3) 중뇌

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 5개의 스폿이 증가되어 있고, 감소한 스폿은 발견되지 않았다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 피검물질 투여군에서 1개의 스폿이 증가되고, 4개의 스폿이 감소되어 있었다.

(1-4) 교

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 6개의 스폿이 증가되어 있고, 4개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 피검물질 투여군에서 3개의 스폿이 증가하고, 감소한 스폿은 발견되지 않았다.

(1-5) 연수

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 증가한 스폿은 보여지지 않고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 피검물질 투여군에서 증가한 스폿은 보여지지 않고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다.

(1-6) 소뇌

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 5개의 스폿이 증가되어 있고, 9개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 발현량에 차이가 있는 스폿은 발견되지 않았다.

(1-7) 척수 후각

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 1개의 스폿이 증가되어 있고, 감소한 스폿은 보여지지 않았다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 피검물질 투여군에서 1개의 스폿이 증가되어 있고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다.

(1-8) 후근신경절

정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군의 비교에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 1개의 스폿이 증가되어 있고, 감소한 스폿은 보여지지 않았다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 발현량에 차이가 있는 스폿은 발견되지 않았다.

지금까지의 실험에서 변화가 발견된 스폿의 수를 표 1에 나타냈다.

(2) 협pH 범위(pH4.5-5.5 및 pH5.3-6.5)에 있어서의 단백질 발현 변동의 해석

pH4-7의 범위에서, 복수의 스폿의 변화를 확인할 수 있었던 중뇌, 교 및 소뇌에 관해서, 보다 좁은 범위(pH4.5-5.5 및 pH5.3-6.5)에서의 DIGE를 실시하고, pH4-7에서 얻어진 결과의 재확인과 새로운 스폿의 검출을 시험해 보았다.

(2-1) 중뇌

pH4.5-5.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 14개의 스폿이 증가되어 있고, 6개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 1개의 스폿이 피검물질 투여군에서 증가되고, 14개의 스폿이 감소되어 있었다. pH5.3-6.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 7개의 스폿이 증가되어 있고, 2개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 2개의 스폿이 피검물질 투여군에서 증가되고, 6개의 스폿이 감소되어 있었다.

중뇌에 있어서 pH4-7의 범위에서 변동이 보여진 스폿은 하나를 제외하고 pH4.5-5.5 및 pH5.3-6.5의 범위에 있어서도 1.5배이상 유의하게 변동하고 있어, 실험의 재현성을 확인할 수 있었다.

(2-2) 교

pH4.5-5.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군 및 SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서 발현량에 차이가 있는 스폿은 발견되지 않았다. pH5.3-6.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 1개의 스폿이 증가되어 있고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 2개의 스폿이 피검물질 투여군에서 증가되고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다.

교에 있어서는, pH4-7의 범위에서 변동을 검출할 수 있었던 스폿을 pH4.5-5.5 및 pH5.3-6.5의 범위에 있어서 확인할 수 없었다.

(2-3) 소뇌

pH4.5-5.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 3개의 스폿이 증가되어 있고, 12개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 2개의 스폿이 피검물질 투여군에서 증가되고, 1개의 스폿이 감소되어 있었다. pH5.3-6.5의 범위에 있어서는 정상 대조군과 SART 스트레스 부하 대조군에서는 SART 스트레스 부하 대조군에서 2개의 스폿이 증가되어 있고, 7개의 스폿이 감소되어 있었다. SART 스트레스 부하 대조군과 SART 스트레스 부하 피검물질 투여군에서는 1개의 스폿이 피검물질 투여군에서 증가되고, 감소되어 있는 스폿은 발견되지 않았다.

소뇌에 있어서 pH4-7의 범위에서 변동이 보여진 스폿은 2개를 제외하고 pH4.5-5.5 및 pH5.3-6.5의 범위에 있어서도 1.5배이상 유의하게 변동하고 있어, 실험의 재현성을 확인할 수 있었다.

(3) pH6-9의 범위에 있어서의 단백질 발현 변동의 해석

pH6-9의 범위에서의 대뇌와 후근신경절에 있어서의 DIGE 해석 결과는 다음과 같았다.

(3-1) 대뇌

(3-2) 후근신경절

협pH 범위 및 염기성 pH 범위의 실험에서 변화가 발견된 스폿의 수를 표 2에 나타냈다.

(4) 중뇌 샘플의 인산화 해석

프로테옴 해석에서는 번역 후 수식의 영향을 찾아낼 수 있는 점에서 다른 방법보다 이점이 있다고 말해지고 있다. 거기에서, 중뇌 샘플에서 단백질의 인산화에 대해서 확인을 행하였다. 총 단백질을 Cy5로 프리 표식하고, 2차원 전기영동 후 인산화되어 있는 단백질을 ProQ Diamond로 염색해서 각각의 형광 파장에서 이미지를 취득하고, 단백질의 인산화의 유무를 확인했다.

(5) 변동이 확인된 단백질의 동정

중뇌, 교 및 소뇌의 샘플에 대해서 2차원 전기영동을 행하고, 스폿에 관해서 피크하여 겔 내 소화한 후 MALDI-TOF/MS로 해석했다.

상기와 같이, 2D-DIGE를 사용한 프로테옴 해석에 의해 SART 스트레스 부하 동물에 있어서는, 중뇌, 교, 소뇌에서 복수의 단백질이 변동하고 있는 것이 확인되었다.

프로테오믹스 해석의 이점으로서는, 유전자 레벨에서는 확인할 수 없는 번역후 수식에 대해서도 확인할 수 있는 점이 있다. DIGE 해석에서는 인산화, 당화, 절단 등의 번역후 수식을 받은 단백질은 다른 스폿으로서 확인할 수 있기 때문에, 스폿이 인산화 단백질인지의 확인을 Pro-Q Diamond 염색을 이용하여 실시했다. Cy Dye 표식과 Pro-Q Diamond 염색을 조합함으로써 DIGE에서 변동을 확인할 수 있었던 스폿의 인산화의 유무를 확인할 수 있었다.

변동을 확인할 수 있었던 단백질의 MALDI-TOF/MS에 의한 동정을 행한 결과, 동정할 수 있었던 단백질은, CRMP-2, CRMP-4, Munc-18-1, Complexin 1, Complexin 2, Synapsin 2, PGP 9.5(Protein gene product 9.5), Alpha-synuclein, Erk2(MAPK), Ser/Thr protein kinase PAK2, TOLLIP, Actin related protein 2/3 sub2, Actin related protein 2/3 sub4, Tubulin alpha, Regucalcin(SMP30), eIF5A, Aldehyde dehydrogenase, Succinyl CoA ligase, Creatine kinase, Citrate synthase, ATP synthase의 21종류이었다. 표 3에, 정상 대조군의 발현량을 1이라고 했을 때의 SART 스트레스 부하 대조군 및 SART 스트레스 부하 피검물질(Drug) 투여군에 있어서의 각 동정단백질의 스폿의 발현량을 나타냈다.

(6) 동정된 단백질의 해석

이들 동정된 단백질 중, 중뇌에 있어서 SART 스트레스 부하에 의해 변동하지만 피검물질 투여에 의해 변동이 억제된 CRMP-2, CRMP-4 및 Munc-18-1, 및 소뇌에 있어서 SART 스트레스 부하에 의해 변동이 확인된 Complexin 1/2에 대해서, 더욱 상세하게 검토를 행했다.

(A) CRMP-2의 중뇌 중심 회백질에서의 mRNA량을 realtime PCR을 이용하여 측정한 결과, SART 스트레스 부하 및 SART 스트레스 부하 피검물질 투여에 의해 mRNA량의 변화는 확인할 수 없고, 전사 단계에서는 영향을 받고 있지 않는 것이 나타내어졌다. 그래서, 중뇌 호모제네이트를 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후, PVDF막에 전사하고, 항CRMP-2 항체를 이용하여 검출한 결과, 항CRMP-2 항체에서 인식된 밴드의 농도에는 변화가 보여지지 않고, 2차원 전기영동에서는 확인 가능한 번역 후 수식 등의 변화가 일어나 있는 것이 시사되었다. 이것을 확인하기 위해서, 2차원 전기영동에 의해 분리한 겔로부터 PVDF막에 전사하고, 항CRMP-2 항체를 이용하여 검출한 결과, 2D-DIGE에서 변동이 확인된 스폿보다 고분자량의 위치에도 CRMP-2의 스폿이 발견되었다. 이 결과로부터 2D-DIGE에서 변동이 확인된 스폿은 CRMP-2의 일부가 절단되어서 생긴, 절단형 CRMP-2인 것이 시사되었다.

(B) CRMP-4의 중뇌 중심 회백질에서의 mRNA량을 realtime PCR을 이용하여 측정한 결과, CRMP-4도 SART 스트레스 부하 및 SART 스트레스 부하 피검물질 투여에 의해 mRNA량의 변화는 확인할 수 없고, 전사 단계에서는 영향을 받고 있지 않는 것이 나타내어졌다. 그래서, 중뇌 호모제네이트를 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후, PVDF막에 전사하고, 항CRMP-4 항체를 이용하여 검출한 결과, 항CRMP-4 항체에서 인식된 밴드의 농도에는 변화가 보여지지 않고, 2차원 전기영동에서는 확인가능한 번역 후 수식 등의 변화가 일어나 있는 것이 시사되었다. 이것을 확인하기 위해서, 2차원 전기영동에 의해 분리한 겔로부터 PVDF막에 전사하고, 항CRMP-4 항체를 이용하여 검출한 결과, 2D-DIGE에서 변동이 확인된 스폿과 거의 같은 분자량에서, 등전점이 다른 복수의 스폿이 검출되어, 번역 후 수식의 가능성이 생각되었다. 이들의 스폿의 농도는 SART 스트레스 부하에 의해 산성측이 감소, 염기성측이 증가하고 있어, 피검물질 투여에 의해 이 변동은 억제되어 있었다. 단백질의 등전점을 변동시키는 번역 후 수식으로서는 인산화가 알려져 있기 때문에, ProQ Diamond에서 염색한 겔 이미지와 비교한 결과, 산성측의 스폿은 인산화되어 있고, 염기성측의 스폿은 인산화되어 있지 않은 것을 알 수 있었다. 이 결과로부터 SART 스트레스 부하에 의한 인산화된 CRMP-4의 감소가 2D-DIGE에 의해 찾아내어진 것이 시사되었다.

(C) Munc-18-1의 중뇌 중심 회백질에서의 mRNA량을 realtime PCR을 이용하여 측정한 결과, Munc-18-1도 SART 스트레스 부하 및 SART 스트레스 부하 피검물질 투여에 의해 mRNA량의 변화는 확인할 수 없고, 전사 단계에서는 영향을 받고 있지 않는 것이 나타내어졌다. 그래서, 중뇌 호모제네이트를 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후, PVDF막에 전사하고, Munc-18-1의 아미노산 58-70을 인식하는 항체를 이용하여 검출한 결과, SART 스트레스 부하에 의해 새롭게 항Munc-18항체에서 인식되는 밴드가 저분자량측에 확인되어, 절단 등의 번역 후 수식이 일어나 있는 것이 시사되었다. 이것을 확인하기 위해서, 2차원 전기영동에 의해 분리한 겔로부터 PVDF막에 전사하고, 항Munc-18 항체를 이용하여 검출한 결과, 2D-DIGE에서 변동이 확인된 스폿에 더해, 고분자량측에도 복수의 스폿이 검출되었다. 또한 Munc-18-1의 C말단의 아미노산 580-594을 인식하는 항체에서 검출을 시험해 본 결과, 고분자량측의 복수의 스폿은 검출되었지만 2D-DIGE에서 변동이 확인된 스폿은 검출되지 않았다. 이들 결과로부터, 2D-DIGE에서 찾아내어진 스폿은 Munc-18-1로부터 C말단이 절단된 것이 시사되었다.

(D) Complexin 1/2에 대해서는, 소뇌 호모제네이트를 2차원 전기영동에 의해 분리하고, 겔로부터 PVDF막에 전사해서 항Complexin 1/2 항체를 이용하여 검출한 결과, MALDI-TOF/MS에서 각각 Complexin 1, Complexin 2로 동정된 스폿 뿐만 아니라, 거의 같은 분자량에서 등전점이 약간 산성측에 존재하는 복수의 스폿이 검출되어, 번역 후 수식의 가능성이 생각되었다. 이들의 스폿은, 2D-DIGE의 해석에서 변동이 확인되고 있었지만 MALDI-TOF/MS에서는 동정에 이르지 않은 스폿에서, 같은 위치에 존재하는 스폿이 중뇌에서도 변동되어 있었다. 중뇌에서는 이들 스폿의 농도는 SART 스트레스 부하에 의해 산성측이 증가되어 있고, 피검물질 투여에 의해 이 변동은 억제되어 있었다. 이 결과로부터 SART 스트레스 부하에 의한 번역후 수식의 변화가 2D-DIGE에 의해 찾아내어진 것이 시사되었다. 이상의 결과를 표 4에 정리했다.

상기의 CRMP-2, CRMP-4 및 Munc-18-1과 같이 발현 프로테옴 해석에 의해 변동하는 단백질로서 동정된 것은, 번역 후에 수식되어 있는 경우도 있다. 변동이 확인된 상술의 단백질은, 번역 후에 수식되어 있는 것도 있으면 수식을 받고 있지 않은 단백질도 있다. 번역 후의 수식 반응으로서는, 펩티드쇄의 절단, 당쇄나 지방산의 부가라고 한 불가역 반응과, 인산화, 아세틸화, 메틸화, 수산화, 카르복실화, 아데닐릴화, ADP 리보실화 등의 가역적 반응을 들 수 있다.

(7) 동정된 단백질의 생체 내 기능

발견된 단백질에 관해서는 공공의 데이터베이스 및 공지의 문헌으로부터 정보를 수집했다.

CRMP-1 , CRMP-2 및 CRMP-4는 같은 CRMP 패밀리에 속하는 단백질이고, 각각 70% 이상의 호모로지가 있다. CRMP-2는 축색신장이나 성장원추의 파괴에 관여하는 단백질이며 인산화에 의해 축색신장이 억제되는 것이 보고되어 있다. 이번 발견된 절단형 CRMP-2에 대해서는, 조직 채취 후에 경시적으로 증가하는 것이나, 내측형 측두엽 간질환자의 위축된 해마에 있어서 발현이 감소하고 있는 것이 보고되어 있지만, 생체 내에서의 기능이나 의의에 관해서는 밝혀지지 않고 있다. CRMP-4도 CRMP-2와 같은 기능을 갖고 있는 것이 알려져 있지만, 그 기능 제어 등에 대해서는 아직 알려져 있지 않고, 인산화의 보고도 없다. 축색신장과 통각 과민의 관련에 대해서는 직접적인 보고는 없지만, 통증이나 온도 등에 의해 신경 네트워크의 변화가 생기고 있을 가능성이 생각된다.

Munc-18-1 , Complexin 1, Complexin 2 및 Synapsin 2에 관해서는, 신경전달물질의 방출에 관여하고 있다. 신경전달물질은 분비 소포 내에 축적되어 있고, 자극에 반응해서 세포막과 융합해 방출이 일어나지만, Munc-18-1 , Complexin 1 및 Complexin 2는 분비 소포와 세포막의 융합에 있어서의 중심적인 단백질 복합체인 SNARE 복합체의 형성에 있어서 중요한 역활을 다하고 있는 것이 알려져 있다. 절단형으로 생각되는 저분자량의 Munc-18-1에 관해서는, 생체 내의 기능이나 의의에 관해서는 밝혀져 있지 않지만, 지금까지 해마나 대뇌피질에서 존재가 관찰되고 있다.

PGP 9.5(Protein gene product 9.5, Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1)와 alpha synuclein도 신경에 특이적으로 발현되고 있는 것이 알려져 있는 단백질이다. PGP 9.5는 신경의 마커로서 널리 사용되고 있는 단백질이지만, 유비키틴 가수분해 효소 활성을 가지고 있어, 유비키틴화에 의한 신경의 손상을 막고 있다고 생각되고 있어, 소실에 의해 신경의 파괴가 생기는 것이 알려져 있다. 또 최근, P2X ATP 수용체를 활성화하고, ATP 유도성의 전류를 증가시키는 것도 보고되어 있다. alpha synuclein은 그 생리적 기능보다 파킨슨병으로 응집됨으로써 널리 알려져 있는 단백질이고, 도파민 합성에 관여하는 티로신 인산화 효소의 활성을 억제하거나, 도파민 트랜스포터와 결합하여 세포 내에의 도파민 유입을 감소시키거나 하는 것이 보고되어 있다.

이들의 신경 특이적인 단백질 이외에도, 시그널 전달계, 세포형태, 단백질 합성 개시, 에너지 생산 등에 관여하는 단백질도 동정되었다. 이상의 변동이 확인되어 MALDI-TOF/MS에서 동정된 단백질에 관한 기지의 기능에 대해서 표 5에 정리하였다.

상기 단백질은 SART 스트레스 부하 동물에 있어서의 동통 한계값 저하 등의 생리기능 이상 혹은 섬유근통증 환자의 병의 원인일 가능성이 있고, 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물의 표적분자일 가능성이 있다. 따라서, 이들 단백질의 변화가 피검물질에 의해 정상화되었을 경우, 상기 피검물질은 섬유근통증이나 요통증, 경추상환 증후군, 증후성 신경통, 견관절 주위염, 변형성 관절증, 대상포진후 신경통 등의 동통성 질환, RSD 등의 신경원인성 동통, 또는 스트레스에 의한 생리기능 이상 등에 대하여 유효한 약품이 될 가능성이 있다.

상기와 같이, 본 발명 방법에 의해 SART 스트레스 부하나 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물 투여로 발현이 변동하는 단백질을 검출·동정할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 SART 스트레스 부하 동물에 피검물질을 투여한 후, 그 뇌조직을 발현 프로테옴 해석함으로써, 상기 피검물질의 섬유근통증에 대한 작용, 진통작용 또는 항스트레스 작용 등의 약리 작용을 연구, 판정 또는 평가하는 방법으로서 유용하다.

Claims

피검물질을 투여한 SART 스트레스 부하 동물의 뇌조직을 발현 프로테옴 해석하는 것에 의한, 상기 피검물질의 약리작용의 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항에 있어서, 약리작용이 섬유근통증에 대한 작용, 진통작용 또는 항스트레스 작용인 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SART 스트레스 부하 동물이 래트인 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 뇌조직이 중뇌, 교 또는 소뇌인 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 프로테옴 해석이 형광표식 2차원 디퍼런스 겔 전기영동을 사용한 것임을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 프로테옴 해석을 행하고, 정상동물과 비교해서 SART 스트레스 부하 동물에 있어서 발현이 변동되는 단백 질을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 프로테옴 해석을 행하고, 피검물질을 투여하고 있지 않은 SART 스트레스 부하 동물과 비교해서 피검물질을 투여한 SART 스트레스 부하 동물에 있어서 발현이 변동되는 단백질을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 발현이 변동되는 단백질로서, 번역 후에 수식되어 있는 또는 수식되어 있지 않은 CRMP-2, CRMP-4, Munc-18-1, Complexin 1, Complexin 2, Synapsin 2, PGP 9.5(Protein gene product 9.5), Alpha-synuclein, Erk2(MAPK), Ser/Thr protein kinase PAK2, TOLLIP, Actin related protein 2/3 sub2, Actin related protein 2/3 sub4, Tubulin alpha, Regucalcin(SMP30), eIF5A, Aldehyde dehydrogenase, Succinyl CoA ligase, Creatine kinase, Citrate synthase 및 ATP synthase 중 1종 이상 또는 2종 이상을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 피검물질이 백시니아 바이러스 접종 염증조직 추출물인 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 9 항에 있어서, 피검물질이 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추 출물인 것을 특징으로 하는 연구, 판정 또는 평가 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 연구, 판정 또는 평가된 약제.
제 11 항에 있어서, 섬유근통증에 대한 치료제인 것을 특징으로 하는 약제.
제 11 항에 있어서, 진통제인 것을 특징으로 하는 약제.
제 11 항에 있어서, 항스트레스 작용을 갖는 약제인 것을 특징으로 하는 약제.
제 11 항에 있어서, 유효성분이 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물인 것을 특징으로 하는 약제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나에 기재된 연구, 판정 또는 평가 방법에 사용하는 SART 스트레스 부하 동물의 사용 방법.
피검물질이 백시니아 바이러스 접종 집토끼 염증 피부 추출물인 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 연구, 판정 또는 평가 방법에 사용하는 SART 스트레스 부하 동물의 사용 방법.