CN101146545A - 基于mans的结构的粘蛋白分泌过多抑制剂和应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含少于24个氨基酸的肽。所述的肽具有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：(a)具有参照序列肽1的4－23个连续氨基酸的氨基酸序列；(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。还提供了非肉豆蔻酰化的MANS肽。利用所述肽的各种方法在本发明提供。

Description

基于MANS的结构的粘蛋白分泌过多抑制剂和应用方法
技术领域
本发明总体涉及包含肽的组合物及其应用方法。
背景技术
粘液是一种生物液体，能形成凝胶。其为各种组分的混合物，包括水和来自各种细胞的分泌产物。粘蛋白也称作粘液糖蛋白或上皮糖蛋白，是粘液的主要成分并且是特征在于多个寡糖侧链通过N-和O-连接与肽核心相连的糖偶联物。粘蛋白(粘液的糖蛋白成分)的分泌过多见于多种呼吸疾病，包括哮喘，慢性支气管炎，以及囊性纤维化(CF)，并且是导致患有这些疾病的患者死亡的危险因素。
在气道中，粘液从表面上皮细胞中的杯状细胞以及从粘膜下腺的粘液细胞释放到气道表面上。气道中表面液体(粘液)的总量是粘液分泌速率与粘液清除速率(通过上皮重吸收，蒸发，纤毛转运，和咳嗽转运)的结果，即粘液分泌速率和粘液清除速率之间差异的结果。在“正常”条件下，粘液分泌和清除速率得以平衡使得仅仅有较薄的液体表面层覆盖在气管支气管树上。粘液分泌过多(如果不同时伴随有粘液清除增加)，导致粘液量相对于正常条件净增加，并且导致气道粘液累积，其可导致气流阻塞以及吸入的颗粒和微生物物质的潴留增加。
人和非人动物中的粘液的分泌过多归因于大量气道炎性疾病的发病。增加的粘液分泌见于慢性疾病状态诸如哮喘，慢性阻性非疾病(COPD)，以及慢性支气管炎；见于遗传疾病诸如囊性纤维化；见于过敏性疾病(遗传性过敏症，过敏性炎症)；见于支气管扩张症；以及多种急性、感染性呼吸疾病诸如肺炎、鼻炎、流感以及普通感冒。
在许多所述的呼吸疾病中伴随粘液分泌过多的是炎性细胞在气道中的存在增加。通过组织损伤和从这些细胞释放的炎性介导物的破坏作用，这些细胞对于这些疾病的病理有很大作用。借助于所述慢性炎症的破坏作用的一个实例见于囊性纤维化患者，其中释放自中性粒细胞的介导物(即髓过氧物酶)诱导气道上皮组织的脱落。
哺乳动物气道衬有一薄层粘液，其由气道上皮(杯状)细胞和粘膜下腺产生并分泌的。在疾病诸如哮喘、COPD，慢性支气管炎、以及囊性纤维化中，粘液分泌过多是常见的损伤。过量粘液可导致阻塞、对感染敏感、甚至气道壁和结缔组织的破坏。粘液的主要成分是分泌细胞(即杯状细胞和粘液细胞)合成并储存在细胞浆膜结合的颗粒中的粘蛋白糖蛋白。粘蛋白是上皮细胞分泌的糖蛋白家族，所述细胞包括在呼吸道、胃肠道和女生殖道中的那些。粘蛋白负责粘液的粘弹性性质并且至少8种粘蛋白基因是已知的。见美国专利申请10/180,753(公开号US2003/0013652)。粘蛋白分泌过多和/或粘膜细胞增生造成的粘膜纤毛损伤导致气道粘液堵塞，其促进慢性感染、气道阻塞并可能导致死亡。许多气道疾病诸如慢性支气管炎，慢性阻塞性肺疾病，支气管扩张，哮喘，囊性纤维化和细菌感染的特征是粘蛋白产生过多。见US专利申请10/180,753(公开号2003/0013652)。适当刺激后，粘蛋白颗粒通过胞吐过程释放，其中颗粒转运到细胞外周，在该处颗粒膜与胞浆膜融合，允许内含物的内腔分泌。
尽管该过程的明显病理生理重要性，最近已经清楚了链接细胞表面的刺激与粘液蛋白颗粒释放的细胞内信号机制。见Li et al，JournalofBiological Chemistry，276：40982-40990(2001)。肉豆蔻酰化的、丙氨酸富含型C激酶底物(MARCKS)蛋白据信是人支气管上皮细胞的粘液分泌所需的。假设是MARCKS在不同位置结合分泌性颗粒膜以及结合肌动蛋白细胞骨架作为收缩性细胞骨架和粘蛋白颗粒的物理连接，并可能在指导分泌性颗粒进入细胞膜上的锚定位点中起作用。见Singer et al.，″A MARCKS-related peptide blocks mucushypersecretion in a mouse model of asthma″，Nature Medicine，10：193-196(2004)。MANS肽(myr-肽1)是称为“肉豆蔻酰化的丙氨酸富含型C-激酶底物”的蛋白质(简称为MARCKS蛋白)的肉豆蔻酰化N末端24氨基酸序列。MARCKS的24氨基酸片段，肉豆蔻酰化的N末端序列(MANS)肽，显示在体外抑制粘蛋白释放，并且也显示阻断哮喘小鼠模型中的粘液分泌。见Li et al.and Singer et al.，见上文。
已知肉豆蔻酰化对于促进肽通过脂质双层的跨膜转运有重要性。最近的研究证实了这一重要性，其显示非肉豆蔻酰化的肽与肉豆蔻酰化的肽相比不通过细胞膜。见A.Harishchandran et a1，″Interaction of aPseudosubstrate peptide of Protein Kinase C and its Myristoylated Formwith Lipid Vesicles..Only the Myristoylated Form Translocates intoLipid Bilayer.，″Biochem.Biopys.Acta，1713：73-82(2005)。
发明内容
一方面，提供这样的肽，其由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，其也已知为MANS肽，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。肽的一或多个氨基酸可选独立地被化学修饰，并且肽以粘蛋白分泌过多抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应。
另一方面，提供这样的肽，其由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。肽的N末端和C末端氨基酸可选独立地被化学修饰。所述肽在以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应并且在以相同浓度施用时与MANS肽相比对哺乳动物具有更高的粘蛋白抑制效应。
另一方面，提供这样的肽，其由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。肽的N末端和C末端氨基酸可选独立地被化学修饰。所述肽具有比MANS肽更高的水溶性并且在以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应。
另一方面，提供了抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多的方法。所述方法包括施用哺乳动物粘蛋白抑制量的粘蛋白分泌抑制性肽。所述肽由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。所述肽中的一或多个氨基酸可选被独立地化学修饰。
另一方面，提供了抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多的方法。所述方法包括给予哺乳动物粘蛋白抑制量的粘蛋白分泌抑制肽。所述肽由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。肽的N末端和C末端可选被独立地化学修饰，并且所述肽在以相同浓度施用时对哺乳动物具有高于MANS肽的粘蛋白抑制效果。
另一方面，提供了抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多的方法。所述方法包括给予哺乳动物粘蛋白抑制量的粘蛋白分泌抑制肽。所述肽由少于24个氨基酸组成并且具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列，和(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列。肽的N末端和C末端可选被独立地化学修饰，并且所述肽具有高于MANS肽的水溶性。
另一方面，提供这样的肽，其由少于24个氨基酸组成并且具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列由具有来自肽1中定义的参照氨基酸序列的4到23个连续氨基酸的氨基酸序列的变体组成。肽的N末端和C末端氨基酸可选独立地被化学修饰。所述肽在以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应，具有比MANS肽更高的水溶性，并且在以相等浓度施用哺乳动物时具有高于MANS的粘蛋白抑制效应。
本发明的肽可用于在疾病治疗和疾病症状的治疗中减少粘蛋白分泌和/或抑制(即减少到正常水平或低于正常水平)粘蛋白分泌过多，在所述疾病中显示粘蛋白分泌过多，诸如见于慢性疾病状态诸如哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和慢性支气管炎；见于遗传疾病诸如囊性纤维化；见于过敏性疾病(遗传性过敏症，过敏性炎症)；见于支气管扩张症；以及多种急性、感染性呼吸疾病诸如肺炎、鼻炎、流感以及普通感冒。
另一实施方案中，提供这样的肽，其由选自下组的序列组成：(a)氨基酸序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO.1)；和(b)与(a)中的序列基本相同的氨基酸序列；其中所述肽的N末端氨基酸序列不是肉豆蔻酰化的并且所述肽的C末端氨基酸可选被独立地化学修饰，所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。该肽用于治疗肺疾病中的粘液分泌过多。
优选实施方案的详细描述
本发明涉及用于各种用途的方法和组合物，包括抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多(即粘蛋白释放抑制)以及粘液产生(有时在本文称为粘液分泌抑制)。但是在更为详细地描述本发明之前，首先定义以下术语。
定义
“粘蛋白抑制效应”，“粘蛋白抑制活性”，或“抑制粘蛋白分泌”意指粘蛋白分泌(即粘蛋白释放)的量减少，并且不一定指粘蛋白分泌的完全停止。施用具有粘蛋白抑制效应的组合物与没有所述组物的情况下可能出现或预期出现的情况相比，前者导致粘蛋白分泌减少。一方面，粘蛋白分泌的量减少可为所分泌或分泌过多的粘蛋白超过正常水平的量的大约5％到大约100％。另一方面，粘蛋白分泌减少的量可为所分泌或分泌过多的粘蛋白超过正常水平的量的大约5％(即所分泌的粘蛋白超过正常水平的量的大约5％)到低于正常分泌水平的量，诸如以正常分泌水平分泌的量的大约50％。
“粘液抑制效应”，“粘液抑制活性”，或“抑制粘液产生”意指粘液产生的量减少，并且不一定指粘液产生的完全停止。施用具有粘液抑制效应的组合物与没有所述组物的情况下可能出现或预期出现的情况相比，前者导致粘液产生减少。
组合物的“粘蛋白抑制量”指与缺乏所述组合物的情况相比，降低或抑制粘蛋白分泌(即粘蛋白释放)的量，诸如使得粘蛋白分泌降低分泌过多的粘蛋白超过正常水平的量的大约5％到大约100％的量。
组合物的“粘液抑制量”是这样的量，其使得与没有所述组合物的情况相比降低或抑制粘液产生。
在参照肽GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO.1)中，在参照肽的N末端位置，G在位置1；相邻于位置1的G是位置2的A；相邻于位置2的A是位置3的Q；相邻于位置3的Q是位置4的F；相邻于位置4的F是位置5的S；相邻于位置5的S是位置6的K；相邻于位置6的K是位置7的T；相邻于位置7的T是位置8的A；相邻于位置8的A是位置9的A；相邻于位置9的A是位置10的K；相邻于位置10的K是位置11的G；相邻于位置11的G是位置12的E；相邻于位置12的E是位置13的A；相邻于位置13的A是位置14的A；相邻于位置14的A是位置15的A；相邻于位置15的A是位置16的E；相邻于位置16的E是位置17的R；相邻于位置17的R是位置18的P；相邻于位置18的P是位置19的G；相邻于位置19的G是位置20的E；相邻于位置20的E是位置21的A；相邻于位置21的A是位置22的A；相邻于位置22的A是位置23的V；以及相邻于位置23的V是位置24的A，其中位置24是参照肽的C-末端位置。
参照肽的“变体”或参照肽的4-23个氨基酸片段的变体是具有这样的氨基酸序列的肽，其与参照肽的氨基酸序列或参照肽的片段的氨基酸序列分别在参照肽或参照肽片段氨基酸序列中的至少一个氨基酸位置中不同，但是仍保持粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常是参照肽或片段的活性的0.1-10倍，优选是参照肽或片段的活性的0.2-6倍，更优选是参照肽或片段的活性的0.3-5倍。参照氨基酸序列的“变体”或参照氨基酸序列的4-23个氨基酸片段的变体是这样的氨基酸序列，其与参照氨基酸序列或参照氨基酸序列的片段有至少一个氨基酸不同，但具有这样的肽的氨基酸序列，其保持参照氨基酸序列编码的所述肽或片段的粘蛋白或粘液抑制活性，所述活性通常分别是参照序列的肽或片段的活性的0.1-10倍，优选分别是参照序列的肽或片段的活性的0.2-6倍，更优选分别是参照序列的肽或片段的活性的0.3-5倍。取代变体肽或取代变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸取代而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)；缺失变体肽或缺失变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸缺失而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)；添加变体肽或添加变体氨基酸序列通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸添加而与参照肽或参照氨基酸序列不同(即有差异)。变体肽或变体氨基酸序列可为参照序列中一或多个氨基酸的取代(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸取代)的结果，或者可为参照序列中一或多个氨基酸的缺失(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸缺失)的结果，或者可为参照序列中一或多个氨基酸的添加(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸添加)的结果，或其以任何顺序的组合。取代变体4-23个氨基酸肽片段或者取代变体4-23个氨基酸片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸取代而与参照4-23个氨基酸肽片段或参照4-23个氨基酸片段序列不同(即有差异)；缺失变体4-23个氨基酸肽片段或者4-22个氨基酸缺失变体氨基酸片段序列可通过参照氨基酸片段序列中的一或多个氨基酸缺失而与5-23个氨基酸的参照肽片段或5-23个氨基酸参照氨基酸片段序列不同(即有差异)；且4-23个氨基酸添加变体肽或者4-23个氨基酸添加变体氨基酸序列可通过参照氨基酸序列中的一或多个氨基酸添加而与4-22个氨基酸的参照肽序列或4-22个氨基酸的参照氨基酸序列不同(即有差异)。4-23氨基酸变体肽或4-23氨基酸变体氨基酸序列可为参照氨基酸序列的4-23个氨基酸的片段中一或多个氨基酸的取代(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸取代)的结果，或者可为相对较大的参照氨基酸序列中一或多个氨基酸的缺失(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸缺失)的结果，或者可为相对较小的参照氨基酸序列中一或多个氨基酸的添加(例如至少1，2，3，4，5，6，7或8个氨基酸)的结果，或其以任何顺序的组合。优选，变体肽或氨基酸序列与参照肽或参照肽的片段或参照氨基酸序列或参照氨基酸序列的片段通过以下变化而不同：少于10个氨基酸取代，缺失和/或添加；更优选少于8个氨基酸取代，缺失和/或添加；更优选少于6个氨基酸取代，缺失和/或添加；更优选少于5个氨基酸取代，缺失和/或添加；更优选少于4个氨基酸取代，缺失和/或添加。最优选所述变体氨基酸序列与参照序列或片段氨基酸序列通过1或2或3氨基酸而不同。
“序列相同性”意指，就两条多肽的氨基酸序列而言，具有相同氨基酸的位置的数目除以两条序列中较短一条中的氨基酸的数目。
“基本相同”意指，就两条肽的氨基酸序列的比较或两条肽片段的氨基酸序列(例如参照肽氨基酸序列的片段)的比较而言，肽或肽片段的氨基酸序列具有至少75％序列相同性，优选至少80％序列相同性，更优选至少90％序列相同性，最优选至少95％序列相同性。
术语“肽”包括肽及其可药用的盐。
本发明所用“分离的”肽意指天然存在的肽，其已经通过纯化、重组合成或化学合成而与天然伴随其的细胞组分(例如核酸和其他肽)分离或基本分离，并且也包括已经从细胞成分、生物物质、化学前体或其他化学物质纯化或基本纯化的非天然存在的重组或化学合成的肽。
以下三字母和单字母氨基酸简写在全文使用：丙氨酸：(Ala)A；精氨酸：(Arg)R；天冬酰胺：(Asn)N；天冬氨酸：(Asp)D；半胱氨酸：(Cys)C；谷氨酰胺：(GIn)Q；谷氨酸：(GIu)E；甘氨酸：(GIy)G；组氨酸：(His)H；异亮氨酸：(He)I；亮氨酸：(Leu)L；赖氨酸：(Lys)K；蛋氨酸：(Met)M；苯基丙氨酸：(Phe)F；脯氨酸：(Pro)P；丝氨酸：(Ser)S；苏氨酸：(Thr)T；色氨酸：(Trp)W；酪氨酸：(Tyr)Y；缬氨酸：(VaI)V。本发明所用其他氨基酸三字母符号包括，见括号中，(Hyp)指代羟脯氨酸，(NIe)指代正亮氨酸，(Om)指代鸟氨酸，(Pyr)指代焦谷氨酸和(Sar)指代肌氨酸。通常，肽的氨基(或N末端)出现在所示肽的氨基酸序列的左侧末端，羧基(或C-末端)出现在所示氨基酸序列的右侧末端。肽的氨基酸序列中可以用单字母符号代表氨基酸，所述氨基酸通过肽中的肽酰胺键共价相连。
表IX包含一系列以单字母简写形式显示的氨基酸序列，并且具有相应的肽编号和SEQ ID NO。参照肽氨基酸序列显示为肽1。具有参照序列的4-23个连续氨基酸的氨基酸序列的本发明的肽的氨基酸序列显示为肽2-231，含MANS肽的氨基酸序列的随机N末端序列(RNS)的氨基酸序列为肽232。本发明肽的氨基酸序列的代表性变体的氨基酸序列也显示为肽233-245以及247-251。所列变体肽并非意图为有限的一组肽，仅仅作为本发明变体肽的代表性实例。还显示了本发明肽的代表性反向氨基酸序列以及代表性随机氨基酸序列。表中的反向和随机氨基酸序列并非意图作为本发明的代表。
表IX中所列的肽的氨基酸序列可经化学方法修饰。例如，如果表IX中所列的肽的氨基酸序列在N末端胺进行化学修饰以便与羧酸形成酰胺化合物，产生的肽在本发明中有时表示为羧酸的标识符作为前缀通过连字符与肽编号相连的组合。例如，以肽79为例，N末端肉豆蔻酰化的肽79有时在本文称为“肉豆蔻酰化的肽79”或“myr-肽79”；N末端乙酰化的肽79有时在本文称为“乙酰基-肽79”或“Ac-肽79”。环化形式的肽79可称为“环形-肽79”或“cyc-肽79”。此外，例如如果表IX中所列肽的氨基酸序列在C末端羧基进行化学修饰，例如通过胺诸如氨以形成C末端酰胺，产生的肽有时在本文通过胺残基的标识符作为前缀通过连字符与肽编号相连的组合来表示。因此，例如，肽79的C末端酰胺有时称为″肽-NH2″。肽(例如肽79)的N末端胺通过例如肉豆蔻酰基进行化学修饰，并且C末端羧基通过例如氨基团进行化学修饰以形成上述的酰胺，利用前缀和后缀说明，产生的肽有时称为″myr-肽79-NH2″。
本发明涉及这样的肽，其具有包含少于24个氨基酸的氨基酸序列，并且其具有与MANS肽的氨基酸序列相关的氨基酸序列(例如MANS肽是肉豆蔻酰-肽1，MANS肽的参照24-氨基酸序列是肽1)。本发明的肽由含有少于24氨基酸的氨基酸序列组成，并且可由8-14，10-12，9-14，9-13，10-13，10-14，至少9，至少10个等氨基酸组成。所述肽通常为直链的，但是也可为环状的。此外，所述肽可为分离的肽。
对于肽1(参照24氨基酸序列)，参照氨基酸序列的23个连续氨基酸的片段有时在本文称为23-mer。类似地，参照序列的22个连续氨基酸的片段有时在本文称为22-mer；21个氨基酸的序列称为21-mer；20个氨基酸的序列称为20-mer；19个氨基酸的序列称为19-mer；18个氨基酸的序列称为18-mer；17个氨基酸的序列称为17-mer；16个氨基酸的序列称为16-mer；15个氨基酸的序列称为15-mer；14个氨基酸的序列称为14-mer；13个氨基酸的序列称为13-mer；12个氨基酸的序列称为12-mer；11个氨基酸的序列称为11-mer；10个氨基酸的序列称为10-mer；9个氨基酸的序列称为9-mer；8个氨基酸的序列称为8-mer；7个氨基酸的序列称为7-mer；6个氨基酸的序列称为6-mer；5个氨基酸的序列称为5-mer；和4个氨基酸的序列称为4-mer。一方面，这些“4到23-mer”氨基酸序列中的任何一种，其本身是肽(有时在本文记为H2N-肽-COOH)，可独立地被化学修饰，例如通过化学方法修饰，其中所述化学修饰可选自下组：(i)在N末端胺基(H2N-肽-)形成酰胺，诸如与例如C1或优选与C2(乙酸)-C22羧酸；(ii)在C末端胺基(-肽-COOH)形成酰胺，诸如与例如氨或与C1-C22伯胺或仲胺；以及(iii)其组合。
所述肽具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代变体、缺失变体、添加变体，及其组合。一些实施方案中，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，具有参照序列肽1的8-14个连续氨基酸；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代变体、缺失变体、添加变体，及其组合。另一实施方案中，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，具有参照序列肽1的10-12个连续氨基酸；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代变体、缺失变体、添加变体，及其组合。另一实施方案中，所述肽具有的氨基酸序列具有参照序列肽1的至少9，至少10，9-14，9-13，10-13，10-14，等个连续氨基酸；与其基本相同的氨基酸序列；或其变体，所述变体选自下组：取代变体、缺失变体、添加变体，及其组合。如下文进一步解释的那样，肽的一或多个氨基酸(例如N末端和/或C末端氨基酸)可选独立地进行化学修饰，一些实施方案中，肽的一或多个氨基酸序列可经过化学修饰，而其他实施方案中，肽的所有氨基酸都没有被修饰。一方面，优选的修饰可出现在肽或肽片段的N末端氨基酸的胺(H2N-)基团(其中胺基团如果存在肽序列内部而不是N末端位置则形成肽酰胺键)。另一方面中，优选的修饰可出现在所述肽或肽片段的C末端氨基酸的羧基(-COOH)基团(其中羧基基团如果存在肽序列内部而不是C末端位置则形成肽酰胺键)。另一方面中，优选的修饰可出现在N末端胺(H2N-)基以及C-末端羧酸(-COOH)基团。
一些实施方案中，肽的氨基酸序列从参照肽肽1的N末端氨基酸开始。例如，肽可具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸，其中氨基酸序列起始于参照序列的N末端氨基酸(即，肽2，肽4，肽7，肽11，肽16，肽22，肽29，肽37，肽46，肽56，肽67，肽79，肽92，肽106，肽121，肽137，肽154，肽172，肽191，或肽211)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。
另一实施方案中，肽的氨基酸序列从参照肽肽1的C末端氨基酸开始。例如，肽可具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸，其中氨基酸序列终止于参照序列的C末端氨基酸(即，肽3，肽6，肽10，肽15，肽21，肽28，肽36，肽45，肽55，肽66，肽78，肽91，肽105，肽120，肽136，肽153，肽171，肽190，肽210，或肽231)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。
另一实施方案中，肽的氨基酸序列不是从参照肽肽1的N末端氨基酸开始而是从参照序列肽1的位置2的氨基酸到位置21的氨基酸开始。例如，肽可具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸，其中所述氨基酸序列在参照序列的位置2到位置21之间的任何氨基酸开始。这些肽的长度可为4-23个连续氨基酸，并且可代表参照序列肽1中部的肽；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。这些肽公开于表IX。
本发明涉及肽氨基酸序列，其用于抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多，并且用于降低哺乳动物中的粘蛋白分泌过多，并且其可用于抑制粘蛋白分泌过多的方法中以及减少粘蛋白分泌过多的方法中，所述肽氨基酸序列包括分离的肽的氨基酸序列以及肽的氨基酸序列，其可选含有本发明N末端和/或C末端化学修饰的基团，所述肽氨基酸序列选自下组：23-mers(即，具有23个氨基酸序列的肽)：肽2；和肽3；22-mers(即，具有22个氨基酸序列的肽)：肽4；肽5；和肽6；21-mers(即，具有21个氨基酸的序列的肽)：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-mers(即，具有20个氨基酸的序列的肽)：肽11；肽12；肽13；肽14；和肽15；19-mers(即，具有19个氨基酸的序列的肽)：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18-mers(即，具有18个氨基酸的序列的肽)：肽22；肽23；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-mers(即，具有17个氨基酸的序列的肽)：肽29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-mers(即，具有16个氨基酸的序列的肽)：肽37；肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-mers(即，具有15个氨基酸的序列的肽)：肽46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；肽54；和肽55；14-mers(即，具有14个氨基酸的序列的肽)：肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；肽64；肽65；和肽66；13-mers(即，具有13个氨基酸的序列的肽)：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；肽75；肽76；肽77；和肽78；12-mers(即，具有12个氨基酸的序列的肽)：肽79；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；肽87；肽88；肽89；肽90；和肽91；11-mers(即，具有11个氨基酸的序列的肽)：肽92；肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；肽100；肽101；肽102；肽103；肽104；和肽105；10-mers(即，具有10个氨基酸的序列的肽)：肽106；肽107；肽108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；肽114；肽115；肽116；肽117；肽118；肽119；和肽120；9-mers(即，具有9个氨基酸的序列的肽)：肽121；肽122；肽123；肽124；肽125；肽126；肽127；肽128；肽129；肽130；肽131；肽132；肽133；肽134；肽135；和肽136；8-mers(即，具有8个氨基酸的序列的肽)：肽137；肽138；肽139；肽140；肽141；肽142；肽143；肽144；肽145；肽146；肽147；肽148；肽149；肽150；肽151；肽152；和肽153；7-mers(即，具有7个氨基酸的序列的肽)：肽154；肽155；肽156；肽157；肽158；肽159；肽160；肽161；肽162；肽163；肽164；肽165；肽166；肽167；肽168；肽169；肽170；和肽171；6-mers(即，具有6个氨基酸的序列的肽)：肽172；肽173；肽174；肽175；肽176；肽177；肽178；肽179；肽180；肽181；肽182；肽183；肽184；肽185；肽186；肽187；肽188；肽189；和肽190；5-mers(即，具有5个氨基酸的序列的肽)：肽191；肽192；肽193；肽194；肽195；肽196；肽197；肽198；肽199；肽200；肽201；肽202；肽203；肽204；肽205；肽206；肽207；肽208；肽209；和肽210；4-mers(即，具有4个氨基酸的序列的肽)：肽211；肽212；肽213；肽214；肽215；肽216；肽217；肽218；肽219；肽220；肽221；肽222；肽223；肽224；肽225；肽226；肽227；肽228；肽229；肽230；和肽231。
本发明分离的肽和N-末端和/或C-末端化学修饰的肽的优选的氨基酸序列选自下组：23-mers：肽2；和肽3；22-mers：肽4；肽5；和肽6；21-mers：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-mers：肽11；肽12；肽13；肽14；和肽15；19-mers：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18-mers：肽22；肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-mers：肽29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-mers：肽37；肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-mers：肽46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-mers：肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-mers：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；和肽75；12-mers：肽79；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽87；11-mers：肽92；肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和肽100；10-mers：肽106；肽107；肽108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；和肽114；9-mers：肽122；肽123；肽124；肽125；肽126；肽127；肽128；和肽129；8-mers：肽139；肽140；肽141；肽142；肽143；肽144；和肽145；7-mers：肽157；肽158；肽159；肽160；肽161；和肽162；6-mers：肽176；肽177；肽178；肽179；和肽180；5-mers：肽196；肽197；肽198；和肽199；和 4-mers：肽217；和肽219。
本发明分离的肽和N-末端和/或C-末端化学修饰的肽的更为优选的氨基酸序列选自下组：23-mers：肽2；和肽3；22-mers：肽4；肽5；和肽6；21-mers：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-mers：肽11；肽12；肽13；肽14；和肽15；19-mers：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18-mers：肽22；肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-mers：肽29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-mers：肽37；肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-mers：肽46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-mers：肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-mers：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽87；11-mers：肽92；肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和肽100；10-mers：肽106；肽108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；和肽114；9-mers：肽124；肽125；肽126；肽127；肽128；和肽129；8-mers：肽141；肽142；肽143；肽144；和肽145；7-mers：肽159；肽160；肽161；和肽162；6-mers：肽178；肽179；和肽180；5-mers：肽198；和肽199；和4-mer：肽219。
另一实施方案中，肽的氨基酸序列包括参照序列肽1的连续残基A，K，G， E，如肽219中那样。例如，肽具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸，其中肽的氨基酸序列如肽219中那样包括参照肽肽1的连续残基A，K，G，和E(例如，肽219，肽45，肽79，肽67，肽80，等)；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体。
含有参照肽氨基酸序列肽1的氨基酸序列AKGF的肽片段的实例包括(a)23-mers：肽2；和肽3；22-mers：肽4；肽5；和肽6；11-mers：肽7；肽8；肽9；和肽10；20-mers：肽11；肽12；肽13；肽14；和肽15；19-mers：肽16；肽17；肽18；肽19；肽20；和肽21；18-mers：肽22；肽23；肽24；肽25；肽26；肽27；和肽28；17-mers：肽29；肽30；肽31；肽32；肽33；肽34；肽35；和肽36；16-mers：肽37；肽38；肽39；肽40；肽41；肽42；肽43；肽44；和肽45；15-mers：肽46；肽47；肽48；肽49；肽50；肽51；肽52；肽53；和肽54；14-mers：肽56；肽57；肽58；肽59；肽60；肽61；肽62；肽63；和肽64；13-mers：肽67；肽68；肽69；肽70；肽71；肽72；肽73；肽74；和肽75；12-mers：肽79；肽80；肽81；肽82；肽83；肽84；肽85；肽86；和肽87；11-mers：肽93；肽94；肽95；肽96；肽97；肽98；肽99；和肽100；10-mers：肽108；肽109；肽110；肽111；肽112；肽113；和肽114；9-mers：肽124；肽125；肽126；肽127；肽128；和肽129；8-mers：肽141；肽142；肽143；肽144；和肽145；7-mers：肽159；肽160；肽161；和肽162；6-mers：肽178；肽179；和肽180；5-mers：肽198；和肽199；和4-mer：肽219，(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；和(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代变体，缺失变体，添加变体及其组合，其中所述片段包含4-23个连续氨基酸或由其组成。
另一实施方案中，优选肽序列具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的10-23个连续氨基酸；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；(c)(a)中定义的氨基酸序列的变体，所述变体选自下组：取代变体，缺失变体，添加变体及其组合，其中优选氨基酸序列包含：23-mer：肽2；22-mer：肽4；21-men肽7；20-mer：肽11；19-mer：肽16；18-mer：肽22；17-mer：肽29；16-mer：肽37；15-mer：肽46；14-mer：肽56；13-mer：肽67；12-mer：肽79；11-mer：肽92；和10-mer：肽106。
其他实施方案中，肽的氨基酸序列从参照序列肽1的N末端氨基酸开始，并包括参照序列肽1的连续残基A，K，G，和E，如在肽219中那样，而在其他实施方案中，肽的氨基酸序列在参照序列肽1的C末端终止，并包括参照序列肽1的连续残基A，K，G，和E，如在肽219中那样。
所述肽相对于参照氨基酸序列而言可包含一或多个氨基酸缺失，取代和/或添加。优选所述取代可为保守氨基酸取代，或所述取代可为非保守氨基酸取代。一些实施方案中，所述肽，包括具有的氨基酸序列与参照氨基酸序列基本相同或为其变体的肽，与参照氨基酸序列的相应连续氨基酸相比不具有缺失或添加，但可具有保守性或非保守性取代。本发明肽中对参照氨基酸序列进行的氨基酸取代包括但不限于以下取代：丙氨酸(A)可被赖氨酸(K)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，或异亮氨酸(I)取代；谷氨酸(E)可被天冬氨酸(D)取代；甘氨酸(G)可被脯氨酸(P)取代；赖氨酸(K)可被精氨酸(R)，谷氨酰胺(Q)，或天冬酰胺(N)取代；苯丙氨酸(F)可被亮氨酸(L)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I)，或丙氨酸(A)取代；脯氨酸(P)可被甘氨酸(G)取代；谷氨酰胺(Q)可被谷氨酸(E)或天冬酰胺(N)取代；精氨酸(R)可被赖氨酸(K)，谷氨酰胺(Q)，或天冬酰胺(N)取代；丝氨酸(S)可被苏氨酸取代；苏氨酸(T)可被丝氨酸(S)取代；缬氨酸(V)可被亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，蛋氨酸(M)，苯丙氨酸(F)，丙氨酸(A)，或正亮氨酸(NIe)取代。例如，可在本发明的肽中对参照氨基酸序列进行取代，包括丙氨酸(A)取代苯丙氨酸(F)(例如在参照氨基酸序列的氨基酸位置4)，谷氨酸(E)取代谷氨酰胺(Q)(例如在参照氨基酸序列的氨基酸位置3)，赖氨酸(K)取代丙氨酸(A)(例如在氨基酸位置2和/或8)，和/或丝氨酸(S)取代苏氨酸(T)(例如在参照氨基酸序列的氨基酸位置7)。
如果相对于参照序列而言本发明的肽(包含未经修饰的肽以及通过化学方法修饰的肽例如通过N末端和/或C末端修饰诸如通过酰胺形成修饰的肽)的氨基酸序列包含取代，优选所述肽的氨基酸序列与参照氨基酸序列具有至少80％序列相同性。具有5-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约80％—约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有10-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约90％—约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有20-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括一处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约95％—约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有10-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括两处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约80％—约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有16-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括两处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约87.5％—约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有20-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括两处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约90％—约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有15-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括三处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约80％—约87％序列相同性。具有20-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括三处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约85％—约87％序列相同性。具有20-23个氨基酸并且相对于参照氨基酸序列而言包括四处氨基酸取代的肽与参照氨基酸序列相比具有约80％—约83％(即，～82.6％)序列相同性。
本发明的肽中，对于参照序列(其为24-mer)的连续氨基酸序列，选自参照24氨基酸序列的连续23氨基酸序列(23-mer)中的一个氨基酸的取代提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽中同23-mer具有相同性的氨基酸片段具有95.65％(或～96％)序列相同性。类似地，所述23-mer中的2，3，4，和5个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有91.30％(或～91％)，86.96％(或～87％)，82.6 1％(或～～83％)，和78.27％(或～78％)序列相同性。类似地，所述22-mer中的1，2，3，4，和5个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有95.45％(或～95％)，90.91％(或～91％)，86.36％(或～86％)，81.82％(或～82％)，和77.27％(或～77％)序列相同性。类似地，所述21-mer中的1，2，3，4，和5个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有95.24％(～95％)，90.48(～91％)，85.71％(～86％)，80.95(～81％)，和76.19％(～76％)序列相同性。类似地，所述20-mer中的1，2，3，4，和5个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有95.00％(95％)，90.00％(90％)，85.00％(85％)，80.00％(80％)，和75.00％(75％)序列相同性。类似地，所述19-mer中的1，2，3，和4个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有94.74％(～95％)，89.47％(～89％)，84.21％(～84％)，和78.95％(～79％)序列相同性。类似地，所述18-mer中的1，2，3，和4个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有94.44％(～94％)，88.89％(～89％)，83.33％(～83％)，和77.78％(～78％)序列相同性。类似地，所述17-mer中的1，2，3，和4个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有94.12％(～94％)，88.23％(～88％)，82.35％(～82％)，和76.47％(～76％)序列相同性。类似地，所述16-mer中的1，2，3，和4个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有93.75％(～94％)，87.50％(～88％)，81.25％(～81％)，和75.00％(75％)序列相同性。类似地，所述15-mer中的1，2，和3个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有93.33％(～93％)，86.67％(～87％)，和80.00％(80％)序列相同性。类似地，所述14-mer中的1，2，和3个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有92.86％(～93％)，85.71％(～86％)，和78.57％(79％)序列相同性。类似地，所述13-mer中的1，2，和3个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有92.31％(～92％)，84.62％(～85％)，和76.92％(～77％)序列相同性。类似地，所述12-mer中的1，2，和3个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有91.67％(～92％)，83.33％(～83％)，和75.00％(75％)序列相同性。类似地，所述11-mer中的1和2个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有90.91％(～91％)和81.82％(～82％)序列相同性。
类似地，所述10-mer中的1和2个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有90.00％(90％)和80.00％(80％)序列相同性。类似地，所述9-mer中的1和2个氨基酸提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有88.89％(～89％)和77.78％(～78％)序列相同性。类似地，所述8-mer中的1和2个氨基酸的取代分别提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列与参照肽氨基酸序列具有87.50％(～88％)和75.00％(75％)序列相同性。类似地，所述7-mer，6-mer，5-mer，和4-mer中的1个氨基酸的取代提供具有这样的氨基酸序列的肽，所述氨基酸序列分别与参照肽氨基酸序列具有85.71％(～86％)，83.33％(～83.3％)，80.00％(80％)，和75.00％(75％)序列相同性。本发明优选的氨基酸序列与参照序列中的氨基酸序列具有超过80％序列相同性，更优选与参照序列中的氨基酸序列具有超过81％-96％序列相同性，更优选与参照序列中的氨基酸序列具有超过80％-96％序列相同性。优选的氨基酸序列可选在末端肽氨基基团与以下部分形成酰胺键而在N末端发生化学健合：C2-C22线性脂肪族羧酸部分，更优选C2-C16线性脂肪族羧酸部分，更优选C2或C16线性脂肪族羧酸部分，并且可选通过末端肽羧酸基团与胺形成酰胺键在C末端发生化学键合，所述胺诸如氨或伯胺或仲胺诸如C1-C16线性脂肪族伯胺。
肽79(12-mer)的取代变体的实例，包括例如肽238，其中肽79中位置3的Q被序列238中的E取代；肽233，其中肽79中位置2的A被肽233中的K取代；肽234，其中肽79中位置8的A被肽234中的K取代；肽235，其中肽79中位置2和8的A被肽235中的K取代；肽237，其中肽79中位置4的F被肽237中的A取代；肽239，其中肽79中位置10的K被肽239中的A取代；肽240，其中肽79中位置11的G被肽240中的A取代；和肽241，其中肽79中位置12的E被肽241中的A取代。
肽106(10-mer)的取代变体的实例，包括例如肽236，其中肽106中位置4的F被肽236中的A取代；肽242，其中肽106中位置1的G被肽242中的A取代；肽243，其中肽106中位置3的Q被肽243中的A取代；肽244，其中肽106中位置5的S被肽244中的A取代；肽245，其中肽106中位置6的K被肽235中的A取代；肽247，其中肽106中位置7的T被肽247中的A取代；肽248，其中肽106中位置10的K被肽248中的A取代；和肽249，其中肽106中位置16和10的K均被肽249中的A取代。
肽137(8-mer)的取代变体的实例，包括例如肽250，其中肽137中位置4的F被肽250中的A取代。
肽219(4-mer)的取代变体的实例包括例如，肽251，其中肽219中位置2的K被肽251中的A取代。
本文描述的取代变体肽可以为分离的肽的形式或者化学修饰的肽的形式，例如N末端酰胺诸如肉豆蔻酰基酰胺，乙酰基酰胺，等以及诸如例如C末端酰胺诸如与氨形成的酰胺，以及诸如N末端酰胺和C末端酰胺。
当与参照氨基酸序列相比在本发明的肽的氨基酸序列中包含缺失时，优选所述肽的氨基酸序列与参照氨基酸序列具有至少80％序列相同性。具有5-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有80％—大约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有10-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有90％—大约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有20-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括一个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有95％—大约96％(即，～95.7％)序列相同性。具有10-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括两个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有80％—大约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有16-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括两个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有87.5％—大约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有20-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括两个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有90％-大约92％(即，～91.3％)序列相同性。具有15-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括三个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有80％—大约87％序列相同性。具有20-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括三个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有85％—大约87％序列相同性。具有20-23个氨基酸并相对于参照肽而言包括四个氨基酸缺失的肽与参照氨基酸序列具有80％—大约83％(即，～82.6％)序列相同性。
如上所述，肽的一或多个氨基酸也可经过化学修饰。可利用本领域已知的任何方法对肽的氨基酸序列进行本领域已知的任何氨基酸修饰。
一些实施方案中，N末端和/或C末端氨基酸可被修饰。例如，肽的N末端氨基酸可在N末端氨基(H2N-)烷基化，酰胺化，或酰化，以及例如，肽的C末端氨基酸可在C末端羧基(-COOH)酰胺化或酯化。例如，N末端氨基可通过酰化进行修饰，以包括任何酰基或脂肪酰基以形成酰胺，包括乙酰基(即CH3-C(＝O)-或肉豆蔻酰基。一些实施方案，N末端氨基可经修饰以包含结构式为-C(O)R的酰基，其中R是具有1-15个碳原子线性或分支烷基，或可经过修饰以包含通式为-C(O)R1的酰基，其中R1是具有1-15个碳原子的线性烷基。肽的C末端氨基酸也可通过化学方法修饰。例如，C末端氨基酸的C末端羧基基团可通过化学方法修饰以包括氨基以取代羟基(即酰胺化的)。一些实施方案中，N末端和/或C末端氨基酸不被化学修饰。
所述肽可在N末端氨基酸的氨基基团酰化以与选自下组的酸形成N末端酰胺：
(i)C2-C24脂肪族(aliphatic)(饱和的或可选不饱和的)羧酸(例如，与乙酸、丙酸、丁酸、己酸，辛酸，癸酸、十二酸、十四酸(肉豆蔻酸)，十六酸、9-十六酸、十八酸、9-十八碳烯酸、11-十八碳烯酸、9，12-十八碳双烯酸，9，12，15-十八碳三烯酸，6，9，12-十八碳三烯酸，二十酸，9-二十碳烯酸，5，8，11，14-二-十碳四烯酸，5，8，11，14,17-二十碳五烯酸，二十二烷酸，13-二十二碳烯酸，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，二十四酸等形成N末端酰胺)；
(ii)三氟乙酸；
(iii)苯甲酸；和
(iv)C1-C24脂肪族烷基磺酸，其形成脂肪族烷基磺酰胺，其中磺酸的C1-C24脂肪族烷基碳链结构与上文所述的脂肪族烷基羧酸中的脂肪族烷基羧酸链的相似。例如，肽可利用表示为(C1-C23)-烷基-C(O)OH的羧酸基团通过脱水偶联酰化，其通过活化羧酸基团形成表示为(C1-C23)-烷基-C(O)-NH-肽的酰胺来进行。类似地，磺酰胺可通过使磺酸种类(表示为(C1-C23)-烷基-S(O2)-X，其中X为卤素或OCH3或其他相容的离去基团)与N末端氨基基团形成(C1-C23)-烷基-S(O2)-NH-肽所示的磺酰胺来形成。
作为另一实例，N末端氨基酸的N末端氨基基团可用C1-C24脂肪族烷基基团烷基化，所述脂肪族烷基基团的结构如上所述。烷基化可通过利用脂肪族烷基卤化物或脂肪族烷基磺酸酯(甲磺酸酯，甲苯磺酸酯，等来实现)，优选利用伯烷基卤化物或伯烷基磺酸酯。N末端氨基酸可在末端氨基修饰以包括任何酰基或脂肪族酰基脂肪酰基基团作为酰胺包括乙酰基团(即，-C(O)CH3)，肉豆蔻酰基团，丁酰基，己酰基，辛酰基，癸酰基，十二烷酰基，十四烷酰基，十六烷酰基，9-十六碳烯酰基，十八烷酰基，9-十八碳烯基，11-十八碳烯酰基，9，12-十八碳二烯酰基，9，12，15-十八碳三烯酰基，6，9，12-十八碳三烯酰基，二十烷酰基，9-二十碳烯酰基，5，8，11，14-二十碳四烯酰基，5，8，11，14，17-二十碳五烯酰基，二十二烷酰基，13-二十二碳烯酰基，4，7，10，13，16，19-二十二碳己烯酰基，二十四烷酰基，所述基团通过酰胺键与肽上的末端氨基基团共价相连。
本发明肽的C末端氨基酸的C末端羧酸也可被化学修饰。例如C末端氨基酸可通过本发明肽的C末端羧酸基团与胺的反应形成酰胺基团来修饰，所述酰胺诸如氨的酰胺；C1-C24脂肪族烷基胺的酰胺，优选线性脂肪族烷基胺的酰胺；羟基取代的C2-C24脂肪族烷基胺的酰胺；线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺；omega-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙基胺基团(也称为omega-甲氧基-PEG-alpha-胺基或omega-甲氧基-(聚乙烯乙二醇)胺基)的酰胺，其中n为0-10。肽的C末端氨基酸的C末端羧酸可为选自下组的酯的形式：C1-C24脂肪族烷基醇的酯，2-(omega-甲氧基-聚(乙烯氧)n)-乙醇基团的酯，其中n为0-10。
肽的C末端羧酸基团，其可表示通式肽-C(O)OH，也可通过转化成活性形式而得以酰胺化，所述活性形式诸如羧酸卤化物、羧酸酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺酯、五氟苯基(OPfp)酯，3-羟基-2，3-二氢-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt)酯，等，以促进与氨或伯或仲胺的反应，优选氨或伯胺，优选肽中的任何其他活性基团通过肽合成领域已知的合成化学相同保护基团来保护，尤其是肽固相合成的合成化学相容保护基团，诸如苯甲基酯，t-丁基酯，和苯基酯等。产生的肽酰胺可表示为通式肽-C(O)-NR3R4(胺在肽的C末端)，其中R3和R4独立选自以下物质组成的组：C1-C24烷基诸如甲基，乙基，丁基，异丁基，环丙甲基，己基，十二基，十四基，和如上所述的那些。
C末端氨基酸的C-末端羧基也可转化为羟基取代的C2-C24脂肪族烷基胺(羟基附着于胺的碳原子而不是胺的氮原子)的酰胺，诸如诸如2-羟基乙基胺，4-羟基丁基胺，和12-羟基十二基胺，等的酰胺。
C-末端羧酸也可转化为羟基-取代的C2-C24脂肪族烷基胺的酰胺，其中羟基基团可被酰化与上述C2-C24脂肪族羧酸形成酯。优选，在肽中，肽的C末端酰胺表示为通式肽-C(O)R5R6，R5是氢，R6选自下组：氢，C1-C24烷基，和羟基-取代的C2-C24烷基。
C末端氨基酸的C末端羧酸可转化为线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺的酰胺。所述酰胺可通过例如使线性C1-C24脂肪族醇与钾的氢化物在含有2-氯乙醇的二甘醇二甲醚中反应提供线性C1-C24脂肪族烷基乙醇，其可通过氧化成醛转化成胺，然后还原胺化成胺(例如利用氨)，或通过转化成烷基卤化物(例如利用亚硫酰氯化物)然后利用胺诸如氨进行处理。
C-末端氨基酸的C-末端羧酸也可转化成omega-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙胺，其中n为0-10，其可从相应的omega-甲氧基-聚(乙烯氧)n-乙醇制备，例如通过如上所述将醇转化为胺。
另一实施方案中，C末端羧基可转化为通式为肽-C(O)-NR7R8的酰胺，其中R7是氢，R8是线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，其中C1-C24脂肪族烷基部分如上所述并包括基团诸如甲氧乙基(即，CH3O-CH2-)，2-十二基氧乙基，等；或R7是氢R8是omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中聚(氧化乙烯)部分的n为0-10，诸如2-甲氧基乙基(即，CH3O-CH2CH2-)，omega-甲氧基乙氧基乙基(即，CH3O-CH2O-CH2CH2-)直到CH3O-(CH2CH2O)10-CH2-。
所述肽的C末端氨基酸的C-末端羧酸基团也可为C1-C24脂肪族烷基醇的酯的形式，醇的脂肪族烷基部分如上所述。肽的C末端氨基酸的C-末端羧酸基团也可为2-(omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基团的酯的形式，其中n为0-10，其可从2-甲氧基醇作为2-甲氧基脱氢乙酸钠(sodium 2-methoxyethanolate)的形式与化学计量组成所需量(stoichiometric amount)的环氧乙烯反应来制备，其中所述化学计量组成所需量有赖于n的大小。
肽中氨基酸的侧链也可被化学修饰。例如，苯丙氨酸或酪氨酸中苯基可被选自下组的取代基替代：
C1-C24脂肪族烷基(即，线性或分支的，和/或饱和的或不饱和的，和/或含有环状基团)诸如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，环丙基，2-甲基环丙基，环己基，辛基，癸基，十二基，十八基，二十基，二十二基，二十四基，9-十六碳烯基，9-十八碳烯基，11-十八碳烯基，9，12-十八碳二烯基，9，12，15-十八碳三烯基，9-二十碳烯基，5，8，11，14-二十碳四烯基，5，8，11，14,17-二十碳五烯基，13-二十二碳烯基，和4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯基；
在除外不饱和位置的至少一个碳原子上被羟基取代的C1-C24脂肪族烷基，所述羟基烷基的实例包括羟基甲基，羟基乙基，羟基十二基等；
羟基取代的C1-C24烷基，被C2-C24脂肪族羧基发生酯化，所述酸诸如乙酸，丁酸，已酸，辛酸，癸酸，十二酸，十四酸，十六酸，9-十六烯酸，十八酸，9-十八烯酸，11-十八烯酸，9，12-十八二烯酸，9，12，15-十八碳三烯酸，6，9，12-十八碳三烯酸，二十酸，9-二十烯酸，5，8，11，14-二十碳四烯酸，5，8，11，14,17-二十碳五烯酸，二十二酸，13-二十二碳烯酸，4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸，二十四酸，等，二羧酸诸如琥珀酸，或羟基酸诸如乳酸，其中酯取代基的碳原子的总数为3-25；
卤素诸如氟-，氯-，溴-，和碘-；硝基-；氨基-，诸如NH2，甲基氨基，二甲基氨基；三氟甲基-；羧基(-COOH)；
C1-C24烷氧基(诸如可通过酪氨酸的烷基化形成)诸如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙基氧基，丁氧基，异丁基氧基，环丙基，2-甲氧基环丙基，环己基，辛基氧基，癸基氧基，十二基氧基，十六基氧基，十八基氧基，二十基氧基，二十二基氧基，二十四基氧基，9-十六碳烯基氧基，9-十八碳烯基氧基，11-十八碳烯基氧基，9，12-十八碳二烯基氧基，9，12，15-十八碳三烯基氧基，6，9，12-十八碳三烯基氧基，9-二十碳烯基氧基，5，8，11，14-二十碳四烯基氧基，5，8，11，14，17-二十碳五烯基氧基，13-二十二碳烯基氧基，和4，7，10，13，16，19-二十二碳己烯基氧基；以及
C2-C24羟基烷氧基，诸如2-羟基乙基氧基及其与上述羧酸或三氟乙酸形成的酯。
丝氨酸羟基可被来自下组的取代基酯化：
C2-C24脂肪族羧酸基团，诸如上文所述那些；
三氟乙酸基团；和
苯甲酸基团。
赖氨酸中的epsilon氨基可通过化学方法修饰，例如通过与以下物质形成酰胺：C2-C24脂肪族羧酸基团(例如，通过胺与羧酸的化学活性形式反应，所述羧酸诸如酸的氯化物，酸酐，N羟基琥珀酰亚胺酯，五氟苯基(OPfp)酯，3-羟基-2，3-二氢-4-氧代-苯并-三嗪酮(ODhbt)酯，等)如上所述，或苯甲酸基团，或氨基酸基团。此外，赖氨酸中的epsilon氨基可通过用一或两个C1-C4脂肪族烷基烷化来进行化学修饰。
谷氨酸中的羧酸基团可通过与胺形成酰胺来修饰，所述胺诸如：氨；C1-C24伯脂肪族烷基胺(其烷基部分如上所述)，包括甲基胺，或者氨基酸的氨基基团。
谷氨酸中的羧酸基团可通过如上所述与C1-C24脂肪族羟基烷基基团形成酯来修饰，优选与C1-C24脂肪族烷基的伯醇形成的酯，所述醇诸如甲醇，乙醇，1-丙醇，n-十二醇等如上所述。
本发明的肽以粘蛋白和/或粘液抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应和/或粘液抑制效应。所述肽可具有(1)与等同浓度施用的MANS肽相比，在哺乳动物中的更高的粘蛋白抑制效应，(2)与等同浓度施用的MANS肽相比，在哺乳动物中的更高的粘液抑制效应，(3)具有高于MANS肽的更高的水溶性。
MARCKS肽和MANS肽分别包含肉豆蔻酰基团，其通过酰胺键在N末端氨基酸与胺相连。但是，如本发明所述，本发明的肽在肽序列的N末端氨基酸的肉豆蔻酰基团存在下没有粘蛋白分泌过多抑制活性。实际上，本发明不包含N末端化学修饰的肽被发现显示粘液分泌过多抑制活性。本发明包含利用除外肉豆蔻酰基的基团(诸如乙酰基)进行N末端化学修饰形成N末端酰胺的肽也被发现显示粘蛋白分泌过多抑制活性。实际上，MANS肽的N末端乙酰化形式(非肉豆蔻酰化的)可在本发明的方法中显示粘液分泌过多抑制活性。此外，本发明所述包含MANS肽氨基酸序列的肽的氨基酸序列及其变体在本发的方法中显示粘蛋白分泌过多抑制活性。
一方面，本发明提供抑制哺乳动物中的粘蛋白分泌过多的方法，所述方法包括施用哺乳动物粘蛋白分泌过多抑制量的粘蛋白分泌过多抑制肽，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：(a)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本互补的氨基酸序列；其中肽的N末端氨基酸不是肉豆蔻酰化的并且肽的C末端氨基酸可选独立地经化学修饰，并且在以粘液分泌过多抑制量施用哺乳动物时所述肽具有粘蛋白分泌过多抑制效应。一个实施方案中，该肽的N末端氨基酸优选是酰化的。另一实施方案中，所述肽显示至少一种下述性质：(a)以相同浓度施用哺乳动物时对于哺乳动物具有高于SEQ ID NO：1的粘蛋白分泌过多抑制效应，其中N末端氨基酸是肉豆蔻酰化的，或(b)在相同液体中、相同浓度下具有高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1的水溶性。
一些实施方案中，N末端氨基基团可被修饰以包括具有通式-C(O)R的酰基，其中R是线性或分支的烷基，具有1-15个碳原子，或可被修饰以包含通式-C(O)R1的酰基，其中R1是线性烷基，具有1-15个碳原子。肽的C末端氨基酸也可被化学修饰。例如C末端氨基酸的C末端羧基可被化学修饰以包含胺基取代羟基(即酰胺化)。一些实施方案中，N末端和/或C末端氨基酸不是化学修饰的。
一些实施方案中，所述肽在人支气管肺泡灌洗液(BALF)中具有高于在人血浆中的半寿期，并在人粘液(例如囊性纤维化患者的粘液)中的半寿期高于在人血浆中的半寿期。
所述肽可用于抑制哺乳动物中粘液分泌和/或粘液产生的方法中，治疗哺乳动物中粘蛋白和/或粘液的分泌过多的方法中，以及治疗导致哺乳动物中粘蛋白和/或粘液分泌过多的肺部疾病的方法中(诸如例如，哮喘，慢性支气管炎，COPD，和囊性纤维化)。适合通过所述肽治疗的疾病包括但不限于，炎性，病毒性，或细菌性气道疾病(例如，哮喘，慢性阻塞性肺疾病(COPD)，普通感冒，鼻炎，急性或慢性支气管炎，肺炎和犬窝咳)，过敏性疾病(例如，遗传性过敏症，过敏性炎症)，支气管扩张症，肺气肿，支气管哮喘，以及一些遗传疾病(例如囊性纤维化)。肽可是适宜地用于治疗以下文献描述的疾病和病症，以及用于下文描述的方法中：美国专利申请10/180,753(公开号U.S.2003/0013652)和09/256,154和国际公开PCT/USOO/05050(国际公开号WO00/50062)，其全文包含在此作为参考。
除了疾病相关性粘蛋白分泌过多，术语粘蛋白分泌过多也包括ATP诱导的粘蛋白分泌过多以及促分泌素诱导的粘蛋白分泌过多和刺激的粘蛋白分泌过多。
优选实施方案中，本发明提供粘蛋白分泌过多抑制肽，其氨基酸序列具有参照氨基酸序列肽1的4-23个连续氨基酸，其中粘蛋白分泌过多抑制肽选自：
(a)以下肽组成的组：肽2，肽3，肽4，肽5，肽6，肽7，肽8，肽9，肽10，肽11，肽12，肽13，肽14，肽15，肽16，肽17，肽18，肽19，肽20，肽21，肽22，肽23，肽24，肽25，肽26，肽27，肽28，肽29，肽30，肽31，肽32，肽33，肽34，肽35，肽36，肽37，肽38，肽39，肽40，肽41，肽42，肽43，肽44，肽45，肽46，肽47，肽48，肽49，肽50，肽51，肽52，肽53，肽54，肽56，肽57，肽58，肽59，肽60，肽61，肽62，肽63，肽64，肽67，肽68，肽69，肽70，肽71，肽72，肽73，肽74，肽75，肽79，肽80，肽81，肽82，肽83，肽84，肽85，肽86，肽87，肽92，肽93，肽94，肽95，肽96，肽97，肽98，肽99，肽100，肽106，肽107，肽108，肽109，肽110，肽111，肽112，肽113，肽114，肽122，肽123，肽124，肽125，肽126，肽127，肽128，肽129，肽139，肽140，肽141，肽142，肽143，肽144，肽145，肽157，肽158，肽159，肽160，肽161，肽162，肽176，肽177，肽178，肽179，肽180，肽196，肽197，肽198，肽199，肽217，和肽219，如本文所述；和，
(b)与(a)中定义的序列具有80％-96％的序列相同性的氨基酸序列；
其中粘蛋白分泌过多抑制肽的氨基酸序列的N末端氨基酸的胺通过酰胺键与选自肉豆蔻酸或乙酸的羧酸共价结合，并且
其中粘蛋白分泌过多抑制肽氨基酸序列的C末端氨基酸的羧基可选通过酰胺键与氨共价相连。
所述肽可局部或系统性施用(例如以包含本发明的肽和可药用载体的药物组合物的方式)，并且可施用哺乳动物身体的任何部分，包括但不限于，产生粘液和/或粘蛋白的身体的部分(例如优选呼吸道，鼻腔，口腔，气管，肺，胃肠道，眼，生殖道等)。所述肽可以多种方式施用，包括但不限于，局部施用，胃肠外施用，直肠施用，肺施用，经鼻施用，吸入，吹入，和口服。肺施用可通过利用，气溶胶化器，雾化器，干粉吸入器，计量剂量的吸入器等进行。
所述肽可作为适于任何药物有效施用途径的药物配制剂制备和施用。本发明的肽(或其药物配制剂)可以适合以以下方式施用的形式：口服施用(例如片剂，锭剂，硬或软胶囊，水性或油性悬液，乳液，可分散的粉末或颗粒，糖浆或酏剂)，局部应用(例如作为乳膏，油膏，凝胶和水性或油性溶液或悬浮液)，用于通过吸入施用(例如作为细粉末或液体气溶胶)，通过吹入施用(例如作为细粉末)，或用于经胃肠外施用(例如作为无菌水性或油性溶液，或经静脉、皮下、肌肉内剂型或作为栓剂用于直肠施用)。
所述肽可通过任何适合方法施用哺乳动物的气道，包括产生包含所述肽的气溶胶。这种气溶胶可为固体或液体，并且可为以水性为基础的。所述气溶胶的适宜大小颗粒可通过本领域已知的多种方法制备。所述气溶胶的颗粒通常大小小于50微米，优选约0.1-约10微米，更优选约1-约10微米，更优选约2-约7微米，优选约2-约7微米。
肽(或肽的药物配制剂)的经鼻施用可通过例如喷洒应用肽的水性溶液或悬液或通过应用诸如来自滴管或移液管肽的水性溶液或悬液的液滴或小液滴，例如以药物可接受的形式，优选无菌盐水(NaCl)溶液进行，所述溶液可选被缓冲。水性溶液的灭菌可通过例如对包含所述肽的含水溶液的无菌过滤，可选在药学可接受的添加物诸如防腐剂、抗氧化剂、缓冲盐、张力修饰剂等的存在下进行。包含所述肽的水性悬液的灭菌可通过以下方法实现，例如照射或者无菌过滤，其可用于在悬浮的物质的粒径小于0.2微米的情况下，例如包含胶束的悬液，脂质体诸如磷脂稳定化的脂质体，或类似的可通过0.2微米的滤纸的颗粒。本发明的肽的治疗有效量的水性溶液(例如等张盐水溶液或高张盐水溶液，以及可选不与肽发生化学反应的糖)可通过例如无菌过滤灭菌，作为含有治疗有效量的肽的等分试样置于无菌小瓶中，冻干以形成干粉末，封口，这优选在惰性环境或气体的存在下利用无菌塞子或帽子进行。使用之前，可加入足量的水重新水化干粉末形成等张溶液作为单剂量，其可作为气溶胶施用哺乳动物的气道。
施用哺乳动物的肽或其药物配制剂的量有赖于多种因素，包括但不限于，具体的肽，哺乳动物的类型，哺乳动物的疾病程度，哺乳动物的重量，哺乳动物的年龄。此外，希望在用肽治疗的哺乳动物中保持一定水平的粘蛋白分泌/粘液产生(例如正常或基础水平)。一个实施方案中，人是优选需要治疗的哺乳动物，施用的肽的量足以在以单或多剂量施用时抑制粘蛋白分泌过多。本发明的肽的单剂量可为0.1mg-约30mg/kg体重，优选约0.1mg-约15mg/kg体重，更优选约0.1mg-约7.5mg/kg体重。剂量的数目和治疗的持续时间有赖于受试者对治疗的反应。对单剂量的量，剂量的数目以及治疗持续时间的调节可通过护理人员根据症状及其严重性来确定。
一个实施方案中，分离的肽由少于24个氨基酸组成并具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸(或其他实施方案中，8-14个连续氨基酸或10-12个连续氨基酸)，其中氨基酸序列从参照序列的N末端氨基酸开始；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；(c)氨基酸序列，，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸(或其他实施方案中，8-14个连续氨基酸或10-12个连续氨基酸)，其中氨基酸序列在参照序列的C末端氨基酸结束；以及(d)基本上类似于(c)中定义的氨基酸序列的序列。N末端氨基酸的N末端氨基和/或C末端氨基酸的C末端羧基可选如下进行化学修饰：
(1)所述肽的N-末端氨基酸的N-末端胺基可选为选自下组的酰胺的形式：
C2-C24脂肪族羧酸的酰胺，
三氟乙酸的酰胺；
苯甲酸的酰胺；
C1-C24脂肪族烷基磺酸的酰胺；或
肽的N末端氨基酸的N-末端胺基可选被选自下组的基团烷基化：
C1-C24脂肪族烷基，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，
Omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，n为0-10；和
(2)所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酰胺的形式：
氨的酰胺，
C1-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
羟基-取代的C2-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺，以及
omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基胺基的酰胺，n为0-10；
或所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酯的形式：
C1-C24脂肪族烷基醇的酯，
2-(omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基的酯，n为0-10。
所述肽以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白释放抑制效应。所述肽在以相同浓度施用时对哺乳动物的粘蛋白抑制效应高于MANS肽和/或具有高于MANS肽的水溶性。
另一个实施方案中，分离的肽由少于24个氨基酸组成并具有这样的氨基酸序列，其为具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸(或其他实施方案中，8-14个连续氨基酸或10-12个连续氨基酸)的变体，其中氨基酸序列从参照序列的N末端氨基酸开始。N末端氨基酸的N末端氨基和/或C末端氨基酸的C末端羧基可选如下进行化学修饰：
(1)所述肽的N-末端氨基酸的N-末端胺基可选为选自下组的酰胺的形式：
C2-C24脂肪族羧酸的酰胺，
三氟乙酸的酰胺；
苯甲酸的酰胺；
C1-C24脂肪族烷基磺酸的酰胺；或
肽的N末端氨基酸的N-末端胺基可选被选自下组的基团烷基化：
C1-C24脂肪族烷基，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，
omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，n为0-10；和
(2)所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酰胺的形式：
氨的酰胺，
C1-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
羟基-取代的C2-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺，以及
omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基胺基的酰胺，n为0-10；
或所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酯的形式：
C1-C24脂肪族烷基醇的酯，
2-(omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基的酯，n为0-10。
所述肽以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应。所述肽在以相同浓度施用时对哺乳动物的粘蛋白抑制效应高于MANS肽和/或具有高于MANS肽的水溶性。
其他实施方案中，抑制哺乳动物中粘蛋白分泌过多的方法包括施用哺乳动物粘蛋白抑制量的分离的粘蛋白分泌抑制肽。所述分离的肽由少于24个氨基酸组成并具有选自下组的氨基酸序列：(a)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸(或其他实施方案中，8-14个连续氨基酸或10-12个连续氨基酸)，其中氨基酸序列从参照序列的N末端氨基酸开始；(b)与(a)中定义的氨基酸序列基本上相似的序列；(c)氨基酸序列，其具有参照序列肽1的4-23个连续氨基酸(或其他实施方案中，8-14个连续氨基酸或10-12个连续氨基酸)，其中氨基酸序列从参照序列的C末端氨基酸结束；以及(d)基本上类似于(c)中定义的氨基酸序列的序列。N末端氨基酸的N末端氨基和/或C末端氨基酸的C末端羧基可选如下进行化学修饰：
(1)所述肽的N-末端氨基酸的N-末端胺基可选为选自下组的酰胺的形式：
C2-C24脂肪族羧酸的酰胺，
三氟乙酸的酰胺；
苯甲酸的酰胺；
C1-C24脂肪族烷基磺酸的酰胺；或
肽的N末端氨基酸的N-末端胺基可选被选自下组的基团烷基化：
C1-C24脂肪族烷基，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，
omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，n为0-10；和
(2)所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酰胺的形式：
氨的酰胺，
C1-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
羟基-取代的C2-C24脂肪族烷基胺的酰胺，
线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基的酰胺，以及
omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基胺基的酰胺，n为0-10；
或所述肽的C-末端氨基酸的C-末端羧酸基团可选为选自下组的酯的形式：
C1-C24脂肪族烷基醇的酯，
2-(omega-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基的酯，n为0-10。
所述肽以粘蛋白抑制量施用哺乳动物时具有粘蛋白抑制效应。所述肽在以相同浓度施用时对哺乳动物的粘蛋白抑制效应高于MANS肽和/或具有高于MANS肽的水溶性。
本发明的肽可通过任何适宜方法制备，包括固相肽合成技术，诸如例如使用芴基甲氧基羰基(FMoc)化学法和适宜的肽合成仪诸如CS-Bio肽合成仪，或利用叔-丁氧基羰基(Boc)化学方法和适宜的肽合成仪诸如ABI430A肽合成仪。适合用于FMoc或Boc合成的被保护的氨基酸可购得，例如购自Calbiochem，a unit of EMD Biosciences，San Diego，CA。在固相肽合成中，所需肽的C末端羧基作为N-alpha-保护的氨基酸共价连接于聚合物支持物。N-alpha-氨基保护基随后被去除并且第二N-alpha-保护的氨基酸通过形成酰胺偶联于附着的氨基酸，所述酰胺与连接在树脂上的去保护的氨基酸N-alpha-胺相结合。这些步骤利用所需肽序列的各自的被保护的氨基酸重复，直到获得所需的序列。合成末，C末端氨基酸和聚合物支持物之间的连接被切割以释放所述肽。所述肽可被分离并通过HPLC纯化。有用HPLC纯化方法包括离子交换层析和反向层析。肽溶液可通过蒸发或冻干以提供固体形式的分离的肽。含有可氧化基团诸如蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的肽优选保持无氧环境中，并且配制并保存在溶液或悬液中时，用于无氧溶剂中。
活化的酯与树脂连接的肽的胺末端在合成过程中的偶联可利用如下物质实现：利用过量诸如4倍过量的氨基酸和苯并三唑-1-基-氧基-tris-二甲基氨基-膦六氟磷酸酯，以及诸如6倍过量的N，N-二异丙基乙基胺。得自Fmoc合成的肽可从树脂上利用三氟乙酸/thioamsole/三异丙基硅烷(triisopropylsilane)/甲醇(例如以比例90∶5∶2.5∶2.5，vol/vol/vol/vol)在20℃、4h来切割，得自Boc合成的那些通过用例如HF/anisole(9∶1，vol/vol)在4℃、1h来切割。
在Fmoc肽策略中，第一Fmoc氨基酸通过酸惰性接头附着于不溶支持树脂。Fmoc的去保护可通过用碱诸如哌啶处理氨基酸来实现。第二Fmoc氨基酸利用预活化的种类或原位活化来偶联(偶联反应可利用活化剂原位进行，所述活化剂是肽化学领域已知的，诸如DCC，HBTU，TBTU，BOP，BOP-Cl，等)。所需的肽合成之后，树脂连接的肽被去保护并例如通过利用弱酸诸如三氟乙酸(TFA)或TMSBr在存在净化剂诸如巯基化合物，苯酚和水的条件下进行酸性水解裂解从固相支持物解离。一方面，对侧链功能团进行去保护并从树脂切割之前，肽的末端胺基可利用羧酸(例如，脂肪族羧酸，三氟乙酸，苯甲酸等)处理，例如，用脂肪族羧酸种类诸如脂肪族羧酸的活化形式诸如五氟酯以类似于肽键形成的方式与羧酸形成酰胺或与脂肪族磺酸种类(诸如磺酰氯)在肽的N末端形成磺酰胺。可选，N-末端胺可被以下物质烷基化，例如，脂肪族烷化剂(例如，脂肪族甲磺酸酯或甲苯磺酸酯)，其通过相应的磺酰氯和碱诸如嘧啶与脂肪醇反应获得，所述醇可通过脂肪族羧酸的还原(例如通过锂铝氢化物(lithium aluminum hydride))获得。另一方面，相应的D氨基酸(例如达4个D氨基酸)与剩余物如L氨基酸可用于肽合成方法中以提供本发明的肽，其可选如上文所述进行化学修饰。另一方面，所需的肽氨基酸序列，例如通过固相合成，并且侧链保护基被选择为耐受酯切割步骤以从树脂释放肽的情况下，形成在肽C末端具有游离羧基的侧链保护的肽。C-末端羧酸可转化成活性酯(例如五氟苯基酯)并用胺诸如氨处理形成酰胺(表示为肽-C(O)-NH2)，或与上述脂肪族胺形成肽的脂肪族酰胺，任何剩余的保护基可被去除以提供所需的本发明的肽。此外，C末端羧酸酯可通过以下方法形成：C末端羧酸与脂肪醇通过脱氢偶联诸如通过使用碳化二亚胺试剂而形成。含有酸性功能基团的氨基酸诸如天冬氨酸和谷氨酸可以类似于上述方法的方式转化成酰胺和酯，并且赖氨酸中的epsilon胺基可如上文对于末端胺基所述的化学方法那样转化成酰胺和脂肪族胺。
可用于本发明的肽的FMoc固相合成的受保护的氨基酸的实例包括以下非限制性实例：N-alpha-Fmoc-L-丙氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-丙氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-甘氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-甘氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸g-2-苯基异丙基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸alpha-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚  己基(dioxocyclohexylidene))-3-甲基丁基]-氨基}苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸gamma-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基]-氨基}苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸alpha-烯丙基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸g-苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸alpha-t-丁基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸  gamma-t-丁基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酸  gamma-t-丁基酯五氟苯基酯；N-alpha，epsilon-二-Fmoc-L-赖氨酸五氟苯基酯；N-alpha，epsilon-二-Fmoc-L-赖氨酸；N-alpha-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基-N-epsilon-Fmoc-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-N-epsilon-t-丁氧基羰基(butoxycarbonyl)-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)-3-甲基丁基-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环己-1-亚基)乙基-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-2-氯-CBZ-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-4-甲基三苯甲游基-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-乙酰-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-苯甲基氧基羰基-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-t-Boc-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-t-Boc-L-赖氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-epsilon-三氟乙酰-L-赖氨酸；N-alpha-Fmoc-4-氯-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-4-氰基-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-4-氟-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-4-硝基-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-L-苯丙氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-N-alpha-甲基-L-苯丙氨酸；N-alpha-Fmoc-L-脯氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-gamma-(4，4′-二甲氧基二苯甲基)-L-谷氨酰胺；N-alpha-Fmoc-gamma-三苯甲游基-L-谷氨酰胺五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酰胺；N-alpha-Fmoc-L-谷氨酰胺五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-gamma-三苯甲游基-L-谷氨酰胺；N-alpha-Fmoc-NG-(4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰)-L-精氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺；N-alpha-Fmoc-NG-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃(dihydrobenzofuran)-5-磺酰-L-精氨酸；N-alpha-Fmoc-NG-2，2，5，7，8-五甲基chroman-6-磺酰-L-精氨酸；N-alpha-Fmoc-NG-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-精氨酸；N-alpha-Fmoc-N-4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰-L-精氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-NG-硝基-L-精氨酸；N-alpha-Fmoc-N-甲苯磺酰基-L-精氨酸；N-alpha-Fmoc-O-(2-乙酰氨-2-脱氧基-3，4，6-三-O-乙酰-alpha-D-吡喃半乳糖基)-L-丝氨酸；N-alpha-Fmoc-L-丝氨酸；N-alpha-Fmoc-O-苯甲基-L-磷酸丝氨酸；N-alpha-Fmoc-O-苯甲基-L-丝氨酸；N-alpha-Fmoc-O-t-丁基-L-丝氨酸；N-alpha-Fmoc-O-t-丁基-L-丝氨酸N-羟基琥珀酰亚胺(succinimide)；N-alpha-Fmoc-O-三苯甲游基-L-丝氨酸；N-alpha-Fmoc-L-苏氨酸；N-alpha-Fmoc-O-苯甲基-L-磷酸苏氨酸；N-alpha-Fmoc-O-苯甲基-L-苏氨酸；N-alpha-Fmoc-O-t-丁基-L-苏氨酸；N-alpha-Fmoc-O-三苯甲游基-L-苏氨酸；N-alpha-Fmoc-O-(2-乙酰胺-2-脱氧-3，4，6-三-O-乙酰-alpha-D-吡喃半乳糖基-L-苏氨酸；N-alpha-Fmoc-L-缬氨酸；N-alpha-Fmoc-L-缬氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-缬氨酸；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-缬氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-甲基-L-缬氨酸；N-alplia-Fmoc-O-(双-二甲基氨基-膦(phosphono))-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-2，6-二氯苯甲基-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-2-溴代-CBZ-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-2-氯代三苯甲游基-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-苯甲基-L-磷酸酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-甲基-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-磷酸-L-酪氨酸；N-alpha-Fmoc-O-t-丁基-L-酪氨酸-alpha-Fmoc-O-t-丁基-L-酪氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-1-金刚烷(adamantly)酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-2-金刚烷酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-2-苯基异丙基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-4-(N-[I-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基]-氨基}苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸alpha-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代环亚己基)-3-甲基丁基]-氨基}苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸alpha-烯丙基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-苯甲基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸alpha-t-丁基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-t-丁基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸beta-t-丁基酯五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸-beta-1-金刚烷酯五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬氨酸-beta-2-金刚烷酯五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-亮氨酸；N-alpha-Fmoc-L-亮氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-亮氨酸；N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苯甲基)-亮氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-甲基-L-亮氨酸；N-alpha-Fmoc-L-异亮氨酸；N-alpha-Fmoc-L-异亮氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-alpha-丁基-L-异亮氨酸；N-alpha-Fmoc-beta-2，4，6-三甲氧基苯甲基-L-天冬酰胺；N-alpha-Fmoc-beta-三苯甲游基-L-天冬酰胺五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-L-天冬酰胺；N-alpha-Fmoc-L-天冬酰胺五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-N-beta-(3，4，6-三-O-乙酰-2-(乙酰氨基)-脱氧-2-beta-吡喃葡萄糖基)-L-天冬酰胺；N-alpha-Fmoc-N-beta-三苯甲游基-L-天冬酰胺；N-alpha-Fmoc-N-im-甲基三苯甲游基-L-组氨酸；N-alpha-Fmoc-N-im-t-Boc-L-组氨酸环己基铵盐；N-alpha-Fmoc-N-im-甲苯磺酰基-L-组氨酸；N-alpha-Fmoc-N-im-三苯甲游基-L-组氨酸；N-alpha-Fmoc-S-乙酰胺基甲基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-乙酰胺基甲基-L-半胱氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-S-苯甲基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-p-甲氧基苯甲基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-p-甲氧基三苯甲游基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-t-丁基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-t-丁基-L-半胱氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-S-t-丁基硫代-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-t-丁基硫代-L-半胱氨酸五氟苯基酯；N-alpha-Fmoc-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸；N-alpha-Fmoc-S-三苯甲游基-L-半胱氨酸五氟苯基酯。这些和用于固相肽合成的其他氨基酸试剂可商购得，例如购自Calbiochem Corporation。脂肪族羧酸也可得自Sigma-Aldrich Chemical Company。
所述肽也可通过固相合成利用Boc策略制备，其中第一Boc氨基酸通过HF可切割接头连接于不溶支持树脂。通过去除Boc基团去保护可伴随用TFA处理BOC-氨基酸来实现。第二Boc氨基酸随后利用预活化的种类或原位活化偶联。合成所需的肽之后，对树脂结合的肽进行去保护，并通过利用强酸诸如HF，TFMSOTf，或TMSOTf.通过切割从固相支持物解离。可加入添加剂诸如巯基化合物添加入保护肽使其在切割过程中不发生任何碳化。以下保护基适合用于HF切割：Arg(Mts)；Cys(4-MeOBzl)；His(Z)；Arg(Tos)；GIu(OBzI)；Lys(Cl-Z)；Asp(OBzl)；Glu(OcHex)；Ser(Bzl)；Asp(OcHex)；His(Bom)；Thr(Bzl)；Cys(Acm)；His(Dnp)；Trp(CHO)；Cys(4-MeBzl)；His(Tos)；Tyr(Br-Z)；Asp(OtBu)；His(Trt)。以下保护基适合TFMSOTf切割：Arg(Mts)；His(Bom)；Met(O)；As[rho](OBzl)；His(Dnp))；Ser(Bzl)；Cys(Acm)；His(Tos)；Thr(Bzl)；Cys(4-MeBzl)；His(Z)；Trp(CHO)；GIu(OBzI)；Lys(Cl-Z)；Tyr(Br-Z)。以下保护基适合TMSOTf切割：Arg(Mts)；Glu(OcHex)；Trp(CHO)；Arg(Mbs)；His(Bom)；Trp(Mts)；Asp(OBzl)；Lys(Cl-Z)；Tyr(Br-Z)；Asp(OcHex)；Met(O)；Tyr(Bzl)；Cys(Acm)；Ser(Bzl)；Tyr(Cl-Bzl)；His(Bom)；Thr(Bzl)。氨基酸羧酸和胺的偶联形成肽酰胺键可通过在Boc策略利用以下物质进行：碳化二亚胺诸如二环己基碳化二亚胺(DCC)，二异丙基碳化二亚胺(DIC)，t-丁基丁基-和t-丁基乙基-碳化二亚胺；BOP；PyBroP；PyBOP；HBTU；TBTU；和HATU，所有这些试剂都需要碱来活化并通过形成对称酸酐来起作用。可选，可以使用羧酸-碳酸或羧酸-次磷酸混合酸酐试剂，其通过将异丁基-或异丙基-氯甲酸酯和取代的氯化次磷酸与N-alpha-保护的氨基酸，或N-羧基酸酐(NCA′s)或Leuchs′酸酐来制备。对于Fmoc化学方法，可根据上文所述的合成策略对N-末端胺和C-末端羧酸基进行化学修饰。
实施例
本发明将进一步通过以下实例说明，所述实例并非意图限制。这些实例提供得自对特定肽进行测定的结果，所述肽代表本发明公开的肽。分别位于所述肽的氨基酸序列左侧和右侧的N末端氨基酸的N末端氨基和/或C末端氨基酸的C末端羧基可被任意修饰，其通过用#标记受试肽来表示。表IX包含肽的关键氨基酸。Myr-和Ac-分别是肉豆蔻酰和乙酰的简写，其通过氨基键与各个肽氨基酸序列的N末端氨基酸共价相连；-NH2表示氨的酰胺，其共价连接于肽氨基酸序列的C末端。
实施例1A-哮喘小鼠模型中受试肽的相对效力
I.方案和方法
设计实验检查MANS肽和其他相关受试肽是否在体内抑制鼠气道中的粘蛋白分泌过多。用于这些研究中的卵清蛋白致敏的小鼠过敏性炎症和哮喘模型见于Singer et al.(2004)，见上文。作为阴性对照，含有N-末端肉豆蔻酰基以及与MANS的氨基酸相同但顺序不同(即随机N末端序列，RNS，肉豆蔻酰-肽232)的对照肽与推荐的活性肽一起进行实验。BP2小鼠，年龄6-8周，每周两次经皮下(twice at weeklyintervals)用1μg卵清蛋白免疫。致敏14天后，将动物暴露于气溶胶化的卵清蛋白，72小时后其导致杯状细胞明显增生。72小时的时间点之后，将促分泌素醋甲胆碱(60mM)利用Buxco system雾化器递送，提供细的气溶胶90秒钟。用促分泌素攻击之前15分钟，将50μL受试多肽，以三种不同浓度(10μM，100μM，或140μM)，通过气管内途经施用。RNS肽仅仅以高剂量水平(50μL140μM溶液)进行实验。MANS以及RNS肽在120mM乙酸钠，pH7中完全可溶(freelysoluable)。这些实验中所用的各种对照见下表I。每次实验以6只小鼠每点的方式进行，每组实验重复3次。为了检测品系间差异，在Balb/C小鼠中在相似方案中重复上述实验。刺激的和未刺激的粘蛋白分泌，在用120mM乙酸钠处理的小鼠中(数据未显示)与盐水对照相同。醋甲胆碱攻击之后，处死动物并对每组6只动物进行支气管肺泡灌洗(BAL)以分析分泌的粘蛋白。
表1表明实验的总体方案。
表I-受试肽存在下醋甲胆碱诱导的粘蛋白分泌过多的总体方 案
    受试组     #小鼠     处理     肽     促分泌素攻击
    盐水对照     6     无内毒素0.9％NaCl     无     是
    盐水对照     6     无内毒素0.9％NaCl     无     否
受试肽     6     无内毒素0.9％NaCl+140μM每种受试肽     每种受试肽     是是
受试肽     6     无内毒素0.9％NaCl+100μM每种受试肽     每种受试肽     是是
受试肽     6     无内毒素0.9％NaCl+100μM每种受试肽 每种受试肽 否
受试肽     6     无内毒素0.9％NaCl+10μM每种受试肽 每种受试肽     是是
受试肽     6     无内毒素0.9％NaCl+10μM每种受试肽     每种受试肽     否
    肽(阴性RNS对照)     6     无内毒素0.9％NaCl+140μM每种受试肽     RNS     是
II.分析BAL液体
通过断颈处死小鼠，并快速暴露气管，通过小的切口插入套管。收集0.5ml支气管肺泡灌洗(BAL)液然后用含有PMSF(5mM)，EDTA(5mM)和DTT(5mM)的3×1ml PBS处理。通过简单离心将BAL液分离成无细胞和含细胞级分，然后进行分析。通过ELISA法通过利用显示与小鼠粘蛋白反应的抗粘蛋白抗体分析无细胞上清中粘蛋白的存在。具体地，识别分泌型粘蛋白的碳水化合物部分的小鼠抗-MUC5AC抗体用于这些测定法中。从每份BAL样品产生的数据相对于Bradford测定法中测定的总蛋白标准化。粘蛋白含量表示为利用抗粘蛋白抗体获得的值减去用非免疫对照抗体获得的值。所有ELISA数据利用单向ANOVA进行统计学检验。P<0.05时实验数据被认为明显不同于对照。
下表II，III，IV， V和VI总结了各种肽对Balb/C和BP2小鼠中粘蛋白分泌的影响。如表II所示，在100μM的各种受试肽存在下，粘蛋白分泌是对照(即没有肽)的8％到56％。
表II-哮喘小鼠模型中的粘蛋白分泌(Balb/C小鼠中的实验)
  肽(肽#标识符)   ％对照   平均误差
  无肽   100   4.2
  MANS，myr-肽1   33.8   5.8
  RNS，myr-肽232   96   5.2
  myr-肽79   50   10.8
  myr-肽233   21   14.2
  myr-肽234   8   4.2
  myr-肽235   13   3.3
  肽79   10   3.3
  myr-肽234-NH2   27.8   1.6
  myr-肽106   33.6   5.8
  肽106   33.8   3.3
  myr-肽106-NH2   29.3   4.2
  myr-肽236-NH2   51   2.0
  myr-肽106   21.5   18.3
  myr-肽137   55   4.2
  myr-肽137-NH2   56   3.3
所有受试肽的浓度均为100μM。所有值相对于对照显著(p<0.001)除外myr-肽137(p<0.01)和RNS。
表III-哮喘小鼠模型中的粘蛋白分泌(Balb/C小鼠中的实验)
  肽(肽#标识符)   ％对照   平均误差
  无肽   100   8.1
  MANS，myr-肽1   40   11.8
  RNS，myr-肽232   81**   2.8
  myr-肽11   54   5.1
  myr-肽37   35**   11.8
  myr-肽79   48   10.3
  myr-肽15   38*   10.6
  myr-肽45   35**   10.3
  myr-肽91   68   14.7
  myr-肽153   50   7.3
所有受试肽的浓度均为100μM。
*＝值相对于对照显著(p<0.05)；**＝值相对于对照显著(p<0.01)。
表IV-哮喘小鼠模型中的粘蛋白分泌(Balb/C小鼠中的实验)
  肽(肽#标识符)   ％对照   平均误差
  无肽   100   5.3
MANS，myr-肽1(100μM)   29**   4.2
  RNS，myr-肽232(100μM)   108   8.5
  肽237(10μM)   67*+   8.5
  肽237(100μM)   8**   3.8
  myr-肽106(10μM)   74*+   10.6
  myr-肽106(100μM)   24**   9.6
  肽106(10μM)   64*   4.2
  肽106(100μM)   40**   9.6
  myr-肽106-NH2(10μM)   67*+   4.2
  myr-肽106-NH2(100μM)   17**   5.3
*＝值相对于对照显著(p<0.05)；**＝值相对于对照显著(p<0.01).+＝值相对于100μM处理显著(p<0.05)。
表V-哮喘小鼠模型中的粘蛋白分泌(BP2小鼠中的实验)
肽   30min   60min   120min
  对照   100   100   100
  MANS，myr-肽1   7   44   50
  RNS，myr-肽232   100   100   100
  Ae-肽106   21   72   70
  肽106   23   48   57
设计实验确定小鼠哮喘模型中受试肽的作用的持续时间。如方法1A中所述，用卵清蛋白免疫Balb/C小鼠。14天以后，用气溶胶化的卵清蛋白攻击动物。用促分泌素处理72小时后，通过气溶胶方法递送醋甲胆碱。受试肽(50L的100M溶液)通过气管内途径施用30min，60min，或120min，然后用醋甲胆碱攻击。处死动物并进行BAL分析分泌的粘蛋白。该实验的结果显示于表VI。
表VI-小鼠中受试肽的作用持续时间
(Balb/C小鼠中的实验)
(％对照)
肽   30min   60min   120min
  对照   100   100   100
  MANS，myr-肽1   7   44   50
  RNS，myr-肽232   100   100   100
  Ae-肽106   21   72   70
  肽106   23   48   57
可选小鼠实验模型和定量测定小鼠肺中粘蛋白的方法可用于评估本发明肽的活性。该方法描述于Evans et al (Am.J.Respir.Cell MoI.Biol.Vol.31，pp 382-394，2004)。简而言之，每周通过对Balb/c雌性小鼠(5-8周龄，每只20-25g)通过腹腔内注射(i.p.)100μL含有2.2mg明矾盐以及20μg卵清蛋白的生理盐水溶液来致敏、持续四周。最后一次腹腔内注射7天后，在30分钟中通过气溶胶施用溶于生理盐水中的卵清蛋白的2.5％溶液来攻击小鼠。利用AeroMist CA-209加压空气雾化器(compressed air nebulizer)(CIS-US，Inc.，Bedford，MA)产生所述气溶胶。
卵清蛋白攻击后3天，在2-3分钟中，将50μL受试肽以10μL的等分试样递送给小鼠的每个鼻孔。15分钟后，用气溶胶化的100mM ATP溶液在处理小鼠5分钟。20分钟后，小鼠通过ip注入克他命(ketamine)，甲苯噻嗪，和乙酰丙嗪的混合物来麻醉，用盐水通过右心室灌洗肺直到从肺组织中流出的血液变清。深度麻醉下，用20号钝头套管对动物进行气管切开，通过腹主动脉放血处死。固定剂(0.1M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛，pH 7.0)以压力10-15cm通过气管输入，原位固定肺30分钟，从胸腔取出并在4℃过夜固定。将肺包埋在石蜡中，切成6μm的切片。
为了对粘蛋白进行荧光标记，利用过碘酸荧光chiff(PAFS)染色法对组织进行染色。组织首先在1％过碘酸(10min)中染色，润洗，用吖啶黄素(acriflavine)荧光Schiff’s剂(0.5％吖啶黄素HCl wt/vol，1％焦亚硫酸钠(sodium metabisulfite)wt/vol，0.01 N HCl)处理20min，在双去离子H2O中润洗，并在酸性乙醇(0.1 N HCl包含在70％乙醇中)中润洗2×5min。在分级乙醇溶液中对切片进行脱水，允许其在黑暗中在空气中干燥。一旦干燥，PAFS-染色的切片用加拿大胶覆盖培养基(Canada balsam mounting medium)(50％加拿大胶树脂，50％丁基水杨酸盐；Fisher Chemicals)覆盖。
为定量粘蛋白，PAFS-染色的切片在40x倍物镜下进行检验。获取来自中轴(axial)支气管的10个视野的图像，利用MagnaFire 2.1(Optronics)控制照相机设置。PAFS显像通过利用双激发滤镜(500run和573nm峰)激发样品并利用双发射滤镜来观察样品，峰值531nm(绿)和628nm(红)。对于每个视野，首先仅仅利用相机上的红色获得通道在(590ms暴露)来产生图像。相同的图像随后利用相机上的红色和绿色通道获得(590ms红，450ms绿)。对于测量细胞学(morphometric)分析，粘蛋白染色的体积密度和荧光强度随后利用ImagePro Plus测定。气道上皮中的粘蛋白染色的体积密度通过立体测量学方法计算。简而言之，染色的表面积与上皮总表面积的比例除以边界长度指标(boundary length measurement)，其是总上皮表面积，基底膜长度，以及几何学常数4/π的积。结果，数据表示为细胞内粘蛋白含量每基底膜表面积。粘蛋白分泌表示为总上皮含量的分数。
实施例1B气溶胶化的Ac-肽106肽施用对具有杯状细胞发育不 良以及气道阻塞的小鼠模型中的粘蛋白分泌过多的影响
气溶胶化的Ac-肽106肽对哮喘小鼠模型中的粘蛋白分泌过多的效力在两个浓度测定。简而言之，5-8周龄的BALB/c小鼠如实施例1A所述用卵清蛋白每周免疫、持续3周。第28天，用气溶胶化的2.5％卵清蛋白生理盐水溶液攻击小鼠30分钟。卵清蛋白攻击之后3天，利用AeroMist CA-209雾化器，施用每组小鼠(n＝2)10mM和30mM的气溶胶化的Ac-肽106的等张溶液1小时。气溶胶颗粒的物质平均空气动力学直径为1.49um(范围0，4-4.7um)。根据Ac-肽106的这些浓度和该粒径，计算的Ac-肽106的肺沉积分别为0.38mg/kg体重和1.1mg/kg体重。
Ac-肽106施用之后立即通过气溶胶施用促分泌素腺苷酸三磷酸酯(ATP)(盐水中的浓度为100mM)5分钟。处死小鼠，20分钟之内收获肺。在盐水中润洗肺，用多聚甲醛固定，包埋于石蜡中，并切片。定量分析切片中粘蛋白的存在，其通过定量免疫组织化学方法根据Evans et al.(Am.J.Respir.Cell MoI.Biol.Vol.31，pp 382-394，2004)所述进行。结果显示Ac-肽106在浓度0.38和1.1mg/kg体重分别有效抑制ATP诱导的粘蛋白分泌过多30-67％。
实施例2在0.5生理盐水中评估受试肽的定量溶解性
各种受试肽(1-5mg每种)在单个2mL螺纹带帽玻璃瓶中精确称重，将25μL 0.5N盐水，pH6.5的等分试样在25℃、环境压力下加入。溶解性通过目测评估。如果受试肽完全溶解在第一盐水等分式样中，计算其溶解性并认为超过计算的量。因此，如果3.5mg受试肽立即溶于0.5N盐水的第一个25μL等分试样时，其溶解度被认为>140mg/mL。类似地，如果1.7mg受试肽不能溶于1.7mL的0.5N盐水中时，其溶解度被认为<1.0mg/mL。各种受试多肽的溶解性的评估结果显示于表VII。
半生理盐水(half-normal saline)中的各种肽的溶解度也可通过以下两种半-定量方法方法1和方法2之一测定。方法1可用于其在半生理盐水中的溶解性将低于约10mg/mL的多肽，而方法2可用于将以超过约30mg/mL溶解于半生理盐水中的肽。
方法1
每种肽以浓度1mg/mL溶于二甲基亚砜(DMSO)。该溶液的等分试样用半生理盐水稀释5倍提供0.2mg/mL溶液。利用C 18/5微米柱对后一种肽溶液进行HPLC分析。洗脱缓冲液包含0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(缓冲液A)和0.1％TFA的100％乙腈溶液(缓冲液B)。所述肽在约20分钟之中用5％B-45％B的梯度洗脱。每个肽峰的曲线下面积(AUC)可由此测定。该AUC值可用作标准值(AUC-Std)以测定饱和溶液上清中每种相应肽的浓度。
每种肽的饱和溶液可通过加入足量的肽到1mL半生理盐水中直到获得云雾状悬液来制备。后者随后在10,000xg离心10分钟。随后对上清进行HPLC分析。如需要，HPLC分析之前进一步用半生理盐水稀释上清。从该分析获得的AUC(AUC-Sat)用于通过以下公式确定饱和溶液中肽的浓度：
溶液中肽的浓度＝AUC-Stdx0.2/AUC-Sat.
方法2
该方法可提供半正常盐水中的肽溶解性的估计。所述方法包括加入加权量(记为“xx”毫克)的肽溶解于1mL半生理盐水中的量。结果表示为>xx mg/mL，其中xx是加入半生理盐水中肽的量。
表VII-20度在0.5N盐水、pH6.5中的肽溶解度
序列   0.5N盐水中的溶解度(mg/mL)
  myr-肽1   <5.0
  Ac-肽1   >125
  myr-肽232   >15
  myr-肽11   >2.0
  myr-肽37   >2.0
  myr-肽79   >2.0
  myr-肽238   >2.0
  myr-肽233   >3.0
  myr-肽234   >3.0
  myr-肽235   >60
  肽79   >60
  myr-肽79-NH2   <1.0
  myr-肽237   <1.0
  myr-肽237-NH2   <1.0
  肽237   >80
  myr-肽234-NH2   <2.0
  Ac-肽79-NH2   >60
  Ac-肽79   >100
  Ac-肽239   >50
  Ac-肽240   N/A
  Ac-肽241   >50
  myr-肽106   >10
  肽106   >70
  myr-肽106-NH2   <10
  myr-肽236   <10
  myr-肽236-NH2   <10
  肽106-NH2   >100
  AC-肽106   >100
  环肽106   >150
  Ac-肽242   >100
  Ac-肽243   >50
  Ac-肽236   >80
  Ac-肽244   >120
  Ac-肽245   >100
  Ac-肽247   >100
  Ac-肽248   >100
  Ac-肽249   <1
  myr-肽121   <1.0
  Ac-肽121   >20
  myr-肽137   <1.0
  myr-肽137-NH2   N/A
  Ac-肽250   N/A
  Ac-肽137   >200
  myr-肽15   >80
  myr-肽45   >80
  myr-肽91   <20
  myr-肽153   <10
  myr-肽143   <1.0
  Ac-肽143   >230
  myr-肽179   <1.0
  Ac-肽179   >150
  myr-肽219   <1.0
  Ac-肽219   >200
  Ac-肽219-NH2   >200
  Ac-肽251   >200
  Ac-肽93-NH2   >90
  Ac-肽108-NH2   >150
  Ac-肽124-NH2   >100
  Ac-肽141-NH2   >200
  Ac-肽159-NH2   >200
  Ac-肽246   <30
  Ac-肽252   <30
实施例3-生物液体中受试肽的稳定性
对人血浆，人BALF，以及CF患者粘液中的各种受试肽进行分析确定受试肽对生物液体中蛋白裂解的易感性。此外，对显示浓度衰减的样品进行一级动力学分析以测定受试肽的半寿期。在接受的同一天分析该样品或保存在-20℃并在随后的2天之内分析。
1.生物液体的收集和处理
A.人血浆
新鲜人血样品收集在柠檬酸盐缓冲的vacuutrainers中(不含EDTA或肝素)。红细胞(RBC)通过在4℃对血液在4000xg离心10min去除。血浆等分试样(0.9mL)随后与0.1mL的0.5mg/mL受试肽溶液在75mM乙酸钠缓冲液、pH7.0中混合(spike)，并保温在水浴中保持在37℃。一式两份的10uL等分试样在5，15，30，60和180分钟间隔取出，并且立刻用990uL下述溶液“冷淬(quench)”，所述溶液包含含有0.2％蚁酸的50％乙腈+50％水。随后对样品进行液相层析质谱(LCMS)分析。
B.人BAL液体：
获得收集自COPD患者的BALF样品并冷冻。解冻BALF样品，混合在一起并在4-8℃、10,000xg离心10min。上清(0.9mL)与0.1mL的0.5mg/mL肽溶液在75mM乙酸钠缓冲液、pH 7.0中混合，并如上所述进行加工和分析。
C.人CF粘液：
来自CF患者的冷冻粘液(痰)被解冻，与2体积的75mM乙酸钠缓冲液，pH 7借助于玻璃组织研磨器混合，在4-8℃、10,000xg离心10min。将沉淀重悬于1体积乙酸盐缓冲液中并离心。组合两种上清并如下使用。上清(450μL)与50μL0.5mg/mL肽溶液在75mM乙酸钠缓冲液、pH 7.0中混合，并如上所述进行加工和分析。
II.浓度分析
所有样品利用LC/MS/MS(MDS/SCIEX，API 4000Model)分析。利用Phenomenex Luna C18柱进行，而利用阳离子电喷离子化进行质谱分析。
A.分析人血浆和BALF中的肽Ac-肽79-NH2，肽106-NH2.Ac- 肽106以及分析人血浆和人CF粘液中的肽mvr-肽106，肽106，肽 106-NH2，Ac-肽106和cvc-肽106 (环状肽)
在人的粘液中对于每种肽，在浓度0.100μg/mL，1.00μg/mL，10.0μg/mL，和100μg/mL，通过LCMS分析校准标准物，但除外myr-肽106，肽106，肽106-NH2，肽106，和环肽，cyc-肽106，它们在浓度0.100μg/mL，1.00μg/mL，10.0μg/mL，和75μg/mL进行分析。标准物在1％人BALF，血浆或粘液中在含有0.2％蚁酸的50/50水/乙腈混合物中制备。对于每组标准物，仪器反应值利用1/(浓度)2线性最小二乘直线(least-squares line)拟合。样品浓度利用该直线的斜率和截距计算。校准范围之外的浓度通过外推校准曲线测定。
B.分析人血浆和BALF中的肽myr-肽，234-NH2-mvr-肽234， 肽106和myr-肽106
对于每种肽，在浓度50μg/mL分析一式两份的校准标准物。对于每组标准物，仪器反应曲线使用没有加权的线性最小二乘直线通过截距0来拟合。样品浓度利用该线的斜率和截距计算。
C.分析人血浆和BALF中的肽：肽237，mvr-肽106-NH2，myr- 肽236和myr-肽236-NH 2
为了分析血浆中的肽浓度，对于每种肽，在浓度25μg/mL和50μg/mL分析一式两份的校准标准物。对于每组标准物，仪器反应曲线使用没有加权的线性最小二乘直线通过截距0来拟合。样品浓度利用该直线的斜率和截距计算。校准范围之外的浓度通过外推校准曲线来测定。
为了分析BALF样品中的肽浓度，在BALF，水，乙腈，和蚁酸的混合物中制备的一份50μg/mL校准标准物针对每个样品组进行分析。
III.动力学图谱
对于所有显示浓度中明显的衰减的样品，一级动力学图谱通过利用软件程序Watson测定。Watson拟合log转化的数据与最小二乘直线，从而测定参数诸如Cmax(最大浓度)，截距，速率常数，斜率和Tm(半寿期)。所得动力学参数基于线性拟合，而不是实际的浓度值。
溶液中的0时间校准标准物不包括作为动力学图谱的一部分。然而，真正的一级动力学不需要包括零时间数据点来准确描述浓度作为时间的函数的改变。
人血浆，人BALF(BALF t1/2)，和人CF粘液(粘液t1/2)中受试肽的半寿期(t1/2)示于表VIII。
表VIII
肽标识符   血浆t1/2(小时)(1stexp.)   血浆t1/2(小时)(2ndexp.)   BALFt1/2(小时)(1stexp.)   BALFt1/2(小时)(2ndexp.)   粘液t1/2(小时)(1stexp.)   粘液t1/2(小时)(2ndexp.)
  myr-肽234-NH2   3.82   --   1.70   --   --   --
  myr-肽234   *   --   1.08   --   --   --
  肽106   0.28   0.15   1.88   --   0.23   0.37
  myr-肽106   1.23   0.90   1.03   --   9.53   3.00
  肽237   0.49   --   *   *   --   --
  myr-肽106-NH2   *   --   10.52   12.81   --   --
  myr-肽236   0.72   --   3.55   2.94   --   --
  myr-肽236-NH2   *   --   4.16   4.08   --   --
  Ac-肽79-NH2   2.64   --   *   --   --   --
  肽106-NH2   0.30   0.13   4.00   --   0.08   0.13
  Ac-肽106   *   0.03   1.89   --   0.55   0.47
  环肽106   --   1.04   --   --   1.10   2.00
#：myr和Ac分别是肉豆蔻酰基和乙酰基，共价结合于N末端胺位点；  -NH2是共价结合于肽C末端羧基的酰胺；seq no.和cyc分别是序列编号和环的简写。
-：实验未进行
*：没有从实验获得足够数据以计算半寿期
所述肽，myr-肽236，是肉豆蔻酰基-肽236。所有其他用于实验的肽如上所述。
实施例4-MANS肽对灵长类上呼吸道中的粘液分泌的效力
本实验的目的是测定MANS肽抑制健康成年恒河猴上呼吸道中粘液分泌的能力。所述实验用于标准方法中评估鼻分泌活性，以及非人灵长类通常与人中的活性较好地相关。
方法
总共17只没有鼻炎病史的健康年轻成年雄性恒河猴用于实验。没有猴子在实验前后患有鼻炎。在任何处理前，在每只猴的左鼻孔中测定鼻粘液。该值被认为是100％粘液分泌。猴子随后随机分成以下四组：
组1：正常盐水，对照(n＝3)；
组2：乙酸钠，溶剂对照(n＝4)；
组3：RNS肽，阴性对照(n＝5)；和
组4：MANS肽，受试肽(n＝5)。
在任何处理前，将盐水置于所有17只动物的左鼻孔中。右鼻孔用2.0mL盐水，乙酸钠，RNS肽或MANS肽处理。因此，每只动物具有其内部对照。在用受试物质处理后，对每只动物的两个鼻孔进行鼻灌洗。所有灌洗物在-80℃立刻冷冻用于通过ELISA分析粘液含量。
A.受试物品：
生理盐水，无菌过滤；乙酸钠，150μM，无菌过滤3.RNS肽-140μM溶液，在150μM过滤灭菌的乙酸钠中，和MANS肽-140μM溶液，在150μM过滤灭菌的乙酸钠中
B.受试动物
恒河猴；动物数目17；性别：所有均为健康雄性，年龄3-4岁，体重4-7Kg，平均5.03 Kg.；环境适应期：7天；鉴定方法：独特的纹身加5数字ID编号。病史：受试前12-24个月，所有动物用于疫苗研究，针对脑膜炎免疫。所有动物在其婴儿期也接受常规抗麻疹以及破伤风免疫。
C.动物管理：
饲养：条件与标准操作规程中的一致，其基于″Guide for the Careand Use ofLaboratory Animals″。食物：标准恒河猴饮食，每天提供。水：随意获取，从自动饮水系统获得市政用水。居住：动物独立圈养在认可的不锈钢笼子中，通过表示动物编号，受试码，性别，动物码的卡片区分。环境：室温每天监测。房间温度范围20-26℃。房间湿度范围，每天调节，为40-70％。光循环利用自动定时器(12小时光，12小时黑暗)控制。人员：助手接受关于灵长类知识的适当培训。
结果
结果提供数据，RNS肽，乙酸钠缓冲液或生理盐水对于粘液分泌没有影响，而粘液分泌的几乎75％受到MANS肽抑制。
实施例5-测定人支气管上皮细胞中分泌的粘蛋白的组织培养 方法
HBE1是乳头瘤病毒转化的人支气管上皮细胞系，在空气/液体界面中培养时能分泌粘蛋白。HBE1细胞培养在空气/液体界面中，如前所述(Li et al，J.Biol.Chem.，volume 276，pp 40982-40990，2001)。简而言之，HBE1细胞培养在空气/液体界面中，通过将适当量的细胞接种到12孔跨孔透明培养插入物(Costar，Cambridge，MA)中进行，所述插入物表面包被一薄层大鼠尾胶原蛋白I型(Collaborative Biomedical，Bedford，MA)。在湿化的95％空气，5％CO2环境下，细胞首先浸没培养在培养基中5-7天直到几乎满底。那时，空气/液体界面通过去除表层培养基并从基底外侧喂养细胞来产生。培养基以后每天更换。细胞再培养14天允许完全分化。在细胞上表面累积的粘蛋白通过用磷酸盐缓冲的盐水pH7.2洗涤来去除。为了收集基线粘蛋白分泌，将细胞与单独的培养基保温30分钟，收集上方培养基中分泌的粘蛋白，通过ELISA定量。为测定粘蛋白促分泌素诱导的粘蛋白分泌过多，将细胞暴露于含有0.5μM佛波醇豆蔻酸乙酸酯(PMA)的培养基中30分钟，收集粘蛋白并通过ELISA定量。为了测定受试肽对PMA诱导的粘蛋白分泌过多的抑制，将细胞与含有25或50μM受试肽的培养基预保温15分钟，然后与0.5μM PMA保温30分钟。每种受试肽和每种对照使用6个孔。收集在上方培养基中分泌的粘蛋白，通过夹心ELISA方法利用碱性磷酸酶-偶联的粘蛋白(MUC5A)特异性抗体(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)定量。
用0.5μM PMA处理HBE1细胞导致粘蛋白分泌增加20％。PMA诱导的这种粘蛋白分泌增加通过用25μM MANS肽或用25μM Ac-肽no：106预处理而100％阻断。Ac-肽no：219在浓度25μM不100％抑制PMA诱导的粘蛋白分泌，但是也抑制粘蛋白分泌到低于未经刺激的培养基对照的20％的水平。Ac-肽no：251对PMA诱导的粘蛋白分泌增加的抑制效应最小，为6％。
表IX含有本发明的肽列表以及其各自的氨基酸序列和相应的SEQ ID NOS。
表IX肽和氨基酸序列
  肽No.   序列   序列ID No.
  肽1   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.1
  肽2    GAQFSKTAAKGEAAAEFPGEAAV    SEQ ID NO，2
  肽3   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.3
  肽4   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.4
  肽5   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV   SEQIDNO.5
  肽6   QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.6
  肽7   GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.7
  肽8   AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.8
  肽9   QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.9
  肽10   FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.10
  肽11   GAQFSKTAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO.11
  肽12   AQFSKTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.12
  肽13   QFSKTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.13
  肽14   FSKTAAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.14
  肽15   SKTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.15
  肽16   GAQFSKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO.16
  肽17   AQFSKTAAKG EAAAERPGE   SEQ ID NO.17
  肽18   QFSKTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.18
  肽19   FSKTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.19
  肽20   SKTAAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.20
  肽21   KTAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.21
  肽22   GAQFSKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO.22
  肽23   AQFSKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO.23
  肽24   QFSKTAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO.24
  肽25   FSKTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.25
  肽26   SKTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.26
  肽27   KTAAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.27
  肽28   TAAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.28
  肽29   GAQFSKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO.29
  肽30   AQFSKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO.30
  肽31   QFSKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO.31
  肽32   FSKTAAKGEAAAERPG E   SEQ ID NO.32
  肽33   SKTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.33
  肽34   KTAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.34
  肽35   TAAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.35
  肽36   AAKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.36
  肽37   GAQFSKTAAKGEAAAE   SEQ ID NO.37
  肽38   AQFSKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO.38
  肽39   QFSKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO.39
  肽40   FSKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO.40
  肽41   SKTAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO.41
  肽42   KTAAKGEAAAERPGEA   SEQ ID NO.42
  肽43   TAAKGEAAAERPGEAA   SEQ ID NO.43
  肽44   AAKGEAAAERPGEAAV   SEQ ID NO.44
  肽45   AKGEAAAERPGEAAVA   SEQ ID NO.45
  肽46   GAQFSKTAAKGEAAA   SEQ ID NO.46
  肽47   AQFSKTAAKGEAAAE   SEQIDNO.47
  肽48   QFSKTAAKGEAAAER   SEQ ID NO.48
  肽49   FSKTAAKGEAAAERP   SEQ ID NO.49
  肽50   SKTAAKGEAAAERPG   SEQ ID NO.50
  肽51   KTAAKGEAAAERPGE   SEQ ID NO.51
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  肽155   AQFSKTA   SEQ IDNO.155
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  肽161   AAKGEAA   SEQIDNO.161
  肽162   AKGEAAA   SEQIDNO.162
  肽163   KGEAAAE   SEQIDNO.163
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  肽165   EAAAERP   SEQIDNO.165
  肽166   AAAERPG   SEQ ID NO.166
  肽167   AAERPGE   SEQIDNO.167
  肽168   AERPGEA   SEQIDNO.168
  肽169   ERPGEAA   SEQIDNO.169
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  肽171   PGEAAVA   SEQIDNO.171
  肽172   GAQFSK   SEQ ID NO.172
  肽173   AQFSKT   SEQIDNO.173
  肽174   QFSKTA   SEQ ID NO.174
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  肽177   IKTAAKG   SEQID NO.177
  肽178   TAAKGE   SEQIDNO.178
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  肽181   KGEAAA   SEQIDNO.181
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  肽183   EAAAER   SEQ ID NO.183
  肽184   AAAERP   SEQ ID NO.184
  肽185   AAERPG   SEO IDNO.185
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  肽220   KGEA   SEQ ID NO.220
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  肽230   EAAV   SEQ ID NO.230
  肽231   AAVA   SEQ ID NO.231
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  肽233   GKQFSKTAAKGE   SEQ ID NO.233
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  肽235   GKQFSKTKAKGE   SEQ ID NO.235
  肽236   GAQASKTAAK   SEQID NO.236
  肽237   GAQASKTAAKGE   SEQ ID NO.237
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  肽239   GAQFSKTAAAGE   SEQID NO.239
  肽240   GAQFSKTAAKAE   SEQIDNO.240
  肽241   GAQFSKTAAKGA   SEQ ID NO.241
  肽242   AAQFSKTAAK   SEQ ID NO.242
  肽243   GAAFSKTAAK   SEQ ID NO.243
  肽244   GAQFAKTAAK   SEQ ID NO.244
  肽245   GAQFSATAAK   SEQ ID NO.245
  肽246   KAATKSFQAG   SEQ ID NO.246
  肽247   GAQFSKAAAK   SEQ ID NO.247
  肽248   GAQFSKTAAA   SEQ ID NO.248
  肽249   GAQFSATAAA   SEQ ID NO.249
  肽250   GAQASKTA   SEQ ID NO.250
  肽251   AAGE   SEQ ID NO.251
  肽252   GKASQFAKTA   SEQ ID NO.252
虽然本发明已经详细描述并给出其具体实施方案，对于本领域熟练技术人员显而易见可进行各种改变和修饰而不偏离本发明的精神和范围

Claims (55)

1.抑制哺乳动物中粘蛋白分泌过多的方法，所述方法包括给哺乳动物施用粘蛋白分泌过多抑制量的粘蛋白分泌过多抑制肽，所述肽由少于24个氨基酸组成，并且具有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IDNO.1)的4-23个连续氨基酸的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的一或多个氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰。
2.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列起始于参照序列的N末端氨基酸。
3.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列起始于参照序列的位置2的氨基酸到位置21的氨基酸。
4.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列包括参照序列的连续残基A，K，G和E(SEQ ID NO：219)。
5.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列终止于参照序列的C末端氨基酸。
6.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列由参照序列的8-14个连续氨基酸组成或者由与所述参照序列基本相同的氨基酸序列的8-14个连续氨基酸组成。
7.权利要求1的方法，其中所述肽的氨基酸序列由参照序列的10-12个连续氨基酸组成或者由与所述参照序列基本相同的氨基酸序列的10-12个连续氨基酸组成。
8.权利要求1的方法，其中所述肽的N末端氨基酸在N末端氨基发生烷基化，酰胺化，或酰化。
9.权利要求8的方法，其中所述肽的N末端氨基酸在N末端氨基发生肉豆蔻酰化。
10.权利要求8的方法，其中所述肽的N末端氨基酸在N末端氨基发生酰化。
11.权利要求1的方法，其中所述肽的N末端氨基酸在N末端氨基是非肉豆蔻酰化的。
12.权利要求11的方法，其中所述肽选自以下一组：乙酰-肽106，肽106，和肽106-NH2。
13.权利要求5的方法，其中所述肽选自以下一组：肽15，肽45，肽91和肽153。
14.权利要求2的方法，其中所述肽选自以下一组：肽79，肽233，肽234，myr-肽234-NH2，和肽235。
15.权利要求4的方法，其中所述肽是乙酰-肽219。
16.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
17.权利要求1的方法，其中哺乳动物中的粘蛋白分泌过多是哺乳动物中的肺疾病引起的。
18.权利要求15的方法，其中所述肺疾病选自以下疾病组成的组：哮喘、慢性支气管炎、COPD和囊性纤维化。
19.权利要求1的方法，其中所述肽显示至少一种以下性质：(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于所述参照序列；或(b)在相同液体中、相同浓度下，具有高于所述参照序列的水溶性。
20.抑制哺乳动物中粘蛋白分泌过多的方法，所述方法包括给哺乳动物施用粘蛋白分泌过多抑制量的粘蛋白分泌过多抑制肽，所述肽具有选自以下序列组成的组的氨基酸序列：
(a)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO.1)的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的N末端氨基酸是非肉豆蔻酰化的并且任选地独立地通过化学方法修饰，所述肽的C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
21.权利要求20的方法，其中所述肽的N末端氨基酸是乙酰化的。
22.权利要求20的方法，其中所述肽显示以下性质中的至少一种：
(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1；或(b)在相同液体中、相同浓度下，其水溶性高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1。
23.一种肽，其由少于23个氨基酸组成，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IDNO.1)的4-23个连续氨基酸的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的N末端氨基酸是乙酰化的并且所述肽的C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
24.权利要求23的肽，其中所述肽的C末端氨基酸在C末端羧基发生酰胺化或酯化。
25.权利要求23的肽，其中C末端氨基酸在C末端羧基与以下物质发生酰胺化：氨，C1-C24脂肪族烷基胺，羟基取代的C2-C24脂肪族烷基胺，线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基，或ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中n为0-10。
26.权利要求23的肽，其中C末端氨基酸在C末端羧基与以下物质发生酯化：C1-C24脂肪族烷基醇或2-(ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基团，其中n为0-10。
27.权利要求23的肽，其中所述肽选自乙酰基-肽106和乙酰基-肽219组成的组。
28.权利要求23的肽，其中所述肽显示以下性质中的至少一种：
(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1；或(b)在相同液体中、相同浓度下，其水溶性高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1。
29.一种肽，其由少于24个氨基酸组成，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IDNO.1)的4-23个连续氨基酸的氨基酸序列；
其中所述肽包含至少一个氨基酸取代，其中K取代A；A取代F，K，G， Q，S，T，和/或E；或E取代Q；
其中所述肽的N末端和C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，且
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
30.权利要求29的肽，其中N末端氨基酸在N末端胺与以下物质发生烷基化：C1-C24脂肪族烷基，线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，或ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中n为0-10。
31.利要求29的肽，其中N末端氨基酸在N末端胺与以下物质发生酰胺化：C2-C24脂肪族羧酸，三氟乙酸，苯甲酸，或C1-C24脂肪族烷基磺酸。
32.权利要求29的肽，其中所述肽的C末端氨基酸在C末端羧基发生酰胺化或酯化。
33.权利要求29的肽，其中C末端氨基酸在C末端羧基与以下物质发生酰胺化：氨，C1-C24脂肪族烷基胺，羟基取代的C2-C24脂肪族烷基胺，线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基，或ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中n为0-10。
34.权利要求29的肽，其中C末端氨基酸在C末端羧基与以下物质发生酯化：C1-C24脂肪族烷基醇或2-(ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基团，其中n为0-10。
35.权利要求29的肽，其中所述肽显示以下性质中的至少一种：
(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1；或(b)在相同液体中、相同浓度下，其水溶性高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1。
36.权利要求29的肽，其中所述肽选自由肽233-245以及肽247-251组成的组。
37.一种肽，其由少于24个氨基酸组成，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IDNO.1)的4-23个连续氨基酸的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的N末端序列起始于参照序列的位置2到位置21；且
其中所述肽的N末端和C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
38.权利要求37的肽，其中在N末端氨基与以下物质发生烷基化：C1-C24脂肪族烷基，线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基，或ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中n为0-10。
39.利要求37的肽，其中在N末端氨基与以下物质发生酰胺化：C2-C24脂肪族羧酸，三氟乙酸，苯甲酸，或C1-C24脂肪族烷基磺酸。
40.权利要求37的肽，其中所述肽的C末端氨基酸在C末端羧基发生酰胺化或酯化。
41.权利要求37的肽，其中在C末端羧基与以下物质发生酰胺化：氨，C1-C24脂肪族烷基胺，羟基取代的C2-C24脂肪族烷基胺，线性2-(C1-C24脂肪族烷基)氧乙基胺基，或ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n-乙基，其中n为0-10。
42.权利要求37的肽，其中在C末端羧基与以下物质发生酯化：C1-C24脂肪族烷基醇或2-(ω-甲氧基-聚(氧化乙烯)n)-乙醇基团，其中n为0-10。
43.权利要求37的肽，其中所述肽显示以下性质中的至少一种：
(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1；或(b)在相同液体中、相同浓度下，其水溶性高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1。
44.一种肽，其由少于17个氨基酸组成，所述肽具有选自下组的氨基酸序列：
(a)具有参照序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ IDNO.1)的4-16个连续氨基酸的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的N末端和C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，且所述肽的N末端氨基酸是非肉豆蔻酰化的，
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
45.权利要求44的肽，其中所述肽的氨基酸序列起始于参照序列的N末端氨基酸。
46.权利要求44的肽，其中所述肽的氨基酸序列包括参照序列的残基AKGE(SEQ ID NO：219)。
47.权利要求44的肽，其中所述肽的氨基酸序列终止于参照序列的C末端氨基酸。
48.权利要求44的肽，其中所述肽的氨基酸序列由参照序列的8-14个连续氨基酸组成或者由与所述参照序列基本相同的氨基酸序列的8-14个连续氨基酸组成。
49.权利要求44的肽，其中所述肽的氨基酸序列由参照序列的10-12个连续氨基酸组成或者由与所述参照序列基本相同的氨基酸序列的10-12个连续氨基酸组成。
50.权利要求44的肽，其中所述肽的N末端氨基酸在N末端氨基发生乙酰化。
51.一种肽，其由选自下组的序列组成：
(a)具有序列GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(SEQ ID NO.   1)的氨基酸序列；和
(b)与(a)中定义的序列基本相同的氨基酸序列；
其中所述肽的N末端氨基酸是非肉豆蔻酰化的，且所述肽的C末端氨基酸任选地独立地通过化学方法修饰，
所述肽在以粘蛋白分泌过多抑制量施用于哺乳动物时具有粘蛋白分泌过多抑制效应。
52.权利要求51的肽，其中所述肽的N末端氨基酸是乙酰化的。
53.权利要求51的肽，其中所述肽显示以下性质中的至少一种：
(a)以相同浓度施用于所述哺乳动物时，对哺乳动物的粘蛋白分泌过多抑制效应高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1；或(b)在相同液体中、相同浓度下，其水溶性高于N末端氨基酸被肉豆蔻酰化的SEQ ID NO：1。
54.药物组合物，其包含权利要求23-53之一的肽，并任选地包含可药用载体和/或稀释剂。
55.权利要求23-53之一的肽在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗哺乳动物中由于肺疾病造成的粘蛋白分泌过多。
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