KR102211605B1 - 개구리 배아를 이용한 기도 뮤신 분비 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

개구리 배아를 이용한 기도 뮤신 분비 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 개구리 배아를 이용한 기도 뮤신 분비 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 무당개구리(Bombina orientalis) 배아를 이용하여 기도 뮤신 분비 억제제를 대량으로 스크리닝 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델은 점액질을 분비하는 점액분비세포(goblet cell, WGA 염색)와 섬모가 존재하는 섬모세포(ciliated cell, acetylated tubulin염색)로 표피 구조가 이루어져, 사람의 호흡기 구조와 유사한 표피 구조를 갖는다. 또한, 본 발명의 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델은 혈장 및 여러 영양소가 포함된 세포주 배양액과 달리, 물과 약간의 염분만을 포함한 배양액을 사용하기 때문에 노이즈가 상대적으로 적고, 점액질의 양이 증가함에 따라 배아 배지의 흡광도가 농도 의존적으로 증가하여 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제 또는 촉진하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

개구리 배아를 이용한 기도 뮤신 분비 억제제의 스크리닝 방법{Methods for Screening Therapeutic Agents for Airway Conduct MucinSecretion Inhibitor Using the Frog Embryo}
본 발명은 개구리 배아를 이용한 기도 뮤신 분비 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 무당개구리(Bombina orientalis) 배아를 이용하여 기도 뮤신 분비 억제제를 대량으로 스크리닝 할 수 있는 방법에 관한 것이다.
호흡기는 인체가 외부 환경과 접촉하도록 노출된 기관(organ)중의 하나이다. 호흡기는 공기의 통로를 이루는 기도(airway)와 기체교환 장소인 폐로 이루어져 있다. 기도는 비강(nasal caviyt), 인두(pharynx), 후두(larynx), 기관(trachea), 기관지(bronchus)로 이루어져 있고, 폐는 소기관지(bronchiole), 폐포(alveolus)로 이루어져 있다. 인체는 호흡기의 작용을 통하여 1일 약 20kl의 공기를 흡입한다. 호흡기는 산소의 흡입과 이산화탄소의 배출과 같은 생명유지의 근간이 되는 기능을 수행함과 동시에 호흡기를 통해 인체에 유입되는 유해한 말질에 대해 생물학적 방어기능을 수행하고 있다.
기관강 표면에 존재하는 점액(mucus)은 점액성 클리어란스(mucociliary clearance)라 불리는 기전을 통해, 대기중 입자와 화학물질등에 대한 인체의 방어작용에 있어서 매우 중요한 역할을 한다. 기도점액의 과다분비 또는 점도의 변화는 만성 기관지염, 천식, 낭포성 섬유증과 같은 다수의 기도질환에서 중요한 문제일 뿐 아니라 미세먼지로 대기오염이 심각한 도시에 사는 사람들에게 상당히 심각한 문제가 될 수 있다.
한편, 호흡기 질환에서 점액질의 과다분비를 조절하는 물질을 발굴하기 위하여 사용되는 실험모델은 암화세포주, ALI-culture, 또는 mouse 질환 모델을 주로 사용하여 왔는데, 호흡기 점액 분비 상피 세포의 in vivo 연구를 위해서는 mouse 질환 모델의 호흡기 상피조직을 적출하여 배양해야 하는 어려움이 있었다. 또한, 종래 호흡기 질환 모델 시스템은 점액 분비 이상 및 질병의 기전을 연구하기에는 좋으나, 점액 분비 조절 유효 물질 탐색을 위한 대량(High-throughput) 스크리닝에 어려움이 있었다.
이에, 본 발명자들은 종래 사용되어 오던 호흡기 질환 in vivo 모델의 단점을 개선하기 위해 다양한 동물들을 대상으로 새로운 호흡기 질환의 치료제 발굴에 사용될 수 있는 새로운 동물모델을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 무당개구리 배아가 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제 또는 촉진하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
특허등록 제10-0268576호 특허공개 제10-2006-0056444호
따라서, 본 발명의 목적은 (a) 무당개구리(Bombina orientalis) 배아에 기도 뮤신 분비 조절제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 무당개구리 배아 모델에서 점액질 분비 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 나라신(narasin)을 유효성분으로 포함하는, 기도 뮤신 분비 조절제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 무당개구리(Bombina orientalis) 배아에 기도 뮤신 분비 조절제 후보 물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 물질이 무당개구리 배아 모델에서 점액질 분비 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법에서, 상기 방법은, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 점액질 분비 수준이 후보물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 기도 뮤신 분비 억제제로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법에서, 상기 방법은, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 점액질 분비 수준이 후보물질이 처리되지 않은 시료에 비해 증가하면 기도 뮤신 분비 촉진제로 판단하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법에서, 상기 무당개구리는 암컷과 수컷에 HCG(Human Chorionic Gonadotropin: 사람 융모성 성선자극호르몬)을 주사하고, 자연교미(natural mating)를 통해 인공산란 될 수 있다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법에서, 상기 무당개구리 배아는 수정 후 4 내지 6일 배양될 수 있다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법에서, 상기 점액질 분비 수준의 측정은 뮤신 다당류 사슬에 결합하는 WGA-HRP(Wheat Germ Agglutinin-Horse Radish Peroxidase)의 효소 반응을 통해 점액질의 분비량을 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 나라신(narasin)을 유효성분으로 함유하는 기도 뮤신 분비 억제용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 기도 뮤신 분비 조절제의 스크리닝 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 종래 사용되어 오던 호흡기 질환 in vivo 모델의 단점을 개선하기 위해 다양한 동물들을 대상으로 새로운 호흡기 질환의 치료제 발굴에 사용될 수 있는 새로운 동물모델을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 무당개구리 배아는 점액질을 분비하는 점액분비세포(goblet cell, WGA 염색)와 섬모가 존재하는 섬모세포(ciliated cell, acetylated tubulin염색)로 표피 구조가 이루어져 사람의 호흡기 구조와 유사한 표피 구조를 갖고, 혈장 및 여러 영양소가 포함된 세포주 배양액과 달리, 물과 약간의 염분만을 포함한 배양액을 사용하기 때문에 노이즈가 상대적으로 적으며, 점액질의 양이 증가함에 따라 배아 배지의 흡광도가 농도 의존적으로 증가하여 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제 또는 촉진하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 용어, “무당개구리(Bombina orientalis)”는 한반도 전역에 분포하는 종이며, 산림지대의 습지나 계곡 또는 하천주변과 습지, 논, 밭 등에 서식한다. 무당개구리의 알은 지름은 1.5∼2 ㎜이며 투명한 젤리층(교질층)은 3겹이다. 암컷 한 마리가 시간을 두고 여러 번 산란을 하는데 약 30∼150개를 산란한다. 무당개구리의 올챙이 등면은 황색, 암갈색 또는 황갈색을 띄며, 몸통과 꼬리에 작은 흑색반점이 있다. 배면은 암갈색이며 반투명해 내장이 보인다. 몸통은 둥글고 꼬리지느러미는 몸통 중간에서부터 시작되는 특징이 있다. 다자란 성체의 길이는 약 3.5∼5 ㎝이며, 채색과 형태는 서식지와 장소에 따라 개체변이가 심하다. 등면은 녹색, 청록색, 또는 갈색을 띄고 있고, 불규칙한 흑색 반점이 있다. 배면은 적색, 황적색을 띄고 불규칙한 흑색 반점과 얼룩무늬가 있다. 머리는 둥글고 납작하며, 짧은 주둥이를 가지고 있고, 주둥이 주변에는 흑색 반점과 얼룩무늬가 있다.
상기 스크리닝 방법에서 (a) 단계는 무당개구리(Bombina orientalis) 배아에 기도 뮤신 분비 조절제 후보 물질을 처리하는 단계이다.
본 발명에서 용어, "뮤신"은 점막에서 분비되는 점액물질로 점액질, 점액소 또는 점소라고도 하는데, 그 화학적 본체는 당단백질의 일종이다. 점액질의 보호기능은 주로 점액성 당단백질인 뮤신의 물리화학적 성질 때문인데, 이 뮤신은 수백만 달톤의 분자량을 가진 당단백질로 구성 탄수화물의 구조에 있어 상당한 다양성을 보인다. 그러므로 기도 뮤신의 양과 질의 이상은 기도생리의 이상뿐 아니라 인체의 방어 작용에 영향을 주어 더 심한 병리 현상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어 기도점액의 과다분비 또는 점도의 변화는 만성 기관지염, 천식, 낭포성 섬유증과 같은 다수의 기도질환에서 중요한 문제일 뿐 아니라 대기오염이 심각한 도시에 사는 사람들에게 상당히 심각한 문제가 될 수 있다.
이와 같은 호흡기 기도 질환에 있어, 점액질 또는 뮤신의 질과 양은 호흡기 생리를 매개하는 역할을 수행하므로, 중요한 치료타겟으로 여겨진다.
본 발명에 용어, "호흡기 동물 모델"이란 인간을 제외한 동물로서, 호흡기의 병리학적 상태에 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 상태에 있는 동물을 의미한다.
본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 호흡기 기도에서 점액질 또는 뮤신의 분비를 증가 또는 감소시켜 기도 뮤신의 분비 수준을 조절할 수 있는 물질로, 올리고 뉴클레오티드, 단백질, 화합물 등을 제한없이 포함한다.
또한, 본 발명의 방법은, 추가로 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 점액질 분비 수준이 후보물질이 처리되지 않은 시료에 비해 감소하면 기도 뮤신 분비 억제제로 판단하는 단계 또는 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 점액질 분비 수준이 후보물질이 처리되지 않은 시료에 비해 증가하면 기도 뮤신 분비 촉진제로 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로 비처리 시료 값과 비교하여, 점액질 분비 수준이 낮거나, 배아 세포내 점액질 보유량이 높으면, 기도 뮤신 분비 억제제로 판단하는 단계일 수 있고, 비처리 시료 값과 비교하여, 점액질 분비 수준이 높거나, 배아 세포내 점액질 보유량이 낮으면, 기도 뮤신 분비 촉진제로 판단하는 단계일 수 있다.
상기 무당개구리는 암컷과 수컷에 HCG(Human Chorionic Gonadotropin: 사람 융모성 성선자극호르몬)를 주사하고, 자연교미(natural mating)를 통해 인공산란 하여 대량 사육할 수 있다.
또한, 상기 무당개구리 배아는 배아 조직 및 세포의 용이 관찰 여부 및 기형관찰 용이성을 고려할 때, 수정 후 4 내지 6일 배양된 배아를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 스크리닝 방법에서 (b) 단계는 상기 후보 물질이 무당개구리 배아 모델에서 점액질 분비 수준을 측정하는 단계이다. 이 단계에서 점액질 또는 뮤신 단백질의 검출은 노던 블롯(Northern blot), 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학적 염색(immunohistochemical staining), 인 시추 혼성화 방법(in situ hybridization), 역전사효소 중합반응(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 정량적 RT-PCR(real-time quantitativeRT-PCR), ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 등을 이용하여 수행할 수 있으나, 점액질 또는 뮤신이 백만 달톤의 분자량을 가진 당단백질로 구성 탄수화물의 구조로 상당한 다양성을 보이는 특징을 감안할 때, 뮤신 다당류 사슬에 효과적으로 결합할 수 있는 WGA-HRP(Wheat Germ Agglutinin-Horse Radish Peroxidase)의 효소 반응을 통해 점액질의 분비량을 측정하는 것이 바람직하다.
본 발명 일 실시예에서는 점액질의 주요 구성성분인 뮤신 당 당백질의 다당류 사슬에 용이하게 결합할 수 있도록, WGA-HRP(Wheat Germ Agglutinin-Horse Radish Peroxidase)의 효소 반응을 이용하여 점액질 분비를 확인할 수 있는 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델을 구축하였고, 종래 인간의 점액질 분비를 감소시키는 것으로 알려진 약물을 비쿠쿨린(Bicuculline)을 처리하였을 때, 점액질 분비가 억제되는 것을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 나라신(narasin)을 유효성분으로 함유하는 기도 뮤신 분비 억제용 조성물을 제공한다.
상기 뮤신 분비와 호흡기 관련 모델에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "기도 뮤신의 분비를 조절하는 물질"은 기도 뮤신에 당단백질을 코딩하는 유전자 또는 이의 단백질에 직접적으로 작용하거나 그의 리간드에 간접적으로 작용하는 등의 방식을 통해 기도 뮤신의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나 단백질로 번역 후 분해를 촉진시키는 방식으로 발현을 저해하는 물질, 또는 뮤신의 세포외 수송을 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다.
상기 기도 뮤신의 분비를 억제하는 물질은 기도 뮤신을 표적으로 하여 이의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 상기 기도 뮤신의 발현 또는 활성을 저해하는 물질의 예로, 바람직하게는 기도 뮤신의 mRNA의 발현을 저해하는 올리고 뉴클레오티드, 기도 뮤신 당단백질의 합성을 억제하는 앱타머 또는 화합물 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자로, 체내에 특정 항원이 침입한 경우 이를 특이적으로 인식하여 반응하는 항원 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 말한다. 하나의 항체 분자는 두 개의 중사슬(heavy chain) 및 두 개의 경사슬(light chain)로 구성되어 있으며, 이들 각각의 중사슬 및 경사슬은 가변 영역과 고정 영역을 포함한다. 상기 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(Complementarity Cetermining Region: CDR) 및 4개의 구조 형성 부위(Framework Region; FR)를 포함하며, 상기 상보성 결정 부위들에 의해 항체와 항원 사이의 결합 부위가 형성되어 특정 항원에 대한 항체의 결합 특이성이 생성될 수 있다.
상기 항체는 전장항체 또는 항체 단편의 형태를 모두 포함하며, 또한, 다클론 항체, 단일클론 항체 등을 모두 포함할 수 있다. 또한 키메라성 항체 또는 이종 결합 항체 등과 같이 유전 공학적으로 제작된 항체들도 모두 포함할 수 있다.
또한, 기도 점액의 분비를 억제하는 물질은 화합물의 형태일 수 있으며, 그 예로 나라신(narasin) 화합물을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 나라신(narasin) 화합물은, 항균 물질로 잘 알려져 있는데, IκB의 인산화를 방해하여 NFκB가 전사 인자로 작용을 하지 못하게 하는 역할은 잘 알려져 있다. 또한, 나리신은 가금류의 콕시듐 감염증의 예방 및 치료제로 주로 사용되며, 세균의 세포막에 이온통로를 형성하는 ionophoric 항생제로 쓰이고 있다. 또한 Narasin은 IκBα 인산화 억제효과가 있음이 보고된 바 있으며, ER stress respond를 유발하는 것으로 알려졌으나, 뮤신 및 점액의 분비와 관련된 연구결과는 보고된 적이 없다.
본 발명에서 사용되는 용어 “억제”란, 본 발명의 조성물을 투여에 의해 호흡기 기도에서 점액질의 과다한 분비를 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 “치료”란, 본 발명의 조성물의 투여에 의해 흡기 기도에서 점액질의 과다한 분비 증상이 호전되도록 하거나, 기도 점액질의 배출을 억제하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 기도 뮤신 분비 억제용 조성물은 약학으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 및 음용수 첨가제 등으로 제공될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 약학적 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있으며, 호흡기 기도에서 점액질의 과다 분비에 대한 치료제인 점에서 경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다. 경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물을 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스(Saccharose), 솔비톨(Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(sodium stearyl fumarate)또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 상기 조성물을 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으며, 호흡기 기도의 점액질이 과다하게 분비되는 것에 대한 치료제인 점에서 안구 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 적합한 도포, 분무 또는 투여량은, 상기 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로는 물론, 투여 대상이 되는 개체의 나이, 체중, 성별, 질병 증상의 정도, 섭취하는 음식, 배설 속도 등과 같은 요인들에 의해 다양해 질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델은 점액질을 분비하는 점액분비세포(goblet cell, WGA 염색)와 섬모가 존재하는 섬모세포(ciliated cell, acetylated tubulin염색)로 표피 구조가 이루어져, 사람의 호흡기 구조와 유사한 표피 구조를 갖는다.
또한, 본 발명의 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델은 혈장 및 여러 영양소가 포함된 세포주 배양액과 달리, 물과 약간의 염분만을 포함한 배양액을 사용하기 때문에 노이즈가 상대적으로 적고, 점액질의 양이 증가함에 따라 배아 배지의 흡광도가 농도 의존적으로 증가하여 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제 또는 촉진하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 한국에서 채취한 개구 배아표피를 이용한 섬모점막 상피조직 모델의 선정과 관련하여 이들 사이의 장단점을 비교하여 나타내는 그림이다.
도 2는 무당개구리 모델이 사람의 호흡기관과 유사한지를 관찰하기 위하여 촬영한 사진이다.
도 3은 수정 후 4~6일 경과 후에, 무당개구리 배아를 촬영한 사진이다.
도 4는 무당개구리 배아 모델에 후보 물질을 처리하여 점액질 발현의 변화 양상을 촬영한 사진이다.
도 5는 Bicuculline, Narasin, Noscapine, 및 phorbol 12,13-dibutyrate를 처리한 후, 점액질 분비의 변화 양상을 나타내는 그림 및 이를 형광염색 방법으로 촬영한 사진이다.
도 6은 본 발명의 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델과 사람 Calu-3 세포주의 호흡기 점액분비 변화을 비교하여 나타낸 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 국내 자생종 개구리 및 알의 채집
1-1. 채집 시기 및 장소
호흡기 기능성 유효물질 탐색 및 스크리닝 방법 연구를 위하여 한국에 자생하고 있는 개구리를 채집하였다. 채집 대상종은 무미목 양서류 중 멸종위기종과와 두꺼비과를 제외한 7종(한국산개구리, 북방산개구리, 계곡산개구리, 참개구리, 청개구리, 옴개구리, 무당개구리)을 대상으로 진행되었다.
개체의 채집은 성체와 알의 채집이 용이한 번식기에 맞추어 채집하였다. 2월부터 6월까지 울주군, 강진군, 홍천군, 춘천시, 원주시, 의성군 등에서 성체와 알을 채집하였고, 총 7종의 성체[한국산개구리(5), 북방산개구리(14), 계곡산개구리(12), 참개구리(4), 청개구리(11), 옴개구리(4), 무당개구리(22)]와 5종의 알[한국산개구리(8), 북방산개구리(7), 계곡산개구리(11), 참개구리(2), 무당개구리(1)]을 채집하였다.
채집한 개구리들을 효과적으로 유지 및 사육하기 위하여, 양서류 사육시설 3식(각 사육시설 별 사육케이지 18개 이용 가능)을 설계, 제작하여 개체들을 사육하였다.
이후, 하기 실시예 2의 실험모델 적성 분석을 통해 무당개구리의 성체 108 개체를 추가 채집하였다.
1-2. 개체 사육
케이지는 높이가 높은 케이지(470×290×280mm)와 낮은 케이지 (460×300×170mm) 두 종류를 사용하였다. 케이지에는 배수구를 뚫어주되, 개체는 빠지지 않고, 배설물이나 기타 먹이 찌꺼기들만 빠질 수 있게 틈이 작은 마개를 끼어주었다. 배수구의 높이만큼 물이 차오르면 자동적으로 물이 빠지게 하여, 물 순환 시 일정한 높이의 물을 유지할 수 있게 해주었다. 케이지 내부에는 높이 20mm와 40mm의 스펀지를 이용하여 물 보다 조금 더 높게 육지를 만들어주었다. 높은 케이지의 경우 40mm 2장, 20mm 1장을, 낮은 케이지의 경우 40mm 1장의 스펀지를 깔아주어 육지를 만들어 주었다. 그 위에 돌이나 은신처 인조 덩굴이나 나뭇잎을 넣어 주어 개체가 은신처 등으로 이용할 수 있게 해주었다. 케이지 내부에 물 부분과 육지 부분이 동시에 있어 개체가 편하게 물과 육지를 이동하며 이용할 수 있게 해주었다.
채집된 알은 케이지 안에 넣어 두고, 상온에 따라 자연 발생·부화가 되게 하였다. 배아가 자라나는 것을 확인하며, 더 이상 발달을 하지 않는 죽은 배아는 썩어서 물이 오염되지 않도록 제거해주었고, 발달하는 배아들은 계속 키워 부화를 할 수 있게 하였다. 알에서의 부화 기간은 온도에 따라 차이가 있지만 대략적으로 10∼15일 정도 걸렸다.
알에서 갓 태어난 올챙이에 테트라민 베이비를 급여하였고, 올챙이가 자라남에 따라 일반 테트라민을 급여해주었다. 먹이가 남게 되면 물이 오염되기 때문에 주고 나서 5∼10분 내외로 먹을 수 있는 만큼 급여하였고, 물이 너무 더러워지게 되는 경우, 사육 중간에 케이지를 청소해주면서 물을 갈아 주었다. 올챙이들이 뒷다리가 나오기 시작하면, 스펀지와 돌을 이용하여 육지를 만들어 주어, 변태 후 육지를 이용할 수 있게 해주었다. 올챙이에서 부터 변태까지의 기간은 대략 30∼50일 정도 걸렸다.
갓 변태한 유생은 사이즈가 매우 작아 사육장의 틈을 다 막아주어 탈출을 방지 하였다. 먹이급여는 일주일에 2∼3회 급여하였다. 갓 변태한 유생은 귀뚜라미 핀헤드(약 1∼2 mm)와 극소밀웜(약 0.3∼0.8 ㎝)을 급여하였고, 개체들이 자라남에 따라 먹이의 크기를 조금씩 키워주었다. 지속적인 먹이 급여를 위해 개체들과 함께 급여하는 먹이인 작은 사이즈의 귀뚜라미와 밀웜을 함께 사육하여, 먹이가 부족하지 않도록 하였다.
무당개구리의 경우 개체수를 많이 보유하고 있어 개체의 크기가 조금 작을 경우 8∼9개체, 개체의 크기가 클 경우 5∼6개체 씩 분리하여 사육하였다. 다른 종의 경우 종에 따라 보유한 만큼 2∼3개체 씩 사육하였다. 먹이의 급여는 주 1∼2회 급여하였다. 먹이로는 귀뚜라미(소∼중, 약 0.8∼2.0 ㎝)와 일반 밀웜(약 1.2∼2.0 ㎝)을 급여하였고, 귀뚜라미의 경우 1개체 당 3마리, 밀웜의 경우 4∼5마리씩 급여하였다. 성체는 여러 마리를 한 케이지에 키우기 때문에 먹이경쟁이 일어날 수 있어 총 먹이 마릿수에 3∼4마리 정도 더 급여하였다.
일주일에 2회 정도 케이지 바닥에 가라앉은 배변이나 먹이 찌꺼기 등을 청소해 주기위해 전체 물갈이를 해주었고, 전체케이지 청소는 매 달 1회 진행하여 케이지가 오염되거나 이끼가 생기는 것을 방지하였다. 지속적인 먹이 급여를 위해 개체들과 함께 급여하는 먹이인 귀뚜라미와 밀웜을 함께 사육하여, 먹이가 부족하지 않도록 하였다.
실시예 2. 스캐닝 분석 및 젤리층 제거 여부를 통한 1차 연구 적합종의 선정
상기 실시예 1에 따라 채집되어 사육된 국내 자생종 개구리를 대상으로 호흡기 질환과 관련된 실험모델 적합성 분석을 실시하였다. 실험과정에서 연구대상 한국 자생종 개구리와 관련된 정보는 한국 양서·파충류 생태도감을 참고하였으며(이 등, 2011; 이와 박, 2016), 각각에 대한 알, 올챙이, 및 성체의 형태 및 생리학적 특징을 관찰하였고, 이들의 생태를 관찰하였다.
2-1. 스캐닝 분석
배아의 크기가 너무 크고, pigment에 의해 발생 정도에 대한 관찰이 용이하지 않아, 브라이트 필드(Brightfield) 이미지 분석을 사용하였다. 브라이트 필드(Brightfield) 이미지 분석은 스캐닝을 통한 이미지 분석 보다 긴 시간이 걸리고, 발생 시간을 측정할 수 없지만 대신 노출시간이나 빛의 세기를 조절하여 더 선명한 이미지 분석이 가능하고 배율 또한 높아 스캐너를 통한 이미지 분석보다 더 정확하고 정밀한 사진을 얻을 수 있는 장점이 있다. 브라이트 필드 이미지 분석은 깨끗한 백그라운드(background)를 얻기 위해 PBS(Phosphate-Buffered Saline: 4.09g NaCl+, 0.01g KCl+, 0.72g Na2HPO4 +, 0.12g KH2PO4 +, 50㎖H2O)에 2% 아가로즈(agarose)를 녹인 배지 위에서 진행되었고, PBS에 0.1% tween-20이 들어있는 용액 안에서 배아의 이미지 분석을 진행하였다.
국내 자생종 개구리를 대상으로 한 브라이트 필드(Brightfield) 이미지 분석 결과, 무당개구리는 대조군인 아프리카 발톱개구리에 비해 배아의 사이즈가 매우 큼에도 불구하고, 다른 한국 자생종 개구리에 비해 색소(pigment)가 적어 스테이지 확인이 비교적 용이하였다. 이에 반하여, 다른 한국 자생종 개구리들은 배아 표피세포의 멜라닌 색소가 많아 기형 관찰이 용이하지 않은 것으로 나타났다(도 1 참조).
2-2. 젤리층 제거
알을 둘러싸고 있는 젤리층의 제거가 필요하다. 점액질 분비 확인이나 섬모의 확인을 위해서는 꼭 제거되어야 한다. 보통 점액질의 제거는 시스테인(cystein)이 들어있는 용액을 이용하였는데, pH가 7.8~8.0 정도인 3% 시스테인 용액(3g cystein, 100㎖ 1/3 × MMR(Marc's modified ringer's) 및 pH가 9.0이상인 3% cystein(3g cystein, 100㎖ 1/9 × MMR) 용액 2 종류를 사용하였고, 스월링(swirling) 방식으로 젤리층 제거를 진행하였다. 스월링을 진행하면 알과 알 사이에 존재하고 있던 젤리층이 사라지면서 알과 알 사이의 거리가 줄어들게 된다. 이후 1/9 × MMR 또는 MBS 용액으로 배아를 세척하였다. 무당개구리는 투명한 젤리층이 3겹으로 존재하는 것으로 관찰되었다.
젤리층 제거 결과, pH 9.0인 3% 시스테인 용액으로 10분 정도 반응 시, 젤리층 제거가 용이한 것으로 관찰되었다. 이외에도 참개구리는 pH 9.0인 3% 시스테인 용액으로 30분 정도 젤리층 제거를 시도하였을 때, 젤리층이 제거되는 것이 관찰되었다. 그러나, 다른 한국 자생종 개구리들은 시스테인 용액으로 30분 이상 반응시에도 젤리층 제거가 충분하게 이루어지지 않음이 관찰되었다(도 1 참조)
2-3. 무당개구리 배아 전체 이미지 분석
개구리 배아의 전체 표피 구조를 형광염색하여 이미징 하였다. 본 발명에서는 개구리가 사람 호흡기와 유사한 구조를 가지고 있는지 확인하기 위하여, 무당개구리의 표피 염색을 통해 그 구조를 분석하였다.
점액질이 분비될 때 그 주요구성물질인 뮤신(mucin) 단백질은 당화(glycosylation) 되어야만 한다. 이렇게 당화 과정을 거치게 되는 뮤신 단백질을 탐지하기 위하여 당화(glycosylation) 된 부분과 결합(binding)하는 단백질인 WGA(Wheat Germ Agglutinin, Thermo사)를 이용하여 실험을 진행하였다.
점액질의 주성분인 뮤신 단백질을 탐지하는 WGA와 분비된 점액질을 제거시켜주는 섬모를 각각 탐지하기 위해 아세틸화 튜블린(acetylated tubulin,Thermo사) 항체를 사용하여 염색을 진행하였다.
그 결과, 무당개구리 배아는 점액질을 분비하는 점액분비세포(goblet cell, WGA 염색)와 섬모가 존재하는 섬모세포(ciliated cell, acetylated tubulin염색)로 표피 구조가 이루어져, 사람의 호흡기 구조와 유사한 표피 구조를 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
또한, 이들을 병합(merge)한 이미지는 이들 튜블린과 WGA 형광 염색이 서로 겹치지 않았고, 이를 통해, WGA 형광 염색이 섬모세포에 염색된 것이 아님을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해, 무당개구리 배아 모델을 점액질 분비 모델과 이를 통한 호흡기 치료 약물의 스크리닝 모델에 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
2-4. 인공산란
상기 수집된 한국 자생종의 산란 및 배아발생과 관련하여, 원하는 시기에 실험을 진행하기 위하여 인공산란을 시도하였다. 인공산란은 암컷만 호르몬 주사를 통해 미수정란을 얻어내고, 수컷의 정소를 해부를 통해 얻은 후 얻은 정소를 갈아 얻어낸 미수정란 위에 뿌려주는 방식인 체외수정(in vitro fertilization) 방식과 암컷과 수컷 두 마리 모두에게 호르몬을 주사한 후 수정란을 얻어내는 방식의 자연교미(natural mating) 방식을 사용하였다.
자연교미 방식은 무당개구리 암, 수 각각의 개체에게 HCG(Human Chorionic Gonadotropin: 사람 융모성 성선자극호르몬)를 주사하여 산란을 유도하였다. 주사는 등쪽 아래 쪽(Dorsal sac) 피부 바로 밑에 주사하였고, 총 3가지 방법을 사용하였다. 첫째, 암컷에 HCG 500∼600Unit을, 수컷에 300Unit을 주사 후, 16℃에서 자연포접을 유도하였다. 둘째, 암컷에 HCG 100Unit을 주사한 후 24시간 동안 16℃에 보관한다. 다음날(24시간 후) 암컷에 HCG 400∼500Unit을 추가로 주사하였고, 수컷에 300Unit을 주사한 후 16℃에서 자연포접을 유도하였다. 셋째, HCG 호르몬을 암컷에 400Unit, 수컷에 320Unit씩 주사한 뒤 상온에서 자연포접을 유지하여 산란을 유도하였다.
그 결과, 체외수정방식의 인공산란은 실패하였으며, 자연교미 방식(80% 정도)으로 인공산란이 진행됨을 확인할 수 있었다. 수정된 알은 1/9x MMR(0.32g KCl, 0.65g CaCl2·2H2O, 0.45g MgCl2·6H2O, 24.92g HEPES, 12.99g NaCl, 20L H2O)에서 유지하였고, 실험에 사용되기 전까진 젠타마이신(Gentamicin)을 사용하여 박테리아로 인한 오염을 방지하였다. 수정된 알은 대략 4 내지 6일 동안 실온에서 배아 단계까지 키운 후 실험에 사용하였고, 실험에 사용한 무당개구리의 발생단계는 도 3과 같다.
실시예 3. 개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직의 점액질 분비량 분석 모델 구축
무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직의 점액질(Mucus) 분비량 분석 모델을 구축하기 위하여 ELLA(Enzyme-Linked Lectin Assay) 기법을 사용하였다.
ELLA 분석을 수행하기 위해, 배아 표피에 남아있는 점액질이 없도록 멸균된 1/9 × MMR 용액으로 수정 후, 5일 전후의 무당개구리 배아를 세척하였다. 상기 세척된 배아를 바닥이 망으로 되어있는 챔버에 각각 다섯 개씩 넣고, 1/9 × MMR 용액으로 배양하였다. 배양 3시간 후, 용액을 일정량 채취하여 96-well plate에 옮기고, 4℃에서 12시간 이상 보관한 후, 플레이트 표면에 점액질들이 자연스럽게 부착하도록 유도하였다. 이 플레이트를 200μl의 PTW(100mlPBS, 0.1ml tween-20) 용액으로 3번 세척한 후, 비특이적인 결합에 의한 오류를 최소화하기 위하여 다시 200μl의 1% BSA(1g BSA + 100ml PTW)를 이용하여 1시간 30분 동안 상온에서 처리하였다. 이후, 1% BSA 용액에 WGA-HRP(Wheat Germ Agglutinin-Horse Radish Peroxidase)를 1:104 (w/w) 농도로 희석하여 150μl 씩 96 well plate에 넣고, 1시간 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝나고 200μl의 PTW 용액을 사용하여 3번 세척하였고, 25ml내지 30ml의 PCB(phosphate citrate buffer,2.35g sodium citrate, 3.65g Na2HPO4, 500ml H2O, pH5.0) 용액에 한 알의 o-Phenylenediamine dihydrochloride tablet(Sigma)을 넣어서 용해시켰다. 여기에 다시 1/104(w/w) 농도의 30% H2O2 용액을 첨가하고, 150μl 씩 96 well plate에 분주 한 후, 10분 동안 상온에서 반응시키고, 50μl의 황산(36.6ml sulfuricacid + 250ml H2O)을 사용하여 반응을 정지시켰다. 이 후, 96 well plate를 microplate reader를 이용해 492nm에서 흡광도(OD: optical density)를 측정하는 방식으로 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직의 점액질 분비량 분석하였다.
그 결과, 도 4B(오른쪽)에 나타난 바와 같이 점액질의 양이 증가함에 따라 배지의 흡광도가 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 무당개구리 배아를 배양하는 배양액은 혈장 및 여러 영양소가 포함된 세포주 배양액과 달리, 물과 약간의 염분만을 포함하고 있기 때문에 노이즈가 상대적으로 적기 때문인 것으로 판단되며, 이로 인해 본 발명의 ELLA(Enzyme-Linked Lectin Assay) 기법을 이용한 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델이 분비된 점액질의 양을 매우 효과적으로 분석할 수 있으므로, 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제하는 물질의 스크리닝에 유용하게 사용됨을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 점액분비 조절물질의 탐색
상기 실시예에서 구축된 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델을 활용하여, 호흡기에 분비되는 뮤신 등의 점액질의 분비를 억제 또는 증진시키는 신규 물질을 스크리닝하기 위한 실험을 진행하였다. 모델의 정확성을 테스트하기 위해, 종래 사람의 호흡기 점액분비세포에서 점액질 분비를 조절한다고 공지되어 있는 물질들과 함께 실험을 진행하였다. 공지된 점액질 분비 저해물질로는 비쿠쿨린(bicuculline)이 사용되었다. 염색과정은 무당개구리 배아에 MEMFA(MOPS/EGTA/Magnesium Sulfate/FormaldehydeBuffer)용액을 이용하여 상온에서 2시간, 4℃에서 12시간 이상 고정하였다. 이후, TBST(Tris BufferedSaline with Tween20) 용액으로 세척을 진행하고, 블로킹 용액(blocking solution)을 이용하여 30분 동안 상온에서 블록킹을 진행한 뒤 블로킹 용액에 1차 항체를 1:300으로 처리하여 반응시켰다. 1차 항체 처리가 끝나고, 다시 TBST 용액으로 세척을 진행하였고, 다시 2차 항체를 1:300으로 블로킹 용액에 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝나고 TBST 용액으로 세척을 진행한 후 공초점 현미경(Zeiss LSM 710)을 사용하여 형광사진을 찍어 분석하였다.
그 결과, 처리된 후보물질 중에서 나라신(narasin), 및 노스카핀(noscapine)이 음성대조군과 비교하였을 때, 용액에 존재하는 점액질의 양이 확연하게 줄어드는 현상이 확인되었다. 특히, 노스카핀(noscapine)은 공지된 점액질 분비 저해물질로 사용된 비쿠쿨린과 정도로 점액질 분비가 관찰되었고, 나라신은 비쿠쿨린과 비교하여 점액질 분비 억제효과가 더 뛰어난 것으로 관찰되었다(도 5A 참조).
한편, 공지된 점액질 분비 촉진물질로 알려진 phorbol 12,13-dibutyrate는 음성대조군에 비해 배지(media)에 존재하는 점액질의 양이 증가하는 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 무당개구리 배아 표피의 섬모점막 상피조직 모델이 사람의 호흡기세포에 적용되는 약물과 유사한 반응을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 5).
또한, 배아를 염색하여 분비되지 못하고 세포 내에 남아있는 점액질을 WGA 항체를 이용하여 공초점 현미경(Zeiss LSM 710)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 음성대조군에 비해 비쿠쿨린과 나라신 및 노스카핀을 처리한 군에서는 분비되지 못하고 표피세포에 남아있는 점액질이 다량 존재하는 것으로 확인되었고, phorbol 12,13-dibutyrate 처리군에서는 표피에 남아있는 점액질의 양이 적게 나타난 것으로 관찰되었다.
실시예 5. 무당개구리 배아 모델과 사람 호흡기 세포주 모델과의 비교 검증
본 발명의 무당개구리 배아 표피 섬모점막 상피조직 모델로 스크리닝한 물질이 실제 사람 호흡기 세포주 모델에서도 효과가 있는지를 검증하였다.
상기 실시예 4에서 발굴한 호흡기 점액질 분비 억제제인 나라신(Narasin)의 점액 및 뮤신 분비 억제효능을 사람의 호흡기 점액분비 실험 세포주인 calu-3 세포주를 사용하여 본 발명의 무당개구리 배아 표피 섬모점막 상피조직 모델과 비교 검증하였다.
나라신을 처리한 calu-3 세포주에 축적되어 있는 뮤신과 점액질의 양을 각각 Muc5ac 항체와 WGA 항체를 사용하여 분석하였다. 염색과정은 Calu-3 세포주에 4% formaldehyde(PBS, 4% formaldehyde)를 이용하여 상온에서 2시간, 4℃에서 12시간 이상 고정하였다. 이후, TBST(Tris BufferedSaline with Tween20) 용액으로 세척을 진행하고, 블로킹 용액(blocking solution)을 이용하여 30분 동안 상온에서 블록킹을 진행한 뒤 블로킹 용액에 1차 항체를 1:300으로 처리하여 반응시켰다. 1차 항체 처리가 끝나고, 다시 TBST 용액으로 세척을 진행하였고, 다시 2차 항체를 1:300으로 블로킹 용액에 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝나고 TBST 용액으로 세척을 진행한 후 공초점 현미경(Zeiss LSM 710)을 사용하여 형광사진을 찍어 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 무당개구리 배아 표피 섬모점막 상피조직 모델과 사람 호흡기 calu-3 세포주 모델에서 모두 세포 내부에 뮤신 및 점액질 단백질이 다량 축적되어 있음을 확인할 수 있었다(도 6C). 또한, 형광 염색을 통하여 확인해본 결과 세포 내에 남아있는 뮤신 함유 소포체의 수와 그 크기가 증가함을 확인할 수 있었다(도 6D).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 나라신(narasin)을 유효성분으로 함유하는 기도 뮤신 분비 억제용 조성물.
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