KR100268576B1 - 기도 뮤신 분비 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리양이온성을 지니는 폴리펩티드를 유효성분으로 하여 기도뮤신(점액)의 분비를 억제하는 억제제에 관한 것으로서, 점액 과다분비로 고통받는 환자들의 점액 과다분비를 조절하여 고통경감 및 질환치료에 도움이 되는 폴리양이온성 폴리펩티드, 특히 폴리-L-라이신 또는 폴리-L-아르지닌을 유효성분으로 하는 기도 뮤신(점액) 분비 억제제에 관한 것이다.

Description

기도 뮤신 분비 억제제

본 발명은 기도 점액(뮤신) 과다분비 억제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 폴리양이온성을 지니는 폴리펩티드를 유효성분으로 하여 기도점액(뮤신)의 과다분비를 억제하는 억제제에 관한 것이다.

호흡기는 인체가 외부 환경과 접촉하도록 노출된 기관(organ)중의 하나이다. 호흡기는 공기의 통로를 이루는 기도(airway)와 기체교환 장소인 폐로 이루어져 있다. 기도는 비강(nasal caviyt), 인두(pharynx), 후두(larynx), 기관(trachea), 기관지(bronchus)로 이루어져 있고, 폐는 소기관지(bronchiole), 폐포(alveolus)로 이루어져 있다. 인체는 호흡기의 작용을 통하여 1일 약 20kl의 공기를 흡입한다. 호흡기는 산소의 흡입과 이산화탄소의 배출과 같은 생명유지의 근간이 되는 기능을 수행함과 동시에 호흡기를 통해 인체에 유입되는 유해한 말질에 대해 생물학적 방어기능을 수행하고 있다.

기관강 표면에 존재하는 점액(mucus)은 점액성 클리어란스(mucociliary clearance)라 불리는 기전을 통해, 대기중 입자와 화학물질등에 대한 인체의 방어작용에 있어서 중요한 역할을 한다. 점액의 보호기능은 주로 점액성 당단백질인 뮤신의 물리화학적 성질때문인데, 이 뮤신은 수백만 달톤의 분자량을 가진 당단백질로 구성 탄수화물의 구조에 있어 상당한 다양성을 보인다. 그러므로 기도 뮤신의 양과 질의 이상은 기도생리의 이상뿐 아니라 인체의 방어작용에 영향을 주어 더 심한 병리 현상을 유발한다. 예를 들어 기도점액의 과다분비 또는 점도의 변화는 만성 기관지염, 천식, 낭포성 섬유증과 같은 다수의 기도질환에서 중요한 문제일 뿐 아니라 대기오염이 심각한 도시에 사는 사람들에게 상당히 심각한 문제인 것이다. 관행적으로 사용해 오던 다수의 생약 및 거담제등이 환자의 기도로부터 끈끈하고 짙은 점액을 제거하는데 효과가 있는 것으로 주장됨에도 불구하고, 현재 객관적인 임상 혹은 약리학적 실험결과를 얻을 수 없는 실정이다. 기도점액 생성 및 분비에 작용하는 약물연구에서의 주된 문제점은 기도 점액의 생화학과 약리에 대한 이해가 부족하다는 점이다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 다수의 기도 상피세포 1차 배양법을 여러 동물들을 이용하여 개발해 왔다. 그것들 중에서 햄스터 기관 표면 상피세포(Hamster Tracheal Surface Epithelial Cell, 이하 HTSE 세포라 한다) 배양법이 생화학적, 형태학적으로 특성 규명이 가장 잘 되어 있다. 요컨데, 두꺼운 콜라겐 기질위에서 자란 HTSE 세포의 융합성 배양(confluent culture)은 점액분비성 세포의 함량이 높아서(90% 이상), 세포 형태학상 배상세포(goblet cell)를 닮았고, 생체내 뮤신과 거의 동일한 특성을 지닌 뮤신을 합성·분비한다.

그러므로 HTSE 세포 1차 배양 시스템을 점액 과다분비로 고생하는 인간과 동물에서 공히 관찰되는 주된 병리학적 특징인 기도 점액분비성 세포 이형성(metaplasia)의 시험관내 모델로 쓸 수 있다. 이러한 기관 표면 상피세포로 부터 분비되는 뮤신의 생화학적 특성 규명 뿐만 아니라 1차 배양에서의 기관 표면 상피세포의 성장이 가능하게 됨에 따라, 기도 배상세포로 부터 뮤신분비에 미치는 약물들의 효과에 대해 연구할 수 있게 되었다.

이론적으로, 과량의 점액을 기도로부터 제거하는데는 두가지 방법이 있을 수 있다. 첫째, 물리적 방법에 의한 점액의 제거 즉,점액의 점도를 낮춘 뒤 흡인해내는 방법이고, 둘째는, 점액생성 자체를 억제할 수 있는 약물의 투여일 것이다. 물리적 방법은 우선 기술적으로 용이하지 않고 실행이 가능하다 하더라도 기도벽의 자극을 유발할 뿐만 아니라 종종 반사기전에 의해 점액 분비를 오히려 자극하게 된다. 마취하에서 그런 방법이 시도된다고 해도, 점액의 제거는 피이드백 메커니즘을 통해 점액의 생성과 분비를 더욱 더 자극하게 된다. 그러므로 물리적 방법은 점액 과다분비로 고생하는 환자에게 있어 치료의 성공에 제한을 가해왔다.

따라서, 기도 뮤신분비를 억제하기 위한 약물학적 접근은 그러한 환자에게서 기도점액 분비를 조절하는데 있어 중요한 방향이 되어 왔다. 생체내와 시험관내 연구 결과, 기도 배상세포로 부터의 뮤신분비는 두 종류의 물질에 의해 촉진되는 것으로 나타났는데 첫째, 담배연기, 이산화황, 암모니아증기와 같은 흡입된 화학적 자극물들과, 둘째, 기도 염증시에 유리되는 여러 종류의 화학적 매개체등이 그것이다. 호흡기 염증발생시 거의 예외없이 점액이 과다분비되기 때문에, 염증기간동안에 이들 염증관련 화학적 매개체에 대한 각각의 수용체들을 차단하므로써 점액 과다분비를 억제하는 방법을 생각해 볼 수 있다. 그러나 이러한 약물학적 전략은 상당히 복잡한데, 그 이유는 상이한 작용기전을 통해서 점액 과다분비에 관여되는 화학적 매개체의 수가 상당히 많기 때문이다.

한편, 본 발명자들은 호산구 단백질 그중에서도 호산구 과산화효소 및 호산구 주염기성 단백질이 투여 용량에 비례해서 뮤신의 분비를 억제한다는 사실을 발견하고 특허출원(출원번호 제95-6828호)한 바 있으며, 배상세포로 부터 뮤신(점액)의 분비를 비특이적으로 억제할 수 있는 약물을 개발하여 만성 기관지염, 천식, 낭포성 섬유증, 대기오염등으로 고통받는 환자들의 점액 과다분비를 조절하므로써 고통경감과 아울러 질환의 치료에 획기적 도움을 주고자 연구를 계속하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기도 점액(뮤신) 과다분비로 고통받는 환자들의 점액 과다분비를 조절하여 고통경감 및 질환치료에 도움이 되는 폴리양이온성을 지니는 폴리펩티드, 그중에서도 폴리-L-라이신(PLL) 또는 폴리-L-아르지닌(PLA)을 유효성분으로 하는 기도 점액(뮤신) 과다분비 억제제를 제공하는 것이다.

제1도는 뮤신분비에 대한 폴리양이온(PLL 373량체, PLL 46량체, PLA 46량체)의 효과를 나타내는 그래프.

제2도는 뮤신분비에 대한 PLL 20량체의 효과를 나타내는 그래프.

제3도는 뮤신분비에 대한 PLL 14량체의 효과를 나타내는 그래프.

제4도는 뮤신분비에 대한 PLL 5량체의 효과를 나타내는 그래프.

제5도는 뮤신분비에 대한 PLA 20량체의 효과를 나타내는 그래프.

제6도는 뮤신분비에 대한 PLA 14량체의 효과를 나타내는 그래프.

제7도는 뮤신분비에 대한 PLA 5량체의 효과를 나타내는 그래프.

제8도는 뮤신분비에 대한 PLA 56량체의 효과를 나타내는 동물실험사진.

제9도는 LDH 유리에 대한 PLL 373량체의 효과를 나타내는 그래프.

제10도는 LDH 유리에 대한 PLL 46량체의 효과를 나타내는 그래프.

제11도는 LDH 유리에 대한 PLL 20량체의 효과를 나타내는 그래프.

제12도는 LDH 유리에 대한 PLL 14량체의 효과를 나타내는 그래프.

제13도는 LDH 유리에 대한 PLA 46량체의 효과를 나타내는 그래프.

제14도는 LDH 유리에 대한 PLA 20량체의 효과를 나타내는 그래프.

제15도는 LDH 유리에 대한 PLA 14량체의 효과를 나타내는 그래프.

제16도는 뮤신분비에 대한 N-아세틸화 PLL 377량체의 효과를 나타내는 그래프.

제17도는 뮤신분비에 대한 N-아세틸화 PLL 46량체의 효과를 나타내는 그래프.

제18도는 뮤신분비에 대한 N-아세틸화 PLA 46량체의 효과를 나타내는 그래프.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 좀 더 구체적으로 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] PLL 및 PLA의 제조

폴리펩티드로서 폴리양이온성을 지니는 대표적 물질인 폴리-L-라이신(PLL) 및 폴리-L-아르지닌(PLA)을 중합도 단위로 개별합성하였다. 구체적인 물질은 다음과 같다.

PLL 373량체 PLA 56 량체

PLL 46량체 PLA 46 량체

PLL 20량체 PLA 20 량체

PLL 14량체 PLA 14 량체

PLL 5량체 PLA 5 량체

실험에 필요한 펩티드는 ABI에서 제작한 자동합성기(ABI 341A)를 이용하여 고상합성법(solid phase peptide synthesis)으로 합성하였다(Fields et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 33 : 298-303, 1989 : Fields and Noble, Int. J. Pept. Prot. Res. 35 : 161-214, 1990). 합성에 사용하는 라이신은 N-말단기와 곁사슬의 아미노기를 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카보닐)과 Boc(3차 부틸옥시 카보닐)기로 보호하 였으며, 아르지닌의 경우 N-말단기는 Fmoc로, 곁사슬은 2,2,5,7,8-펜타 메틸크로만-6-술포닐기로 보호된 것을 사용하였다. 합성에 사용된 수지는 합성의 반응정도와 합성되어지는 펩티드의 안정성을 고려하여 PAL수지를 이용하였다. 커플링 반응시 아미노산은 DCC(N',N'-디시클로헥실-카보디이미드)와 HoBt(N-히드록시벤조트리아졸)를 이용하여 활성형을 만들어 수지에 반응시켰으며(Merrifield, Science 232 : 342-347, 1986), 커플링이 종료된 후 미반응된 반응기는 무수초산을 이용하여 캡핑하였다. N-말단의 Fmoc기는 피페리딘 20% 용액으로 제거한 후 그 다음 아미노산은 위에 기술한 동일한 방법으로 활성형을 만들어 커플링시켰으며, 위의 과정을 연속적으로 진행하여 원하는 크기의 펩티드를 합성하였다. 합성이 완료된 후 수지에 결합된 펩티드는 폴리-라이신의 경우 90% TFA에 2.5% 에탄디티올, 2.5% 티오아니졸과 5%의 증류수로 구성된 용액과 상온에서 약 4시간 정도 반응시켰으며(Alberocio et al., J. Org. Chem. 55 : 3730-3743, 1990), 폴리-아르지닌의 경우 1M 트리메틸실릴 브로마이드/티오아니졸 TFA 용액에 약 20시간 반응시킨 후(Green et al., Tetrahedron Lett. 29 : 4341-4344, 1988) 펩티드 수지용액을 여과하여, TFA용액은 질소로 제거한 후 -20℃로 냉각된 디에틸에테르에 침전시켜 -70℃에서 약 10여분간 방치한 후 원심분리기로 침전물을 분리하여 원하는 펩티드를 얻었다. 얻어진 펩티드는 질소로 디에틸에테르용매를 말린 후 증류수와 아세토니트릴 용매의 혼합 용액에 녹여져, 델타 pak C-18 컬럼(300Å, 19mm × 30cm)을 장착한 파마시아 LKB HPLC 시스템에 0.1% TFA를 함유하는 증류수와 아세토니트릴을 선형 그래디언트로 유동시켜 원하는 펩티드를 분리하였으며 합성된 펩티드는 VG 플랫폼 II 질량 분광측광기를 이용, 분자량을 측정하여 합성 성공여부를 결정하였다. HPLC로 분리된 펩티드는 유기용매를 회전 증발기로 제거한 후 동결건조법을 이용, 분말형태로 얻은 후 -20℃에서 보관하였다.

[실시예 2] 시험관내 실험

A. HTSE 세포의 분리 및 배양

8내지 10주령의 웅성 햄스터를 이산화탄소로 질식사시켜 기관을 절제해낸다. 공지의 문헌(Kim and Brody, Mucus and Related Topics, Cambridge, U.K., Company of Biologists Limited, 231-239, 1989)에 기재된 방법에 따라 기관상피세포를 분리 수거하고 일차배양하였다.

B. 뮤신의 대사적 방사능 표시

Kim 등(Kim et al., J. Biol. Chem., 260 : 4021-4027, 1985)의 방법을 이용하였는데, 배양세포중의 뮤신은 완전히 자란 배양세포(24 웰플레이트, 5x10⁵세포/웰)에, 10 μCi/ml의 [6-³H]-글루코사민 (39.2 Ci/mmol, New England Nuclear)을 함유하는 완전 성장 배양액을 웰당200㎕씩 가하고 32℃에서 24시간 동안 배양함으로써 방사능 표지된다.

C. 폴리양이온 처리

24시간 동안의 대사적 방사능 표지가 끝나면 사용된 배양액 처리전 샘플(이하 PT로 약칭)을 수거해 둔다. 배양세포에 웰당 0.5ml의 둘베코 Ca²⁺, Mg²⁺없는 인산완충염수(이하 PBS로 약칭)을 가하고 세척하는 조작을 2회 반복함으로써 배양세포의 잔사등을 제거한 뒤 최종농도 1uM, 10uM 혹은 100uM의 폴리-L-라이신 또는 폴리-L-아르지닌을 함유하는 PBS를 가하고 32℃에서 30분간 배양한다. 30분의 배양이 끝난 뒤 이 배양액을 수거하여 처리샘플(이하 T 샘플)로 정의한다. 수거된 모든 샘플들은 원심분리하여 부유세포 기타 잔사를 제거하고 50ul의 상등액은 젖산 탈수소효소 활성측정(LDH 활성측정)을 따로 덜어두고 나머지는³H- 뮤신함량을 측정할 때까지 -70℃에서 냉동저장했다.

D. 뮤신 함량 측정

히알루로니다제에 의해 분해되지 않으며, 세파로즈 CL-4B 컬럼으로부터 배제되는 고분자량의 글리코콘쥬게이트를 뮤신으로 정의하였다(Kim et al., J. Biol. Chem. 260 : 4021-4027, 1985). 각 배양웰간에 있을 수 있는 뮤신 기초유리율의 변이도를 보정하기 위하여 T기간 동안 유리된 뮤신의 양을 PT기간 동안 유리된 뮤신의 양으로 나누어 얻어지는 비율을 분비지수(Secretory Index)로 정의하고 대조군과 약물처리군의 분비지수 평균값을 통계학적으로 비교함으로써 뮤신유리에 미치는 약물의 효과를 검증하였다.

이상의 과정을 요약하면 다음과 같다. 완전히 성장하고 분화된 HTSE 세포에 뮤신을 구성하는 탄수화물중의 일부인 글루코사민을 삼중수소로 표지한³H-글루코사민을 사용하여 뮤신을 대사적 방사능 표지화한 뒤, 후보물질 처리군과 대조군간의 방사성 뮤신분비 정도의 차이를 비교함으로써 후보물질의 뮤신분비 억제효능을 검색하였다.

[결과]

1) PLL 373량체의 경우 1μM 농도에서 뮤신분비를 억제시켰다(도1 : 각바는 4 배양웰로 부터의 평균 +/- 표준오차를 나타내며, *는 컨트롤과 유의적으로 상이함(P〈0.05)을 나타낸다. 이하 같다).

2) PLL 46량체 및 PLA 46량체의 경우 10μM 농도에서 뮤신분비를 억제시켰다(도1).

3) PLL 20량체, 14량체 및 PLA 20량체, 14량체는 100μM 농도에서 뮤신분비를 억제시켰다(도2,3,5,6).

4) PLL 5량체 및 PLA 5량체는 100μM 농도에서 뮤신분비를 억제시키지 않았다(도4 및 도7).

이상의 결과에서, PLL 및 PLA는 373량체 내지 14량체의 범위에서 뮤신분비 억제기능을 나타내며 중합도가 5량체 정도로 축소되면 뮤신분비 억제기능이 소실되는 것으로 판단된다. 이러한 결과는 폴리양이온성 뿐만 아니라 분자의 크기등의 특징이 뮤신분비 억제기능에 중요한 요인으로 작용할 가능성을 나타낸다.

[실시예 3] 동물실험

A. 이산화황(SO₂) 노출 실험장치의 설계 및 제작

가로 100cm, 세로 60cm, 높이 25cm의 직육면체 상자를 두께 1cm의 아크릴 수지판을 재료로 하여 제작하였다. 가로면에 SD랫트가 출입할 수 있도록 가로, 세로 10cm 크기의 출입문을 만들고, 가로면과 수직으로 접하고 있는 좌우 양면의 중앙부에 직경 5cm의 구멍을 각면당 3개씩 만든 후 그에 맞는 주입구와 폴리에틸렌 덕트를 장착하였다. 한쪽 덕트는 이산화황이 발생되는 초음파 가습기의 분무구에 연결시키고, 반대쪽 덕트는 0.5마력 용량의 모터로 구동되는 환풍기의 흡기구에 연결시켜 실험종료후 잔류하는 이산화황 기체를 완전히 제거할 수 있도록 하였다.

B. 이산화황에의 노출

15%(V/V) 소듐 메타비설파이트(MBS) 수용액을 초음파 가습기에 주입하고 가습기를 작동시켰다. 작동후 2분이내에 MBS의 증기가 충만했고 작동종료시까지 실험장치 내부의 이산화황 농도는 150ppm으로 유지되었다. 이산화황 농도측정은 20-3600ppm 범위의 공기중 이산화황을 감지할 수 있는 가스텍 검출 키트(Gastec Co. Ltd., Japan)를 이용하였다. SD랫트를 대조군, 이산화황 1주 처리군, 이산화황 2주 처리군, 이산화황 3주 처리군, 이산화황 2주처리후 최종 1주간 이산화황 및 폴리양이온 동시처리(약물처리군) A군, B군, C군으로 분류하고, 각 군당 동물수는 3마리로 하였다. 노출기간은 1일 3시간, 1주일에 5일, 각 군별로 1주, 2주 혹은 3주간이었다. 대조군은 실험장치가 설치된 동일한 실내에 전 실험기간동안, 1일 3시간의 이산화황 노출조작만 제외하고 노출군과 동일한 조건하에 사육되었다.

C. 기관내 폴리양이온의 흡입투여

폴리-L-아르지닌 56량체의 PBS(ph 7.2)용액을 최종농도 50(A군), 500(B군), 5000μM(C군)로 조제하여, 이산화황 2주처리후 최종 1주간 이산화황 및 폴리양이온 동시처리(약물처리군) A군, B군, C군에 소속된 동물에게 개체당 100㎕를 분무기(PARI master, starnberg, Germany)를 이용, 기도내 흡입 투여시켰다. 즉, 총 3주간의 이산화황 노출 기간중 마지막 1주간(총 5일), 매일 반복적으로 폴리양이온을 투여하였는데, 폴리양이온 투여는 오전 10시에서 11시 사이에 이산화황 노출은 오후 1시에서 4시까지 각각 실시하였다.

D. 기도 과다분비 유발여부 및 폴리양이온의 약리작용 확인

1주, 2주, 혹은 3주간의 노출기간이 종료된 후, 각 군에 소속된 해당 SD랫트를 이산화탄소로 질식사시킨 후 기관을 절개, 분리한 후, 냉각된 10% 중성완충 포르말린액에 넣어 24 시간동안 고정하였다. 고정한 조직을 파라핀으로 포매(embedding)하였다. 마이크로톰을 이용, 5㎕ 두께로 잘라 조직절편을 제작하고, PAS 염색을 실시한 후 광학현미경하에서 관찰하고 사진촬영하였다. 대조군, 이산화황 처리군, 폴리양이온 투여군의 기관내강 배상세포의 증식여부 및 배상세포내 점액함유 정도를 비교함으로써 기도점액 과다분비 유발여부 및 폴리양이온이 배상세포내 점액함량에 미치는 영향을 판별하였다.

이상의 과정을 요약하면 다음과 같다. 150ppm 농도의 이산화황에 3주간 노출시켜 기도점액 과다분비 상태를 유발시킨 SD랫트에게 후보물질중 PLA 56량체 처리군, 이산화황 3주 노출군, 대조군간의 기도 배상세포내 점액함유 정도를 조직학적으로 비교하여 후보물질의 뮤신분비 억제효능을 검색하였다.

[결과]

중합도 56량체의 PLA는 100㎕ 용량으로 흡입투여시 농도의존적으로 기도 배상세포내 점액함유 정도를 대조군의 수준으로 정상화시켰으며, 5mM 농도에서 최고효능을 발현하였다(도8 참조 : (A) 대조군, (B) 이산화황 3주 노출군, (C) PLA 56량체 50μM 처리군, (D) PLA 56량체 50μM 처리군, (E) 56량체 5mM 처리군)

[실시예 4] 세포독성실험

폴리양이온성 특징이 나타낼 수 있는 세포독성 유발여부를 규명하기 위하여, 유해물질에 의한 세포막의 손상시 세포질로부터 유리되는 것으로 알려진 젖산 탈수소효소(LDH) 활성의 검출정도를 세포독성의 지표로 채택했다. LDH 활성 측정은 상업적 측정키트(Sigma, LD-L 10)를 이용하였다. 배양세포를 폴리양이온으로 32℃에서 30분간 처리한 후, 50㎕의 배양상등액을 측정키트의 반응 혼합물 1ml와 혼합하고 340nm에서의 경시적 흡광도 증가치를 UV-분광측광기로 측정, LDH 활성도를 계산하였다. 후보물질 처리군과 대조군의 배양 상등액내의 LDH 활성측정치의 차이를 비교함으로써 후보물질에 의한 세포독성 유발가능성을 검색하였다.

[결과]

1) PLL 373량체는 1μM 농도에서 세포독성 지표인 LDH유리를 증가시켰다(도9).

2) PLL 46량체 및 PLA 46량체는 10μM 농도에서 세포독성 지표인 LDH유리를 증가시키지 않았다(도10 및 도13).

3) PLL 20량체 및 PLA 20량체는 활성농도의 10배 및 100배에 해당하는 농도인 1∼10mM에서 세포독성 지표인 LDH유리를 증가시키지 않았다(도11 및 도14).

4) PLL 14량체 및 PLA 14량체도 활성농도의 10배 및 100배에 해당하는 농도인 1∼10mM에서 세포독성 지표인 LDH유리를 증가시키지 않았다(도12 및 도15).

5) PLL 5량체 및 PLA 5량체도 100μM 농도에서 세포독성 지표인 LDH유리를 증가시키지 않았다(도면 생략).

이상의 결과에서 PLL, PLA의 뮤신분비 억제효능은 세포독성을 유발시키지 않는 안전한 범위내에서 발현되는 것으로 판단되며, 뮤신분비 억제효능 및 세포독성 유발과정은 별개의 기전임을 시사한다.

[비교예 1] N-아세틸화 폴리양이온 실험

폴리양이온성 특징과 뮤신분비 억제효능 발현의 기전적 상관성을 규명하기 위하여 폴리양이온성을 차단시킨 N-아세틸화 폴리펩티드를 만들어 상기 실험에 적용하였다.

A. N-아세틸화 방법

폴리양이온 0.1mM 혹은 1mM 수용액 100㎕에 초산 나트륨을 최종 농도로서 폴리양이온의 1.5배가 되도록 첨가하여 혼합하였다. 그리고 나서 총 25㎕의 무수초산을 가하여 아세틸화 반응을 진행시키는데, 실온에서 5㎕씩 5회에 걸쳐 나누어 가했으며, 각 첨가조작의 간격은 10분이었다. 무수초산 첨가가 종료되면 100℃에서 2분간 가열하여 반응을 완결시킨 뒤 얼음에 넣어 식혔다. 무수초산을 가하지 않은채 전과정을 거친 폴리양이온 수용액을 동시에 준비하여 N-아세틸화 과정에서 있을 수 있는 폴리양이온의 활성 소실을 보정하고자 하였다. N-아세틸화 반응으로 양전하가 차단된 반응산물과 극소량의 미반응물질을 분리하기 위하여 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하였다. 양이온 교환 수지로는 CM-세파로즈 CL-6B(pharmacia)를 선택하여 0.7 × 5cm 컬럼에 충전하고 0.05M 인산완충액(pH 7.5)으로 세척 및 평형화시켰다. 반응 혼합물중의 여분의 초산을 중화시킨뒤 0.05M 인산완충액을 첨가하여 전체용량을 200㎕로 맞추고, 샘플을 컬럼에 적용하였다. N-아세틸화 산물은 양전하가 차단되어 세척단계에 용출되므로 세척에 필요한 용량(3ml)의 인산완충액을 적용한 후 즉시 0.3ml씩 분획을 수거하였다. 세척용 완충액이 컬럼의 상표면(bed surface)을 지나자마자 0.05M 인산완충액으로 조제한 2M NaCl용액 3ml을 컬럼에 적용하고 세척단계와 동일한 방법으로 분획을 수거하였다. 아세틸화 되지 않은 폴리양이온에 대해서도 같은 과정을 적용하여 N-아세틸화 폴리양이온의 용출 양상과 비교하였다. UV 분광측광기를 이용, 210nm에서의 흡광도를 측정함으로써 반응산물이 용출된 분획들을 확인하였고, 해당 분획들을 한 용기에 수거하여 동결건조시킨 후 뮤신유리 측정 실험에 사용하였다.

B. N-아세틸화 폴리양이온의 처리 및 뮤신 함량 측정

N-아세틸화 폴리양이온의 처리농도가 1μM 또는 10μM인 것을 제외하고는 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 N-아세틸화 폴리-L-라이신 또는 N-아세틸화 폴리-L-아르지닌을 처리하고 뮤신함량을 측정하였다.

이상의 과정을 요약하면 다음과 같다. 폴리양이온의 양전하성 아민작용기를 N-아세틸화하여 양전하를 차단한 폴리펩티드를 얻었다. HTSE 배양세포에서 뮤신을 방사능 표지화한뒤 대조군, 폴리양이온 처리군, N-아세틸화 폴리양이온 처리군간의 방사성 뮤신분비의 차이를 비교함으로써 폴리양이온성 특징과 뮤신분비 억제효능 발현의 기전적 상관성을 규명하였다.

[결과]

뮤신분비 억제효능이 발현되는 PLL 373량체, PLL 46량체, PLA 46량체의 경우, N-아세틸화로 폴리양이온성 특징을 차단했을 때, 뮤신분비 억제효능이 소실되었다(도16,17,18).

이상의 결과에서 양전하의 차단으로 뮤신분비 억제효능이 소실되는 점으로 보아, 상기 폴리펩티드의 기도뮤신분비 억제효능 발현은 기전적으로 폴리양이온과 뮤신분비세포막 표면 음전하와의 정전기적 상호작용에 기인하였을 가능성을 나타낸다.

본 발명에 따른 폴리양이온성을 지니는 폴리펩티드는 세포독성이 나타나지 않는 안전한 범위내에서 뮤신분비 억제효능을 발현하므로, 기도점액 과다분비 억제기능을 가져 기도 점액 과도분비로 고통받는 환자들의 점액 과다분비를 조절하여 고통경감 및 질환치료에 도움을 준다.

Claims (4)

1. 폴리양이온성을 지니는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 기도 뮤신 분비 억제제.
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 폴리-L-라이신인 것을 특징으로 하는 기도 뮤신 분비 억제제.
3. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 폴리-L-아르지닌인 것을 특징으로 하는 기도 뮤신 분비 억제제.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 구성하는 단량체의 수가 14개 이상인 것을 특징으로 하는 기도 뮤신 분비 억제제.