KR20070107052A - 뮤신 과분비 억제제 및 이용방법 - Google Patents

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Abstract

24개 이하의 아미노산을 포함하는 펩티드를 제공한다. 상기 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1(PEPTIDE 1)의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 미리스토일화되지 않은 MANS 펩티드를 제공한다. 아울러, 상기 펩티드를 사용하는 다양한 방법을 제공한다.
MANS 펩티드, 펩티드 1(PEPTIDE 1)

Description

뮤신 과분비 억제제 및 이용방법{Mucin Hypersecretion Inhibitors and Methods of Use}
본 발명은 일반적으로 펩티드를 포함하는 조성물 및 그의 이용방법에 관한 것이다.
점액(mucus)은 겔을 형성할 수 있는 생물학적 액체로, 물과 다양한 세포의 분비산물을 포함하는 성분들의 혼합물이다. 또한, 뮤신(mucin)은 점액당단백질(mucus glycoprotein) 또는 상피당단백질(epithelial glycoprotein)로 불리우며, 다수의 이당류 측쇄(side chain)가 펩티드 중심(core)에 N- 및 O- 결합으로 연결되어 있는 것으로 특정지워지는 점액과 당복합물(glycoconjugate)의 주 구성성분이다. 뮤신(점액의 당단백질 성분)의 과분비(hypersecretion)는 천식(asthma), 만성 기관지염(choronic bronchitis) 및 낭포성섬유증(cystic fibrosis)을 포함하는 몇몇 호흡기 질환에서 발생하며, 이러한 질병들을 가지는 환자의 사망에 대한 위험인자이다.
기도 내에서, 뮤신은 표면상피에서의 배상세포(goblet cell) 및 점막하 샘(submucosal gland)의 점액세포로부터 기도 표면으로 분비된다. 기도에서의 표면 액체(점액)의 총량은 점액제거율(상피의 재흡수, 증발, 섬모의 수송 및 기침에 의한 수송에 의해)과 함께 점액분비율의 결과, 즉, 점액분비와 점액제거율의 차이의 결과에 의한다. "정상적인(normal)" 상태하에서는, 점액의 분비와 제거율은 균형을 이뤄, 얇은 액체 표면 막만이 기관지관분지(tracheobronchial tree)를 덮는다. 점액 과분비(점액제거의 부수적인 증가가 동반되지 않는다면)는 정상적인 상태에 대하여 점액 양의 순수 증가를 가져오며, 기도 점액의 축적을 이끌어, 그 결과 기류(airflow)의 장애 및 흡입된 미립자와 미생물성 물질(microbial matter)의 정체를 초래한다.
점액의 과분비는 인간과 비-인간 동물의 수많은 기도 염증 질병의 발병에 기여한다. 증가된 점액분비는 친식, 만성 장애성 폐질환(COPD: chronic obstructive pulmonary disease) 및 기관지염 등의 만성질환 상태; 낭포성 섬유증 등의 유전병; 알레르기성 상태(아토피, 알레르기성 염증); 기관지확장증; 및, 폐렴, 비염, 유행성 독감 및 일반적인 감기 등의 수많은 급성, 감염성 호흡기 질환에서 보여진다.
점액의 과분비를 수반하는 많은 호흡기 질환은 기도에서의 염증세포의 존재를 증가시킨다. 이러한 세포들은 상기 세포들에 의해 방출되는 염증 매개체에 의한 조직 손상 및 파괴를 통하여 질병들의 병리에 크게 기여한다. 낭포성 섬유증 환자에 유발되는 만성 염증을 통한 이러한 파괴의 한 예로, 호중구(neutrophil)로부터 방출되는 매개체(예를 들어, 골수세포형 과산화효소(myeloperoxidase))는 기 도 상피조직의 박리를 유발한다.
포유동물의 기도는 기도 표피세포(배상세포) 및 점막하샘(submucosal gland)에 의해 생성되고, 분비되는 점액의 얇은 층으로 덮혀 있다. 천식, COPD, 만성 기관지염 및 낭포성 섬유증 등의 질병에서, 점액의 과분비는 일반적인 손상이다. 과다한 점액은 기도 벽 및 인접한 조직의 장애, 감염의 민감성 및 파괴를 야기시킬 수 있다. 점액의 주요 구성성분은 분비세포(예를 들어, 배상세포 및 점액세포)에 의해 합성되는 뮤신 당단백질이며, 세포질 막에 결합 된 과립 내에 저장된다. 뮤신은 호흡기, 위장관 및 여성 생식관에의 상피세포에 의해 분비되는 당단백질의 한 종류이다. 뮤신은 점액의 점탄성(viscoelastic property)을 관장하며, 최소 8개의 뮤신 유전자가 알려졌다. 미합중국 특허출원 제 10/180,753호(공개번호 제 2003/0013652호)를 참조하라. 점액 과분비 및/또는 점액세포 이상증식에 의한 점액섬모 손상은 기도의 점액에 의한 막힘을 유발시켜, 만성 감염, 기류의 장애를 증진시키고 때로는 사망을 유발한다. 만성 기관지염, 만성 장애성 폐질환, 기관지 확장증, 천식, 낭포성 섬유증 및 세균성 감염 등의 많은 기도 질병은 뮤신의 과생성(overproduction)으로 특징지워 진다. 미합중국 특허출원 제 10/180,753호(공개번호 제 2003/0013652호)를 참조하라. 적당한 자극으로, 뮤신 과립은 상기 과립이 세포 주변으로 이동해 원형질막과 융합하여, 내용물의 내강분비(luminal secretion)를 하게 하는 세포외유출(exocytosis) 과정을 통해 방출된다.
이러한 과정의 명백한 병리 생리학적 중요성에도 불구하고, 뮤신 과립의 세포표면에서의 분비자극과 연관된 세포내 신호기작은 최근에서야 밝혀졌다. 리(Li) 등., Journal of Biological Chemistry, 276:40982-40990(2001)을 참조하라. 미리스토일화된, 알라닌 풍부 C 키나제 기질(alanine-rich C kinase substrate, MARCKS) 단백질은 인간 기관지 상피세포에 의한 점액분비에 필요하다고 믿어진다. MARCKS는 분비과립막 및 액틴세포골격(actin cytoskeleton)의 각기 다른 부위에 결합하여, 수축성의 세포골격과 뮤신 과립간의 물리적 결합을 제공하고, 분비과립을 세포막 상의 도킹(docking) 부위로 유도할 수 있는 역할을 하는 것으로 추정되어 왔다. 싱어(Singer) 등의 "A MARCKS-related peptide blocks mucus hypersecretion in a mouse model of asthma", Nature Medicine, 10: 193-196(2004)을 참조하라. MANS 펩티드(myr-펩티드 1)은 "미리스토일화된 알라닌이 풍부한 C-키나아제 기질(myristoylated alanine rich C-kinase substrate)"이라 불리우는 단백질의 미리스토일화된 N-말단 24개 아미노산 서열로, 일반적으로 MARCKS 단백질로 약하여 호칭한다. MARCKS의 24개 아미노산 조각, 미리스토일화된 N-말단 서열(MANS) 펩티드는 실험실 조건(in vitro)에서 뮤신 방출을 억제하고, 또한 마우스 천식모델에서 점액 과분비를 막는 것으로 알려졌다. 상기 리(Li) 등 및 싱어(Singer) 등의 문헌을 참조하라.
막을 가로질러 지질층을 통한 펩티드의 이동을 촉진하는데 있어서 미리스토일화의 중요성은 알려져 있다. 최근의 연구결과는 이러한 중요성을, 비-미리스토일화된(non-myristoylated) 펩티드가 미리스토일화된 펩티드에 비해 세포막을 통과할 수 없음을 보여줌으로써 증명하였다. 하리쉬찬드란(Harishchandran) 등의 "Interation of a Pseudosubstrate Peptide of Protein Kinase C and its Myristoylated Form with Lipid Vesicles..Only the Myristoylated Form Translocates into Lipid Bilayer.", Biochem . Biopys . Acta, 1713: 73-82(2005)을 참조하라.
본 발명의 일 측면에 따르면, 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) MANS 펩티드라 알려진 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이되고, 포유동물에 뮤신-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신-억제효과를 가진다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이된다. 상기 펩티드는 포유동물에 뮤신-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신-억제효과를 가지며, 동일한 농도로 투여하는 경우, NANS 펩티드보다 우수한 뮤신-억제효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이된다. 상기 펩티드는 MANS 펩티드보다 우수한 수용성을 가지며, 포유동물에 뮤신-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신-억제효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서의 뮤신 과분비 억제방법이 제공된다. 상기 방법은 뮤신 분비를 억제하는 펩티드의 뮤신-억제량의 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 가진다. 상기 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서의 뮤신 과분비 억제방법이 제공된다. 상기 방법은 뮤신 분비를 억제하는 펩티드의 뮤신-억제량의 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4부터 23의 연속적인 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이되고, 상기 펩티드는 포유동물에 동일 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 우수한 뮤신-억제효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 포유동물에서의 뮤신 과분비 억제방법이 제공된다. 상기 방법은 뮤신 분비를 억제하는 펩티드의 뮤신-억제량의 포유동물에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4부터 23의 연속적인 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이되고, 상기 펩티드는 MANS 펩티드보다 우수한 수용성을 가진다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, 펩티드 1로 정의된 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열의 변이체로 구성된 아미노산 서열을 가지는 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 선택적, 화학적으로 변이된다. 상기 펩티드는 포유동물에 뮤신-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신-억제효과, 동일한 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 우수한 뮤신-억제효과를 가진다.
본 발명의 펩티드는 천식(asthma), 만성 장애성 폐질환(COPD) 및 만성 기관지염 등의 만성 질환 상태; 낭포성 섬유증 등의 유전질환; 알레르기 조건(아토피, 알레르기성 염증); 기관지확장증(bronchiectasis); 및 폐렴(pneumonia), 비염(rhinitis), 독감(influenza) 및 보통의 감기 등의 수많은 급성, 감염성 호흡기 질환에서 보여지는 뮤신 과분비 질환 및 질환의 징후의 치료에서 뮤신 과분비의 감소 및/또는 뮤신 과분비 억제에 유용하다.
본 발명의 추가적인 실시태양에 따르면, N-말단 아미노산은 미리스토일화되지 않고, C-말단은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이되며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신 과분비-억제효과를 가지는 (a) GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 서열을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열로 구성되는 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드는 폐질환에서의 점액 과분비 치료에 유용하다.
본 발명은 포유동물에서의 뮤신 과분비억제(예를 들어, 뮤신 방출억제) 및 점액생성(본 명세서에서, 때로는 점액분비의 억제로 언급됨)을 포함하는 방법 및 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다. 그러나, 본 발명을 좀 더 상세하게 설명하기에 앞서, 다음의 용어를 우선적으로 정의한다.
정의
"뮤신-억제효과(mucin-inhibiting effect)", "뮤신-억제활성(mucin-inhibiting activity)", 또는 "뮤신분비억제(inhibiting mucin secretion)"는 뮤신 분비량의 감소(예를 들어, 뮤신 방출)를 의미하고, 뮤신 분비의 완전한 중단을 의미하지는 않는다. 뮤신-억제효과를 가지는 조성물의 투여는 이러한 조성물의 부재시 발생할 수 있거나, 또는 예상되는 결과에 비하여 뮤신 분비를 감소시킨다. 본 발명의 일 측면에 따르면, 뮤신 분비의 감소량은 정상수준의 위에서 분비되거나 과분비되는 양의 약 5% 내지 정상 분비수준의 위에서 분비되거나 과분비되는 양의 약 100%일 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, 뮤신 분비의 감소량은 정상수준의 위에서 분비되거나, 과분비되는 양의 약 5%(예를 들어, 정상수준의 위에서 분비되는 양의 5%) 내지 정상 분비 수준의 분비량의 약 50% 까지 같은, 정상 분비 수준 아래의 양까지일 수 있다.
"점액-억제효과(mucus-inhibitin effect)", "점액-억제활성(mucus-inhibiting activity)", 또는 "점액생성억제(inhibiting mucus production)"는 점액생성량의 감소를 의미하며, 점액생성의 완전한 중단을 의미하지는 않는다. 점액-억제효과를 가지는 조성물의 투여는 이러한 조성물의 부재시 발생할 수 있거나, 또는 예상되는 결과에 비하여 점액생성을 감소시킨다.
조성물의 "점액-억제량(mucin-inhibiting amount)" 은 상기 조성물의 부재시, 발생할 수 있는 것에 비하여 점액생성이 감소하거나 억제되는 양이다.
참조 펩티드인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 N-말단에서, G는 1번 위치에; 1번 위치의 G에 인접한 것은 2번 위치의 A; 2번 위치의 A에 인접한 것은 3번 위치의 Q; 3번 위치의 Q에 인접한 것은 4번 위치의 F; 4번 위치의 F에 인접한 것은 5번 취치의 S; 5번 위치의 S에 인접한 것은 6번 위치의 K; 6번 위치의 K에 인접한 것은 7번 위치의 T; 7번 위치의 T에 인접한 것은 8번 위치의 A; 8번 위치의 A에 인접한 것은 9번 위치의 A; 9번 위치의 A에 인접한 것은 10번 위치의 K; 10번 위치의 K에 인접한 것은 11번 위치의 G; 11번 위치의 G에 인접한 것은 12번 위치의 E; 12번 위치의 E에 인접한 것은 13번 위치의 A; 13번 위치의 A에 인접한 것은 14번 위치의 A; 14번 위치의 A에 인접한 것은 15번 위치의 A; 15번 위치의 A에 인접한 것은 16번 위치의 E; 16번 위치의 E에 인접한 것은 17번 위치의 R; 17번 위치의 R에 인접한 것은 18번 위치의 P; 18번 위치의 P에 인접한 것은 19번 위치의 G; 19번 위치의 G에 인접한 것은 20번 위치의 E; 20번 위치의 E에 인접한 것은 21번 위치의 A; 21번 위치의 A에 인접한 것은 22번 위치의 A; 22번 위치의 A에 인접한 것은 23번 위치의 V; 23번 위치의 V에 인접한 것은 24번 위치의 A이며, 상기 서열에서 24번 위치는 참조 펩티드의 C-말단이다.
참조 펩티드의 "변이체(variant)" 또는 참조 펩티드의 4 내지 23개 아미노산 단편의 변이체는, 각각 참조 펩티드 또는 참조 펩티드 단편 아미노산 서열 내에 적어도 하나의 아미노산 위치가 다른 아미노산 서열을 가지는 펩티드이지만, 뮤신- 또는 점액-억제활성을 유지하고, 이 활성은 통상적으로, 각각 참조 펩티드 또는 단편의 활성에 0.1과 10배 사이이며, 바람직하게는, 각각 참조 펩티드 또는 단편의 활성에 0.2와 6배 사이이고, 보다 바람직하게는, 각각 참조 펩티드 또는 단편의 활성에 0.3과 5배 사이이다. 참조 아미노산 서열의 "변이체(variant)" 또는 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개 아미노산 단편의 변이체는, 각각 참조 아미노산 서열 또는 참조 아미노산 서열의 단편에 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산 서열이지만, 각각 펩티드 또는 단편의 뮤신-또는 점액 억제활성을 유지하는 펩티드의 아미노산 서열을 가지고 있고, 참조 아미노산 서열에 의하여 암호화되며, 이 활성은 통상적으로, 참조서열의 각각 펩티드 또는 단편의 활성의 0.1 내지 10배 사이이고, 바람직하게는 참조서열의 각각 펩티드 또는 단편의 활성의 0.2 내지 6배 사이이며, 보다 바람직하게는, 참조서열의 각각 펩티드 또는 단편의 활성의 0.3 내지 5배 사이이다. 치환 변이체 펩티드 또는 치환 변이체 아미노산 서열은 참조 펩티드 또는 참조 아미노산 서열과 참조 아미노산 서열에서의 하나 또는 그 이상의 치환에 의해 다르다; 결실 변이체 펩티드 또는 결실 변이체 아미노산 서열은 참조 펩티드 또는 참조 아미노산 서열과 참조 아미노산 서열에서의 하나 또는 그 이상의 결실에 의해 다르다; 부가 변이체 펩티드 또는 부가 변이체 아미노산 서열은 참조 펩티드 또는 참조 아미노산 서열과 참조 아미노산 서열에서의 하나 또는 그 이상의 부가에 의해 다르다. 변이체 펩티드 또는 변이체 아미노산 서열은 참조서열에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 치환)의 결과, 또는 참조서열의 하나 또는 그 이상의 결실(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 결실)의 결과, 또는 참조서열의 하나 또는 그 이상의 부가(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 부가)의 결과, 또는 그의 조합으로부터 생길 수 있다. 치환 변이체 4 내지 23개 아미노산 펩티드 단편 또는 치환 변이체 4 내지 23개 아미노산 단편 서열은 참조 아미노산 단편 서열에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환에 의해 4 내지 23개 아미노산 펩티드 단편 또는 참조 4 내지 23개 참조 아미노산 단편 서열과 다를 것이다; 결실 변이체 4 내지 23개 아미노산 펩티드 단편 또는 결실 변이체 4 내지 22개 아미노산 단편 서열은 참조 아미노산 단편 서열에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실에 의해 5 내지 23개 참조 아미노산 펩티드 단편 또는 5 내지 23개 참조 아미노산 단편 서열과 다를 것이다; 또한, 4 내지 23개 아미노산 부가 변이체 펩티드 또는 4 내지 23개 아미노산 부가 변이체 아미노산 서열은 참조서열 내에 하나 또는 그 이상의 아미노산 부가에 의해 4에서 22 아미노산 참조 펩티드 서열 또는 4에서 22 아미노산 참조 아미노산 서열과 다를 것이다. 4 내지 23개 아미노산 변이체 펩티드 또는 4 내지 23개 아미노산 변이체 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개 아미노산 단편에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 치환)의 결과, 또는 더 큰 참조 아미노산 서열에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 결실(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 결실)의 결과, 또는 작은 참조 아미노산 서열에서의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 부가(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산의 부가), 또는 그의 조합으로부터 생길 수 있다. 바람직하게는, 변이체 펩티드 또는 아미노산 서열은, 각각 참조 펩티드 또는 참조 펩티드의 단편 또는 참조 아미노산 서열 또는 참조 아미노산 서열의 단편으로부터, 10 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 다르고; 보다 바람직하게는, 8 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가; 더욱 바람직하게는, 6 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가; 더욱 바람직하게는, 5 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가; 반면의 더욱 바람직하게는, 4 이하의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 다르다. 가장 바람직하게는, 상기 변이체 아미노산 서열은 참조 펩티드 또는 단편 아미노산 서열과 하나 또는 두 개 또는 세 개의 아미노산이 다르다.
"서열상동성(sequence identity)"은 두 펩티드의 아미노산 서열에 있어서, 동일한 아미노산을 가지는 위치의 수를 두 서열 중 짧은 서열의 아미노산 수에 의해 나눈 것을 의미한다.
"실질적으로 동일한(substantially identical)"은 두 펩티드의 아미노산 서열의 비교 또는 두 펩티드 단편(예를 들어, 참조 펩티드 아미노산 서열의 단편)의 아미노산 비교에 있어서, 상기 펩티드의 아미노산 서열 또는 펩티드의 단편이 적어도 75% 서열상동성을 가지고, 바람직하게는, 적어도 80% 서열상동성을, 보다 바람직하게는, 적어도 90%의 서열상동성을, 가장 바람직하게는, 적어도 95% 서열상동성을 가짐을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "펩티드(petide)"라는 용어는 펩티드뿐만 아니라, 약학적으로 허용되는 펩티드의 염을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "분리된(isolated)" 펩티드란 세포 구성물(예를 들어, 핵산 및 다른 펩티드)로부터 정제, 재조합 합성, 또는 화학 합성에 의해 분리된 또는 실질적으로 분리된 자연적으로 발생한 펩티드를 의미하고, 또한, 세포 구성물, 생물학적 물질, 화학적 전구체, 또는 다른 화학 약품으로부터 정제 또는 실질적으로 정제된 비-자연적으로 발생 재조합된 또는 화학적으로 합성된 펩티드도 포함한다.
다음의 세-글자 또는 한-글자 아미노산 약어는 본 문서의 도처에 사용되었다: 알라닌: (Ala) A; 아르기닌: (Arg) R; 아스파라긴: (Asn) N; 아스파르트산: (Asp) D; 시스테인: (Cys) C; 글루타민: (Gln) Q; 글루타민산: (Glu) E; 글리신: (Gly) G; 히스티딘: (His) H; 이소루이신: (Ile) I; 루이신: (Leu) L; 라이신: (Lys) K; 메티오닌: (Met) M; 페닐알라닌: (Phe) F; 프롤린: (Pro) P; 세린: (Ser) S; 트레오닌: (Thr) T; 트립토판: (Trp) W; 타이로신: (Tyr) Y; 발린: (Val) V. 괄호 안의 본 명세서에 유용하게 사용된 아미노산의 추가의 세-글자 기호는 (Hyp) 히드록시프롤린, (Nle) 노르루이신, (Orn) 오르니틴, (Pyr) 피로글루타민산 및 (Sar) 사로신을 포함한다. 통상적으로, 펩티드의 아미노말단(또는 N-말단)은 펩티드의 기재된 아미노산 서열의 왼쪽 끝에 나타내고, 카르복시말단(또는 C-말단)은 기재된 아미노산 서열의 오른쪽 끝에 나타낸다. 펩티드의 아미노산 서열은 펩티드에서의 펩티드결합에 의해 공유결합된 아미노산을 나타내기 위해 한 글자 기호로 기재될 수 있다.
표 9는 각각의 상응하는 펩티드번호 및 서열번호와 함께 한 글자 약어 형식의 아미노산 서열 리스트를 포함한다. 참조 펩티드 아미노산 서열은 펩티드 1로 나타내었다. 본 명세서에 참조 아미노산 서열의 4 내지 23개의 인접한 아미노산의 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 아미노산 서열은 펩티드 2 내지 231로, MANS 펩티드의 아미노산을 포함하는 임의의 N-말단 서열(RNS: random N-terminal sequence)의 아미노산 서열을 가지는 펩티드 232와 함께 나타내었다. 본 명세서에 기술된 본 발명의 펩티드 아미노산 서열의 대표적인 변이체 아미노산 서열 역시 펩티드 233 내지 245 및 247 내지 251로 나타내었다. 상기에서 나타낸 변이체 펩티드는 펩티드를 제한하는 그룹은 아니고, 본 발명의 변이체 펩티드의 대표적인 예를 나타내는 것이다. 또한, 본 발명의 대표적인 역(reverse) 아미노산 서열 및 대표적인 임의의 펩티드 아미노산 서열을 나타내었다. 표에서 역 및 임의의 아미노산 서열은 본 발명을 대표하는 것은 아니다.
표 9에 개시된 펩티드의 아미노산 서열은 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, 표 9에 개시된 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 아민이 화학적으로 변이되어 카르복시산을 가지는 아민을 형성하였다면, 상기 결과의 펩티드는 때때로 본 명세서에서 펩티드 번호에 하이픈(-)으로 연결된 카르복시산 접두사와 조합으로 언급하였다. 하나의 예로 펩티드 79에 있어서, N-말단이 미리스토일화된 펩티드 79는 본 명세서에서 때때로 "미리스토일화-펩티드 79" 또는 "myr-펩티드 79"로 언급될 것이고; N-말단이 아세틸화된 펩티드 79는 본 명세서에서 때때로 "아세틸-펩티드 79" 또는 "Ac-펩티드 79"라 언급될 수 있다. 펩티드 79의 환형은 "환형-펩티드 79" 또는 "cyc-펩티드 79"로 언급될 수 있다. 또한, 예를 들어, 표 9에 개시된 펩티드의 아미노산 서열의 C-말단 카르복실기가, 예를 들어, 암모니아 등의 아민이 C-말단 아미드를 형성에 의한 것처럼 화학적으로 변이되었다면, 상기 결과 펩티드는 본 명세서에서 펩티드 번호에 하이픈(-)으로 연결된 아민잔기(amine residue) 접미사의 조합으로 언급된다. 따라서, 예를 들어, 펩티드 79의 C-말단 아미드는 때때로 "펩티드-NH2"로 언급될 수 있다. 예를 들어, 펩티드(예를 들어, 펩티드 79)의 N-말단이, 미리스토일기로 화학적으로 변이되고, C-말단 카르복실기가 암모니아기로 화학적으로 변이되어 상술한 바와 같이 아미드를 형성하였다면, 상기 결과 펩티드는 접두사 및 접미사 표시법을 모두 사용해, "myr-펩티드 79-NH2"로 언급될 수 있다.
본 발명은 MANS 펩티드의 아미노산 서열과 관계된 아미노산 서열을 가지는 24개 이하의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함한다(즉, MANS 펩티드는 미리스토일-펩티드 1이고, MANS 펩티드의 참조 24개 아미노산 서열은 펩티드 1이다). 본 발명의 펩티드는 24개 이하의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열로 구성되고, 8 내지 14개, 10 내지 12개, 9 내지 14개, 9 내지 13개, 10 내지 13개, 10 내지 14개, 적어도 9개, 적어도 10개 또는 그와 같은 아미노산으로 구성될 수 있다. 상기 펩티드는 통상적으로 직쇄형이지만, 환형 펩티드일 수도 있다. 아울러, 상기 펩티드는 분리된 펩티드일 수 있다.
펩티드 1인 참조 24 아미노산 서열에 있어서, 연속된 23개 아미노산의 단편은 본 명세서에서 때때로 23-머(mer)로 언급된다. 마찬가지로, 참조서열의 연속된 22개 아미노산의 단편은 본 명세서에서 때때로 20-머로 언급되고; 19개 아미노산 서열은 19-머로; 18개 아미노산 서열은 18-머로; 17개 아미노산 서열은 17-머로; 16개 아미노산 서열은 16-머로; 15개 아미노산 서열은 15-머로; 14개 아미노산 서열은 14-머로; 13개 아미노산 서열은 13-머로; 12개 아미노산 서열은 12-머로; 11개 아미노산 서열은 11-머로; 10개 아미노산 서열은 10-머로; 9개 아미노산 서열은 9-머로; 8개 아미노산 서열은 8-머로; 7개 아미노산 서열은 7-머로; 6개 아미노산 서열은 6-머로, 5개 아미노산 서열은 5-머로; 4개 아미노산 서열은 4-머로 언급된다. 본 발명의 일 측면에서는, "4- 내지 23-머" 아미노산 서열 중 어느 하나는 그 자체로 펩티드(본 명세서에서, 때때로 H2N-펩티드-COOH를 의미)이며, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, 이러한 화학적 변이는 (i) C1 또는 바람직하게는 C2(아세트산)에서 C22 카르복시산의 예와 같은 N-말단 아민기(H2N-펩티드-)에 아미드형성; 암모니아 또는 C1 내지 C22 일차 또는 이차 아민을 가지는 예와 같은 C-말단 카르복실기에 아미드 형성; 및, (iii) 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합 등의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 8 내지 14개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합 등의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 10 내지 12개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합 등의 변이체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 펩티드는 참조서열인 펩티드 1의 적어도 9개, 적어도 10개, 9 내지 14개, 9 내지 13개, 10 내지 13개, 10 내지 14개, 또는 그와 같은 연속된 아미노산; 그에 실질적으로 동일한 아미노산 서열; 또는 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합 등의 것들을 포함하는 그룹에서 선택되는 변이체를 가지는 아미노산 서열을 가진다. 상세히 설명하면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산(예를 들어, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산)은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 것이고; 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산은 화학적으로 변이될 수 있는 반면, 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드 아미노산의 어느 것도 화학적으로 변이되지 않을 것이다. 본 발명의 일 측면에서는, 바람직한 변이는 펩티드 또는 펩티드 단편의 N-말단 아미노산의 아민기(H2N-)에서 일어날 수 있다(이 아민기가 N-말단보다는 펩티드 서열의 내부에 존재한다면, 펩티드 아민결합을 형성할 수 있다). 본 발명의 다른 측면에 따르면, 바람직한 변이는 펩티드 또는 펩티드 단편의 C-말단 아미노산의 카르복실기(-COOH)에서 일어날 수 있다(이 카르복실기가 C-말단보다는 펩티드 서열의 내부에 존재한다면, 펩티드 아미드결합을 형성할 수 있다). 본 발명의 다른 측면에 따르면, 바람직한 변이는 N-말단 아민기(H2N-) 및 C-말단 카르복실기(-COOH)에서 일어날 수 있다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열인 펩티드 1의 N-말단 아미노산으로부터 시작한다. 예를 들어, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 N-말단 아미노산으로부터 시작되는, 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열(즉, 펩티드 2, 펩티드 4, 펩티드 7, 펩티드 11, 펩티드 16, 펩티드 22, 펩티드 29, 펩티드 37, 펩티드 46, 펩티드 56, 펩티드67, 펩티드 79, 펩티드 92, 펩티드 106, 펩티드 121, 펩티드 137, 펩티드 154, 펩티드 172, 펩티드 192, 또는 펩티드 211); (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열 펩티드 1의 C-말단 아미노산에서 끝난다. 예를 들어, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 C-말단 아미노산에서 끝나는, 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열(즉, 펩티드 3, 펩티드 6, 펩티드 10, 펩티드 15, 펩티드 21, 펩티드 28, 펩티드 36, 펩티드 45, 펩티드 55, 펩티드 66, 펩티드 78, 펩티드 91, 펩티드 105, 펩티드 120, 펩티드 136, 펩티드 153, 펩티드 171, 펩티드 190, 펩티드 210, 또는 펩티드 231); (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열인 펩티드 1의 N-말단 아미노산에서 시작되지 않고, 그보다는 참조서열인 펩티드 1의 2번 위치의 아미노산과 21번 위치의 아미노산 사이에서 시작한다. 예를 들어, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 위치 2 내지 위치 21 사이의 어느 한 아미노산에서 시작하는, 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열로 구성된 그룹에서 선택된 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 펩티드는, 참조서열인 펩티드 1의 중앙부에서의 펩티드에서 4 내지 23개의 아미노산 길이일 것이고; (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체일 수 있다. 이러한 펩티드는 표 9에 개시하였다.
본 발명에서 포유동물에서의 뮤신 과분비 억제, 뮤신 과분비량의 감소에 유용하고, 뮤신 과분비 억제방법, 뮤신 과분비 감소의 방법에 유용한 펩티드 아미노산 서열은 분리된 펩티드의 아미노산 서열 및 본 발명의 N-말단- 및/또는 C-말단이 화학적으로 변이된 그룹을 선택적으로 포함하는 펩티드의 아미노산 서열을 포함하며, 이러한 펩티드 아미노산 서열은 23-머(즉, 23 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 2; 및 펩티드 3; 및 22-머(즉, 22 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 4; 펩티드 5; 및 펩티드 6; 21-머(즉, 21 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 7; 펩티드 8; 펩티드 9; 및 펩티드 10; 20-머(즉, 20 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 11; 펩티드 12; 펩티드 13; 펩티드 14; 펩티드 15; 19-머(즉, 19 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 16; 펩티드 17; 펩티드 18; 펩티드 19; 펩티드 20; 및 펩티드 21; 18-머(즉 18 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 22; 펩티드 23; 펩티드 24; 펩티드 25; 펩티드 26; 펩티드 27; 및 펩티드 28; 17-머(즉, 17 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 29; 펩티드 30; 펩티드 31; 펩티드 32; 펩티드 33; 펩티드 34; 펩티드 35; 및 펩티드 36; 16-머(즉, 16 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 37; 펩티드 38; 펩티드 39; 펩티드 40; 펩티드 41; 펩티드 42; 펩티드 43; 펩티드 44; 및 펩티드 45; 15-머(즉, 15 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 46; 펩티드 47; 펩티드 48; 펩티드 49; 펩티드 50; 펩티드 51; 펩티드 52; 펩티드 53; 펩티드 54; 및 펩티드 55; 14-머(즉, 14 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 56, 펩티드 57, 펩티드 58, 펩티드 59, 펩티드 60; 펩티드 61; 펩티드 62; 펩티드 63; 펩티드 64; 펩티드 65; 및 펩티드 66; 13-머(즉, 13 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 67; 펩티드 68; 펩티드 69; 펩티드 70; 펩티드 71; 펩티드 72; 펩티드 73; 펩티드 74; 펩티드 75; 펩티드 76; 펩티드 77; 및 펩티드 78; 12-머(즉 12 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 79; 펩티드 80; 펩티드 81; 펩티드 82; 펩티드 83; 펩티드 84; 펩티드 85; 펩티드 86; 펩티드 87; 펩티드 88; 펩티드 89; 펩티드 90; 및 펩티드 91; 11-머(즉 11 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 92; 펩티드 93; 펩티드 94; 펩티드 95; 펩티드 96; 펩티드 97; 펩티드 98; 펩티드 99; 펩티드 100; 펩티드 101; 펩티드 102; 펩티드 103; 펩티드 104; 및 펩티드 105; 10-머(즉, 10 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 106; 펩티드 107; 펩티드 108; 펩티드 109; 펩티드 110; 펩티드 111; 펩티드 112; 펩티드 113; 펩티드 114; 펩티드 115; 펩티드 116; 펩티드 117; 펩티드 118; 펩티드 119; 및 펩티드 120; 9-머(즉, 9 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 121; 펩티드 122; 펩티드 123; 펩티드 124; 펩티드 125; 펩티드 126; 펩티드 127; 펩티드 128; 펩티드 129; 펩티드 130; 펩티드 131; 펩티드 132; 펩티드 133; 펩티드 134; 펩티드 135; 및 펩티드 136; 8-머(즉, 8 아미노산을 가지는 펩티드): 펩티드 137; 펩티드 138; 펩티드 139; 펩티드 140; 펩티드 141; 펩티드 142; 펩티드 143; 펩티드 144; 펩티드 145; 펩티드 146; 펩티드 147; 펩티드 148; 펩티드 149; 펩티드 150; 펩티드 151; 펩티드 152; 및 펩티드 153; 7-머(즉, 7 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 154; 펩티드 155; 펩티드 156; 펩티드 157; 펩티드 158; 펩티드 159; 펩티드 160; 펩티드 161; 펩티드 162; 펩티드 163; 펩티드 164; 펩티드 165; 펩티드 166; 펩티드 167; 펩티드 168; 펩티드 169; 펩티드 170; 및 펩티드 171; 6-머(즉, 6 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 172; 펩티드 173; 펩티드 174; 펩티드 175; 펩티드 176; 펩티드 177; 펩티드 178; 펩티드 179; 펩티드 180; 펩티드 181; 펩티드 182; 펩티드 183; 펩티드 184; 펩티드 185; 펩티드 186; 펩티드 187; 펩티드 188; 펩티드 189; 및 펩티드 190; 5-머(즉, 5 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 191; 펩티드 192; 펩티드 193; 펩티드 194; 펩티드 195; 펩티드 196; 펩티드 197; 펩티드 198; 펩티드 199; 펩티드 200; 펩티드 201; 펩티드 202; 펩티드 203; 펩티드 204; 펩티드 205; 펩티드 206; 펩티드 207; 펩티드 208; 펩티드 209; 및 펩티드 210; 4-머(즉, 4 아미노산 서열을 가지는 펩티드): 펩티드 211; 펩티드 212; 펩티드 213; 펩티드 214; 펩티드 215; 펩티드 216; 펩티드 217; 펩티드 218; 펩티드 219; 펩티드 220; 펩티드 221; 펩티드 222; 펩티드 223; 펩티드 224; 펩티드 225; 펩티드 226; 펩티드 227; 펩티드 228; 펩티드 229; 펩티드 230; 및 펩티드 231로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이다.
분리된 펩티드와 본 발명의 N-말단- 및/또는 C-말단-화학적으로 변이된 펩티드의 바람직한 아미노산 서열은 23-머: 펩티드 2; 및 펩티드 3; 및 22-머: 펩티드 4; 펩티드 5; 및 펩티드 6; 21-머: 펩티드 7; 펩티드 8; 펩티드 9; 및 펩티드 10; 20-머: 펩티드 11; 펩티드 12; 펩티드 13; 펩티드 14; 펩티드 15; 19-머: 펩티드 16; 펩티드 17; 펩티드 18; 펩티드 19; 펩티드 20; 및 펩티드 21; 18-머: 펩티드 22; 펩티드 23; 펩티드 24; 펩티드 25; 펩티드 26; 펩티드 27; 및 펩티드 28; 17-머: 펩티드 29; 펩티드 30; 펩티드 31; 펩티드 32; 펩티드 33; 펩티드 34; 펩티드 35; 및 펩티드 36; 16-머: 펩티드 37; 펩티드 38; 펩티드 39; 펩티드 40; 펩티드 41; 펩티드 42; 펩티드 43; 펩티드 44; 및 펩티드 45; 15-머: 펩티드 46; 펩티드 47; 펩티드 48; 펩티드 49; 펩티드 50; 펩티드 51; 펩티드 52; 펩티드 53; 및 54; 14-머: 펩티드 56, 펩티드 57, 펩티드 58, 펩티드 59, 펩티드 60; 펩티드 61; 펩티드 62; 펩티드 63; 및 펩티드 64; 13-머: 펩티드 67; 펩티드 68; 펩티드 69; 펩티드 70; 펩티드 71; 펩티드 72; 펩티드 73; 펩티드 74; 및 펩티드 75; 12-머: 펩티드 79; 펩티드 80; 펩티드 81; 펩티드 82; 펩티드 83; 펩티드 84; 펩티드 85; 펩티드 86; 및 펩티드 87; 11-머: 펩티드 92; 펩티드 93; 펩티드 94; 펩티드 95; 펩티드 96; 펩티드 97; 펩티드 98; 펩티드 99; 및 펩티드 100; 10-머: 펩티드 106; 펩티드 107; 펩티드 108; 펩티드 109; 펩티드 110; 펩티드 111; 펩티드 112; 펩티드 113; 및 펩티드 114; 9-머: 펩티드 122; 펩티드 123; 펩티드 124; 펩티드 125; 펩티드 126; 펩티드 127; 펩티드 128; 및 펩티드 129; 8-머: 펩티드 139; 펩티드 140; 펩티드 141; 펩티드 142; 펩티드 143; 펩티드 144; 및 펩티드 145; 7-머: 펩티드 157; 펩티드 158; 펩티드 159; 펩티드 160; 펩티드 161; 및 펩티드 162; 6-머: 펩티드 176; 펩티드 177; 펩티드 178; 펩티드 179; 및 펩티드 180; 5-머: 펩티드 196; 펩티드 197; 펩티드 198; 및 펩티드 199; 4-머: 펩티드 217; 및 펩티드 219로 구성된 그룹으로부터 선택한 것이다.
분리된 펩티드와 본 발명의 N-말단- 및/또는 C-말단-화학적으로 변이된 펩티드의 보다 바람직한 아미노산 서열은 23-머: 펩티드 2; 및 펩티드 3; 및 22-머: 펩티드 4; 펩티드 5; 및 펩티드 6; 21-머: 펩티드 7; 펩티드 8; 펩티드 9; 및 펩티드 10; 20-머: 펩티드 11; 펩티드 12; 펩티드 13; 펩티드 14; 펩티드 15; 19-머: 펩티드 16; 펩티드 17; 펩티드 18; 펩티드 19; 펩티드 20; 및 펩티드 21; 18-머: 펩티드 22; 펩티드 23; 펩티드 24; 펩티드 25; 펩티드 26; 펩티드 27; 및 펩티드 28; 17-머: 펩티드 29; 펩티드 30; 펩티드 31; 펩티드 32; 펩티드 33; 펩티드 34; 펩티드 35; 및 펩티드 36; 16-머: 펩티드 37; 펩티드 38; 펩티드 39; 펩티드 40; 펩티드 41; 펩티드 42; 펩티드 43; 펩티드 44; 및 펩티드 45; 15-머: 펩티드 46; 펩티드 47; 펩티드 48; 펩티드 49; 펩티드 50; 펩티드 51; 펩티드 52; 펩티드 53; 및 54; 14-머: 펩티드 56, 펩티드 57, 펩티드 58, 펩티드 59, 펩티드 60; 펩티드 61; 펩티드 62; 펩티드 63; 및 펩티드 64; 13-머: 펩티드 67; 펩티드 68; 펩티드 69; 펩티드 70; 펩티드 71; 펩티드 72; 펩티드 73; 및 펩티드 74; 12-머: 펩티드 80; 펩티드 81; 펩티드 82; 펩티드 83; 펩티드 84; 펩티드 85; 펩티드 86; 및 펩티드 87; 11-머: 펩티드 92; 펩티드 93; 펩티드 94; 펩티드 95; 펩티드 96; 펩티드 97; 펩티드 98; 펩티드 99; 및 펩티드 100; 10-머: 펩티드 106; 펩티드 107; 펩티드 108; 펩티드 109; 펩티드 110; 펩티드 111; 펩티드 112; 펩티드 113; 및 펩티드 114; 9-머: 펩티드 124; 펩티드 125; 펩티드 126; 펩티드 127; 펩티드 128; 및 펩티드 129; 8-머: 펩티드 141; 펩티드 142; 펩티드 143; 펩티드 144; 및 펩티드 145; 7-머: 펩티드 159; 펩티드 160; 펩티드 161; 및 펩티드 162; 6-머: 펩티드 178; 펩티드 179; 및 펩티드 180; 5-머: 펩티드 198; 및 펩티드 199; 4-머: 펩티드 219로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열인 펩티드 1의 펩티드 219에서와 같이 연속된 A, K, G 및 E 잔기를 포함한다. 예를 들어, 펩티드는 (a) 참조서열인 펩티드 1의 펩티드 219에서와 같이 연속된 A, K, G 및 E 잔기를 포함하는, 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열(예를 들어, 펩티드 219, 펩티드 45, 펩티드 79, 펩티드 67, 펩티드 80 등); (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가질 것이다.
참조 펩티드 아미노산 서열인 펩티드 1의 AKGE 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편의 예로는, (a) 23-머: 펩티드 2; 및 펩티드 3; 및 22-머: 펩티드 4; 펩티드 5; 및 펩티드 6; 21-머: 펩티드 7; 펩티드 8; 펩티드 9; 및 펩티드 10; 20-머: 펩티드 11; 펩티드 12; 펩티드 13; 펩티드 14; 펩티드 15; 19-머: 펩티드 16; 펩티드 17; 펩티드 18; 펩티드 19; 펩티드 20; 및 펩티드 21; 18-머: 펩티드 22; 펩티드 23; 펩티드 24; 펩티드 25; 펩티드 26; 펩티드 27; 및 펩티드 28; 17-머: 펩티드 29; 펩티드 30; 펩티드 31; 펩티드 32; 펩티드 33; 펩티드 34; 펩티드 35; 및 펩티드 36; 16-머: 펩티드 37; 펩티드 38; 펩티드 39; 펩티드 40; 펩티드 41; 펩티드 42; 펩티드 43; 펩티드 44; 및 펩티드 45; 15-머: 펩티드 46; 펩티드 47; 펩티드 48; 펩티드 49; 펩티드 50; 펩티드 51; 펩티드 52; 펩티드 53; 및 54; 14-머: 펩티드 56, 펩티드 57, 펩티드 58, 펩티드 59, 펩티드 60; 펩티드 61; 펩티드 62; 펩티드 63; 및 펩티드 64; 13-머: 펩티드 67; 펩티드 68; 펩티드 69; 펩티드 70; 펩티드 71; 펩티드 72; 펩티드 73; 펩티드 74; 및 펩티드 75; 12-머: 펩티드 79; 펩티드 80; 펩티드 81; 펩티드 82; 펩티드 83; 펩티드 84; 펩티드 85; 펩티드 86; 및 펩티드 87; 11-머: 펩티드 93; 펩티드 94; 펩티드 95; 펩티드 96; 펩티드 97; 펩티드 98; 펩티드 99; 및 펩티드 100; 10-머: 펩티드 108; 펩티드 109; 펩티드 110; 펩티드 111; 펩티드 112; 펩티드 113; 및 펩티드 114; 9-머: 펩티드 124; 펩티드 125; 펩티드 126; 펩티드 127; 펩티드 128; 및 펩티드 129; 8-머: 펩티드 141; 펩티드 142; 펩티드 143; 펩티드 144; 및 펩티드 145; 7-머: 펩티드 159; 펩티드 160; 펩티드 161; 및 펩티드 162; 6-머: 펩티드 178; 펩티드 179; 및 펩티드 180; 5-머: 펩티드 198; 및 펩티드 199; 4-머: 펩티드 219, (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체를 포함하고, 변이체는 단편이 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 포함하거나 구성하는, 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변이체이다.
본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 바람직한 펩티드 서열은 (a) 참조서열인 펩티드 1의 10 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; 및, (c) (a)에서 정의된 아미노산 서열의 변이체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고, 변이체는 바람직한 아미노산 서열이 23-머: 펩티드 2; 22-머: 펩티드 4; 21-머: 펩티드 7; 20-머: 펩티드 11, 19-머: 펩티드 16; 18-머: 펩티드 22; 17-머: 펩티드 29; 16-머: 펩티드 37; 15-머: 펩티드 46; 14-머: 펩티드 56; 13-머: 펩티드 67; 12-머: 펩티드 79; 11-머: 펩티드 92; 및 10-머: 펩티드 106을 포함하는 치환 변이체, 결실 변이체, 부가 변이체 및 그의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 변이체이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열인 펩티드 1의 N-말단 아미노산으로부터 시작하고, 참조서열인 펩티드 1의 펩티드 219 에서와 같이 연속된 A, K, G 및 E 잔기를 포함하는 반면, 본 발명의 다른 실시태양에 따르면, 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열인 펩티드 1의 C-말단 아미노산에서 끝나며, 참조서열인 펩티드 1의 펩티드 219에서와 같이 연속된 A, K, G 및 E 잔기를 포함한다.
펩티드는 참조 아미노산 서열에 있어서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 결실, 치환 및/또는 부가를 포함한다. 바람직하게는, 상기 치환은 보존적인 아미노산 치환 또는 비-보존적인 아미노산 치환일 수 있다. 본 발명의 일 실시태양에 따르면, 참조 아미노산 서열의 변이체와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열의 연속된 아미노산에 상응하는 것에 비하여, 결실 또는 부가를 가지지 않을 것이지만, 보존적인 또는 비-보존적인 치환을 가질 것이다. 본 발명의 펩티드에 참조 아미노산 서열을 제조하는 아미노산 치환은 다음을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 라이신(K), 발린(V), 루이신(L), 또는 이소루이신(I)으로 치환되는 아닐린(A); 아스파르트산(D)로 치환되는 글루타민산(E); 프롤린(P)로 치환되는 글리신(G); 아르기닌(R), 글루타민(Q), 또는 아스파라긴(N)으로 치환되는 라이신(K); 루이신(L), 발린(V), 이소루이신(I), 또는 알라닌(A)으로 치환되는 페닐알라닌(F); 글리신(G)로 치환되는 프롤린(P); 글루타민산(E) 또는 아스파라긴(N)으로 치환되는 글루타민(Q); 라이신(K), 글루타민(Q), 또는 아스파라긴(N)으로 치환되는 아르기닌(R); 트레오닌(T)로 치환되는 세린(S); 세린(S)으로 치환되는 트레오닌(T); 및 루이신(L), 이소루이신(I), 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 알라닌(A), 또는 노르루이신(Nle)으로 치환되는 발린(V). 예를 들어, 본 발명의 펩티드에서의 참조 아미노산 서열을 제조할 수 있는 치환은 알라닌(A)의 페닐알라닌(F)로의 치환(예를 들어, 참조 아미노산 서열의 4번 위치 아미노산에), 글루타민산(E)의 글루타민(Q)로의 치환(예를 들어, 참조 아미노산 서열의 3번 위치 아미노산에), 라이신(K)의 알라닌(A)로의 치환(예를 들어, 참조 아미노산 서열의 2번 위치 및/또는 8번 위치 아미노산에) 및/또는 세린(S)의 트레오닌(T)으로의 치환(예를 들어, 참조 아미노산 서열의 7번 위치 아미노산에).
참조 아미노산 서열에 있어서, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 내에 치환이 포함될 때(상기 펩티드는 변이되지 않은 것뿐만 아니라, 예를 들어, 아미드 형성과 같이 N-말단 및/또는 C-말단 변이에 의해 화학적으로 변이된 펩티드를 포함한다), 펩티드의 아미노산 서열과 참조 아미노산 서열 간에는, 바람직하게 적어도 80%의 서열상동성이 있다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 5 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 하나의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 96%(즉, ~97%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 10 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 하나의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 90% 내지 약 96%(즉, ~95.7%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 20 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 하나의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 95% 내지 약 96%(즉, ~95.7%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 10 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 두 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 92%(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 16 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 두 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 87.5% 내지 약 92%(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 20 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 두 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 90% 내지 약 92%(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 15 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 세 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 87%의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 20 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 세 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 85% 내지 약 87%의 서열상동성을 가질 것이다. 참조 아미노산 서열에 있어서, 20 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드와 네 개의 아미노산 치환을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 약 80% 내지 약 83%(즉, ~82.6%)의 서열상동성을 가질 것이다.
본 발명의 펩티드에서, 참조서열(24-머)의 연속된 아미노산 서열에 있어서, 24개 참조 아미노산 서열로부터 선택되는 연속된 23개 아미노산 서열(23-머)에서의 아미노산의 치환은, 참조서열에서의 아미노산 단편과 95.6%(또는 ~96%)의 서열상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공하고, 상기 23-머는 상동성을 가진다. 마찬가지로, 상기 23-머 내에 두 개, 세 개, 네 개 및 다섯 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 91.30%(또는 ~91%), 86,96%(또는 ~87%), 82.61%(또는 ~83%) 및 78.27%(또는 ~78%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 22-머 내에 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 및 다섯 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 95.45%(또는 ~95%), 90.91%(또는 ~91%), 86.36%(또는 ~86%), 81.82%(또는 ~82%) 및 77.27%(또는 ~77%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 21-머 내에 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 및 다섯 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 95.24%(~95%), 90.48%(~91%), 85.71%(~86%), 80.95%(~81%) 및 76.19%(~76%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 20-머 내에 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 및 다섯 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 95.00%(~95%), 90.00%(90%), 85.00%(~85%), 80.00%(~80%) 및 75.00%(~75%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 19-머 내에 한 개, 두 개, 세 개 및 네 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 94.74%(~95%), 89.47%(~89%), 84.21%(~84%) 및 78.95%(~79%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 18-머 내에 한 개, 두 개, 세 개 및 네 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 94.44%(~94%), 88.89%(~89%), 83.33%(~83%) 및 77.78%(~78%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 17-머 내에 한 개, 두 개, 세 개 및 네 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 94.12%(~94%), 88.23%(~88%), 82.35%(~82%) 및 76.47%(~76%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 16-머 내에 한 개, 두 개, 세 개 및 네 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 93.75%(~94%), 87.50%(~88%), 81.25%(~81%) 및 75.00%(~75%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 15-머 내에 한 개, 두 개 및 세 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 93.33%(~93%), 86.67%(~87%) 및 80.00%(~80%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 14-머 내에 한 개, 두 개 및 세 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 92.86%(~93%), 85.71%(~86%) 및 78.57%(~79%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 13-머 내에 한 개, 두 개 및 세 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 92.31%(~92%), 84.62%(~85%) 및 76.92%(~77%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 12-머 내에 한 개, 두 개 및 세 개 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 91.67%(~92%), 83.33%(~83%) 및 75.00%(~75%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 11-머 내에 한 개 및 두 개의 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 90.91%(~91%) 및 81.82%(~82%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 10-머 내에 한 개 및 두 개의 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 90.00%(~90%) 및 80.00%(~80%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 9-머 내에 한 개 및 두 개의 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 88.89%(~89%) 및 77.78%(~78%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 8-머 내에 한 개 및 두 개의 아미노산의 치환은 참조 펩티드 아미노산 서열에 대하여, 각각, 87.50%(~88%) 및 75.00%(~75%)의 서열상동성의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 마찬가지로, 7-머, 6-머, 5-머 및 4-머에서의 한 개의 아미노산의 치환은 참조 펩티드에 대하여, 각각 85.71%(~86%), 83.33%(~83.3%), 80.00%(~80%) 및 75.00%(~75%)의 서열상동성 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 제공한다. 본 발명의 바람직한 아미노산 서열은 참조서열의 아미노산 서열과 80%이상의 서열상동성를 가지며, 보다 바람직하게는, 참조서열의 아미노산 서열과 81% 내지 96%의 서열상동성을 가지며, 보다 바람직하게는, 참조서열의 아미노산 서열과 80% 내지 96%의 서열상동성을 가진다. 바람직한 아미노산 서열은 말단 펩티드 아미노기에 선택적, N-말단적, 화학적으로 C2 내지 C22 직쇄형 지방족 카르복시산 일부분에 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, C2 내지 C16 직쇄형 지방족 카르복시산 일부분에, 가장 바람직하게는, C2 또는 C16 직쇄형 지방족 카르복시산 일부분에 아미드 결합에 의해, 또한 말단 펩티드 카르복실기에서, 선택적으로 아미드 결합에 의해 암모니아 같은 아민에 C-말단의 화학적으로 결합하거나 일차 또는 C1 내지 C16 직쇄형 지방족 일차 아민 등의 이차 아민에 아미드 결합에 의해 결합할 수 있다.
12-머인 펩티드 79의 치환 변이체의 예들은 펩티드 79에서의 3번 위치에 Q가 서열 238에서의 E로 치환된 펩티드 238; 펩티드 79에서의 2번 위치에 A가 펩티드 233에서의 K로 치환된 펩티드 233; 펩티드 79에서의 8번 위치에 A가 펩티드 234에서의 K로 치환된 펩티드 234; 펩티드 79에서의 2번 위치와 8번 위치에 A가 펩티드 235에서의 K로 치환된 펩티드 235; 펩티드 79에서의 4번 위치에 F가 펩티드 237에서의 A로 치환된 펩티드 237; 펩티드 79에서의 10번 위치에 K가 펩티드 239에서의 A로 치환된 펩티드 239; 펩티드 79에서의 11번 위치에 G가 펩티드 240에서의 A로 치환된 펩티드 240; 및 펩티드 79에서의 12번 위치에 E가 펩티드 241에서의 A로 치환된 펩티드 241을 포함한다.
10-머인 펩티드 106의 치환 변이체의 예들은 펩티드 106에서의 4번 위치에 F가 펩티드 236에서의 A로 치환된 펩티드 236; 펩티드 106에서의 1번 위치에 G가 펩티드 242에서의 A로 치환된 펩티드 242; 펩티드 106에서의 3번 위치에 Q가 펩티드 243에서의 A로 치환된 펩티드 243; 펩티드 106에서의 5번 위치에 S가 펩티드 244에서의 A로 치환된 펩티드 244; 펩티드 106에서의 6번 위치에 K가 펩티드 245에서의 A로 치환된 펩티드 245; 펩티드 106에서의 7번 위치에 T가 펩티드 247에서의 A로 치환된 펩티드 247; 펩티드 106에서의 10번 위치에 K가 펩티드 248에서의 A로 치환된 펩티드 248; 펩티드 106에서의 6번 위치 및 10번 위치에 K가 펩티드 249에서의 각각 A로 치환된 펩티드 249를 포함한다.
8-머인 펩티드 137의 치환 변이체의 예로는 펩티드 137에서의 4번 위치에 F가 펩티드 250에서의 A로 치환된 펩티드 250을 포함한다.
4-머인 펩티드 219의 치환 변이체의 예로는 펩티드 219에서의 2번 위치에 K가 펩티드 251에서의 A로 치환된 펩티드 251을 포함한다.
본 명세서에 기술한 치환 변이체 펩티드는 분리된 펩티드 형태 또는 예를 들어, 미리스토일아미드, 아세틸아미드 및 본 명세서에 기술한 바와 같은 N-말단 아미드, 암모니아로 형성된 아미드와 같은 C-말단 아미드, N-말단 아미드 및 C-말단 아미드 등의 화학적으로 변이된 펩티드 형태일 수 있다.
참조 아미노산 서열에 있어서, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열 내에 결실이 포함될 때, 참조 아미노산 서열과 상기 펩티드의 아미노산 서열 사이의의 바람직한 서열상동성은 적어도 80%이다. 5 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 하나의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 80% 내지 약 90%사이(즉, ~95.7%)의 서열상동성을 가질 것이다. 10 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드를 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 하나의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 90% 내지 약 96%사이(즉, ~95.7%)의 서열상동성을 가질 것이다. 20 내지 23개 아미노산을 가지는 펩티드고, 참조 펩티드에 있어서, 하나의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 95% 내지 약 96%사이(즉, ~95.7%)의 서열상동성을 가질 것이다. 10 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 두 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 80% 내지 약 92%사이(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 16 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 두 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 87.5% 내지 약 92%사이(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 20 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 두 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 90% 내지 약 92%사이(즉, ~91.3%)의 서열상동성을 가질 것이다. 15 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 세 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 80% 내지 약 87%사이의 서열상동성을 가질 것이다. 20 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 세 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 85% 내지 약 87%사이의 서열상동성을 가질 것이다. 20 내지 23개 아미노산을 가지고, 참조 펩티드에 있어서, 네 개의 아미노산 결실을 포함하는 펩티드는 참조 아미노산 서열과 80% 내지 약 83%사이(즉, ~82.6%)의 서열상동성을 가질 것이다.
상술한 바와 같이, 펩티드의 하나 또는 그 이상의 아미노산은 또한 화학적으로 변이될 수 있다. 이 분야에 알려진 어떠한 아미노산의 변이도 이 분야에 알려진 어떠한 방법을 이용하여 만들어질 수 있을 것이다.
본 발명의 일부 실시태양에 따르면, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산이 변이될 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단 아미노기(H2N-)가 알킬화, 아미드화, 또는 아세틸화될 수 있고, 또한, 예를 들어, 펩티드의 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기(-COOH)가 아미드화 또는 에스테르화될 수 있다. 예를 들어, N-말단 아미노기는 아세틸기(즉, CH3-C(=O)-) 또는 미리스토일기를 포함하는 아실기 또는 지방족 아실기를 포함하도록 아실화에 의해 변이되어 아미드를 생성할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, N-말단 아미노기는 -C(O)R의 화학식을 가지는 아실기를 포함하도록 변이될 수 있다(이때, R은 1 내지 5개의 탄소원자를 가지는 직쇄형 또는 분지형 알킬기이다). 또는, -C(O)R1 화학식을 가지는 아실기를 포함하도록 변이될 수 있다(이때, R1은 1 내지 15개의 탄소원자를 가지는 직쇄형 알킬기이다). 펩티드의 C-말단 아미노산 역시, 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는 히드록시기 대신에 아미노기를 포함하도록 화학적으로 변이될 수 있다(즉, 아미드화). 본 발명의 일부 실시태양에 따르면, N-말단 및/또는 C-말단 아미노산은 화학적으로 변이되지 않는다.
펩티드는 N-말단 아미드를 생성하도록, N-말단 아미노산의 아미노기가 다음으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 산으로 아실화될 수 있다:
(i) C2 내지 C24 지방족(포화되거나 선택적으로 불포화된) 카르복시산(예를 들어, 아세트산, 프로판산, 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산(미리스트산), 헥사데칸산, 9-헥사데칸산, 옥타데칸산, 9-옥타데센산, 11-옥타데센산, 9,12-옥타데카디엔산, 9,12,15-옥타데카트리엔산, 6,9,12-옥타데카트리엔산, 에이코산산, 9-에이코센산, 5,8,11,14-에이코사테트라엔산, 5,8,11,14,17-에이코타펜타엔산, 도코산산, 13-도코센산, 4,7,10,13,16,19-도코헥사엔산, 테트라코산산 등을 가지는 N-말단 아미드);
(ii) 트리플루오로아세트산;
(iii) 벤조산;
(iv) 지방족 알킬술폰아미드를 생성하는 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산(이때, 술폰산의 C1 내지 C24 지방족 알킬탄소 사슬구조는 상술한 지방족 알킬 카르복시산에서의 지방족 알킬 카르복시산 사슬과 유사하다).
예를 들어, 펩티드는 (C1 내지 C23)-알킬-C(O)OH로 나타내어지는 카르복시산기를 이용하여 카르복시산기의 활성화로 인한 탈수성 결합(dehydrative coupling)을 통하여 아실화되어, C1 내지 C23-알킬-C(O)-NH-펩티드로 나타내어지는 아미드를 생성할 수 있다. 마찬가지로, 술폰아미드는 술폰산((C1 내지 C23)-알킬-S(O2)-X로 나타내어지는 술폰산(이때, X는 할로겐 또는 OCH3 또는 다른 적합한 이탈기이다)와 N-말단 아미노기의 반응에 의해 (C1 내지 C23)-알킬-S(O2)-NH-펩티드로 나타내어지는 술폰아미드를 생성할 수 있다.
또 다른 예로, N-말단 아미노산의 N-말단 아미노기는 상술한 지방족 알킬기 구조의 C1 내지 C24 지방족 알킬기로 알킬화될 수 있다. 알킬화는 지방족 알킬 할로겐화물 또는 지방족 알킬술폰산 에스테르(메실레이트, 토실레이트 등)를 이용하여 수행할 수 있고, 바람직하게는, 일차 알킬할로겐화물 또는 일차 알킬술폰산에스테르를 이용한다. N-말단 아미노산은 또한 말단 아미노에서, 아세틸기(즉, -C(O)CH3), 미리스토일기, 부타노일기, 헥사노일기, 옥타노일기, 데카노일기, 도데카노일기, 테트라데카노일기, 헥사테카노일기, 9-헥사테세노일기, 옥타데카노일기, 9-옥타데세노일기, 11-옥타데세노일기, 9,12-옥타데카디에노일기, 9,12,15-옥타데카트리에노일기, 6,9,12-옥타데카트리에노일기, 에이코사노일기, 9-에이코세노일기, 5,8,11,14-에이코사테트라에노일기, 5,8,11,14,17-에이코사펜타노일기, 도코사노일기, 13-도코세노일기, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에노일기, 테트라코사노일기를 포함하는, 아실 또는 지방족 아실 지방 아실기(aliphatic acyl fatty acyl group)를 아미드로 포함하도록, 펩티드의 말단 아미노기에 아미드 결합에 의해 공유결합되어 변이될 수 있다.
본 발명의 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기 또한, 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, C-말단 아미노산은 펩티드의 C-말단 카르복실기와 아민의 반응에 의해 변이되어, 암모니아의 아미드; C1 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드 등의 아미드기를 형성할 수 있고, 바람직하게는 직쇄형 지방족 알킬아민; 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드; 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드; 및 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(이때, n은 0 내지 10이다)의 아미드 등의 아미드기를 형성할 수 있다. 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기 또한, C1 내지 C24 지방족 알킬알콜의 에스테르 및 2-오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(이때, n은 0 내지 10이다)의 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택되는 에스테르의 형태일 수 있다.
펩티드-COOH로 나타내어지는 펩티드의 C-말단 카르복실기는 또한, 카르복시산 할로겐화물, 카르복시산 무수물, N-히드록시숙신이미드에스테르, 펜타플루오로페닐(OPfp) 에스테르, 3-히드록시-2,3-디히드로-4-옥소-벤조-트리아존에스테르 등으로 전환됨으로써 아미드화될 수 있어, 암모니아 또는 일차 또는 이차 아민과 쉽게 반응하고, 바람직하게는, 암모니아 또는 일차 아민과 쉽게 반응하며, 바람직하게는, 펩티드에서의 다른 반응기는 펩티드 합성분야, 특히 벤질에스테르, t-부틸에스테르, 페닐에스테르 등의 고상펩티드 합성분야에 잘 알려진 합성화학으로 적합한 보호기에 의해 보호되는 동안에 쉽게 반응한다. 결과 펩티드 아민은 펩티드-C(O)-NR3R4(아미드는 펩티드의 C-말단에 존재)로 표현될 수 있다(이때, R3 및 R4 는 각각 독립적으로 수소; 메틸, 에틸, 부틸, 이소부틸, 싸이클로프로필메틸 헥실, 도데실, 테트라데실 등의 C1 내지 C24 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택된다).
C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은 또한, 2-히드록경우틸아민, 4-히드록시부틸아민 및 12-히드록시도데실아민 등의 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민(수산기는 아민의 질소원자보다는 탄소원자에 부착된다)의 아미드로 전환될 수 있다.
C-말단 카르복시산은 또한, 상술한 바와 같이, 수산기가 아세틸화되어 C2 내지 C24 지방족 카르복시산을 가지는 에스테르를 형성할 수 있는, 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드로 전환될 수 있다. 바람직하게는, 펩티드-C(O)R5R6로 나타내어지는 펩티드의 C-말단의 펩티드 아미드에서, R5는 수소이고, R6는 수소, C1 내지 C24 알킬 및 수산기가 치환된 C2 내지 C24 알킬로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
또한, C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민의 아미드로 전환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 아미드는, 직쇄형 C1 내지 C24 지방족 알콜의, 2-클로로에탄올을 함유하는 디글림(diglyme) 중의 칼륨수소화물(potassium hydride)와의 반응에 의해 직쇄형 C1 내지 C24 알킬 에탄콜을 생성하고, 이를 다시 알데히드로의 산화에 의해 아민으로 전환된 다음, 환원성 아민화에 의해(예를 들어, 암모니아를 사용하여) 아민으로 전환하거나, 또는 알킬할로겐화물(alkyl halide, 예를 들어, 티오닐클로라이드)로 전환한 다음, 암모니아 등의 아민 처리에 의해 제조될 수 있을 것이다.
C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은 또한, 대응하는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에탄올로 부터, 예를 들어, 상술한 바와 같이, 알콜의 아민으로의 전환에 의해 제조되는, 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민(이때, n은 0 내지 10이다)의 아미드로 전환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, C-말단 카르복실기는 펩티드-C(O)-NR7R8의 화학식으로 나타내어지는 아미드로 전환될 수 있다(이때, R7은 수소이고, R8은 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸기(이때, C1 내지 C24 지방족 알킬 부분은 상술한 바와 같이 메톡경우틸(즉, CH3O-CH2CH2-), 2-도데실옥시에틸 등의 그룹을 포함한다)이며; 또는, R7은 수소이고, R8은 2-메톡경우틸(즉, CH3O-CH2CH2-), 오메가-메톡경우톡경우틸(즉, CH3O-CH2CH2O-CH2-CH2-) 내지 CH3O-(CH2CH2O)10-CH2CH2- 등의 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, 폴리(에틸렌옥시) 부분의 n은 0 내지 10이다))이다.
또한, 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산 그룹은 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜의 에스테르 형태이고, 지방족 알킬알콜은 상기와 같다. 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산 그룹은 또한, 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올 그룹(이때, n은 0 내지 10이다)의 에스테르 형태일 수 있고, 이는 소듐 2-메톡경우탄올레이트로서의 2-메톡경우탄올과 n의 크기에 의존하는 화학양론적 량(stoichiometric amount)에 해당하는 에틸렌옥사이드와의 반응에 의해 제조될 수 있다.
또한, 펩티드의 아미노산에서의 측쇄는 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, 페닐알라닌 또는 타이로신에서의 페닐기는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환기로 치환될 수 있다:
메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 싸이클로프로필, 2-메틸싸이클로프로필, 싸이클로헥실, 옥틸, 데실, 도데실, 헥사데실, 옥토데실, 에이코사닐, 도코사닐, 테트라코사닐, 9-헥사데세틸, 9-옥타데세닐, 11-옥타데세닐, 9,12-옥타데세닐, 9,12,15-옥타데세닐, 6,9,12-옥타데세닐, 9-에이코세닐, 5,8,11,14-에이코스테이트라에닐, 5,8,11,17-에이코스테이트라에닐, 13-도코세닐 및 4,7,10,13,16,17-도코사헥사에닐 등의 C1 내지 C24 지방족 알킬기;
예를 들어, 히드록시메틸, 히드록경우틸, 히드록시도데실 등의 수산기로 불포화 부위에서 적어도 하나의 탄소원자와 떨어져 치환된 C1 내지 C24 지방족 알킬기;
아세트산, 부탄산, 헥산산, 옥탄산, 데칸산, 도데칸산, 테트라데칸산, 헥사데칸산, 9-헥사데센산, 옥타데칸산, 9-옥타데센산, 11-옥타데센산, 9,12-옥타데카디엔산, 9,12,15-옥타데카트리엔산, 6,9,12-옥타데카트리엔산, 에이코산산, 9-에이코센산, 5,8,11,14-에이코사테트라엔산, 5,8,11,14,17-에이코사펜타엔산, 도코산산, 13-도코센산, 4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산, 테트라코산산 등의 산의 C2 내지 C24 지방족 카르복실기, 숙신산 등의 디카르복시산, 또는 젖산으로 에스테르화된 수산기로 치환된 C1 내지 C24 지방족 카르복실기(이때, 에스테르 치환기의 탄소원자 수는 3 내지 25개이다);
플루오로-, 클로로-, 브로모- 및 이오도- 등의 할로겐; 니트로-; NH2, 메틸아미노, 디에틸아미노 등의 아미노; 트리플루오로메틸-; 카르복실(-COOH);
메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 이소프로필옥시, 부틸옥시, 이소부틸옥시, 싸이클로프로필옥시, 2-메톡시싸이클로프로필옥시, 싸이클로헥실옥시, 옥틸옥시, 데실옥시, 도데실옥시, 헥사데실옥시, 옥타데실옥시, 에이코사닐옥시, 도코사닐옥시, 테트라코사닐옥시, 9-헥사데세닐옥시, 9-옥타데세닐옥시, 11-옥타데세닐옥시, 9,12-옥타데카디에닐옥시, 9,12,15-옥타데카티리에닐옥시, 6,9,12-옥타데카트리에닐옥시, 9-에이코세닐옥시, 5,8,11,14-에이코사테트라에닐옥시, 5,8,11,14,17-에이코사펜타에닐옥시, 13-도코세닐옥시 및 4,7,10,13,16,19-도코사헥사에닐옥시 등의 C1 내지 C24 알콕시기; 및
2-히드록경우틸옥시 등의 C2 내지 C24 히드록시알킬옥시 및 상술한 카르복시산과 또는 트리플루오로아세트산과의 에스테르.
세린 히드록시기는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환기로 에스테르화될 수 있다:
상술한 바와 같은 C2 내지 C24 지방족 카르복시산 그룹;
트리플루오로아세트산; 및
벤조산 그룹.
라이신에서의 엡실론아미노기(epsilon amino group)는, 예를 들어, 상술한 C2 내지 C24 지방족 카르복시산 그룹(예를 들어, 아민과 산클로라이드(acid chloride), 무수화합물(anhydride), N-히드록시숙신이미드에스테르, 펜타플루오로페닐(OPfp) 에스테르, 3-히드록시-2,3-디히드로-4-옥소-벤조-트리아존(ODhbt) 에스테르 등의 카르복시산의 화학적으로 활성화된 형태와의 반응에 의해) 또는 벤조산 그룹, 또는 아미노산 그룹과의 아미드 형성에 의해 화학적으로 변이될 수 있다. 아울러, 리신에서의 엡실론아미노기는 하나 또는 두 개의 C1 내지 C4 지방족 알킬기의 알킬화에 의해 화학적으로 변이될 수 있다.
글루타민산에서의 카르복실기는 암모니아 등의 아민; 메틸아민을 포함하는 C1 내지 C24 일차 지방족 알킬아민(이것의 알킬 부분은 상술한 바와 같다)과 아미드의 형성에 의해 변이될 수 있다.
글루타민산에서의 카르복실기는 상술한 C1 내지 C24 일차 지방족 히드록시알킬기와, 바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판-1-올, n-도데카놀 등과의 에스테르의 형성에 의해 변이될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 뮤신- 및/또는 뮤신-억제량으로 포유동물에 투여하는 경우, 뮤신 억제효과 및/또는 점액 억제효과를 가진다. 상기 펩티드는 (1) 동일한 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신-억제효과, (2) 동일한 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 포유동물에 대한 우수한 점액-억제효과 및/또는 (3) MANS 펩티드보다 우수한 수용성의 특성을 가진다.
MARCKS 펩티드 및 MANS 펩티드는 각각 아민 결합에 의해 N-말단 아미노산의 아민에 미리스토일기가 결합된 것을 포함한다. 그러나, 본 명세서에 기술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 뮤신 과분비-억제활성은 상기 펩티드 서열의 N-말단 아미노산에서 미리스토일기의 존재에 의존하지 않는다. 다시 말하면, 본 발명의 N-말단 화학적 변이를 포함하지 않는 펩티드도 뮤신-과분비-억제활성을 나타냄이 확인되었다. 본 발명의 N-말단이 미리스토일 보다는 N-말단 아미드로의 아세틸기 등의 그룹에 의해 화학적으로 변이된 펩티드도 또한, 뮤신 과분비-억제활성을 나타냄이 확인되었다. 다시 말하면, MANS 펩티드(비-미리스틸화된)의 N-말단 아세틸화된 펩티드도 본 발명의 방법에서 뮤신 과분비-억제활성을 나타낼 수 있다. 아울러, 본 명세서에 기술된 MANS 펩티드 아미노산 서열 및 그의 변이체를 포함하는 아미노산의 펩티드 서열도, 본 발명의 방법에서 뮤신 과분비-억제활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 포유동물에서 뮤신 과분비를 억제하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 뮤신 과분비를 억제하는 펩티드의 뮤신 과분비-억제량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 펩티드는 N-말단 아미노산 서열은 미리스토일화되지 않고, C-말단 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하는 경우, 뮤신 과분비-억제효과를 가지고, (a) GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 서열을 가지는 아미노산 서열; 및, (b) (a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따르면, 바람직하게는 상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 아세틸화된다. 또 다른 본 발명의 실시태양에 따르면, 상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하는 경우, N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대해 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, N-말단 아미노기는 R은 1 내지 15의 탄소원자를 가지는 직쇄형 또는 분지형 알킬기를 나타내는 -C(O)R의 화학식을 가지는 아실그룹을 포함하도록 변이되거나, 또는 R1은 1 내지 15의 탄소원자를 가지는 직쇄형 알킬기를 나타내는 -C(O)R1의 화학식을 가지는 아실그룹을 포함하도록 변이될 수 있다. 펩티드의 C-말단 아미노산 또한, 화학적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는 수산기가 있는 부위에 아미노기를 포함하도록 변이될 수 있다(즉, 아미드화). 본 발명의 일 실시태양에 따르면, N-말단 아미노산 및/또는 C-말단 아미노산은 화학적으로 변이되지 않는다.
본 발명의 일 실시태양에 따르면, 펩티드는 인간 혈장 내에서보다 인간 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 내에서 더 큰 반감기를 가질 수 있고, 또한 인간 혈장 내에서보다 인간 점액(예를 들어, 낭포성 섬유증 환자의 점액)내에서 더 큰 반감기를 가질 수 있다.
본 발명의 펩티드는 포유동물에서 뮤신의 분비 및/또는 점액 생성의억제방법, 포유동물에서 뮤신 및/또는 점액 과분비의 치료방법 및 포유동물에서 뮤신 및/또는 점액 과분비를 유발하는 폐질환(예를 들어, 천식, 만성 기관지염, 만성 장애성 폐질환(COPD) 및 낭포성 섬유증)의 치료방법에 사용될 수 있다. 펩티드에 의한 치료에 적절한 상태는, 이에 한정되는 것은 아니나, 감염성, 바이러스성 또는 박테리아성 기도질환(예를 들어, 천식, 만성 장애성 폐질환, 일반적인 감기, 비염, 급성 또는 만성 기관지염, 폐렴 및 켄넬코프(kennel cough)), 알레르기 상태(예를 들어, 아토피, 알레르기성 감염), 기관지 확장증(bronchiectasis), 기종(emphysema), 기관지 천식 및 특정 유전적 상태(예를 들어, 낭포성 섬유증)를 포함한다. 상기 펩티드는 또한, 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된, 미합중국 특허출원 제 10/180,753호(특허공개 제 2003/0013652호) 및 제 09/256,154호, 국제출원 PCT/US00/05050(국제 특허공개 WO00/50062)에 기술된 상태 및 질병의 치료, 그리고 상기 특허에 기술된 방법에 적절히 사용될 수 있다.
질병과 연관된 뮤신 과분비이외에도, 뮤신 과분비라는 용어는 또한, ATP-유도 뮤신 과분비 뿐만 아니라, 분비촉진제-유도 뮤신 과분비 및 촉진된 뮤신 과분비를 포함한다.
바람직한 실시태양에 따르면, 본 발명은 참조 아미노산 서열, 펩티드 1의 4 내지 23개의 연속된 아미노산 서열을 가지는 뮤신 과분비-억제 펩티드를 제공한다. 상기 뮤신 과분비-억제 펩티드는 다음으로부터 선택된다:
본 명세서에 정의된 (a) 펩티드 2, 펩티드 3, 펩티드 4, 펩티드 5, 펩티드 6, 펩티드 7, 펩티드 8, 펩티드 9, 펩티드 10, 펩티드 11, 펩티드 12, 펩티드 13, 펩티드 14, 펩티드 15, 펩티드 16, 펩티드 17, 펩티드 18, 펩티드 19, 펩티드 20, 펩티드 21, 펩티드 22, 펩티드 23, 펩티드 24, 펩티드 25, 펩티드 26, 펩티드 27, 펩티드 28, 펩티드 29, 펩티드 30, 펩티드 31, 펩티드 32, 펩티드 33, 펩티드 34, 펩티드 35, 펩티드 36, 펩티드 37, 펩티드 38, 펩티드 39, 펩티드 40, 펩티드 41, 펩티드 42, 펩티드 43, 펩티드 44, 펩티드 45, 펩티드 46, 펩티드 47, 펩티드 48, 펩티드 49, 펩티드 50, 펩티드 51, 펩티드 52, 펩티드 53, 펩티드 55, 펩티드 56, 펩티드 57, 펩티드 58, 펩티드 59, 펩티드 60, 펩티드 61, 펩티드 62, 펩티드 63, 펩티드 64, 펩티드 67, 펩티드 68, 펩티드 69, 펩티드 70, 펩티드 71, 펩티드 72, 펩티드 73, 펩티드 74, 펩티드 75, 펩티드 79, 펩티드 80, 펩티드 81, 펩티드 82, 펩티드 83, 펩티드 84, 펩티드 85, 펩티드 86, 펩티드 87, 펩티드 92, 펩티드 93, 펩티드 94, 펩티드 95, 펩티드 96, 펩티드 97, 펩티드 98, 펩티드 99, 펩티드 100, 펩티드 106, 펩티드 107, 펩티드 108, 펩티드 109, 펩티드 110, 펩티드 111, 펩티드 112, 펩티드 113, 펩티드 114, 펩티드 122, 펩티드 123, 124, 펩티드 125, 펩티드 126, 펩티드 127, 펩티드 128, 펩티드 129, 펩티드 139, 펩티드 140, 펩티드 141, 펩티드 142, 펩티드 143, 펩티드 144, 펩티드 145, 펩티드 157, 펩티드 158, 펩티드 159, 펩티드 160, 펩티드 161, 펩티드 162, 펩티드 163, 펩티드 164, 펩티드 165, 펩티드 166, 펩티드 167, 펩티드 168, 펩티드 169, 펩티드 176, 펩티드 177, 펩티드 178, 펩티드 179, 펩티드 180, 펩티드 196, 펩티드 197, 펩티드 198, 펩티드 199, 펩티드 217 및 펩티드 219로 구성된 그룹; 및
(a)에서 정의된 서열과 80%내지 96% 사이의 서열상동성을 가지는 아미노산 서열;
상기 뮤신 과분비-억제 펩티드 아미노산 서열의 N-말단 아미노산의 아민은 선택적으로 미리스트산 및 아세트산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카르복시산의 아미드 결합에 의해 공유결합하고,
상기 뮤신 과분비-억제 펩티드 아미노산 서열의 C-말단 아미노산의 키르복실기는 선택적으로 암모니아에 아미드 결합에 의해 공유결합한다.
펩티드는 국부 또는 전신에 투여될 수 있고(예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물의 형태로), 점액 및/또는 뮤신을 생성하는 신체의 부분을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 포유동물 신체의 어느 부분으로든 투여될 수 있다(예를 들어, 바람직하게는, 호흡기도(respiratory passage), 비강(nasal cavity), 구강(oral cavity), 기관(trachea), 폐(lung), 위장관(gastrointestinal tract), 눈(eye) 생식관(reproductive tract) 등). 상기 펩티드는 국부 투여(topical administration), 비경구투여(parenteral administration), 직장내 투여(rectal administration), 폐내 투여(pulmonary administration), 비강내 투여(nasal administration), 흡입법(inhalation), 주입법(insufflation) 및 구강내 투여(oral administration)을 포함하되, 이제 제한되지 않는 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 폐내 투여는, 예를 들어, 분무기(aerosolizer), 흡인기(nebulizer), 건조분말흡입기(dry powder inhaler), 정량식 흡입기(metered dose inhaler) 등에 의해 수행된다.
펩티드는 약학적으로 효과적인 투여경로에 적당한 약학 제형으로 제조되어 투여될 수 있다. 본 발명의 펩티드(또는 그의 약학 제형)는 구강내 투여를 위해(예를 들어, 정제(tablet), 함당정제(lozenge), 경질 또는 연질의 캡슐제(capsule), 수성 또는 지성 현탁액(suspension), 유제(emulsion), 분산시킬 수 있는 분말(powder) 또는 과립제(granule), 시럽제(syrup) 또는 엘릭서제(elixir)), 국부적 사용을 위해(예를 들어, 크림제(cream), 연고제(ointment), 겔제(gel), 또는 수성 또는 지성의 용액 또는 현탁액(suspension)), 흡입(inhanlation)에 의한 투여를 위해(예를 들어, 미세하게 분쇄된 분말 또는 액체 에어로졸), 주입(insufflation)에 의한 투여를 위해(예를 들어, 미세하게 분쇄된 분말) 또는 비경구 투여를 위해(예를 들어, 정맥내, 피하내, 근육내 투여를 위한 멸균된 수성 또는 지성 용액 또는 직장내 투여를 위한 좌약(suppository)) 등 적당한 형태가 될 수 있다.
펩티드는 상기 펩티드를 포함하는 에어로졸 생성을 포함하여, 적당한 방법에 의해 포유동물의 기도를 통해 투여될 수 있다. 이러한 에어로졸은 고체 또는 액체 및 수성기반(aqueous-based)의 것일 수 있다. 이러한 에어로졸의 적당한 입자크기는 이 분야에 알려진 다양한 방법들로 생성될 수 있다. 이러한 에어로졸의 입자들은 통상적으로 50μm 크기 이하, 바람직하게는 약 0.1μm에서 약 10μm 크기, 보다 바람직하게는 약 1μm에서 약 10μm 크기 및 더욱 바람직하게는 약 2μm에서 약 7μm 크기 및 바람직하게는 약 2μm에서 약 7μm 크기일 수 있다.
펩티드의 비강내 투여(또는 펩티드의 약학적 제형)는 예를 들어, 펩티드의 수용액 또는 현탁액의 분무도포(spray application)에 의해, 또는 드롭퍼(dropper) 또는 피펫 등을 이용한 방울(drop) 또는 작은 물방울(droplet)로의 펩티드 수용액 또는 현탁액의 도포에 의해, 선택적으로 완충되고(buffered) 약학적으로 허용되며, 바람직하게 멸균된 식염수용액(NaCl)의 형태로 수행될 수 있다. 수용액의 멸균은 예를 들어, 방부제(preservative), 산화방지제(antioxidant), 완충염(buffering salt), 긴장도 조절제(tonicity modifier) 등의 약학적으로 허용되는 첨가제(additive)의 존재하에, 선택적으로 펩티드를 포함하는 수용액의 멸균 여과에 의해 수행될 수 있다. 수성 현탁액의 멸균은 예를 들어, 부유된 물질이 0.2μm 이하의 크기일 때 방사선조사 또는 멸균여과에 의해, 예를 들어, 미셀(micelle), 인지질-안정화 리포좀 등의 리포좀, 또는 유사한 입자는 0,2μm 여과지(filter)를 통과함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 치료적으로 유효한 양의 수용액(예를 들어, 등장 식염수(isotonic saline solution) 또는 고장 식염수(hypertonic saline solution) 및 선택적으로 펩티드와 화학적으로 반응하지 않는 당(sugar))은 예를 들어, 멸균 여과에 의해 멸균되고, 치료적으로 유효한 양의 펩티드를 멸균된 바이알(vial)에 등분되며, 동결건조하여 건조된 분말 형태 및 밀폐된 형태로 놓일 수 있고, 바람직하게는 비활성의 공기 또는 가스의 존재하에 멸균된 마개 또는 뚜껑을 이용할 수 있다. 사용에 앞서, 상기 건조된 분말은 충분한 양의 물을 가함으로써, 수화되어 포유동물의 기도를 통해 투여할 수 있는 에어로졸로 단일 용량의 등장액을 형성할 수 있다.
펩티드 또는 그의 약학 제형의 포유동물에의 투여량은 특정 입자, 포유동물의 형태, 포유동물의 질병 정도, 포유동물의 무게 및 포유동물의 나이를 포함하되, 이에 제한되지 않는 다양한 요소에 따라 변형될 수 있을 것이다. 아울러, 이는 펩티드가 처리된 포유동물에서의 뮤신 분비/점액분비의 어떤 수준(예를 들어, 표준 또는 기본 수준)을 유지하는데 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나의 실시태양에 따르면, 사람은 치료를 필요로 하는 바람직한 동물이고, 단일 또는 다수의 용량으로 투여된 펩티드의 양은 뮤신 과분비를 억제하기에 충분하다. 본 발명의 펩티드의 1회 투여는 0.1mg에서 약 30mg/kg 체중의 범위, 바람직하게는 약 0.1mg에서 약 7.5mg 체중의 범위일 수 있다. 투여의 수 및 치료기간은 치료에 대한 환자의 반응에 따라 다를 수 있다. 단일 복용량, 복용의 수 및 치료기간에 관한 조절은 징후 및 상기 징후의 심각성에 따라 주치의에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에 따르면, 분리된 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 참조서열인 펩티드 1의 N-말단 아미노산에서 시작되는 4 내지 23개의 연속된 아미노산(또는, 다른 실시태양에서, 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 10 내지 12개의 연속된 아미노산); (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열; (c) 참조서열인 펩티드 1의 C-말단 아미노산에서 종결되는 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열(또는, 다른 실시태양에서, 부터 14까지의 연속된 아미노산 또는 10 내지 12개의 연속된 아미노산); 및, (d) (c)에 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. N-말단 아미노산의 N-말단 아미노기 및/또는 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는 다음과 같이 선택적, 화학적으로 변이될 수 있다:
(1) 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, 선택적으로 C2 내지 C24 지방족 카르복시산의 아미드, 트리플루오로아세트산의 아미드, 벤조산의 아미드 및 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산의 아미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는,
펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, C1 내지 C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸(이때, n은 0 내지 10이다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 그룹으로 선택적으로 알킬화되는 형태; 및,
(2) 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는, 선택적으로 암모니아의 아미드, C1 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드 및, 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민(이때, n은 0 내지 10이다)의 아미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는
펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은, 선택적으로 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜)의 에스테르, 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올에스테르(이때, n은 0 내지 10이다)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 에스테르의 형태.
상기 펩티드는 뮤신-억제량으로 포유동물에 투여하는 경우, 뮤신 방출-억제효과를 가진다. 상기 펩티드는 또한 동일 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 포유동물에 대해 우수한 뮤신-억제효과 및/또는 MANS 펩티드보다 우수한 수용성을 가진다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 분리된 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, 참조서열 펩티드 1의 N-말단 아미노산으로부터 시작하거나 C-말단 아미노산에서 종결되는 4 내지 23개의 연속된 아미노산(또는, 다른 실시태양에서, 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 10 내지 12개의 연속된 아미노산)을 가지는 아미노산 서열의 변이체로 구성된 아미노산 서열을 가진다. N-말단 아미노산의 N-말단 아미노기 및/또는 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는 다음과 같이 선택적, 화학적으로 변이될 수 있다:
(1) 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, 선택적으로 C2 내지 C24 지방족 카르복시산의 아미드, 트리플루오로아세트산의 아미드, 벤조산의 아미드 및 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산의 아미드로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는
펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, 선택적으로 C1 내지 C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸(이때, n은 0 내지 10이다)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 치환기로 알킬화; 및
(2) 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는, 선택적으로 암모니아의 아미드, C1 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드 및 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(이때, n은 0 내지 10이다)의 아미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는,
펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은, 선택적으로 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜의 에스테르, 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올(이때, n은 0 내지 10이다)의 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택되는 에스테르의 형태.
상기 펩티드는 뮤신-억제량으로 포유동물에 투여하는 경우, 뮤신-억제효과를 가진다. 상기 펩티드는 또한 동일 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 우수한 뮤신-억제효과 및/또는 MANS 펩티드보다 우수한 수용성을 가질 것이다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 따르면, 포유동물에서 뮤신 과분비 억제방법은 뮤신 분비를 억제하는 분리된 펩티드의 뮤신-억제량을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 상기 분리된 펩티드는 24개 이하의 아미노산으로 구성되고, (a) 참조서열 펩티드 1의 N-말단 아미노산에서 시작되는 4 내지 23개의 연속된 아미노산(또는, 다른 실시태양에서, 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 10 내지 12개의 연속된 아미노산)을 가지는 아미노산 서열; (b) (a)에서 정의된 아미노산 서열과 상당히 유사한 서열; (c) 참조서열 펩티드 1의 C-말단 아미노산에서 종결되는 4 내지 23개의 연속된 아미노산(또는, 다른 실시태양에서, 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 10 내지 12개의 연속된 아미노산)을 가지는 아미노산 서열; 및, (d) (c)에 정의된 아미노산 서열과 실질적으로 유사한 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가진다. N-말단 아미노산의 N-말단 아미노기 및/또는 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는 다음과 같이 선택적, 화학적으로 변이될 수 있다:
(1) 펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, 선택적으로 C2 내지 C24 지방족 카르복시산의 아미드, 트리플루오로아세트산의 아미드, 벤조산의 아미드 및 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산의 아미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는,
펩티드의 N-말단 아미노산의 N-말단 아민기는, 선택적으로 C1 내지 C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, n은 0 내지 10이다)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 그룹으로 알킬화;
(2) 펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복실기는, 선택적으로 암모니아의 아미드, C1 내지 C24 지방족 알킬아민의 아미드, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기의 아미드 및 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸아민기(이때, n은 0부터 10이다)의 아미드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미드의 형태; 또는,
펩티드의 C-말단 아미노산의 C-말단 카르복시산은, 선택적으로 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜의 에스테르, 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올기(이때, n은 0 내지 10이다)의 에스테르로 구성된 그룹으로부터 선택되는 에스테르의 형태.
상기 펩티드는 뮤신-억제량으로 포유동물에 투여하는 경우, 뮤신-억제효과를 가진다. 상기 펩티드는 또한 동일 농도로 투여하는 경우, MANS 펩티드보다 우수한 뮤신-억제효과 및/또는 MANS 펩티드보다 우수한 수용성을 가질 것이다.
본 발명의 펩티드는 예를 들어, 플루오르에닐메틸옥시카보닐(fluoroenylmethyloxycarbonyl) 화학법 및 CS-Bio 펩티드 합성기 등의 적당한 합성기를 이용한, 또는 tert-부티옥시카보닐(tert-butyoxycarbonyl, Boc) 화학법 및 ABI 430A 펩티드 합성기 등의 적당한 펩티드 합성기를 이용한 고상펩티드합성법을 포함하는 적당한 방법에 의해 제조될 수 있다. Fmoc 또는 Boc 합성의 사용을 위한 적당한 보호 아미노산은 예를 들어, Calbiochem, EMD Biosciences 유닛, San Diego, CA로부터 상업적으로 입수가능하다. 고상펩티드합성법에서, N-알파-보호 아미노산(N-alpha-protected amino acid)으로의 원하는 펩티드의 C-말단 카르복실기는 중합체 지지체(polymer support)에 공유결합되어 있다. 상기 N-알파-아미노 보호기는 이후에 제거되고, 두 번째 N-알파-보호 아미노산은 수지에 연결된 아미노산의 탈보호 N-알파-아민에 아미드 결합을 형성함으로써 아미노산에 붙어 결합한다. 상기 단계는 원하는 펩티드 서열의 각자의 보호 아미노산이 원하는 서열이 수득될 때까지 반복된다. 상기 합성의 말미에서, C-말단 아미노산과 중합체 지지체 사이의 결합은 펩티드를 유리시키기 위해 절단된다. 상기 펩티드는 HPLC에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 유용한 HPLC 정제방법은 이온교환 크로마토그래피 및 역상 크로마토그래피를 포함한다. 펩티드 용액은 건조 또는 동결건조되어 분리된 펩티드를 고체형태로 제공할 수 있다. 메티오닌, 시스테인, 트립토판 등의 산화되기 쉬운 그룹을 포함하는 펩티드는, 바람직하게 산소가 없는 대기조건에 유지되고, 용액 또는 현탁액내에 제제화 및 보존될 때에는 산소가 없는 용매에 사용된다.
합성도중에 수지-연결된 펩티드의 아민 말단에의 활성화된 에스테르의 결합은, 예를 들어, 아미노산 및 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-디메틸아미노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(benzotriazol-1-yl-oxy-tris-dimethylaminophosphonium hexafluorophosphate)의 4배 초과량과 같은 초과량 및 N,N-디이소프로필에틸아민의 6배 초과량 같은 초과량을 사용하여 수행할 수 있다. Fmoc 합성으로부터의 펩티드는 트리플루오로아세트산/티오아니솔/트리이소프로필실레인/메탄올(trifluor-oacetic acid/thioanisole/triisopropylsilane /methanol)(예를 들어, 90:5:2.5:2.5 vol/vol/vol/vol 비율)을 20℃에서 4시간 반응으로, Boc 합성으로 부터의 펩티드는 예를 들어, HF/아니솔(HF/anisole)(9:1 vol/vol)을 4℃에서 1시간 반응에 의해 수지로부터 분리된다.
Fmoc 펩티드 방법에서, 첫 번째 Fmoc 아미노산은 산에 불안정한 링커(acid labile linker)를 통해 불용성 지지체 수지(insoluble support resin)에 결합한다. Fmoc의 탈보호는 아미노산을 피페리딘과 같은 염기를 처리하여 수행된다. 두 번째 Fmoc 아미노산은 전-활성화된 물질(pre-activated species) 또는 인시튜(in situ) 활성화를 이용하여 결합된다(결합반응은 DCC, HBRU TBTU, BOP, BOP-Cl 등의 펩티드 화학에 알려진 활성화제를 이용하여 원위치에서(in situ) 실행될 수 있다). 원하는 펩티드의 합성 후에, 수지가 결합된 펩티드는 고체의 지지체로부터, 예를 들어, 티올화합물, 페놀 및 물 등의 스캐빈져(scavenger)의 존재하에 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 또는 TMSBr 등의 약산의 산분해 절단(acidolysis cleavage)에 의해 탈보호되고 떨어져 나간다. 본 발명의 일 측면에 의하면, 측쇄기능성(side chain functionality)의 탈보호 및 수지로부터의 분리에 앞서, 펩티드의 말단 아민기는 카르복실(예를 들어, 지방족 카르복실(aliphatic carboxylic), 트리플루오로아세틸(trifluoroacetic), 벤조(benzoic) 등)로, 예를 들어, 카르복실의 아미드(amide) 형성을 위한 펩티드 결합의 형성과 마찬가지로, 펜타플루오로에스테르(pentafluoroester) 등의 지방족 카르복시산(aliphatic carboxylic acid)의 활성화된 형태와 같은 지방족 카르복시산 또는 펩티드의 N-말단에 술폰아미드(sulfonamide)를 형성하는 지방족 술폰산(aliphatic sulfonic acid)으로 처리될 수 있다. 선택적으로, N-말단 아민은 예를 들어, 상응하는 술포닐클로라이드(sulfonyl chloride)와, 지방족 카르복시산의 환원에 의해(예를 들어, 리튬알미늄수소화물에 의해) 수득된 알콜인 지방족 알콜(alphatic alcohol)로 피리딘(pyridine) 등의 염기(base)의 반응에 의해 수득되는 지방족 알킬화제로 알킬화될 수 있다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, L-아미노산에 상응하는 D-아미노산(예를 들어, 네 개의 D-아미노산까지)은 상술한 선택적, 화학적으로 변이된 본 발명의 펩티드를 제공하는 펩티드 합성에 사용될 수 있다. 본 발명의 또 따른 측면에 따르면, 원하는 펩티드 아미노산 서열이, 예를 들어, 고상합성법(solid phase synthesis)에 의해 형성되는 경우 및 수지로 부터 펩티드를 유리시키는 에스테르 절단을 견뎌내도록 측쇄 보호기(side chain protecting group)가 선택되는 경우, 펩티드의 C-말단에 유리된(free) 카르복시산을 가지는 측쇄 보호펩티드가 형성된다. 상기 C-말단 카르복시산은 활성화 에스테르(예를 들어, 펜타플루오로페닐에스테르(pentafluorophenyl ester))로 전환될 수 있으며, 암모니아 등의 아민을 처리해, 아미드(펩티드-C(O)-NH2로 나타내는)를 형성, 또는 상술한 지방족 아민을 처리해, 펩티드의 지방족 아미드를 형성하고, 잔여 보호기가 제거되어 본 발명에서 원하는 펩티드를 제공할 수 있다. 또한, C-말단 카르복시산 에스테르(carboxylic ester)는 C-말단 카르복시산 및 지방족 알콜로부터 카보디이미드(carbodiimide) 시약의 사용 등의 탈수결합(dehydrative coupling)에 의해 형성될 수 있다. 아스파르트산(aspartic acid) 및 글루타민산(glutamic acid) 등의 산관능기-함유 아미노산은 상술한 방법과 유사한 방법으로 아미드(amide) 또는 에스테르(ester)로 전환될 수 있고, 라이신(lysine)에서의 엡실론아민기(epsilon amine group)는 말단 아미노기의 화학에 의해 상술한 바와 같이 아미드 및 지방족 아민으로 전환될 수 있다.
본 발명의 펩티드 FMoc 고상합성법에 유용한 보호 아미노산의 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 다음을 포함한다: N-알파-Fmoc-L-벤질-L-포스포세린(N-alpha-Fmoc-L-benzyl-L-phosphoserine); N-알파-Fmoc-O-벤질-L-세린(N-alpha-Fmoc-O-benzyl-L-serine); N-알파-Fmoc-O-t-부틸-L-세린(N-alpha-Fmoc-O-t-butyl-L-serine); N-알파-Fmoc-O-t-부틸-L-세린 N-히드록시숙신이미드(N-alpha-Fmoc-O-t-butyl-L-serine N-succcinimide); N-알파-Fmoc-O-트리틸-L-세린(N-alpha-Fmoc-O-trityl-L-serine); N-알파-Fmoc-L-트레오닌(N-alpha-Fmoc-L-threonine); N-알파-Fmoc-O-t-부틸-L-트레오닌(N-alpha-Fmoc-O-t-butyl-L-threonine); N-알파-Fmoc-O-트리릴-L-트레오닌(N-alpha-O-trityl-L-threonine); N-알파-Fmoc-O-(2-아세트아미도-2-데옥시-3,4,6-트리-O-아세틸-알파-D-갈락토피라노실)-L-트레오닌(N-alpha-Fmoc-O-(2-acetamido-2-deoxy-3,4,6-tri-O-acetyl-alpha-D-galactopyranosyl)-L-threonine; N-알파-Fmoc-L-발린(N-alpha-Fmoc-L-valine); N-알파-Fmoc-L-발린 펜타플루오로페닐에스테르(N-alpha-Fmoc-L-valine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-알파-(2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질)-발린(N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-oxy-4-methoxybenzyl)-valine); N-알파-Fmoc-N-알파-(2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질)-발린 펜타플루오로페닐에스테르(N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-oxy-4-methoxybenzyl)-valine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-알파-메틸-L-발린(N-alpha-Fmoc-N-alpha-methyl-L-valine); N-알파-Fmoc-O-(비스-디메틸아미노-포스포노)-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-(bid-dimethylamino-phosphono)-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-L-티로신(N-alpha-Fmoc-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-2,6-디클로로벤질-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-2,6-dicholorobenzyl-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-2-브로모-CBZ-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-2-bromo-CBZ-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-2-클로로트리틸-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-2-chlorotrityl-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-벤질-L-포스포티로신(N-alpha-Fmoc-O-benzyl-L-phosphotyrosine); N-알파-Fmoc-O-메틸-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-methyl-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-포스포-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-phospho-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-t-부틸-L-티로신(N-alpha-Fmoc-O-t-butyl-L-tyrosine); N-알파-Fmoc-O-t-부틸-L-티로신-펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-O-t-butyl-L-tyrosine-pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-1-아다만틸 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-1-adamantyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-2-아다만틸 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-2-adamantyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-2-페닐이소프로필 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-2-phenylisopropyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-4-{N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소싸이클로헥실리덴)-3-메틸부틸]-아미노} 벤질 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl]-amino} benzyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-알파-4-{N-[1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소싸이클로헥실리덴)-3-메틸부틸]-아미노} 벤질 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid alpha-4-{N-[1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)-3-methylbutyl]-amino} benzyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-알파-알릴 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid alpha-allyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-벤질 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-benzyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-벤질 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid beta-benzyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-t-부틸 에스테르 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid-beta-t-butyl ester pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-1-아다만틸 에스테르 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid-beta-1-adamantyl ester pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파르트산-베타-2-아다만틸 에스테르 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-aspartic acid-beta-2-adamantyl ester pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-L-루이신(N-alpha-Fmoc-L-leusine); N-알파-Fmoc-L-루이신 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-leusine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-알파-(2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질)-루이신(N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-oxy-4-methoxybenzyl)-leusine); N-알파-Fmoc-N-알파-(2-Fmoc-옥시-4-메톡시벤질)-루이신-펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-N-alpha-(2-Fmoc-oxy-4-methoxybenzyl)-leusine-pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-알파-메틸-L-루이신(N-alpha-Fmoc-N-alpha-methyl-L-leucine); N-알파-Fmoc-L-이소루이신(N-alpha-Fmoc-L-isoleucine); N-알파-Fmoc-L-이소루이신 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-isoleucine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-알파-메틸-L-이소루이신(N-alpha-Fmoc-N-alpha-methyl-L-isoleucine); N-알파-Fmoc-베타-2,4,6-트리메톡시벤질-L-아스파라긴(N-alpha-Fmoc-beta-2,4,6-trimethoxybenzyl-L-asparagine); N-알파-Fmoc-베타-트리틸-L-아스파라긴 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-beta-trityl-L-asparagine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-L-아스파라긴(N-alpha-Fmoc-L-asparagine); N-알파-Fmoc-L-아스파라긴 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-L-asparagine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-N-베타-(3,4,6-트리-O-아세틸-2-(아세틸아미노)-데옥시-2-베타-글루코피라노실)-L-아스파라긴(N-alpha-Fmoc-N-beta-(3,4,6-tri-O-acetyl-2-(acetylamino)-deoxy-2-beta-glucopyranosyl)-L-asparagine); N-알파-Fmoc-N-베타-트리틸-L-아스파라긴(N-alpha-Fmoc-N-beta-trityl-L-asparagine); N-알파-Fmoc-N-임-메틸트리틸-L-히스티딘(N-alpha-Fmoc-N-im-methytrityl-L-histidine); N-알파-Fmoc-N-임-t-Boc-L-히스티딘 싸이클로헥실암마늄염(N-alpha-Fmoc-N-im-t-Boc-L-histidine cyclohexylammonium salt; N-알파-Fmoc-N-임-토실-L-히스티딘(N-alpha-Fmoc-N-im-tosyl-L-histidine); N-알파-Fmoc-N-임-트리틸-L-히스티딘(N-alpha-Fmoc-N-im-trityl-L-histidine); N-알파-Fmoc-S-아세트아미도메틸-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-acetamidomethly-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-아세트아미도메틸-L-시스테인 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-S-acetamidomethyl-L-cysteine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-S-벤질-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-benzyl-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-p-메톡시벤질-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-p-methoxybenzyl-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-p-메톡시트리틸-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-p-methoxytrityl-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-t-부틸-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-t-butyl-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-t-부틸-L-시스테인 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-S-t-butyl-L-cysteine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-S-t-부틸티오-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-t-butylthio-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-t-부틸티오-L-시스테인 펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-S-t-butylthio-L-cysteine pentafluorophenyl ester); N-알파-Fmoc-S-트리틸-L-시스테인(N-alpha-Fmoc-S-trityl-L-cysteine); N-알파-Fmoc-S-트리틸-L-시스테인-펜타플루오로페닐 에스테르(N-alpha-Fmoc-S-trityl-L-cysteine pentafluorophenyl ester). 펩티드의 고상합성법에의 사용을 위한 상기 및 다른 아미노산 시약은, 예를 들어, Calbiochem Corporation으로부터 상업적으로 입수가능하다. 지방족 카르복시산, 또한 Sigma-Aldrich Chemical Company로부터 입수가능하다.
상기 펩티드는 또한, 첫 번째 Boc 아미노산이 HF 절단가능한 링커(cleavable linker)를 통하여 불용성 지지체 수지에 결합하는 Boc 방법을 이용한 고상합성법에 의해 제조될 수 있다. Boc 그룹의 제거에 의한 탈보호(deprotection)는 Boc-아미노산을 TFA로 처리하여 수행된다. 두 번째 Boc 아미노산은 이후에, 전-활성화 물질 또는 인시튜 활성화를 이용하여 결합한다. 원하는 펩티드가 합성된 후에, 수지-결합된 펩티드는 HF, TFMSOTf, 또는 TMSOTf 등의 강산을 이용한 절단을 통해 고체 지지체로부터 탈보호화 및 분리된다. 티올(thiol) 화합물 등의 첨가제는 절단과정에서 형성되는 탄소 양이온(carbocation)으로부터 펩티드를 보호하기 위하여 부가된다. 다음의 보호기들은 HF 절단에 적합하다: Arg(Mts); Cys(4-MeOBzl); His(Z); Arg(Tos); Glu(OBzl); Lys(Cl-Z); Asp(OBzl); Glu(OcHex); Ser(Bzl); Asp(OcHex); His(Bom); Thr(Bzl); Cys(Acm); His(Dnp); Trp(CHO); Cys(4-MeBzl); His(Tos); Tyr(Br-Z); Asp(OtBu); His(Trt). 다음의 보호기들은 TFMSOTf 절단에 적합하다: Arg(Mts); His(Bom); Met(O); Asp(OBzl); His(Dnp); Ser(Bzl); Cys(Acm); His(Tos); Thr(Bzl); Cys(4-MeBzl): His(Z); Trp(CHO); Glu(OBzl); Lys(Cl-Z); Tyr(Br-Z). 다음의 보호기들은 TMSOTf 절단에 적합하다: Arg(Mts); Glu(OcHex); Trp(CHO); Arg(Mbs), His(Bom); Trp(Mts), Asp(OBzl); Lys(Cl-Z); Tyr(Br-Z); Asp(OcHex); Met(O); Tyr(Bzl); Cys(Acm); Ser(Bzl); Tyr(CL-Bzl); His(Bom); Thr(Bzl). 펩티드 아미드결합을 형성하기 위한 아미노산 카르복시산 및 아민의 결합은 디싸이클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide, DCC), 디이소프로필카보디이미드(diisoprpylcarbodiimide, DIC), t-부틸메틸-(t-butyl methyl) 및 t-부틸에틸-카보디이미드(t-butylethyl-carbodiimide); BOP; PyBroP; PyBOP; HBTU; TBTU; 및 HATU, 활성화에 염기(base)를 필요로 하고 대칭적인 무수물(symmetric anhydride) 등의 카보디이미드를 이용한 Boc 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 이소부틸-(isobutyl-) 또는 이소프로필-클로로포메이트(isopropyl-chloroformate)와 N-알파-보호 아미노산(N-alpha-protected amino acid), 또는 N-카르복시무수물(N-carboxyanhydride, NCA's) 또는 루치스 무수물(Leuchs' anhydride)로 치환된 포스핀클로라이드(phosphinic chloride)의 반응에 의해 제조되는 카르복실-탄산염(carboxylic-carbonate) 또는 카르복실-포스핀이 혼합된 무수물 시약(carboxylic-phophinic mixed anhydride reagent)이 사용될 수 있다. Fmoc 화학에서와 같이, N-말단 아민 및 C-말단 카르복시산 그룹은 상술한 합성전략에 따라 화학적으로 변이될 수 있다.
본 발명은 이에 제한되는 것은 아니나, 후술하는 예시적인 실시예에 의해 상세히 설명될 것이다. 이하의 실시예로는 본 출원에 개시된 펩티드를 대표하는 특정 펩티드의 시험결과를 제공한다. 상기 펩티드는 시험 펩티드의 펩티드#로 지정되는 아미노산 서열의 각각 왼쪽- 및 오른쪽-측면의 N-말단 아미노산의 N-말단 아 미노기 및/또는 C-말단 아미노산의 C-말단 아미노기에 변이를 함께 나타내었다. 표 9는 펩티드 서열에 핵심(key)을 포함하고 있다. Myr- 및 Ac-은 각각의 펩티드 아미노산 서열에서의 N-말단 아미노산의 아미드결합내에 공유결합한 미리스토일(myristoyl)과 아세틸(acetyl)의 약자이다; -NH2는 펩티드 아미노산 서열의 C-말단에 공유결합한 암모니아의 아미드를 의미한다.
실시예 1A: 마우스 천식모델에서의 시험 펩티드의 상대적 효능
I. 프로토콜 및 방법
상기 MANS 및 거기에 관련된 다른 시험 펩티드가 생체에서의 생쥐 기도에 뮤신의 과분비를 억제하는지 시험하기 위해 다음과 같은 실험을 행하였다. 본 연구에 사용된 알레르기성 염증 및 천식의 난백 알부민-감작화 마우스 모델은 상술한 싱어(Singer) 등에 의해 기술되어 있다. 음성 대조군으로, N-말단 미리스토일기(myristoyl group) 및 동일한 MANS 펩티드 그러나 임의의 순서로 배열한 대조군 티드(예를 들어, 임의의 N-말단 서열, RNS, 미리스토일-펩티드(myristoyl-peptide) 232)를 제안된 활성화 펩티드와 함께 시험하였다. 6-8주령의 BP2 마우스는 일주일에 두번 간격으로 1μg의 난백 알부민을 피하주사하여 면역화하였다. 감작(sensitization) 14일 후에, 상기 동물은 에어로졸화(aerosolized)된 난백 알부 민에 노출시켜, 72시간 후에, 현저한 배상세포 이상증식을 유발하였다. 72시간이 경과한 시점에는, 분비촉진제인 메타콜린(methacholine, 60mM)을 북스코(Buxco) 시스템 분무기를 이용하여 뿜어내어 미세한 에어로졸을 90초간 제공하였다. 상기 분비촉진제를 처리하기 15분 앞서, 3가지 다른 농도(10μM, 100μM, 또는 140μM)의 시험 펩티드 50μL를 기관내경로(intratracheal route)로 투여하였다. 상기 RNS 펩티드는 가장 높은 농도수준(140μM 용액의 50μL)만 시험하였다. 상기 실험에 사용된 다양한 대조군은 아래 표 1에 나타내었다. 각각의 실험은 각 시험 포인트(point)당 6 마우스로 수행하였고, 각각의 실험세트는 3번 반복하였다. 혈통간의 변이를 시험하기 위해서, 상기 실험은 유사한 프로토콜하에 Balb/C 마우스로 반복하였다. 140mM의 소듐 아세테이트를 처리한 마우스에서(데이터는 나타내지 않음), 뮤신 분비의 자극, 비자극 모두는 식염수(saline) 대조군과 동일하였다. 메타콜린 투여에 이어, 상기 동물은 희생시키고, 분비된 뮤신의 분석을 위해 그룹당 6 동물의 기관지폐포세척(bronchoalveolar lavage, BAL)을 수행하였다.
표 1은 상기 실험을 위한 일반적인 프로토콜을 나타낸다.
시험 펩티드의 존재하에 메타콜린-유도 뮤신 과분비를 위한 일반적인 프로토콜
시험군 마우스수 처리 펩티드 분비촉진제 투여
식염수 대조군 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl 무 ○
식염수 대조군 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl 무 ×
시험 펩티드 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 140μM 각 시험 펩티드 각 시험 펩티드 ○
시험 펩티드 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 100μM 각 시험 펩티드 각 시험 펩티드 ○
시험 펩티드 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 100μM 각 시험 펩티드 각 시험 펩티드 ×
시험 펩티드 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 10μM 각 시험 펩티드 각 시험 펩티드 ○
시험 펩티드 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 10μM 각 시험 펩티드 각 시험 펩티드 ×
음성(대조군) 펩티드(RNS) 6 무-엔도톡신 0.9% NaCl + 140μM RNS 펩티드 RNS 펩티드 ○
II. BAL액 분석
마우스를 경추분리(cervical dislocation)에 의해 희생시키고, 이어 호흡관(trachea)의 빠른 노출과 약간의 절개를 통한 캐뉼러(cannula) 삽입을 수행하였다. 기관지폐포세척(BAL)액을 PMSF(5mM), EDTA(5mM) 및 DTT(5mM)을 포함하는 PBS 0.5ml을 처리하고, 이어 세번의 1ml을 처리하여 수득하였다. BAL액은 분석을 수행하기에 앞서, 간단한 원심분리를 통해 무-세포(cell-free) 및 세포(cell) 분획들로 각각 분리하였다. 상기 무-세포 상층액은 마우스 뮤신과 반응하는 항-뮤신 항체를 이용한 ELISA방법을 통해 뮤신의 존재를 분석하였다. 특히, 분비된 뮤신의 탄수화물 부분을 인식하는 마우스 항-MUC5AC 항체를 본 검사법에 사용하였다. 각각의 BAL 시료로부터 생성된 데이터는 브래드포드(Bradford) 검사법에 의하여 측정된 총 단백질로 정규화하였다. 뮤신 함유량은 항-뮤신 항체로 얻은 값에서 비-면역 대조군 항체로 얻은 값을 감하여 나타내었다. 모든 ELISA 데이터는 일방적인 ANOVA(one-way ANOVA)를 이용하여 통계적으로 시험하였다. 상기 실험 데이터는 p<0.05일때, 대조군과는 유의성있게 다르다고 간주되었다.
아래 표 2, 3, 4, 5 및 6은 Balb/C 마우스와 BP2 마우스의 뮤신 분비에 대한 다양한 펩티드의 효과를 요약하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 다양한 시험 펩티드의 100μM 농도에서, 뮤신 분비는 대조군(예를 들어, 무 펩티드)의 8%와 56% 사이로 밝혀졌다.
생쥐 천식모델에서의 뮤신 분비(Balb/C 마우스에서 실험)
펩티드(펩티드#식별자) % 대조군 평균 에러
무 펩티드 100 4.2
MANS, myr-펩티드 1 33.8 5.8
RNS, myr-펩티드 232 96 5.2
myr-펩티드 79 50 10.8
myr-펩티드 233 21 14.2
myr-펩티드 234 8 4.2
myr-펩티드 235 13 3.3
펩티드 79 10 3.3
myr-펩티드 106-NH2 27.8 1.6
myr-펩티드 106 33.6 5.8
펩티드 106 33.8 3.3
myr-펩티드 106-NH2 29.3 4.2
myr-펩티드 236-NH2 51 2.0
Ac-펩티드 106 21.5 18.3
myr-펩티드 137 55 4.2
myr-펩티드 137-NH2 56 3.3
모든 펩티드는 100μM로 시험하였다. myr-펩티드 137(p<0.01)과 RNS를 제외한 모든 값의 대조군에 대한 중요도는, p<0.001이다.
생쥐 천식모델에서의 뮤신 분비(Balb/C 마우스에서 실험)
펩티드(펩티드#식별자) % 대조군 평균 에러
무 펩티드 100 8.1
MANS, myr-펩티드 1 40 11.8
RNS, myr-펩티드 232 81** 2.8
myr-펩티드 11 54 5.1
myr-펩티드 37 35** 11.8
myr-펩티드 79 48 10.3
myr-펩티드 15 38** 10.6
myr-펩티드 45 35** 10.3
myr-펩티드 91 68 14.7
myr-펩티드 153 50 7.3
모든 펩티드는 100μM로 시험하였다.
*=대조군에 대한 중요도(p<0.05); **=대조군에 대한 중요도(p<0.01)
생쥐 천식모델에서의 뮤신 분비(Balb/C 마우스에서 실험)
펩티드(펩티드#식별자) % 대조군 평균 에러
무 펩티드 100 5.3
MANS, myr-펩티드 1(100μM) 29** 4.2
RNS, myr-펩티드 232(100μM) 108 8.5
펩티드 237(10μM) 67*+ 8.5
펩티드 237(100μM) 8** 3.8
myr-펩티드 106(10μM) 74*+ 10.6
myr-펩티드 106(100μM) 24** 9.6
펩티드 106(10μM) 64* 4.2
펩티드 406(100μM) 40** 9.6
myr-펩티드 106-NH2(10μM) 67*+ 4.2
myr-펩티드 106-NH2(100μM) 17** 5.3
*=대조군에 대한 중요도(p<0.05); **=대조군에 대한 중요도(p<0.01).
+=100μM 처리에 대한 중요도(p<0.05).
생쥐 천식모델에서의 뮤신 분비(BP2 마우스에서 실험)
뮤신 분비 (% 대조군)
펩티드(농도) 10μM 100μM 140μM
MANS 펩티드 35 12 8
RNS 펩티드 - 100 100
생쥐 천식모델의 시험 펩티드의 작용 지속기간을 측정하기 위해 실험을 설계하였다. 방법 1A에 설명한 바와 같이, Balb/C 마우스는 난백 알부민으로 면역화하였다. 14일 후에, 상기 동물은 에어로졸화된 난백 알부민을 투여하였다. 72시간 후에, 분비 촉진제인 메타콜린(methacholine)이 에어로졸화되어 전달되었다. 상기 시험 펩티드(100M 용액 50μL)은 기관내경로(intratracheal route)로 메타콜린 투여에 30분, 60분 또는 120분 앞서 투여하였다. 상기 동물은 희생되어 분비된 뮤신의 분석을 위해 BAL을 수행하였다. 본 실험의 상기 결과는 표 6에 나타내었다.
생쥐에서의 시험 펩티드 활성 지속기간(Balb/C 마우스에서 실험)(단위: % 대조군)
펩티드 30분 60분 120분
대조군 100 100 100
MANS, myr-펩티드 1 7 44 50
RNS, myr-펩티드 232 100 100 100
Ac-펩티드 106 21 72 70
펩티드 106 23 48 57
선택적 마우스 시험 모델 및 마우스 폐에서의 뮤신의 정량적인 측정방법은 본 발명의 펩티드 활성을 평가하기에 유용하다. 본 방법은 에반(Evan) 등의 문헌에 기술되어 있다(참조: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol. 31, pp 382-394, 2004). 간단히 설명하면, 암컷 Balb/C 마우스(5-8주령, 각각 20-25g)은 주 1회 4주간 식염수 내에 2.2mg 명반염(alum salt) 및 20μg 난백 알부민을 함유한 100μL의 용액을 복강주사하여 감작하였다. 마지막 복강주사 7일 후에, 상기 마우스는 표준 식염수에 용해시킨 2.5% 난백 알부민 용액을 30분 이상 에어로졸을 처리하였다. 상기 에어로졸은 AeroMist CA-209 압축 공기 분무기(CIS-US, Inc, Bedford, MA)로 생성되었다.
난백 알부민 투여 3일 후에, 시험 펩티드 50μL을 10μL로 등분하여 2-3분에 걸쳐 마우스의 각 콧구멍에 가하였다. 15분 후에, 상기 마우스는 에어로졸화된 ATP 용액을 5분에 걸쳐 처리하였다. 20분 후에, 상기 마우스는 케타민(ketamine), 자일라진(xylazine) 및 아세프로마진(acepromazine)의 혼합물을 복강내 주사하여 마취시키고, 우심실을 경유하여 식염수로 관류(perfuse)하여 폐조직으로부터 혈액을 제거하였다. 깊은 마취상태하에, 동물은 20 게이지의 뭉툭한 끝의 캐뉼러(cannula)를 이용하여 기관절개하고(tracheostomized), 복부 대동맥을 통해 방혈(exsanguination)하여 희생하였다. 고정액(Fixative, 0.1M 인산염 완충액에서의 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde), pH 7.0)을 10-15cm 압력으로 기관내 주입하고, 폐는 원위치에서(in situ) 30분동안 고정하여, 흉강으로부터 제거하여 4℃에서 밤샘 고정하였다. 폐는 파라핀에 끼워넣어 6μm 절편으로 잘랐다.
뮤신의 형광표지를 위하여, 조직을 과옥소산 형광 쉬프(periodic acid fluorescent Schiff, PAFS) 염색방법을 이용하여 염색하였다. 조직은 우선 1% 과옥소산(periodic acid)로 산화하여, 세척하고, 아크리플라빈 형광 쉬프시약(acriflavine fluorescent Schiff's reagent, 0.5% 아크리플라빈 HCl wt/vol, 1% 나트륨 메타비아황산염(sodium metabisulfite) wt/vol, 0.01N HCl)을 20분간 처리하여, 이중 탈이온화한 H2O로 세척하고, 산알콜(70% 알콜 중의 0.1N HCl)로 5분간 2번 세척하였다. 슬라이드는 선별된(graded) 알콜용액 내에서 탈수하여, 암소에서 공기건조시켰다. 건조직후, PAFS-염색된 슬라이드는 카나다발삼(Canada balsam) 고정액(50% 카나다발삼 수지, 50% 메틸 살리실산염(methyl salicylate); Fisher Chemicals)으로 커버글라스를 덮었다.
뮤신을 정량하기 위해, PAFS-염색된 슬라이드를 40X 대물렌즈 하에서 시험하였다. 축 방향의 기관지로부터 10면의 이미지를 포획하고, 카메라 설치는 MagnaFire 2.1(Optronics)를 이용하여 조정하였다. PAFS 이미징은 이중 여기필터(dual excitation filter, 531nm 및 573nm 피크)를 이용한 여기표본(excitation specimen) 및 531nm(녹색)과 628nm(빨강)의 피크를 가지는 발광필터(emission filter)를 이용한 관찰 표본(observing specimen)으로 수행하였다. 각각의 장(field)에 대하여, 우선 카메라(590ms 노출)의 빨간색 포착채널(acquisition channel)만을 이용하여 이미지를 생성하였다. 이후, 상기와 동일한 이미지를 카메라(590ms 빨강, 450ms 녹색)상의 빨강과 녹색 채널 모두를 이용하여 다시 얻었다. 형태학적분석(morphometric analysis)을 위하여, 이후, 뮤신 염색의 부피밀도 및 형광밀도를 ImagePro Plus를 이용하여 측정하였다. 기도 상피의 뮤신 염색의 부피밀도는 입체학적으로(stereologically) 계산하였다. 간단히 설명하면, 전체 상피 표면 부분에 대한 염색 표면 부분의 비율을 총 상피 표면 부분, 기저막 길이 및 기하학적인 상수 4/π의 산물인 경계길이 측정으로 나누었다. 결과적으로, 데이터는 기저막의 표면 부분당 세포내 뮤신 함유량의 부피로 나타내었다. 상기 뮤신 분비는 총 상피 함유량의 분수(fraction)로 나타내었다.
실시예 1B: 배상세포 변질형성(metaplasia) 및 기도장애를 가진 마우스 모델에서의 뮤신 과분비상의 에어로졸화된 Ac-펩티드 106 펩티드 투여의 효과
마우스 천식모델에서의 뮤신 과분비에의 에어로졸화된 Ac-펩티드 106의 효능을 두가지 항목으로 측정하였다. 간단히 설명하면, 5-8주령 BALB/c 마우스를 실시예 1A에서 설명된 바와 같이, 주 1회 3주간 난백 알부민으로 면역화하였다. 28일째에, 상기 마우스는 에어로졸화된 표준 식염수에서의 2.5% 난백 알부민을 30분간 투여하였다. 난백 알부민 투여 3일 후에, 각 그룹의 마우스들(n=2)은 10mM 또는 30mM Ac-펩티드 106의 에어로졸화된 등장액을 AeroMist CA-209 분무기를 이용하여 1시간 동안 투여하였다. 에어로졸 입자의 공기역학상의 평균입자크기는 1.49μm(0.4-4.7πm 범위)이었다. 상기 주어진 Ac-펩티드의 농도와 입자크기를 가지고, 계산된 Ac-펩티드 106의 폐 침전은 각각, 0.38mg/kg 체중 및 1.1mg/kg 체중이었다.
Ac-펩티드 106는 즉시 분비촉진제 ATP(식염수에 100mM의 농도로 용해시킴)로 5분간 투여하였다. 상기 마우스는 희생되어, 폐를 20분 이내에 수확하였다. 상기 폐는 식염수로 세척하여, 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고, 파라핀에 끼워 넣어 절단하였다. 상기 절편에 대하여 에반(Evan) 등의 문헌에 개시된 방법에 따라, 정량적 면역조직화학법에 의해 뮤신의 존재를 정량적으로 분석하였다(참조: Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. Vol.31, pp 382-394, 2004). 상기 결과는 Ac-펩티드 106은 각각 0.38 및 1.1mg/kg 체중에서 30에서 67%로 ATP-유도 뮤신 과분비의 억제제로서 효과적이라는 것을 명시한다.
실시예 2: 시험 펩티드의 0.5N 식염수 내에서의 정성적 용해도의 평가
다양한 시험 펩티드(각각 1 내지 5mg)를 개개의 2ml 스크류캡(screw cap) 유리 바이알(vial)에 정확히 저울에 달아 분배하고, 0.5N 식염수(pH 7.5)를 25℃, 대기하에서 25μL씩 등분하여 가하였다. 용해도는 육안으로 평가되었다. 시험 펩티드가 첫 번째 식염수 등분(aliquot)에 완전히 용해되면, 펩티드의 용해도를 산출하고, 계산된 양보다 많은 것으로 지정하였다. 따라서, 만약 3.5mg의 시험 펩티드가 첫 번째 0.5N 식염수의 25μL 등분에 즉시 용해된다면, 용해도는 >140mg/mL로 정해진다. 마찬가지로, 1.7mg의 시험 펩티드가 0.5N 식염수 1.7mL에 용해되지 않는다면, 용해도는 <1.0mg/mL로 정해진다. 다양한 시험 펩티드의 용해도 평가결과는 표 7에 나타내었다.
반규정액(half-normal saline)에서의 다양한 펩티드의 용해도 역시 다음의 두가지 반-정량적 방법, 즉 방법 1 및 방법 2 중 어느 한가지 방법에 의해 측정할 수 있다. 방법 1은 반규정액에서의 용해도가 약 10mg/mL이하인 펩티드에 사용할 수 있는 반면, 방법 2는 반규정액에 약 30mg/mL이상 용해될 수 있는 펩티드에 사용할 수 있다.
방법 1
각각의 펩티드를 1mg/ml 농도로 티에틸설폭사이드(diethylsulfoxide, DMSO)에 용해시켰다. 상기 용액의 등분은 반규정액으로 5배 희석하여, 0.2mg/mL 용액을 제조하였다. 상기 최후의 펩티드 용액은 C18/5 마이크론컬럼(micron colum)을 이용한 HPLC로 분석하였다. 용출완충액은 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)(완충액 A) 및 100% 아세토니트릴 중의 0.1% TFA(완충액 B)로 구성된다. 상기 펩티드는 약 20분 동안 5% B에서 45% B의 농도 차로 용출하였다. 따라서, 각각의 펩티드 피크에 대한 곡선 아래 영역(AUC: area under the curve)을 결정할 수 있다. 이 AUC값은 포화용액의 상층액에서의 각각의 상응하는 펩티드의 농도를 결정하는 표준(AUC-Std)으로 사용할 수 있다.
각각의 펩티드의 포화용액은 충분한 양의 펩티드를 1mL의 반규정액에 혼탁한 부유물이 얻어질 때까지 가하여 제조할 수 있다. 최후에는 10,000×g로 10분간 원심분리한다. 상기 상층액은 이후에, HPLC로 분석하였다. 상기 상층액은 필요하다면, HPLC분석에 앞서 반규정액으로 좀 더 희석시킨다. 본 분석에 의하여 얻어진 AUC(AUC-Sat)은 다음 공식에 의해 포화용액에서의 펩티드 농도결정에 사용된다:
포화용액에서의 펩티드 농도 = AUC = Std×0.2/AUC-Sat.
방법 2
본 방법은 반규정액에서의 펩티드 용해도를 제공한다. 상기 방법은 1mL 반규정액에 용해시킨 펩티드의 측정된 중량("xx"mg을 의미)을 가하는 것으로 구성된다. 상기 결과는 >xxmg/mL로 나타내며, xx는 반규정액에 가한 펩티드의 양이다.
20℃에서 0.5N 식염수(pH 7.5)에서의 펩티드 용해도
서열번호 0.5N 식염수에서의 용해도(mg/mL)
myr-펩티드 1 <5.0
Ac-펩티드 1 >125
myr-펩티드 232 >15
myr-펩티드 11 >2.0
myr-펩티드 37 >2.0
myr-펩티드 79 >2.0
myr-펩티드 238 >2.0
myr-펩티드 233 >3.0
myr-펩티드 234 >3.0
myr-펩티드 235 >60
펩티드 79 >60
myr-펩티드 79-NH2 <1.0
myr-펩티드 237 <1.0
myr-펩티드 237-NH2 <1.0
펩티드 237 >80
myr-펩티드 234-NH2 <2.0
Ac-펩티드 79-NH2 >60
Ac-펩티드 79 >100
Ac-펩티드 239 >50
Ac-펩티드 240 N/A
Ac-펩티드 241 >50
myr-펩티드 106 >10
펩티드 106 >70
myr-펩티드 106-NH2 <10
myr-펩티드 236 <10
myr-펩티드 236-NH2 <10
펩티드 106-NH2 >100
Ac-펩티드 106 >100
cyclic-펩티드 106 >150
Ac-펩티드 242 >100
Ac-펩티드 243 >50
Ac-펩티드 236 >80
Ac-펩티드 244 >120
Ac-펩티드 245 >100
Ac-펩티드 247 >100
Ac-펩티드 248 >100
Ac-펩티드 249 <1
myr-펩티드 121 <1.0
Ac-펩티드 121 >20
myr-펩티드 137 <1.0
myr-펩티드 137-NH2 N/A
Ac-펩티드 250 N/A
Ac-펩티드 137 >200
myr-펩티드 15 >80
myr-펩티드 45 >80
myr-펩티드 91 <20
myr-펩티드 153 <10
myr-펩티드 143 <1.0
Ac-펩티드 143 >230
myr-펩티드 179 <10.
Ac-펩티드 179 >150
myr-펩티드 219 <1.0
Ac-펩티드 219 >200
Ac-펩티드 219-NH2 >200
Ac-펩티드 251 >200
Ac-펩티드 93-NH2 >90
Ac-펩티드 108-NH2 >150
Ac-펩티드 124-NH2 >100
Ac-펩티드 141-NH2 >200
Ac-펩티드 159-NH2 >200
Ac-펩티드 246 <30
Ac-펩티드 252 <30
실시예 3: 생물학적 액체 내에서의 시험 펩티드의 안정성
인간 혈장, 인간 BALF 및 CF 환자 점액에서의 다양한 시험 펩티드가 상기 시험 펩티드의 생물학적 액체에의 단백질 분해 민감성 측정을 위해 분석되었다. 아울러, 1차 동력학적 분석이 시험 펩티드의 반감기를 측정하기 위하여 농도 감소를 나타내는 시료에 대하여 수행되었다. 상기 시료는 수령한 당일 분석하거나, -20℃로 저장하면서 2일 안에 분석하였다.
Ⅰ. 생물학적 액체의 수집 및 처리
A. 인간 혈장:
신선한 인간 혈액을 구연산염 완충처리한 베큐트레이너(citrate buffered vacuutrainer)(EDTA 또는 헤파린(heparin) 부재하에)에 수집하였다. 적혈구(RBC)는 상기 혈액을 4℃에서 4000×g로 10분간 원심분리하여 제거하였다. 혈장 등분(0.9mL)은 이후, pH 7.0의 75mM 나트륨 아세트산염 완충액에서의 0.5mg/mL 시험 펩티드 용액 0.1mL을 가하고, 항온수조에서 37℃를 유지하여 반응시켰다. 10μL의 중복 등분(duplicate aliquot)은 5, 15, 30, 60 및 180분 간격으로 회수하여, 50% 아세토니트릴 + 0.2% 포름산을 함유한 50% 물로 구성된 용액 990μL로 즉시 "급랭시켰다(quenched)". 그런 다음, 상기 시료는 액체크로마토그래피-질량분석기(liquid chromatography-mass spectrometry, LCMS)로 분석하였다.
B. 인간 BAL액:
COPD 환자로부터 수집된 BALF 시료는 수득하여 냉동하였다. 상기 BALF 시료는 융해시켜, 서로 혼합하고, 4 내지 8℃에서 10,000×g로 10분간 원심분리하였다. 상기 상층액(0.9mL)은 pH 7.0의 75mM 나트륨 아세트산염 완충액에서의 0.5mg/mL 시험 펩티드 용액 0.1mL을 가하고, 상술한 바와 같이 처리하고 분석하였다.
C. 인간 CF 점액:
CF 환자로부터 냉동된 점액(타액)은 융해시켜, 유리 조직 분쇄기로 2배 부피의 pH 7.0, 75mM 나트륨 아세트산염 완충액 내에 혼합하고, 4 내지 8℃에서 10,000×g로 10분간 원심분리하였다. 상기 두 상층액은 혼합하여 다음과 같이 사용하였다. 상기 상층액(450μL)에 pH 7.0의 75mM 나트륨 아세트산염 완충액에서의 0.5mg/ml 펩티드 용액 50μL를 가하여, 상술한 바와 같이 처리하고 분석하였다.
Ⅱ. 농도 분석
모든 시료는 LC/MS/MS(MDS/SCIEX, API 4000 Model)을 이용하여 분석하였다. 크로마토그래피는 Phenomenex Luna C18 컬럼을 사용하여 수행하였고, 질량분석은 전기분무이온화(electrospary ionization)를 이용하여 수행하였다.
A. 인간 혈장 및 BALF에서의 Ac-펩티드 79-NH2, 펩티드 106-NH2, Ac-펩티드 106 펩티드 분석과 인간 혈장 및 인간 CF 점액에서의 myr-펩티드 106, 펩티드 106, 펩티드 106-NH2,Ac-펩티드 106 및 cyc-펩티드 106(환형 펩티드) 펩티드의 분석
보정표준(calibration standard)은 각각의 펩티드에 대해 0.100μg/ml, 1.00μg/ml, 10.0μg/ml 및 100μg/ml의 농도로 LCMS에 의해 분석하였다. 예외로, 인간 점액에서의 펩티드 myr-펩티드 106, 펩티드 106, 펩티드 106-NH2, 펩티드 106 및 환형 펩티드, cyc-펩티드 106은 0.100μg/ml, 1.00μg/ml, 10.0μg/ml 및 75μg/ml의 농도로 보정표준을 분석하였다. 표준은 0.2% 포름산(formic acid)을 함유한 50/50 물/아세토니트릴 혼합물에서의 1% 인간 BALF, 혈장, 또는 점액에서 제조되었다. 각각의 표준 세트에 대한 방법 반응값(instrument response value)은 1/(농도)2 직쇄형 최소 제곱근 선(linear least-square line)를 이용하여 조절하였다. 시료 농도는 상기 선의 기울기와 절편을 이용하여 계산하였다. 측정 범위 밖의 농도는 측정곡선 외삽법(extrapolation)에 의해 측정하였다.
B. 인간 혈장 및 BALF에서의 펩티드 myr-펩티드 234-NH2, myr-펩티드 234, 펩티드 106 및 myr-펩티드 106의 분석
중복의 보정표준은 각각의 펩티드에 대하여 50μL 농도로 분석하였다. 각각의 표준 세트에 대한 방법 반응값은 기울지 않은(unweighted), 직쇄형 최소 제곱근을 이용한 0의 절편을 통해 조절하였다: 시료 농도는 상기 선의 기울기와 절편을 이용하여 계산하였다.
C. 인간 혈장과 BALF에서의 펩티드 펩티드 237, myr-펩티드 106-NH2, myr-펩티드 236 및 myr-펩티드 236-NH2의 분석
혈장에서의 펩티드 농도를 분석하기 위하여, 중복의 보정표준을 각각의 펩티드에 대하여 25μg/ml 및 50μg/ml의 농도로 분석하였다. 각각의 표준 세트에 대한 방법 반응값은 기울지 않은, 직쇄형 최소 제곱근 선을 이용한 0의 절편을 통해 조절하였다. 시료 농도는 상기 선의 기울기와 절편을 이용하여 계산하였다. 측정 범위 밖의 농도는 측정곡선 외삽법에 의해 측정하였다.
BALF 시료에서의 펩티드 농도 분석을 위하여, BAFL, 물, 아세토니트릴 및 포름산의 혼합물에서 제조된 하나의 50μg/ml 보정표준이 각각의 시료 세트로 분석하였다.
Ⅲ. 동력학적 프로파일(kinetic profile)
1차 동력학적 프로파일을 농도에 현저한 감쇠를 보이는 모든 시료에 대하여 왓슨(Watson) 소프트웨어 프로그램을 이용하여 측정하였다. 왓슨은 로그 변환데이터(log transformed data)를 Cmax(최대농도), 절편(intercept), 속도상수(rate constant), 기울기(slope) 및 T1 /2(반감기) 등의 매개변수를 측정하기 위하여, 최소 제곱근 선(linear least-squares line)과 맞추었다. 상기 동력학적 프로파일 결과는 리니어피트(linear fit)에 기초한 것이고, 실제 농도 값은 아니다.
용액에서의 타임-제로(time-zero) 보정표준은 동력학적 프로파일의 부분으로 포함하지 않았다. 그러나, 진정(true) 1차 동력학은 시간의 함수로 농도변화를 정확히 설명하기 위한 타임-제로 데이터 점들을 필요로 하지 않는다.
인간 혈장(혈장 t1 /2), 인간 BALF(BALF1 /2) 및 인간 CF 점액(점액1 /2)에서의 시험 펩티드의 반감기는 표 8에 개시하였다.
펩티드 식별자# 혈장 t1 /2(시간) (1st 실험) 혈장 t1 /2(시간) (2nd 실험) BALF t1 /2(시간) (1st 실험) BALF t1 /2(시간) (2nd 실험) 점액 t1 /2(시간) (1st 실험) 점액 t1 /2(시간) (2nd 실험)
myr-펩티드 234-NH2 3.82 -- 1.70 -- -- --
myr-펩티드234 * -- 1.08 -- -- --
펩티드 106 0.28 0.15 1.88 -- 0.23 0.37
myr-펩티드 106 1.23 0.09 1.03 -- 9.53 3.00
펩티드 237 0.49 -- * * -- --
myr-펩티드 106-NH2 * -- 10.52 12.81 -- --
myr-펩티드 236 0.72 -- 3.55 2.94 -- --
myr-펩티드 236-NH2 * -- 4.16 4.08 -- --
Ac-펩티드 79-NH2 2.64 -- 4.16 4.08 -- --
펩티드 106-NH2 0.30 0.13 4.00 -- 0.08 0.13
Ac-펩티드 106 * 0.03 1.89 -- 0.55 0.47
cyclic-펩티드 106 -- 1.04 -- -- 1.10 2.00
#: myr 및 Ac는 각각, 펩티드의 N-말단 아미노산 부위에 공유결합된 미리스토일기 및 아세틸기; -NH2는 펩티드의 C-말단 카르복실기에 공유결합된 아민; seq no. 및 cyc는 각각, 서열번호 및 고리의 약자이다.
--: 수행되지 않은 실험.
*: 반감기를 계산하기에 실험에서 얻어진 데이터가 불충분함.
상기의 myr-펩티 드236은 미리스토일-펩티드 236이다. 본 실험에서 사용한 다른 모든 펩티드는 상술한 바와 같다.
실시예 4: 영장류의 위쪽 호흡관 내 점액분비에 대한 MANS 펩티드의 효능
본 실험의 목적은 건강한 성체 붉은털 원숭이의 위쪽 호흡관에서 MANS 펩티드의 점액분비 억제능력을 측정하기 위함이다. 상기 사용된 시험은 코의 분비능력 평가를 위한 표준방법이며, 비-인간 영장류는 통상적으로 남성에서의 활성에 대하여 좋은 상관관계를 제공한다.
방법
비염의 병력이 없는 총 17마리의 건강하고 젊은 수컷 붉은털 원숭이가 본 실험을 위해 사용되었다. 상기 원숭이 중 어느 하나 상기 실험 전 또는 후에 비염을 앓지 않았다. 각각 원숭이의 코점액 분비는 어떤 처리 전에 왼쪽 콧구멍에서 측정하였다. 상기 값은 100% 점액분비로 간주된다. 상기 원숭이들은 이후에, 선택적으로 다음의 4 그룹으로 나누었다:
그룹 1: 표준 식염수, 대조군(n=3);
그룹 2: 소듐 아세테이트, 용매 대조군(n=4)
그룹 3: RNS 펩티드, 음성 대조군(n=5);및
그룹 4: MANS 펩티드, 시험 펩티드(n=5).
처치에 앞서, 모든 17마리의 동물의 왼쪽 콧구멍에 식염수를 넣었다. 오른쪽 콧구멍에는 0.2mL의 식염수, 소듐 아세테이트, RNS 펩티드, 또는 MANS 펩티드를 처리하였다. 따라서, 각각의 동물은 각자의 자체 대조군을 가지고 있다. 상기 시험품목(test article)의 처리 1시간 후, 각각의 동물의 양쪽 콧구멍에 코 세척을 수행하였다. 모든 세척액은 즉시 -80℃에 냉동하고, ELISA에 의하여 점액 함유량을 분석하였다.
A. 시험품목(test article)
표준 식염수; 여과멸균한, 150μM 소듐 아세테이트; 여과멸균한 150μM 소듐 아세테이트에서의 여과멸균한 3. RNS 펩티드-140μM 용액 및 여과멸균한 150μM 소듐 아세테이트에서의 MANS-펩티드-140μM\
B. 시험동물
붉은털 원숭이; 동물 수: 17; 성별: 모든 건강한 수컷; 나이: 3에서 4세; 몸무게: 4에서 7kg., 평균 5.03Kg; 환경순응기간(acclimatization period): 7일; 식별방법: 5자리 ID 번호와 특유의 문신. 병력: 모든 동물은 본 시험의 12-24달 전에 뇌막염에 대한 면역화를 위한 백신 연구에 사용되었다. 모든 동물은 또한, 유년기에 홍역과 파상풍에 대한 기본예방접종(routine immunization)을 하였다.
C. 동물관리
보호(Husbandry): 조건은 "실험 동물의 관리와 사용을 위한 안내서"를 기초하여, 표준조작법을 따랐다. 먹이: 표준 붉은털 원숭이 음식물은 매일 제공되었다. 물: 마음대로 이용할 수 있도록, 자동화 급수 시스템을 통한 한정된 구역의 물이 전달되었다. 숙소: 동물들은 동물번호, 시험코드, 성별, 동물코드를 지시하는 카드로 식별될 수 있는 증진된 스테인레스 케이지에 개별적인 주거공간을 제공하였다. 환경: 실내온도는 매일 조정하였다. 실에서의 온도 범위는 20-26℃ 범위 내로 조절하였다. 동물실에서의 습도범위는 40-70%가 되도록 매일 조정하였다. 광주기(light cycle)는 자동화 타이머(12시간 낮, 12시간 밤)를 이용하여 조절하였다. 관리인력: 관리인력들은 영장류 사육을 위해 적절히 검증되고 훈련되었다.
결과
상기 결과는 RNS 펩티드, 소듐 아세테이트 완충액, 또는 표준 식염수는 점액분비에 어떤 효과도 가지지 않는 반면, 점액분비는 MANS 펩티드에 의해 거의 75% 억제된다는 데이터를 제공한다.
실시예 5: 인간 기관지 상피세포에서의 분비된 뮤신 측정을 위한 조직 배양방법
HBE1은 공기/액체 경계면(air/liquid interface)에서 배양되었을시, 뮤신을 분비할 수 있는 유두종(papilloma) 바이러스-혈질전환 된 인간 기관지 상피세포주이다(참조: Li et al., J. Biol. Chem., 276:40982-40990, 2001). 간단히 설명하면, HBE1 세포는 랫트 꼬리 콜라겐Ⅰ형(Costar, Bedford, MA)으로 얇게 도포된 12-웰 트랜스웰(transwell) 청결 배양 삽입물(Costar, Cambridge, MA)내에 적당수의 세포를 뿌려줌으로써, 공기/액체 경계면(air/liquid interface) 내에 배양하였다. 세포를 처음에는 배양용기에 거의 찰 때까지, 5-7일간 95% 습도, 5% CO2 조건에서의 배양액에 잠긴 채로 배양하였다. 이때, 상기 공기/액체 경계면은 상부의 배양액을 제거하고, 세포를 바닥에 비스듬히 넣어 줌으로써 만들어진다. 그 이후에는 배양액을 매일 교체해 주었다. 세포는 완전히 분화할 때까지 14일 추가적으로 배양하였다. 상기 세포의 상층 표면에 축적된 뮤신는 pH 7.2의 인산생리식염완충액(phosphate-buffered saline)으로 세척하여 제거하였다. 기준 뮤신 분비를 수집하기 위해서, 세포는 배양액만으로 30분간 배양하여 상층 배양액에서의 분비된 뮤신을 수집하고, ELISA에 의해 정량하였다. 뮤신 분비 촉진제에 의해 과분비된 뮤신을 측정하기 위하여, 세포를 0.5μM 포볼미리스테이트아세트산염(phorbol myristrate acetate, PMA)을 포함하는 배양액에 30분간 노출하였고, 뮤신을 수집해 ELISA로 정량하였다. 시험 펩티드에 의한 PMA-유도 뮤신 과분비의 억제를 측정하기 위하여, 세포를 25 또는 50μM 시험 펩티드를 포함하는 배양액에 15분간 전-배양한 후 0.5μM PMA로 30분간 배양하였다. 6웰이 각각의 시험 펩티드와 각각의 대조군에 사용되었다. 상기 상층 배양액의 분비된 뮤신는 수집되어 알칼리 인산가수분해효소-접합 뮤신(MUC5A) 특이적 항체(Zymed Laboratories, San Francisco, CA)을 이용한 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)로 정량하였다.
HBE1 세포에 0.5μM PMA 처리결과, 20%의 뮤신 분비가 증가하였다. 상기 뮤신 분비의 PMA-유도 증가는 25μM MANS 펩티드 또는 25μM Ac-펩티드 번호: 106의 전처리에 의해 100% 차단되었다. 25μM의 Ac-펩티드 번호: 219는 PMA-유도 뮤신 분비를 100% 억제할 뿐만 아니라, 비자극 배양액 대조군의 뮤신 분비를 20% 아래로 억제하였다. Ac-펩티드 번호: 251은 뮤신 분비 PMA-유도 증가의 최소 6% 억제효과를 가졌다.
표 9는 본 발명의 펩티드 및 그들 각각의 아미노산 서열에 상응하는 서열번호를 나타낸다.
펩티드 및 아미노산 서열
펩티드 번호 서 열 서열번호
펩티드 1 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 1
펩티드 2 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 2
펩티드 3 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 3
펩티드 4 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 4
펩티드 5 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 5
펩티드 6 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 6
펩티드 7 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 7
펩티드 8 AQFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 8
펩티드 9 QFSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 9
펩티드 10 FSKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 10
펩티드 11 GAQFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 11
펩티드 12 AQFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 12
펩티드 13 QFSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 13
펩티드 14 FSKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 14
펩티드 15 SKTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 15
펩티드 16 GAQFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 16
펩티드 17 AQFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 17
펩티드 18 QFSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 18
펩티드 19 FSKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 19
펩티드 20 SKTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 20
펩티드 21 KTAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 21
펩티드 22 GAQFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 22
펩티드 23 AQFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 23
펩티드 24 QFSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 24
펩티드 25 FSKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 25
펩티드 26 SKTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 26
펩티드 27 KTAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 27
펩티드 28 TAAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 28
펩티드 29 GAQFSKTAAKGEAAAER 서열번호 29
펩티드 30 AQFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 30
펩티드 31 QFSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 31
펩티드 32 FSKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 32
펩티드 33 SKTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 33
펩티드 34 KTAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 34
펩티드 35 TAAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 35
펩티드 36 AAKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 36
펩티드 37 GAQFSKTAAKGEAAAE 서열번호 37
펩티드 38 AQFSKTAAKGEAAAER 서열번호 38
펩티드 39 QFSKTAAKGEAAAERP 서열번호 39
펩티드 40 FSKTAAKGEAAAERPG 서열번호 40
펩티드 41 SKTAAKGEAAAERPGE 서열번호 41
펩티드 42 KTAAKGEAAAERPGEA 서열번호 42
펩티드 43 TAAKGEAAAERPGEAA 서열번호 43
펩티드 44 AAKGEAAAERPGEAAV 서열번호 44
펩티드 45 AKGEAAAERPGEAAVA 서열번호 45
펩티드 46 GAQFSKTAAKGEAAA 서열번호 46
펩티드 47 AQFSKTAAKGEAAAE 서열번호 47
펩티드 48 QFSKTAAKGEAAAER 서열번호 48
펩티드 49 FSKTAAKGEAAAERP 서열번호 49
펩티드 50 SKTAAKGEAAAERPG 서열번호 50
펩티드 51 KTAAKGEAAAERPGE 서열번호 51
펩티드 52 TAAKGEAAAERPGEA 서열번호 52
펩티드 53 AAKGEAAAERPGEAA 서열번호 53
펩티드 54 AKGEAAAERPGEAAV 서열번호 54
펩티드 55 KGEAAAERPGEAAVA 서열번호 55
펩티드 56 GAQFSKTAAKGEAA 서열번호 56
펩티드 57 AQFSKTAAKGEAAA 서열번호 57
펩티드 58 QFSKTAAKGEAAAE 서열번호 58
펩티드 59 FSKTAAKGEAAAER 서열번호 59
펩티드 60 SKTAAKGEAAAERP 서열번호 60
펩티드 61 KTAAKGEAAAERPG 서열번호 61
펩티드 62 TAAKGEAAAERPGE 서열번호 62
펩티드 63 AAKGEAAAERPGEA 서열번호 63
펩티드 64 AKGEAAAERPGEAA 서열번호 64
펩티드 65 KGEAAAERPGEAAV 서열번호 65
펩티드 66 GEAAAERPGEAAVA 서열번호 66
펩티드 67 GAQFSKTAAKGEA 서열번호 67
펩티드 68 AQFSKTAAKGEAA 서열번호 68
펩티드 69 QFSKTAAKGEAAA 서열번호 69
펩티드 70 FSKTAAKGEAAAE 서열번호 70
펩티드 71 SKTAAKGEAAAER 서열번호 71
펩티드 72 KTAAKGEAAAERP 서열번호 72
펩티드 73 TAAKGEAAAERPG 서열번호 73
펩티드 74 AAKGEAAAERPGE 서열번호 74
펩티드 75 AKGEAAAERPGEA 서열번호 75
펩티드 76 KGEAAAERPGEAA 서열번호 76
펩티드 77 GEAAAERPGEAAV 서열번호 77
펩티드 78 EAAAERPGEAAVA 서열번호 78
펩티드 79 GAQFSKTAAKGE 서열번호 79
펩티드 80 AQFSKTAAKGEA 서열번호 80
펩티드 81 QFSKTAAKGEAA 서열번호 81
펩티드 82 FSKTAAKGEAAA 서열번호 82
펩티드 83 SKTAAKGEAAAE 서열번호 83
펩티드 84 KTAAKGEAAAER 서열번호 84
펩티드 85 TAAKGEAAAERP 서열번호 85
펩티드 86 AAKGEAAAERPG 서열번호 86
펩티드 87 AKGEAAAERPGE 서열번호 87
펩티드 88 KGEAAAERPGEA 서열번호 88
페티드 89 GEAAAERPGEAA 서열번호 89
펩티드 90 EAAAERPGEAAV 서열번호 90
펩티드 91 AAAERPGEAAVA 서열번호 91
펩티드 92 GAQFSKTAAKG 서열번호 92
펩티드 93 AQFSKTAAKGE 서열번호 93
펩티드 94 QFSKTAAKGEA 서열번호 94
펩티드 95 FSKTAAKGEAA 서열번호 95
펩티드 96 SKTAAKGEAAA 서열번호 96
펩티드 97 KTAAKGEAAAE 서열번호 97
펩티드 98 TAAKGEAAAER 서열번호 98
펩티드 99 AAKGEAAAERP 서열번호 99
펩티드 100 AKGEAAAERPG 서열번호 100
펩티드 101 KGEAAAERPGE 서열번호 101
펩티드 102 GEAAAERPGEA 서열번호 102
펩티드 103 EAAAERPGEAA 서열번호 103
펩티드 104 AAAERPGEAAV 서열번호 104
펩티드 105 AAERPGEAAVA 서열번호 105
펩티드 106 GAQFSKTAAK 서열번호 106
펩티드 107 AQFSKTAAKG 서열번호 107
펩티드 108 QFSKTAAKGE 서열번호 108
펩티드 109 FSKTAAKGEA 서열번호 109
펩티드 110 SKTAAKGEAA 서열번호 110
펩티드 111 KTAAKGEAAA 서열번호 111
펩티드 112 TAAKGEAAAE 서열번호 112
펩티드 113 AAKGEAAAER 서열번호 113
펩티드 114 AKGEAAAERP 서열번호 114
펩티드 115 KGEAAAERPG 서열번호 115
펩티드 116 GEAAAERPGE 서열번호 116
펩티드 117 EAAAERPGEA 서열번호 117
펩티드 118 AAAERPGEAA 서열번호 118
펩티드 119 AAERPGEAAV 서열번호 119
펩티드 120 AERPGEAAVA 서열번호 120
펩티드 121 GAQFSKTAA 서열번호 121
펩티드 122 AQFSKTAAK 서열번호 122
펩티드 123 QFSKTAAKG 서열번호 123
펩티드 124 FSKTAAKGE 서열번호 124
펩티드 125 SKTAAKGEA 서열번호 125
펩티드 126 KTAAKGEAA 서열번호 126
펩티드 127 TAAKGEAAA 서열번호 127
펩티드 128 AAKGEAAAE 서열번호 128
펩티드 129 AKGEAAAER 서열번호 129
펩티드 130 KGEAAAERP 서열번호 130
펩티드 131 GEAAAERPG 서열번호 131
펩티드 132 EAAAERPGE 서열번호 132
펩티드 133 AAAERPGEA 서열번호 133
펩티드 134 AAERPGEAA 서열번호 134
펩티드 135 AERPGEAAV 서열번호 135
펩티드 136 ERPGEAAVA 서열번호 136
펩티드 137 GAQFSKTA 서열번호 137
펩티드 138 AQFSKTAA 서열번호 138
펩티드 139 QFSKTAAK 서열번호 139
펩티드 140 FSKTAAKG 서열번호 140
펩티드 141 SKTAAKGE 서열번호 141
펩티드 142 KTAAKGEA 서열번호 142
펩티드 143 TAAKGEAA 서열번호 143
펩티드 144 AAKGEAAA 서열번호 144
펩티드 145 AKGEAAAE 서열번호 145
펩티드 146 KGEAAAER 서열번호 146
펩티드 147 GEAAAERP 서열번호 147
펩티드 148 EAAAERPG 서열번호 148
펩티드 149 AAAERPGE 서열번호 149
펩티드 150 AAERPGEA 서열번호 150
펩티드 151 AERPGEAA 서열번호 151
펩티드 152 ERPGEAAV 서열번호 152
펩티드 153 RPGEAAVA 서열번호 153
펩티드 154 GAQFSKT 서열번호 154
펩티드 155 AQFSKTA 서열번호 155
펩티드 156 QFSKTAA 서열번호 156
펩티드 157 FSKTAAK 서열번호 157
펩티드 158 SKTAAKG 서열번호 158
펩티드 159 KTAAKGE 서열번호 159
펩티드 160 TAAKGEA 서열번호 160
펩티드 161 AAKGEAA 서열번호 161
펩티드 162 AKGEAAA 서열번호 162
펩티드 163 KGEAAAE 서열번호 163
펩티드 164 GEAAAER 서열번호 164
펩티드 165 EAAAERP 서열번호 165
펩티드 166 AAAERPG 서열번호 166
펩티드 167 AAERPGE 서열번호 167
펩티드 168 AERPGEA 서열번호 168
펩티드 169 ERPGEAA 서열번호 169
펩티드 170 RPGEAAV 서열번호 170
펩티드 171 PGEAAVA 서열번호 171
펩티드 172 GAQFSK 서열번호 172
펩티드 173 AQFSKT 서열번호 173
펩티드 174 QFSKTA 서열번호 174
펩티드 175 FSKTAA 서열번호 175
펩티드 176 SKTAAK 서열번호 176
펩티드 177 KTAAKG 서열번호 177
펩티드 178 TAAKGE 서열번호 178
펩티드 179 AAKGEA 서열번호 179
펩티드 180 AKGEAA 서열번호 180
펩티드 181 KGEAAA 서열번호 181
펩티드 182 GEAAAE 서열번호 182
펩티드 183 EAAAER 서열번호 183
펩티드 184 AAAERP 서열번호 184
펩티드 185 AAERPG 서열번호 185
펩티드 186 AERPGE 서열번호 186
펩티드 187 ERPGEA 서열번호 187
펩티드 188 RPGEAA 서열번호 188
펩티드 189 PGEAAV 서열번호 189
펩티드 190 GEAAVA 서열번호 190
펩티드 191 GAQFS 서열번호 191
펩티드 192 AQFSK 서열번호 192
펩티드 193 QFSKT 서열번호 193
펩티드 194 FSKTA 서열번호 194
펩티드 195 SKTAA 서열번호 195
펩티드 196 KTAAK 서열번호 196
펩티드 197 TAAKG 서열번호 197
펩티드 198 AAKGE 서열번호 198
펩티드 199 AKGEA 서열번호 199
펩티드 200 KGEAA 서열번호 200
펩티드 201 GEAAA 서열번호 201
펩티드 202 EAAAE 서열번호 202
펩티드 203 AAAER 서열번호 203
펩티드 204 AAERP 서열번호 204
펩티드 205 AERPG 서열번호 205
펩티드 206 ERPGE 서열번호 206
펩티드 207 RPGEA 서열번호 207
펩티드 208 PGEAA 서열번호 208
펩티드 209 GEAAV 서열번호 209
펩티드 210 EAAVA 서열번호 210
펩티드 211 GAQF 서열번호 211
펩티드 212 AQFS 서열번호 212
펩티드 213 QFSK 서열번호 213
펩티드 214 FSKT 서열번호 214
펩티드 215 SKTA 서열번호 215
펩티드 216 KTAA 서열번호 216
펩티드 217 TAAK 서열번호 217
펩티드 218 AAKG 서열번호 218
펩티드 219 AKGE 서열번호 219
펩티드 220 KGEA 서열번호 220
펩티드 221 GEAA 서열번호 221
펩티드 222 EAAA 서열번호 222
펩티드 223 AAAE 서열번호 223
펩티드 224 AAER 서열번호 224
펩티드 225 AERP 서열번호 225
펩티드 226 ERPG 서열번호 226
펩티드 227 RPGE 서열번호 227
펩티드 228 PGEA 서열번호 228
펩티드 229 GEAA 서열번호 229
펩티드 230 EAAV 서열번호 230
펩티드 231 AAVA 서열번호 231
펩티드 232 GTAPAAEGAGAEVKRASAEAKQAF 서열번호 232
펩티드 233 GKQFSKTAAKGE 서열번호 233
펩티드 234 GAQFSKTKAKGE 서열번호 234
펩티드 235 GKQFSKTKAKGE 서열번호 235
펩티드 236 GAQASKTAAK 서열번호 236
펩티드 237 GAQASKTAAKGE 서열번호 237
펩티드 238 GAEFSKTAAKGE 서열번호 238
펩티드 239 GAQFSKTAAAGE 서열번호 239
펩티드 240 GAQFSKTAAKAE 서열번호 240
펩티드 241 GAQFSKTAAKGA 서열번호 241
펩티드 242 AAQFSKTAAK 서열번호 242
펩티드 243 GAAFSKTAAK 서열번호 243
펩티드 244 GAQFAKTAAK 서열번호 244
펩티드 245 GAQFSATAAK 서열번호 245
펩티드 246 KAATKSFQAG 서열번호 246
펩티드 247 GAQFSKAAAK 서열번호 247
펩티드 248 GAQFSKTAAA 서열번호 248
펩티드 249 GAQFSATAAA 서열번호 249
펩티드 250 GAQASKTA 서열번호 250
펩티드 251 AAGE 서열번호 251
펩티드 252 GKASQFAKTA 서열번호 252
본 발명은 특정 실시태양에 대하여 참고문헌과 함께 상세히 설명하였지만, 이를 본 발명의 의도와 범주에 벗어나지 않는 당해 분야의 숙련된 자들이 다양하게 변이시키고 변형시킬 수 있음은 명백할 수 있다.
<110> BIOMARCK PHARMACEUTICALS, LTD. <120> MUCIN HYPERSECRETION INHIBITORS AND METHODS OF USE <150> US60/645,293 <151> 2005-01-20 <160> 252 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15 Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15 Arg Pro Gly Glu Ala Ala Val 20 <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 3 Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu Arg 1 5 10 15 Pro Gly Glu Ala Ala Val Ala 20 <210> 4 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 4 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu Ala Ala Ala Glu 1 5 10 15 Arg Pro Gly Glu Ala Ala 20 <210> 5 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Ala Ala 1 <210> 222 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 222 Glu Ala Ala Ala 1 <210> 223 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 223 Ala Ala Ala Glu 1 <210> 224 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 224 Ala Ala Glu Arg 1 <210> 225 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 225 Ala Glu Arg Pro 1 <210> 226 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 226 Glu Arg Pro Gly 1 <210> 227 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 227 Arg Pro Gly Glu 1 <210> 228 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 228 Pro Gly Glu Ala 1 <210> 229 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 229 Gly Glu Ala Ala 1 <210> 230 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 230 Glu Ala Ala Val 1 <210> 231 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 231 Ala Ala Val Ala 1 <210> 232 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 232 Gly Thr Ala Pro Ala Ala Glu Gly Ala Gly Ala Glu Val Lys Arg Ala 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ala Lys Gln Ala Phe 20 <210> 233 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 233 Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 234 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 234 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 235 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 235 Gly Lys Gln Phe Ser Lys Thr Lys Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 236 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 236 Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 237 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 237 Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 238 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 238 Gly Ala Glu Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Glu 1 5 10 <210> 239 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 239 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala Gly Glu 1 5 10 <210> 240 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 240 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Ala Glu 1 5 10 <210> 241 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 241 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys Gly Ala 1 5 10 <210> 242 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 242 Ala Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 243 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 243 Gly Ala Ala Phe Ser Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 244 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 244 Gly Ala Gln Phe Ala Lys Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 245 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 245 Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 246 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 246 Lys Ala Ala Thr Lys Ser Phe Gln Ala Gly 1 5 10 <210> 247 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 247 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 248 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 248 Gly Ala Gln Phe Ser Lys Thr Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 249 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 249 Gly Ala Gln Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 250 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 250 Gly Ala Gln Ala Ser Lys Thr Ala 1 5 <210> 251 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 251 Ala Ala Gly Glu 1 <210> 252 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 252 Gly Lys Ala Ser Gln Phe Ala Lys Thr Ala 1 5 10

Claims (55)

  1. 뮤신 과분비를 억제하고, 24개 이하의 아미노산으로 구성되며,
    (a) 참조서열인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지고,
    하나 또는 그 이상의 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있는 펩티드의 뮤신 과분비-억제량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 뮤신 과분비를 억제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 상기 참조서열의 N-말단 아미노산으로부터 시작하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열의 2번 위치의 아미노산으로부터 시 작하여 21번 위치의 아미노산까지인 것을 특징으로 하는
    방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 상기 참조서열의 연속된 A, K, G 및 E 잔기(서열번호 19)를 포함하는 것을 특징으로 하는
    방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 상기 참조서열의 C-말단 아미노산에서 종결되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 상기 참조서열의 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 상기 참조서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 상기 참조서열의 10 내지 12개의 연속된 아미노산 또는 상기 참조서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단의 아미노기가 알킬화, 아미드화 또는 아실화되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단의 아미노기가 미리스토일화(myristoylated)되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단 아미노기가 아세틸화되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단 아미노기가 미리스토일화되지 않은 것을 특징으로 하는
    방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 펩티드는 아세틸-펩티드 106, 펩티드 106 및 펩티드 106-NH2로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  13. 제 5항에 있어서,
    상기 펩티드는 펩티드 15, 펩티드 45, 펩티드 91 및 펩티드 153으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  14. 제 2항에 있어서,
    상기 펩티드는 펩티드 79, 펩티드 233, 펩티드 234, myr-펩티드 234-NH2 및 펩티드 235로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  15. 제 4항에 있어서,
    상기 펩티드는 아세틸-펩티드 235인 것을 특징으로 하는
    방법.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 포유동물은 사람인 것을 특징으로 하는
    방법.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 포유동물의 뮤신 과분비는 포유동물의 폐질환(pulmonary disease)에 의한 것을 특징으로 하는
    방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 폐질환은 천식(asthma), 만성 기관지염(chronic bronchitis), 만성 장애성 폐질환(choronic obstructive pulmonary disease, COPD) 및 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하였을 경우 참조서열보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 참조서열보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는
    방법.
  20. 뮤신 과분비를 억제하고,
    (a) GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 서열을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, N-말단 아미노산은 미리스토일화되지 않고, 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, C-말단은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있고, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하였을 경우 뮤신 과분비-억제효과를 가지는 펩티드의 뮤신 과분비-억제량을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서의 뮤신 과분비를 억제하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 펩티드의 상기 N-말단 아미노산은 아세틸화되는 것을 특징으로 하는
    방법.
  22. 제 20항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하였을 경우 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는
    방법.
  23. 23개 이하의 아미노산으로 구성되고,
    (a) 참조서열인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)의 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, N-말단 아미노산은 아세틸화되고, C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하였을 경우 뮤신 과분비-억제효과를 가지는 펩티드.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 펩티드의 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  25. 제 23항에 있어서,
    상기 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 암모니아, C1 내지 C24 지방족 알킬아민, 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸아민기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, n은 0 내지 10이다)로 아미드화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  26. 제 23항에 있어서,
    상기 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기기 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜, 또는 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올기(이때, n은 0 내지 10이다)로 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  27. 제 23항에 있어서,
    상기 펩티드는 아세틸-펩티드 106 및 아세틸-펩티드 219로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  28. 제 23항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여되었을 경우 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  29. 24개 이하의 아미노산으로 구성되고,
    참조서열인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, K는 A로 치환되고; A는 F, K, G, Q, S, T 및/또는 E로 치환되고; 또는 E는 Q로 치환되는 것들 중 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하고, N-말단 및 C-말단 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하였을 경우 뮤신 과분비-억제효과를 가지는 펩티드.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 N-말단 아미노산은 N-말단 아민이 C1 내지 C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 지방족 알킬)옥시에틸기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, n은 0 내지 10이다)로 알킬화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  31. 제 29항에 있어서,
    상기 N-말단 아미노산은 N-말단 아민이 C2 내지 C24 지방족 카르복시산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 또는 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산으로 아미드화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  32. 제 29항에 있어서,
    상기 펩티드의 상기 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  33. 제 29항에 있어서,
    상기 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 C1 내지 C24 지방족 알킬아민, 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민, 직쇄형 2-(C1 내지 C24의 지방족 알킬)옥시에틸아민기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, n은 0 내지 10이다)로 아미드화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  34. 제 29항에 있어서,
    상기 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜 또는 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올기(이때, n은 0 내지 10이다)로 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  35. 제 29항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하였을 경우 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  36. 제 29항에 있어서,
    상기 펩티드는 펩티드 233 내지 245 및 펩티드 247 내지 251로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  37. 24개 이하의 아미노산으로 구성되고,
    (a) 참조서열인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 4 내지 23개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 아미노산을 가지며, N-말단 서열은 참조서열의 2번 위치에서 시작하여 21번 위치까지이고, N-말단 및 C-말단 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하였을 경우 뮤신-과분비 억제효과를 가지는 펩티드.
  38. 제 37항에 있어서,
    상기 N-말단 아미노기가 C1 내지 C24 지방족 알킬기, 직쇄형 2-(C1 내지 C24의 지방족 알킬)옥시에틸기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸(이때, n은 0 내지 10이다)로 알킬화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  39. 제 37항에 있어서,
    상기 N-말단 아미노기가 C2 내지 C24 지방족 카르복시산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 또는 C1 내지 C24 지방족 알킬술폰산으로 아미드화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  40. 제 37항에 있어서,
    상기 펩티드의 C-말단 아미노산은 C-말단 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  41. 제 37항에 있어서,
    상기 C-말단 카르복실기가 암모니아, C1 내지 C24 지방족 알킬아민, 수산기가 치환된 C2 내지 C24 지방족 알킬아민, 직쇄형 2-(C1 내지 C24 의 지방족 알킬)옥시에틸아민기, 또는 오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n-에틸기(이때, n은 0 내지 10이다)로 아미드화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  42. 제 37항에 있어서,
    상기 C-말단 카르복실기가 C1 내지 C24 지방족 알킬알콜 또는 2-(오메가-메톡시-폴리(에틸렌옥시)n)-에탄올기(이때, n은 0 내지 10이다)로 에스테르화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  43. 제 37항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하였을 경우 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대해 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  44. 17개 이하의 아미노산으로 구성되고,
    (a) 참조서열인 GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 4 내지 16개의 연속된 아미노산을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산이 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있고, N-말단 아미노산은 미리스토일화되지 않으며, 포유동물에 뮤신 과분비 억제량으로 투여하였을 경우 뮤신 과분비 억 제효과를 가지는 펩티드.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산은 참조서열의 N-말단 아미노산으로부터 시작하는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  46. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열의 AKGE 잔기(서열번호 219)를 포함하는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  47. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열의 C-말단 아미노산에서 종결되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  48. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열의 8 내지 14개의 연속된 아미노산 또는 상기 참조서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  49. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 아미노산 서열은 참조서열의 10 내지 12개의 연속된 아미노산 또는 상기 참조서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  50. 제 44항에 있어서,
    상기 펩티드의 N-말단 아미노산은 N-말단 아미노기가 아세틸화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  51. (a) GAQFSKTAAKGEAAAERPGEAAVA(서열번호 1)의 서열을 가지는 아미노산 서열; 및,
    (b)(a)에서 정의된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로 구성된 그룹으로부터 선택되는 서열로 구성되며, N-말단 아미노산은 미리스토일화(myristoylated)되지 않고, C-말단 아미노산은 선택적, 독립적, 화학적으로 변이될 수 있으며, 포유동물에 뮤신 과분비-억제량으로 투여하였을 경우 뮤신 과분비-억제효과를 가지는 펩티드.
  52. 제 51항에 있어서,
    상기 펩티드의 상기 N-말단 아미노산은 아세틸화되는 것을 특징으로 하는
    펩티드.
  53. 제 51항에 있어서,
    상기 펩티드는 (a) 포유동물에 동일한 농도로 투여하였을 경우 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 포유동물에 대한 우수한 뮤신 과분비-억제효과, 또는 (b) 동일한 액체에서 동일한 농도로 N-말단 아미노산이 미리스토일화된 서열번호 1보다 우수한 수용성 중 적어도 어느 하나의 특성을 나타내는 것을 특징 으로 하는
    펩티드.
  54. 제 23항 내지 제 53항의 어느 한 항에 개시된 펩티드 및 선택적, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학 조성물.
  55. 제 23항 내지 제 53항의 어느 한 항에 개시된 펩티드의, 포유동물에서 폐질환에 의하여 야기되는 포유동물에서의 뮤신 과분비 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 용도.
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