CN101139344A - 一种提取罗希吐碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从红果樫木Dysoxylum binectariferum(Roxb.)Hook.f.ex Bedd树皮中提取罗希吐碱(rohitukine)的方法，该方法主要包括以下步骤：1)将红果樫木树皮粉末用提取溶剂溶解后进行提取，得到红果樫木的粗提物；所述提取溶剂为水、质量浓度为10％－100％的乙醇或甲醇；2)将所述红果樫木的粗提物溶解于水中，调节该粗提物的水溶液呈酸性，用水饱和的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取；保留水层的萃取液，并将其调节为碱性；用水饱和的正丁醇再进行萃取，收集正丁醇层萃取液；3)将提取液的pH值调节到1－2，用阳离子交换树脂进行离子交换，用水洗脱至流出液的pH值呈中性，再用碱性的30％－90％乙醇溶液洗脱，收集乙醇溶液的洗脱液，即得到罗希吐碱的提取物。该工艺操作简单，提取效率较高，提取物中罗希吐碱含量大于50％，适宜于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取罗希吐碱(rohitukine)的方法，特别是一种从红果樫木树皮中提取罗希吐碱的方法。
背景技术
红果樫木Dysoxylum binectariferum(Roxb.)Hook.f.ex Bedd为楝科樫木属植物，在我国分布于海南及云南南部等地区，至今未见药用报道。红果樫木的树皮中含有生物碱类成分，以罗希吐碱为主，含量约为0.9％。罗希吐碱具有抗炎和免疫调节的生物活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种从红果樫木中提取罗希吐碱的方法。
本发明提供的提取罗希吐碱的方法，包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮粉末溶解于提取溶剂后，回流或超声提取，得到红果樫木的粗提物；所述提取溶剂为水、质量浓度为10％-100％的乙醇或质量浓度为10％-100％的甲醇。
2)将红果樫木的粗提物溶解于水中，调节该粗提物的水溶液呈酸性，用水饱和的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取；保留水层的萃取液，并将其调节为碱性；用水饱和的正丁醇再进行萃取，收集正丁醇层萃取液，回收溶剂至干，得到含有罗希吐碱的提取物；
3)将含有罗希吐碱提取物水溶液的pH值调节到1-2，用阳离子交换树脂进行离子交换，用水洗脱至流出液的pH值呈中性，再用碱性的30％-90％乙醇溶液洗脱，收集乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，得到含有罗希吐碱的洗脱物。
上述提取方法的步骤1)中，所述红果樫木树皮粉末40目-120目。
上述提取方法的步骤1)中，所述乙醇或甲醇水溶液的浓度为70％，所述乙醇或甲醇水溶液的质量为所述红果樫木树皮粉末质量的10-50倍，优选为50倍。
上述提取方法的步骤1)中，所述回流提取的时间为1-12小时，所述超声提取的时间为15-60分钟，优选为60分钟。
上述提取方法的步骤2)中，调节红果樫木提取物溶液的目标pH值为1-2；用氨水调节水层溶液的目标pH值为10-11。
上述提取方法的步骤3)中，用0.5M的盐酸溶液将所述罗希吐碱提取物的水溶液的pH值调节到1-2；所述阳离子交换树脂为732型阳离子交换树脂、DOWEX 50WX2型阳离子交换树脂、D-72阳离子交换树脂、D001阳离子交换树脂等；所述碱性的30％-90％乙醇溶液的目标pH值为10。
上述提取方法的步骤3)中，用质量浓度为25％的氨水将所述30％-90％乙醇溶液的pH值调节到10。
本发明所提供的提取工艺操作简单，酸碱用量少，生产成本较低，罗希吐碱的提取效率较高，最终红果樫木树皮的提取物中罗希吐碱的含量大于50％，且该提取物具有抗炎和免疫调节的生物活性，药用治疗价值很高，非常适宜于工业化生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
下述实施例中，利用高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，简称HPLC)对该红果樫木的提取物进行检测。选用Zorbax SB-C18柱或各种型号ODS柱(4.6mm×250mm，5μm)的色谱柱，柱温为25℃，检测波长为254nm；选用20mM磷酸二氢钾(A)-乙腈(B)作为流动相进行梯度洗脱，该流动相的流速为1.0mL/min；罗希吐碱的HPLC保留时间为26-27min。
实施例1、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮的粉末过40目筛后，称取50g，用50倍该粉末质量的70％乙醇溶液浸泡30分钟，超声提取60分钟，将提取后的药渣用同样的方法再提取一次。
利用HPLC测得前后两次超声提取液中罗希吐碱的峰面积比值为13.06，第一次提取液中罗希吐碱的含量为0.95％。
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为2，用水饱和的正丁醇萃取一次，弃去正丁醇层萃取液；保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到10，用250mL水饱和的正丁醇萃取，收集正丁醇层萃取液，定容到300mL；
取50mL正丁醇萃取液，回收溶剂后充分干燥，称重，甲醇溶解定容到10mL，利用HPLC测定该正丁醇层萃取液中罗希吐碱的含量，如表1中编号1-1样品所示。
3)另取步骤2)得到的正丁醇层萃取液150mL，回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到2，得到酸化的提取物；
取该酸化提取物80mL，过732型阳离子交换树脂柱进行离子交换；样品过树脂后先用纯水150mL洗脱，再用400mL质量浓度为70％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
将该洗脱物称重，甲醇溶解并定容至10mL，利用HPLC测定罗希吐碱的含量，其结果如表1中1-2编号样品所示，可知洗脱物中罗希吐碱的含量为50.88％。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法为：在500mL70％乙醇水溶液中，加入50mL25％氨水，将该乙醇溶液的pH值调节到10即可。
另取步骤1)得到的粗提物250mL，加入0.5M盐酸调节pH值为2，用水饱和的乙酸乙酯萃取一次，弃去乙酸乙酯层的萃取液，余下步骤同上述提取步骤2)和3)。对所得到正丁醇萃取物和碱性乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量进行HPLC测定，如表1中编号2-1、2-2样品所示，可知萃取物和洗脱物中罗希吐碱的含量分别为25.20％和57.35％。
表1、红果樫木正丁醇萃取物和70％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量
| 编号 | 提取物质量(mg) | rohitukine含量(mg) | rohitukine含量(％) |
| 1-11-22-12-2 | 63.54480.455.3 | 13.6222.3920.2631.72 | 21.4450.8825.2057.35 |
由表1中数据可见，该红果樫木经过步骤2)的正丁醇萃取后，其中罗希吐碱的含量均大于20％；经过步骤3)的阳离子交换树脂后，其中罗希吐碱的含量均大于50％。
实施例2、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)取红果樫木树皮的粉末过120目筛后，称取50g，用20倍该粉末质量的70％乙醇溶液回流提取12h，过滤后得到提取液；
将该提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为1.5，用水饱和的正丁醇萃取一次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到10.5，用250mL水饱和的正丁醇再进行萃取，并收集正丁醇萃取液；
3)将得到的正丁醇萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到1.5，得到酸化的提取物；
取上述酸化的提取物80mL，过732型阳离子交换树脂柱进行离子交换；样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，再用400mL70％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，70％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为56.13％。
实施例3、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮的粉末过60目筛后，称取50g，用10倍该粉末质量的70％乙醇溶液浸泡30分钟，超声60分钟提取，过滤后得到提取液；
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为1.5，用250mL水饱和的正丁醇萃取一次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到11，用水饱和的正丁醇再进行萃取，并收集正丁醇层的萃取液。
3)将得到的正丁醇层萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到1.5，得到酸化的提取物；
取上述酸化的提取物80mL，过732型阳离子交换树脂柱进行离子交换；
样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，其pH值呈中性时即可；
再用400mL60％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，得到60％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为50.34％。
实施例4、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮的粉末过60目筛后，称取50g，用20倍该粉末质量的70％乙醇溶液浸泡30分钟，超声30分钟提取，过滤后得到提取液；
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为1，用250mL水饱和的正丁醇萃取一次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到10，用250mL水饱和的正丁醇萃取两次，并收集正丁醇层的萃取液。
3)将得到的正丁醇层萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到1.5，得到酸化的提取物；
取上述酸化的提取物80mL，过732型阳离子交换树脂柱进行离子交换；
样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，其pH值呈中性时即可；
再用400mL50％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，得到该50％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为54.93％。
实施例5、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮的粉末过100目筛后，称取50g，用30倍该粉末质量的70％乙醇溶液浸泡30分钟，超声45分钟提取，过滤后得到提取液；
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为1，用水饱和的正丁醇萃取三次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到11，用250mL水饱和的正丁醇萃取，并收集正丁醇层的萃取液。
3)将得到的正丁醇层萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到1.5，得到酸化的提取物；
取上述酸化的提取物80mL，过DOWEX 50WX2型阳离子交换树脂柱进行离子交换；
样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，其pH值呈中性时即可；
再用400mL30％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，得到30％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为51.81％。
实施例6、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮的粉末过60目筛后，称取50g，用40倍该粉末质量的70％乙醇溶液浸泡30分钟，超声15分钟提取，过滤后得到提取液；
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为2，用水饱和的正丁醇萃取两次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到11，用250mL水饱和的正丁醇萃取，并收集正丁醇萃取液。
3)将得到的正丁醇萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到2，得到酸化的提取液；
取上述酸化的提取物80mL，过D001阳离子交换树脂柱进行离子交换；
样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，其pH值呈中性时即可；
再用400mL90％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，得到90％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为56.89％。
实施例7、提取罗希吐碱
本发明所述提取罗希吐碱的方法主要包括以下步骤：
1)取红果樫木树皮的粉末过80目筛后，称取50g，用20倍该粉末质量的100％乙醇溶液回流提取7h，过滤后得到提取液；
取上述提取液回收溶剂到没有乙醇，水定容到500mL，得到该红果樫木的粗提物。
2)取上述粗提物250mL，加入0.5M盐酸将pH值调节为1.5，用250mL水饱和的正丁醇萃取一次，弃去正丁醇层萃取液；
保留水层的萃取液，加入25％的氨水将pH值调节到10.5，用水饱和的正丁醇再进行萃取三次，并收集正丁醇萃取液。
3)将得到的正丁醇层萃取液回收溶剂，充分干燥，用100mL水溶解，用0.5M的盐酸将pH值调节到1.5，得到酸化的提取物；
取上述酸化的提取物80mL，过D-72阳离子交换树脂柱进行离子交换；
样品过树脂后先用纯水150mL洗脱至流出液无色透明，其pH值呈中性时即可；
再用400mL70％的碱性乙醇溶液洗脱树脂柱，收集该乙醇溶液的洗脱液，回收溶剂至干，即得到含有罗希吐碱的洗脱物。
其中，所述碱性乙醇溶液的配制方法同实施例1所述。
利用HPLC进行检测，得到70％乙醇洗脱物中罗希吐碱的含量为55.05％。
实施例8、红果樫木提取物对大鼠角叉菜胶性足肿胀的影响
取健康SD大鼠40只，体重200±20g，按体重随机分为4组，每组动物连续灌胃给药3天，阳性组实验当天腹腔注射给药1次，分组及给药剂量见表2。实验前在各鼠右后足踝关节处作标记，用足容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为正常足容积。末次给药后30min，每只大鼠右后足跖部皮下进针至踝关节附近皮下，注射1％角叉菜胶溶液0.1mL致炎，分别于致炎后1h、2h、3h、4h、5h、6h测定致炎足容积，计算各大鼠致炎前后右后足跖容积变化值，以足肿胀度和足肿胀抑制百分率表示药物的抗炎效应，结果见表2。
表2结果显示，与模型组比较，红果樫木提取物中、高剂量组均有显著的抑制大鼠角叉菜胶性足肿胀的作用(P＜0.05)。
表2、红果樫木提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响
| 组别 | n | 剂量g/kg- 1 | 正常足容积mL | 足容积净增值/mL(足肿胀抑制百分率/％) | |||||
| 1h | 2h | 3h | 4h | 5h | 6h | ||||
| 模型组 | 10 | 0.93±0.06 | 0.71±0.19 | 0.91±0.21 | 1.03±0.16 | 0.87±0.12 | 1.08±0.20 | 0.64±0.12 | |
| 醋酸地塞米松组 | 10 | 0.01 | 0.96±0.09 | 0.28±0.17(60.56)*** | 0.31±0.09(65.93)*** | 0.20±0.13(80.58)*** | 0.23±0.08(75.56)*** | 0.21±0.12(80.56)*** | 0.16±0.12(75.00)*** |
| 中剂量组 | 10 | 1.5 | 0.96±0.06 | 0.58±0.13(18.31) | 0.48±0.15(47.25)** | 0.46±0.15(55.34)** | 0.59±0.16(32.18)*** | 0.54±0.12(50.00)*** | 0.31±0.07(51.56)** |
| 高剂量组 | 10 | 2.5 | 0.93±0.07 | 0.49±0.12(30.99)* | 0.47±0.16(48.35)** | 0.51±013(50.49)** | 0.62±0.11(28.74)** | 0.58±0.12(46.30)*** | 0.26±0.14(59.38)*** |
注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
实施例9、红果樫木提取物对大鼠局部过敏性反应(Arthus反应)的影响
取雄性Wistar大鼠，用10％结晶卵白蛋白生理盐水溶液与福氏佐剂按1∶2配成悬液，每周1次，0.5mL/次给大鼠肌肉注射，共6次，前3次用福氏完全佐剂，后3次用福氏不完全佐剂。末次免疫后第4天动物随机分4组，每日给药1次，共给药6天，均灌胃给药，实验组给予红果樫木提取物1.5、2.5g/kg；阳性对照组给予醋酸泼尼松10mg/kg；对照组给予等体积生理盐水。第9天动物背部剪毛，第10天每鼠3点皮内注射1％结晶卵白蛋白攻击，每点0.1mL。抗原攻击后2、5、8、12、24h测定注射点红肿直径，进行统计学处理。结果表明，红果樫木提取物于抗原攻击前给药1.5、2.5g/kg可明显抑制抗原攻击后2、5、8、12、24h大鼠Arthus反应。结果见表3。
表3、红果樫木提取物对大鼠Arthus反应的的影响
| 组别 | n | 剂量g/kg-1 | 反应直径/mm(抑制率/％) | ||||
| 2h | 5h | 8h | 12h | 24h | |||
| 生理盐水组 | 7 | 6.1±1.3 | 6.8±1.8 | 6.6±1.9 | 6.4±1.8 | 6.7±1.6 | |
| 中剂量组 | 7 | 1.5 | 3.0±0.8(48.7)* ** | 3.5±1.1(48.9)* * | 4.0±1.6(38.8)* | 3.9±1.5(40.0)* | 3.8±1.4(44.0)* * |
| 高剂量组 | 7 | 2.5 | 2.5±0.2(62.1)* ** | 2.5±0.3(63.0)* ** | 2.6±0.4(60.4)* ** | 2.5±0.4(61.4)* ** | 2.8±0.4(58.9)* ** |
| 醋酸泼尼松组 | 8 | 0.01 | 2.8±1.2(53.1)* ** | 3.1±1.4(54.0)* * | 3.1±1.5(52.7)* * | 3.3±1.6(48.8)* * | 3.2±1.4(52.9)* ** |
注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
Claims (9)
1.一种提取罗希吐碱的方法，包括以下步骤：
1)将红果樫木树皮粉末用提取溶剂溶解后进行提取，得到红果樫木的粗提物；所述提取溶剂为水、质量浓度为10％-100％的乙醇或质量浓度为10％-100％的甲醇；
2)将所述红果樫木的粗提物溶解于水中，调节该粗提物的水溶液呈酸性，用水饱和的正丁醇或乙酸乙酯进行萃取；保留水层的萃取液，并将其调节为碱性；用水饱和的正丁醇再进行萃取，收集正丁醇层萃取液，回收溶剂至干，得到含有罗希吐碱的提取物；
3)将所述含有罗希吐碱提取物的水溶液的pH值调节到1-2，用阳离子交换树脂进行离子交换，用水洗脱至流出液的pH值呈中性，再用碱性的30％-90％乙醇溶液洗脱，收集乙醇溶液的洗脱液，得到含有罗希吐碱的洗脱物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述的红果樫木树皮粉末为40-120目。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述乙醇或甲醇的浓度为70％，所述乙醇或甲醇溶液的质量为所述红果樫木树皮粉末质量的10-50倍，优选为50倍。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中的所述提取方法为回流或超声提取。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述回流提取的时间为1-12小时；所述超声提取的时间为15-60分钟，优选为60分钟。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述调节红果樫木粗提物溶液呈酸性的步骤中，其目标pH值为1-2；所述调节水层溶液呈碱性的步骤中，其目标pH值为10-11。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述水层溶液碱性是用氨水进行调节的。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，用0.5M的盐酸溶液将所述含有罗希吐碱提取物的水溶液的pH值调节到1-2；所述阳离子交换树脂为732型阳离子交换树脂、DOWEX 50WX2型阳离子交换树脂、D-72阳离子交换树脂、D001阳离子交换树脂等；所述碱性的30％-90％乙醇溶液的目标pH值为10。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：用质量浓度为25％的氨水将所述30％-90％乙醇溶液的pH值调节到10。
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| CNA200710121333XA Pending CN101139344A (zh) | 2007-09-04 | 2007-09-04 | 一种提取罗希吐碱的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101139344A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103245713A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-08-14 | 江苏易谱恒科技有限公司 | 基于支持向量机和离子迁移谱的中草药产地鉴别方法 |
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2007
- 2007-09-04 CN CNA200710121333XA patent/CN101139344A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103245713A (zh) * | 2013-03-25 | 2013-08-14 | 江苏易谱恒科技有限公司 | 基于支持向量机和离子迁移谱的中草药产地鉴别方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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