CN101137751B - 钼传输体及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明提供可以更有效地控制从环境中吸收钼及在生物体内传输钼、首次负责植物中的钼传输的新的钼传输体MoTR1基因。通过对拟南芥的品系Col-0和Ler之间进行QTL分析，发现支配叶子的Mo浓度的QTL存在于第2条染色体上。在本发明中，通过遗传分析将起因基因的存在区域限定在172kb的范围内。在该区域中，存在着具有与硫酸离子传输体相同的域但其功能未得到分析的基因At2g25680。从在At2g25680中插入外来基因片段(T-DNA)形成的独立两系统基因破坏株入手，测定叶子的Mo浓度，从而鉴别了MoTR1基因。

Description

钼传输体及其基因

技术领域

本发明涉及源自拟南芥、稻、油菜子、大麦、小麦、玉米、蒺藜苜蓿的钼传输体及它们的基因。

背景技术

钼(Mo)是植物必需的元素(例如，参见非专利文献1)，它的缺乏会导致抑制节间伸长及叶子形态异常等症状(例如，参见非专利文献2及3)。Mo是过渡金属，其被作为电子供体或受体而包含于催化植物的多种氧化·还原反应的酶中。承担氮代谢路径上的重要反应的硝酸还原酶是含钼的酶之一(例如，参见非专利文献4)。

Mo是以与蝶呤化合物结合的Mo辅因子(Moco)形态与这些酶进行结合的(例如，参见非专利文献5)。在硝酸还原酶中Moco是必需的，在Moco含量低的突变株中硝酸还原酶的活性低(例如，参见非专利文献6)。硝酸还原酶活性低的突变株显示出耐高氯酸性和钨酸感受性的表现型(例如，参见非专利文献7)。以这些表现型为指标，对Moco的生物合成中必需的酶出现欠缺的突变株进行分离，可以查明Moco的合成线路(例如，参见非专利文献8)。另一方面，关于因植物体内的Mo浓度低而导致Moco含量低的突变株及其起因基因，还没有报导。

通常认为植物从土壤中以主要为二价阴离子的MoO₄ ^2-形态吸收Mo(例如，参见非专利文献9)，并且与一般离子一样，在透过膜时要借助传输体。对于细菌和古细菌，已鉴别出了ABC-type(ATP-binding cassette-type)Mo传输体(例如，参见非专利文献10)。但是，对于植物并未鉴别出Mo传输体。

另一方面，已知如果在大量含有Mo的牧草地上施用Na₂SO₄，则会抑制Mo在牧草中的蓄积(例如，参见非专利文献11)。通常认为其原因在于，如果在土壤有同为二价阴离子的SO₄ ^2-与MoO₄ ^2-共存，就会竞合阻碍植物对Mo的吸收(例如，参见非专利文献12)，这暗示着MoO₄ ^2-是通过与SO₄ ^2-类似的机理被从土壤中输送到植物体内的。

硫是氨基酸的构成元素，是植物的必需元素。植物通过硫酸离子传输体从土壤中吸收二价阴离子SO₄ ^2-而将硫吸收到体内(例如，参见非专利文献13)。通过对基因组DNA的序列分析(例如，参见非专利文献14)，预测了拟南芥中至少存在14个硫酸离子传输体。该硫酸离子传输体族可根据其相同性再分成5个组，分至组1至组4的基因在组织特异的表达及细胞内存在方面显示出各组之间相同的特征(例如，参见非专利文献15)。另一方面，关于分至组5的基因，其特征并不明确(例如，参见非专利文献16)。属于该组的基因序列中存在与硫酸离子传输体族相同的域，但是作为序列整体来说与属于其它组的基因序列的相同性低(例如，参见非专利文献17)。另外，还没有报导属于组5的基因的翻译产物具有硫酸离子传输活性，其功能是未知的。

比较拟南芥(Arabidopsis thaliana)的品系Col-0和Ler的元素组成时，Col-0的Mo含量明显比Ler高(例如，参见非专利文献18)。

专利文献1：日本特开2002-262872号公报

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发明内容

发明所要解决的问题

钼(Mo)是植物必需的元素，其缺乏会导致抑制节间伸长及叶子形态异常等症状。Mo是过渡金属，其被作为电子供体或受体而包含于催化植物的多种氧化·还原反应的酶中。承担氮代谢路径的重要反应的硝酸还原酶是含钼的酶之一(例如，参见非专利文献4)。通常认为植物从土壤中以主要为二价阴离子的MoO₄ ^2-形态吸收Mo的，并且与一般离子一样在透过膜时要借助传输体。对于细菌和古细菌，已鉴别出了ABC-type的Mo传输体。但是，对于植物并未鉴别出Mo传输体。可以说在分子水平上了解植物体内的钼输送结构、弄清楚钼传输的主要路径及制约因素会提供施肥方法及育种策略方面的知识。另外，还可以说鉴别植物体内与钼传输相关的基因对于耐钼缺乏、钼过剩植物品种的培育有直接关系。本发明的问题是提供新的基因，该基因可以更有效地控制从环境中吸收钼及在生物体内传输钼、首次负责植物中的钼传输。

解决问题的手段

为了解决上述问题，本发明人进行深入研究，鉴别对拟南芥的Mo传输体编码的MoTR1基因。该基因是半显性的，决定了叶子中的Mo浓度。MoTR1是细胞膜蛋白质，是具备向细胞内浓缩Mo能力的传输体。另外，还暗示了该Mo传输体是通过进行硝酸还原的组织进行表达的。以下进行详细说明。

(基因的鉴别)

本发明人对拟南芥的品系Col-0和Ler之间进行了QTL分析，发现支配叶子Mo浓度的QTL存在于第2条染色体上。在本发明中，通过遗传分析将起因基因的存在区域限定在172kb的范围内。在该区域中，存在着具有与硫酸离子传输体相同的域但其功能未得到分析的基因At2g25680。由于硫和Mo是作为SO₄ ^2-和MoO₄ ^2-被植物吸收的，因此可以认为在硫酸离子传输体中相同的At2g25680可能涉及Mo的吸收。因此，从在At2g25680中插入外来基因片段(T-DNA)形成的独立两系统基因破坏株入手，测定叶子的Mo浓度时，所有突变株中的浓度均低至野生株的约1/3。这个结果暗示At2g25680是决定拟南芥叶子的Mo浓度的基因。另外，由独立两系统基因破坏株交配得到的F₁代的叶子Mo浓度是野生株的约1/3，所谓Mo浓度低的表现型并未产生互补。而且，在由突变株和野生株交配形成的F₁代进行自传粉得到的F₂代中，杂合子中具有插入基因的植株的叶子Mo浓度显示为纯合子中具有插入基因的植株和野生株的中间值。这些结果暗示Mo浓度低是由At2g25680突变引起的，并且该突变是半显性的。由这些结果可以确定突变株的叶子Mo浓度低的原因在于At2g25680的突变，因此将该基因命名为MoTR1。

(细胞内的存在部位)

据预测MoTR1具有7-11个膜贯穿区域。为了查明翻译产物位于细胞的哪个膜上，在花椰菜花叶病毒35SRNA启动子控制下制作用于表达MoTR1和GFP(green Fluorescent protein)的融合蛋白质的构建体，并将其导入洋葱表皮细胞。利用激光共聚集显微镜进行观察时，融合蛋白质的荧光位于细胞外缘部分。该结果暗示MoTR1是细胞膜蛋白质。

(Mo传输活性)

为了研究MoTR1的Mo传输能力，制作用于表达酵母中的MoTR1的构建体，并将其导入酵母中。在未添加Mo的培养基中对导入了该基因的菌株和野生株进行继代培养，然后移入含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的培养基中振荡培养30分钟。测定菌体内的Mo浓度时，导入了基因的菌株的浓度提高到野生株的80倍以上。另外，通过从菌体的干燥重量推断菌体内的液体量而算出的菌体内的Mo浓度比培养基的Mo浓度高。因此，可以认为MoTR1是具有逆浓度梯度对Mo进行浓缩能力的传输体。

(表达组织)

为了研究表达MoTR1的组织，在距At2g25680的起始密码子约2.9kb的上游启动子区域中连接β-glucuronidase(GUS)基因，对拟南芥进行形质转换。在导入了独立基因的植株16系统中，可以确认地上部分的叶柄和叶的外缘部位具有GUS活性。在根上，可确认根端有GUS活性，离根端1-6mm的区域没有活性。可观察到其上部的中柱鞘处有GUS活性，而且在被认为是侧根的区域上部可观察到皮层上有活性。进行同样的分析时，使用GFP作为报告子也获得了同样的结果。根上的表达模式与至今为止报导的硝酸传输体AtNRT1.1的表达模式类似，存在着MoTR1被硝酸离子浓度高的组织表达，并向硝酸还原酶提供Mo的可能性。

接着，将MoTR1的氨基酸序列作为查询，在DDBJ的网站上通过tblastn程序进行BLAST检索，发现了源自拟南芥、稻、油菜子、大麦、小麦、玉米、蒺藜苜蓿的钼传输体基因，确认了对于拟南芥、稻的钼传输体活性。

本发明是基于以上认识而得以完成的。

即，本发明涉及(1)编码由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列构成的钼传输体的DNA；(2)编码由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(3)由序列号1、30、32或34所示的碱基序列或其互补序列构成的钼传输体基因DNA；(4)编码由序列号1、30、32或34所示的碱基序列缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列构成、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(5)编码在严紧条件下与上述(3)记载的DNA进行杂交、并具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(6)编码含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(7)编码含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(8)编码含有序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列或其互补序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(9)编码含有序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(10)编码在严紧条件下与由序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列或其互补序列构成的DNA进行杂交、并具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；(11)由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列构成的钼传输体；(12)由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成、且具有钼传输体活性的蛋白质；(13)含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质；(14)含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质；(15)含有上述(1)～(10)中任一项所述的DNA，并且可以表达钼传输体的重组载体；(16)导入了上述(15)所述的重组载体，并且表达钼传输体的形质转换体；(17)上述(16)所述的形质转换体，其特征在于形质转换体为酵母；(18)上述(16)所述的形质转换体，其特征在于形质转换体为植物；(19)添加吸收了钼的上述(16)～(18)中任一项所述的形质转换体或其处理物的钼强化食品或食品原料；(20)添加吸收了钼的上述(16)～(18)中任一项所述的形质转换体或其处理物的钼强化饲料；(21)筛选促进或抑制钼传输体活性的物质的方法，其特征在于，在被检物质的存在下，使MoO₄ ^2-与导入了上述(15)所述的重组载体且表达钼传输体的形质转换体进行接触，测定和评价向细胞内吸收钼的程度；(22)上述(21)所述的筛选促进或抑制钼传输体活性的物质的方法，其特征在于形质转换体为酵母；(23)上述(21)所述的筛选促进或抑制钼传输体活性的物质的方法，其特征在于形质转换体为植物。

附图说明

图1是显示本发明测定结果的图。

图2是显示确定T-DNA插入位置的结果的图。对于At2g25680或其附近插入了外来基因片段(T-DNA)而形成的基因的破坏株SALK_11831和SALK_069683，使用T-DNA插入预测部位的上游和下游的各碱基序列相同的引物和T-DNA的内部序列相同的引物(参见表1)进行PCR，分别选择纯合子中具有插入基因的系统。对于选取的系统，再分析插入的T-DNA和基因组DNA边界附近的碱基序列。此处的5’-3’是按照At2g25680的ORF方向标记的。标记为LBb1-LP1或LBb1-RP2的序列是对各引物的放大产物的碱基序列进行分析的一部分结果。另外，记为genome的序列表示与这些产物相同性高的拟南芥基因组DNA序列。此处显示了将放大产物和拟南芥的基因组DNA序列进行比较时，序列相同性产生间隔的边界附近的序列。5个碱基以上的序列一致的区域用大写文字标记，其余用小写文字标记。图上的数字表示的是将At2g25680的启始密码子的腺嘌呤作为第一个碱基对5’至3’的碱基进行编号时，T-DNA插入的位置相当于第几个碱基。

图3是显示At2g25680破坏株的叶子Mo浓度的图。将SALK_11831、SALK_069683、Col-0及Ler播种在石棉中，使用含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的MGRL培养液栽培30天。在各系统中测定5个个体的叶子Mo浓度，列出其平均值。误差条线表示标准偏差。另外，各系统的Mo浓度在Student的t检验(P＜0.05)中与其它任意系统的Mo浓度有显著差异。

图4是显示回交的F₂代(SALK_11831×Col-0；F₂)的叶子Mo浓度的图。使SALK_11831和Col-0交配形成的F₁代植株进行自传粉，得到F₂代种子。将该F₂种子、Col-0及Ler播种在石棉中，使用含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的MGRL培养液栽培30天。对于F₂代个体，用PCR确认At2g25680是否插入了T-DNA，并分成未插入T-DNA的系统(Wild Type)、杂合子中具有插入基因的系统(Hetero)及纯合子中具有插入基因的系统(Homo)三种系统。在各系统中测定4个个体的叶子Mo浓度，列出其平均值。误差条线表示标准偏差。各测定值上标注的英文字母表示：在标注的英文字母相同的系统之间，Mo浓度在Student的t检验(P＜0.05)中没有显著差异，在标注的英文字母不同的系统之间，Mo浓度在Student的t检验(P＜0.05)中有显著差异。

图5是显示MOTR1::GFP融合蛋白质在细胞内的存在位置的图。在花椰菜花叶病毒35SRNA启动子控制下制作用于表达MoTR1和GFP的融合蛋白质的构建体，并将其导入洋葱表皮细胞。利用激光共聚集显微镜观察GFR的荧光。定标线条表示100μm。

图6是显示MOTR1的钼传输能力的图。制作用于表达酵母中的MOTR1的构建物，并将其导入酵母(Saccharomyces cerevisiae，BY4741)中。在未添加Mo的培养基中培植该基因导入株和野生株，进行继代培养。回收处于对数增殖期中期的菌体，在未加入Mo的培养基(-Mo)或添加MoO₄ ^2-使最终浓度为1.7×10²nM的培养基(+Mo)中进行再悬浮，振荡培养30分钟。将振荡后的菌体直接干燥，测定Mo浓度。在各系统中测定从不同的菌落开始进行继代培养的4个菌株的Mo浓度，列出各系统的平均值。误差条线表示标准偏差。还有，下部的图是上部的图改变缩尺后得到的，显示的相同数据。另外，各系统的Mo浓度在Student的t检验(P＜0.05)中与其它任意系统的Mo浓度有显著差异。

图7是显示MOTR1的表达组织的图。将距At2g25680的起始密码子约2903bp的上游启动子区域与GUS基因连接，对拟南芥进行形质转换。用光学显微镜((B)、(C)、(D)、(F)及(J))或立体显微镜((H)及(I))观察发芽后第7天的形质转换体的GUS活性。(A)：发芽后第7天的形质转换体的GUS的染色图像。(B)：子叶外缘部分。(C)：子叶的叶柄。(D)：成熟根(距根端2cm的部位)。(F)根端。(H)：成熟根(距根端1cm的部位)。(I)：成熟根(距根端2cm的部位)。(J)：成熟根(距根端2cm的部位)的水平切片。另外，将距At2g25680的起始密码子约2903bp的上游启动子区域与GUS基因连接，对拟南芥进行形质转换。利用激光共聚集显微镜观察发芽后第7天的形质转换体的GFR的荧光。(E)：发芽后第7天的形质转换体的成熟根(距根端2cm的部位，用碘化丙啶染色)。(G)根端。定标线条在(A)中表示1cm，在其它图中表示100μm。

图8是显示钼传输体的Km的图。纵轴为钼传输速度的倒数(1/[钼传输速度])，横轴为培养基的钼浓度的倒数(1/[培养基的钼浓度])。

图9是显示在各种条件下将似南芥(野生株、突变株)栽培3周的结果的图。(A)是在钼存在下进行栽培的植株，(B)是在没有钼存在下进行栽培的植株。

图10是显示稻的MOTR1、MOTR2的钼传输活性的图。

具体实施方式

作为本发明的DNA，除了由编码由序列号2(拟南芥MOTR1)、序列号31(拟南芥MOTR2)、序列号33(稻MOTR1)、序列号35(稻MOTR2)所示的氨基酸序列构成的蛋白质的DNA；编码由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成、且具有钼(Mo)传输体活性的蛋白质的DNA；由序列号1(拟南芥MOTR1)、序列号30(拟南芥MOTR2)、序列号32(稻MOTR1)、序列号34(稻MOTR2)所示的碱基序列或其互补序列构成的钼传输体基因DNA；编码由序列号1、30、32或34所示的碱基序列缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列构成、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；或编码在严紧条件下与由序列号1、30、32或34所示的碱基序列构成的DNA进行杂交并且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；组成的钼传输体基因外，如果是编码含有序列号37(油菜籽MOTR1)、序列号39(大麦MOTR1)、序列号41(稻MOTR1)、序列号43(大麦MOTR1)、序列号45(玉米MOTR1)、序列号47(蒺藜苜蓿MOTR1)、序列号49(蒺藜苜蓿MOTR2)所示的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；编码含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；编码含有序列号36(油菜籽MOTR1基因)、序列号38(大麦MOTR1基因)、序列号40(大麦MOTR2基因)、序列号42(小麦MOTR1基因)、序列号44(玉米MOTR1基因)、序列号46(蒺藜苜蓿MOTR1基因)、序列号48(蒺藜苜蓿MOTR2基因)所示的碱基序列或其互补序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；编码含有序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列、且具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；编码在严紧条件下与由序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列或其互补序列构成的DNA进行杂交并具有钼传输体活性的蛋白质的DNA；就没有特别的限制。另外，作为本发明的蛋白质，除了由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列构成的钼传输体；由序列号2、31、33或35所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成、且具有钼传输体活性的蛋白质；以外，如果是由含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质；含有序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质；组成的钼传输体蛋白质，则没有特别的限制，此处，“钼传输体基因”是指涉及钼传输的基因，“钼传输体蛋白质”是指涉及钼传输的蛋白质。

上述“具有钼传输体活性的蛋白质”是指在酵母、植物等细胞内具有向生物体内传输钼作用的蛋白质。

作为钼传输体基因，可以分别列举由序列号1所示碱基序列构成的拟南芥MOTR1基因；由序列号30所示碱基序列构成的拟南芥MOTR2基因；由序列号32所示碱基序列构成的稻MOTR1基因；由序列号34所示碱基序列构成的稻MOTR2基因；由序列号36所示碱基序列构成的油菜子MOTR1基因；由序列号38所示碱基序列构成的大麦MOTR1基因；由序列号40所示碱基序列构成的大麦MOTR2基因；由序列号42所示碱基序列构成的小麦MOTR1基因；由序列号44所示碱基序列构成的玉米MOTR1基因；由序列号46所示碱基序列构成的蒺藜苜蓿MOTR1基因；由序列号48所示碱基序列构成的蒺藜苜蓿MOTR2基因；另外，作为钼传输体蛋白质，可以分别列举由序列号2所示氨基酸序列构成的拟南芥MOTR1；由序列号31所示氨基酸序列构成的拟南芥MOTR2；由序列号33所示氨基酸序列构成的稻MOTR1；由序列号35所示氨基酸序列构成的稻MOTR2；由序列号37所示氨基酸序列构成的油菜子MOTR1；由序列号39所示氨基酸序列构成的大麦MOTR1；由序列号41所示氨基酸序列构成的大麦MOTR2；由序列号43所示氨基酸序列构成的小麦MOTR1；由序列号45所示氨基酸序列构成的玉米MOTR1；由序列号47所示氨基酸序列构成的蒺藜苜蓿MOTR1；由序列号49所示氨基酸序列构成的蒺藜苜蓿MOTR2。

上述“缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列”是指缺失、替换或附加例如1～20个，优选1～15个，更优选1～10个，进一步优选1～5个的任意数目的氨基酸后的氨基酸序列。另外上述“缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列”是指缺失、替换或附加例如1～20个，优选1～15个，更优选1～10个，进一步优选1～5个的任意数目的碱基后的碱基序列。

例如由缺失、替换或附加1个或多个碱基后的碱基序列构成的DNA(突变DNA)可以通过化学合成、基因工程学的手段、诱导突变等本领域人员已知的任意方法进行制作。具体来说，对于由序列号1、30、32或34所示的碱基序列构成的DNA及含有序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列的的DNA，可以采用与作为变异原的试剂接触而进行作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程方法等，在这些DNA中引入突变，从而得到突变DNA。作为基因工程方法之一的局部特殊变异诱导法是在特定的位置引入特定的变异的方法，因此是有用的，可以按照分子克隆第2版，Current Protocols in Molecular Biolody，Supplement 1～38，John&Sons(1987-1997)等中记载的方法进行实施。通过用适当的表达系表达该突变DNA，可以获得由缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成的蛋白质。

上述“在严紧条件下进行杂交的碱基序列”是指使用DNA或RNA等核酸作为探针，采用菌落杂交法、菌斑杂交法或Southem印迹杂交法等获得的碱基序列，具体来说，固定了来自菌落或菌斑的DNA或DNA片段的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下，于65℃下进行杂交，然后使用0.1～2倍左右的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成为：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下清洗过滤器，从而可提取可以进行鉴别的DNA。杂交可以按照Molecular Cloning：A laboratory Mannual，2nd ED.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY.，1989(以下简称为“分子克隆第2版”)等中记载的方法实施。

即，在严紧条件下是指形成特殊杂种，不形成非特殊杂种的条件，具体来说，可以列举具有50～70％以上相同性的DNA相互杂交，比此相同性低的DNA相互不杂交的条件，或在相当于通常杂交清洗条件的65℃，1×SSC，0.1％SDS，或0.1×SSC，0.1％SDS的盐浓度下进行杂交的条件。例如，作为可以在严紧条件下进行杂交的DNA，可以列举与用作探针的DNA具有规定以上的相同性的DNA，可适当地列举例如具有60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选90％以上，特别优选95％以上，最优选98％以上相同性的DNA。

本发明基因的获取方法没有特别的限制，可以基于本说明书中公开的序列号1、30、32或34，或者序列号36、38、40、42、44、46或48所示的碱基序列信息或序列号2所示的氨基酸序列信息制备适当的探针及引物，用它们筛选预测该基因存在的cDNA文库，从而分离出目标基因，或者通过常规化学合成进行制备。

具体来说，利用分离出本发明基因的拟南芥，按常规方法制备cDNA文库，然后使用本发明基因特有的适当探针从该文库中选择所希望的无性系，从而可以获得本发明的基因。作为上述cDNA的起源，可以例示来自上述植物的各种细胞或组织，另外，从这些细胞或组织中进行全RNA分离、mRNA的分离或精制、cDNA的获取及其筛选可以按任意常规方法实施。从cDNA文库中分离本发明的基因的方法可以列举例如分子克隆第2版中记载的方法等本领域技术人员所常用的方法。

另外，作为上述本发明的突变基因或相同基因，可以利用序列号所示的碱基序列或具有其一部分的DNA片段，在适当条件下从其它生物体等中筛选该cDNA的同系物，从而进行分离。另外，还可以通过上述突变DNA的制作方法进行制备。

作为相同基因的查找方法，例如可以列举将拟南芥MOTR1、拟南芥MOTR2、稻MOTR1、稻MOTR2等氨基酸序列作为询问，以DDBJ中登记的碱基序列为对象通过tblastn进行BLAST检索，将所获得的序列中score为100以上的序列判定为相同基因的方法等。在这种情况下，通过clastal对相同基因的氨基序列和MOTR1的氨基酸序列进行比较后，将相同基因的氨基酸中完全一致的氨基酸比例作为同源度。按这种方式，可以得到含有序列号37所示氨基酸序列的油菜子MOTR1；含有序列号39所示氨基酸序列的大麦MOTR1；含有序列号41所示氨基酸序列的大麦MOTR2；含有序列号43所示氨基酸序列的小麦MOTR1；含有序列号45所示氨基酸序列的玉米MOTR1；含有序列号47所示氨基酸序列的蒺藜苜蓿MOTR1；含有序列号49所示氨基酸序列的蒺藜苜蓿MOTR2等。

本发明的蛋白质的获得、精制方法没有特别的限制，可以是来自天然的蛋白质、化学合成的蛋白质、通过基因重组技术制备的重组蛋白质中的任意蛋白质。在获取来自天然的蛋白质的情况下，通过适当地组合从表达上述蛋白质的细胞或组织中分离、精制蛋白质的方法，可以获得本发明的蛋白质。在通过化学合成制备蛋白质的情况下，例如可按照Fmoc法(芴基甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成方法合成本发明的蛋白质。另外，还可以利用市售的肽合成器合成本发明的蛋白质。在通过基因重组技术制备蛋白质的情况下，可以将由表达该蛋白质的碱基序列构成的DNA导入适当的表达系中，从而制备本发明的蛋白质。其中，优选通过比较容易操作且可进行大量制备的基因重组技术进行制备。

例如，在通过基因重组技术制备本发明的蛋白质的情况下，从细胞培养物回收、精制上述蛋白质时，可以采用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲合色谱法、羟基磷灰石色谱法及外源凝集素色谱法的公知方法，优选采用高速液相色谱法。特别地，作为亲合色谱法中使用的柱，通过使用对于本发明的蛋白质结合了单克隆抗体等抗体的柱，以及对上述本发明的蛋白质附加通常的肽标记时使用结合有对该肽标记具有亲合性的物质的柱，可以得到这些蛋白质的精制物。另外，当本发明的蛋白质在细胞膜中表达时，可以用细胞膜分解酶进行作用，然后进行上述精制，从而得到精制标准物质。

另外，对于由序列号2、31、33或35，或者序列号37、39、41、43、45、47或49所示的氨基酸序列缺失、替换或附加1个或多个氨基酸后的氨基酸序列、且具有钼传输体活性的蛋白质所示的氨基酸序列构成的蛋白质，或由与序列号2所示的氨基酸序列具有60％相同性的氨基酸序列构成的蛋白质，只要是本领域技术人员，就可以基于序列号1所示的碱基序列的信息进行适当地制备或获取，上述序列号1所示的碱基序列分别表示编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列之一例。例如，可以用序列号1所示的碱基序列或具有其一部分的DNA作为探针，在适当的条件下从拟南芥以外的生物中筛选该DNA的同系物，从而进行分离。筛选出该同系DNA的全长DNA后，编入表达载体中通过适当的宿主进行表达，从而可以制备由该同系DNA编码的蛋白质。

作为本发明的重组载体，没有特别的限制，只要是含有上述本发明的基因，并且可以表达钼传输体的重组载体即可，本发明的重组载体可以通过将本发明的基因适当地集成到表达载体中而进行构建。例如，可以优选例示将本发明的基因上除去5’和3’两侧的非翻译区域的ORF部分的cDNA连接在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子〔mol.Gen.Genet(1990)220，389-392〕、磷酸丙糖异构酶启动子、MOTR1(At2g25680)启动子等的下游而形成的构建物。作为表达载体，优选可在宿主细胞中进行自复制的载体，或可编入宿主细胞的染色体中的载体，另外，优选使用在表达本发明基因的位置上含有启动子、强化因子、终止基因等控制序列的载体。作为表达载体，可以使用酵母用表达载体、植物细胞用表达载体、细菌用表达载体、动物用表达载体等，但优选使用了酵母用表达载体及植物细胞用表达载体的重组载体。

作为酵母用表达载体，例如可以例示pGEM-T Easy Vector(Promega)、pYES2(invitrogen)、YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC30751)、Ycp5O(ATCC37419)、pHS19、pHS15等。作为酵母用载体，例如可以具体列举PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、GAL1启动子、GAL10启动子、热休克蛋白质启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等启动子。

作为植物细胞用表达载体，例如可以例示Ti质粒(Tumor inducing plasmid)、pSPORT1、pT7Blue-T载体、pIG121-Hm〔Plant Cell Report，15，809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J.6，3901-3907(1987)〕等质粒，或烟草花叶病毒、花椰菜花叶病毒、双生病毒等植物病毒载体等。作为植物细胞用启动子，例如可以列举花椰菜花叶病毒35S启动子〔mol.Gen.Genet(1990)220，389-392〕、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基启动子等，作为终止基因，例如可以列举Nopalin合成酶基因的终止基因。

另外，作为本发明的形质转换体，没有特别的限制，只要是导入了本发明的重组载体并且表达钼传输体的形质转换体即可，优选形质转换酵母、形质转换植物(细胞、组织、个体)、形质转换细菌、形质转换动物(细胞、组织、个体)，优选形质转换酵母及形质转换植物(细胞、组织、个体)。

作为制作形质转换酵母中使用的宿主酵母，可以列举酿酒酵母(saccharomycescerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、许旺阿鲁维斯酵母(Schwanniomyces alluvius)等。作为向酵母宿主中导入重组载体的方法，例如可以列举电穿孔法、环芽法、醋酸锂法等。

作为制作形质转换植物(细胞、组织、个体)中使用的宿主植物(细胞、组织、个体)，其种类没有特别的限制，可以从包括花卉、果实植物、蔬菜、根菜、谷类、观叶植物、果树等树木的植物，例如属于茄科、稻科、油菜科、菊科、胡麻科、木犀科、桃金娘科、蔷薇科、豆科、棕榈科或茜草科的植物，以及这些植物的培养细胞、组织(种子、愈伤组织等)中进行适当选择。在制作该形质转换植物时，可以采用以下方法：使用含有本发明的基因的上述本发明的重组载体，将该重组载体导入植物细胞中，在植物细胞中的基因组DNA中导入本发明的基因DNA。植物的形质转换可以根据植物种类，适当地采用叶盘共培养法、电穿孔法、土壤杆菌法、基因枪法等公知方法进行实施。另外，也可以采用以下方法：利用物理或化学方法提高植物细胞的透过性，将本发明的重组载体直接引入受容体细胞中，从而制作形质转换植物。

作为本发明的钼强化食品或食品原料，没有特别的限制，只要是添加了包含钼的本发明的形质转换酵母及形质转换植物(细胞、组织、个体)等形质转换体或其处理物的食品或食品原料即可，表达酵母等钼传输体、包含了钼的形质转换体还可以添加到食品或食品原料中，作为具有预防、治疗钼缺乏症的功能的食品及食品原料使用。作为被用于预防、治疗钼缺乏症的钼强化食品或食品原料的种类，没有特别的限制，例如可以列举乳酪、酸奶、汁、牛奶、豆浆、酒类、咖啡、红茶、煎茶、乌龙茶、运动饮料等各种饮料，以及牛乳布丁、曲奇饼、面包、蛋糕、果子冻、煎饼等烤制点心，羊羹等日本式点心、冷点心、口香糖等面包、点心类，面条、荞麦面条等面类，鱼糕、火腿、鱼肉香肠等鱼肉熬制品，豆酱、酱油、调味品、蛋黄酱、甜味料等调味类，于酪、黄油等乳制品，豆腐、魔芋，以及佃煮、饺子、油炸饼、色拉等各种家常菜。在这些食品及食品原料中，不仅可以添加以酵母为代表的上述表达钼传输体、包含了钼的形质转换体本身，还可添加它们的粉碎物、干燥物、干燥粉碎物、抽提物、酶处理物等处理物。

另外，作为本发明的钼强化饲料，没有特别的限制，只要是只要是添加了包含钼的本发明的形质转换酵母及形质转换植物(细胞、组织、个体)等形质转换体或其处理物的饲料即可。作为表达酵母等钼传输体、包含了钼的形质转换体，通过混入到基础饲料中，可以作为能够有利地用于猪、牛、鸡等家畜、家禽，以及狗、猫等宠物、养殖鱼及甲壳类的饲养等的饲料用原料进行使用。作为上述基础饲料原料，可以使用米糠、小麦麸子、大豆粕、大豆胚芽、酱油粕、马铃薯渣、魔芋渣粉、棕榈油残渣、含钙物质、淀粉类。作为上述含钙物质，可以列举蛋壳、牡蛎壳、碳酸钙、乳酸钙、磷酸钙、丙酸钙等中的一促或两种以上的混合物。另外，作为淀粉类，可以列举玉米、高粱、其它饲料用谷物、甘薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉及西谷淀粉、各种化工淀粉、葡萄糖、异构糖、糖稀等。在这些饲料中，不仅可以添加以酵母为代表的上述表达钼传输体、包含了钼的形质转换体本身，还可添加它们的粉碎物、干燥物、干燥粉碎物、抽提物、酶处理物等处理物。

作为促进或抑制本发明的钼传输体活性的物质的筛选方法，没有特别的限制，只要是在被检物质存在下，使MoO₄ ^2-与导入了重组载体且表达钼传输体的形质转换体进行接触，测定和评价向细胞内吸收钼的程度的方法即可，作为上述形质转换体，可以列举酵母、植物细胞、植物，另外，酵母菌体的Mo浓度测定可以按照文献(Takano，J.，Noguchi，K.，YasuMori，M.，Kobayashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2002)Arabidopsis boron transporter for xylem loading.Nature 420：337-340)记载的方法进行实施。进行测定、评价时，优选与不表达钼传输体的同种细胞进行比较。

以下，通过实施例对本发明进行更具体地说明，但本发明的技术范围并不局限于这些例子。

实施例1

(材料和方法)

[植物的培育]

在本实验中，使用拟南芥的品系Col-0、Ler及它们交配形成的recombinant inbred(RI)系统(Lister and Dean，1993)。Col-0和Ler使用研究室的备料。RI系统是从NottinghamArabidopsis Stock Centre接受的分发。另外，还接受了分发的来自突变株SALK institute的外来基因片段(T-DNA)插入基因破坏株SALK_069683和SALK_118311。这些突变株的本底是Col-0。

拟南芥的栽培是通过对文献(Hirai，M.Y.，fujiwara，T.，Chino，M.and Naito，S.(1995)Effects of sulfate concentrations on the expression of a soybean seed storage protein gene and itsreversibility in transgenic Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physi ol.36：1/331-1/339)记载的方法进行一部分改变来进行实施。在摆放于塑料盘中的石棉(Nittobo Co.，Tokyo，Japan)中进行播种，在4℃下进行48小时以上的春化处理。使用人工气象器，采用照明10小时/黑暗14小时的条件在22℃进行栽培。培养液使用MGRL(fujiwara，T.，Hirai，M.Y.，Chino，M.，Komeda，Y.and Naito，S.(1992)Effects of sulfur nutrition on expression of the soybean seed storage protein genes intransgenic petunia.Plant Physiol.99：263-268)培养液。每过3天用去离子水清洗塑料盘，替换培养液。该MGRL中含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-。

对用于测定拟南芥的叶子Mo浓度的试样的调整按文献(Noguchi，K.，YasuMori，M.，Imai，T.，Naito，S.，Matsunaga，T.，oda，H.，Hayashi，H.，Chino，M.and fujiwara，T.(1997)borl-1，anArabidopsis thaliana mutant that requires a high 1 evel of boron.Plant Physiol.115：901-906)记载的方法进行。将有11-1/3片本叶展开的个体的第5-9片叶中的3片叶用于进行测定。将试样在80℃下干燥48小时，测定干燥重量。将试样转移到特氟龙(注册商标)管中，对于每个试样，用2ml硝酸在1/30℃条件下进行分解。将用硝酸分解后的试样溶解在含有内标物质——5ppb铟的0.08N硝酸1.5ml中。使用inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS；SEIKo，Chiba，Japan)，按照ICP-MS中所附的说明书中记载的方法测定Mo浓度。

[基因分析]

从基因分析用拟南芥中萃取DNA是按照文献(Kasajima，I.，Ide，Y.，ohkama-ohtsu，N.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2004)A protocol for rapid DNA extraction fromArabidopsis thaliana for PCR analysis.Plant Mol.Biol.Rep.22：49-52)记载的方法进行的。基于文献(Jander，G.，Norris，S.R.，Rounsley，S.D.，Bush，D.f.，Levin，I.M.and Last，R.L.(2002)Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.Plant Physiol.129：440-450)中报导的Col-0和Ler之间的基因多型数据，制作通过PCR(polymerase chain reaction)使含有SSLP的区域放大的引物。PCR中使用的引物示于表1。

表1

基因分析用植株必须是多个Col-0和Ler同时栽培。对于各个Mo浓度的测定，同时测定试样及Col-0和Ler的Mo浓度。将同时栽培的Col-0和Ler的Mo浓度的中间值作为基准，分为比其浓度高的情况(High)和比其浓度低的情况(Low)。

[构建物的制作]

按以下程序制作本实验中使用的构建物。所制作的构建物的概貌示于图1。另外，构建物制作中使用的引物参见表1。以下列出了下述质粒及其制法。

(1)PHT010(CaMV35SO::At2g25680(genomic ORF)::sGFP(sythetic GFP))

1)用Col-0的基因组DNA作为模版，利用genomic ORF 5’(SalI-EcoRI)和genomic ORF3’(BamHI)的引物(参见表1)的组合来放大At2g25680的ORF。

2)通过TA克隆法将放大的产物插入到pGEM-T Easy Vector(Promega)中(命名为pHT002)。

3)通过碱基序列分析，确认所插入的序列与At2g25680的ORF一致。

4)用SalI和BamHI切断pHT002，插入到用SalI和BamHI切断的pTF486中(命名为pHT010)。

(2)PHT007(Triose Phosphate Isomerase Promoter::At2g25680(genomic ORF))

1)用Col-0的基因组DNA作为模版，利用genomic ORF 5’(SalI-EcoRI)和genomic ORF3’(XhoI)的引物(参见表1)的组合来放大At2g25680的ORF。

2)通过TA克隆法将放大的产物插入到pGEM-T Easy Vector(Promega)中(命名为pHT001)。

3)通过碱基序列分析，确认所插入的序列与At2g25680的ORF一致。

4)用EcoRI和XhoI切断pHT001，插入到用EcoRI和XhoI切断的pYX222x(来自IowaState University的Dr.Beom-Seok Seo的分发)中(命名为pHT007)。

(3)PHT005(At2g25680启动子(2903bp)::GUS))

1)用Col-0的基因组DNA作为模版，利用genomic ORF 5’(BamHI)和genomic ORF 3’(NcoI)的引物(参见表1)的组合来放大At2g25680的起始密码子向上游2903bp的区域。

2)用BamHI和NcoI切断放大产物，插入到用BamHI和NcoI切断的pTF537中(命名为pHT003)。

3)用BamHI和NotI切断pHT003，插入到用BamHI和ApaI切断的pTkan+中(命名为pHT005)。

(4)PHT006(At2g25680启动子(2903bp)::sGFP))

1)用Col-0的基因组DNA作为模版，利用genomic ORF 5’(BamHI)和genomic ORF 3’(NcoI)的引物(参见表1)的组合来放大At2g25680的起始密码子向上游2903bp的区域。

2)用BamHI和NcoI切断放大产物，插入到用BamHI和NcoI切断的pTF538中(命名为pHT004)。

3)用BamHI和NotI切断pHT003，插入到用BamHI和ApaI切断的pTkan+中(命名为pHT006)。

[At2g25680在细胞内存在部位的分析]

为了研究At2g25680的翻译产物在细胞内的存在部位，观察At2g25680和GFP的融合蛋白质在细胞内的存在部位。首先，在植物细胞内的花椰菜花叶病毒35SRNA启动子控制下制作用于表达At2g25680的翻译产物和GFP的融合蛋白质的构建体(pHT010，参见表1)。然后使容器室内的真空度为28英寸Hg，在7.6MPa的氦压下，使用helium-gas-driven particleaccelerator(PDS-1000/He，BioRad)将附着了该质粒的金粒导入洋葱表皮细胞中。将导入后的洋葱表皮细胞置于渗透了MGRL培养液的滤纸，在22℃的暗处静置12小时。按照文献(Takano，J.，Noguchi，K.，YasuMori，M.，Kobayashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2002)Arabidopsis boron transporter for xylem loading.Nature 420：337-340)记载的方法观察该洋葱表皮细胞的GFP荧光。

[酵母的培育]

本实验中使用的酵母(Saccharomyces cerevisiae)是BY4741株(MATa his2DO met15DOura3DO)。酵母的培育按常规方法进行。培养基是使用从Sherman(2002)的最少培养基中除去Na₂Mo₄，并添加2％葡萄糖、20mg/l Ade、30mg/l L-Leu、20mg/l Met、20mg/l Ura及20mg/lL-Trp而得到的培养基(以下有时称为“-MoSD培养基”)。

[酵母的形质转换]

在酵母的形质转换中使用醋酸锂法(Rose，M.D.Winston，F.and Heiter，P.(1990)Methodsin Yeast Genetics.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press)这种变换变换方法。以下列出其程序。

(1)在1/3000rpm，4℃，5sec的条件下对OD₆₀₀值为0.4左右的酵母培养液进行离心操作，除去上清液。

(2)用杀菌水清洗两次。第一次使用750μl杀菌水，第二次使用100μl杀菌水。

(3)添加TE/LiAc buffer[10×TE(pH7.5)5ml、1M的LiAc(pH7.5)5ml、杀菌水40ml]50μl使其进行良好地悬浮，在1/3000rpm，4℃，5sec的条件下进行离心操作，除去上清液。

(4)添加TE/LiAc buffer50μl使其进行良好地悬浮，添加PEG/LiAc buffer[10×TE(pH7.5)5ml、1M的LiAc(pH7.5)5ml、50％(w/v)PEG400 40ml]210μl。再添加Salmon Sperm DNA[在6mgDNA中添加TE(pH7.5)1ml，在37℃下搅拌一昼夜]5μl和质粒5μl，使其良好悬浮。

(5)在30℃的室温下静置30分钟。

(6)在42℃的加热块中静置15分钟，在1/3000rpm，4℃，10sec的条件下进行离心操作，除去上清液。

(7)添加100μl杀菌水，在固态培养基中播种菌体。

[使用酵母时的传输活性测定]

在酵母中的triose phosphate isomerase启动子的控制下，制作用于过剩表达At2g25680的构建物(pHT007，参见图1)。然后采用醋酸锂法的变换方法，通过形质转换将该构建物导入酵母(Saccharomyces cerevisiae，BY4741)中，得到基因导入株。分别在其它的-MoSD液体培养基中种植基因导入株及对照株的单菌落，在30℃，300rpm条件下进行振荡培养。

酵母菌体的Mo浓度测定按照对文献(Takano，J.，Noguchi，K.，YasuMori，M.，Kobay ashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2002)A rabidopsis borontransporter for xylem loading.Nature 420：337-340)记载的方法进行一部分改变的方法进行实施。以600nm处的吸光度值为指标，按照使OD₆₀₀值为0.5的方式使基因导入株和对照株的细胞密度大体一致，通过离心操作凹收该培养液30ml的菌体。使回收的菌体悬浮在-MoSD液体培养基或含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的-MoSD液体培养基20ml中，按30℃，300rpm的条件振荡培养30分钟。再通过离心操作回收菌体，使用冰冷却的milliQ清洗两次，直接干燥菌体。使菌体在80℃下干燥48小时以上，测定干燥重量。酵母菌体的Mo浓度测定按与拟南芥的叶子Mo浓度测定相同的方式进行。

[At2g25680的表达组织的分析]

为了研究表达At2g25680的组织，制作在距离At2g25680的起始密码子2903bp的上游启动子区域连接β-glucuronidase(GUS)基因而形成的构建物(pHT006，参见图1)。使用土壤杆菌(Agrobacterium tumef aciens，GV3101；Koncz，C.and Schell，J.(1 986)The proMoter ofTL-DNA gene 5 controls the tissue specific expression of chimeric genes carried by a novel type ofA grobacterium binary vector.Mol.Gen.Genet.204：383-396)通过减压浸润法(Clough，S.J.andBent，A.f.(1998)floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana.Plant J.16：735-743)对拟南芥野生株(Col-0)进行形质转换。对于由该形质转换株得到的种子，将在种植于含有ClaForan 250mg/l、Kanamicin 50mg/l、Agar 8g/l及通常浓度一半的Murashige & Skoog培养基用混合物盐类(Wako，Osaka，Japan)的固态培养基中，从显示出Kanamycin抗性的植株获得种子，形成形质转换系统。关于用GUS对形质转换系统进行染色和切片的制作、观察，按照文献(Shibagaki，N.，Rose，A.，McDerMott，J.P.，fujiwara，T.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and Davies，J.P.(2002)Selenate-resistant mutants ofArabidopsis thaliana identify Sultrl；2，a sulfate transporter requi red for efficient transport of sulfateinto roots.Plant J.29：475-486)记载的方法实施。

对于在距离At2g25680的起始密码子2903bp的上游启动子区域连接GFP基因而形成的构建物(pHT005，参见图1)，同样对拟南芥进行形质转换。对GFP荧光的观察按文献(Takano，J.，Noguchi，K.，YasuMori，M.，Kobayashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2002)Arabidopsis boron transporter for xylem loading.Nature420：337-340)记载的方法实施。

[钼传输体的米歇利斯常数的确定]

当某种传输体的基质传输速度为最大值一半时的基质浓度下，Michaelis(米歇利斯)常数(Km)在各传输体中是固定值。即，在本发明的情况下，当钼传输体从培养基向细胞内传输钼的速度为最大速度的一半时，培养基的钼浓度为Km，该值记载了传输体的重要特征，与此同时，可以获得在什么样的情况下传输体发挥其效果这种应用/实用时的暗示。

酵母菌体的Mo浓度测定按照对文献(Takano，J.，Noguchi，K.，YasuMori，M.，Kobay ashi，M.，Gajdos，Z.，Miwa，K.，Hayashi，H.，Yoneyama，T.and fujiwara，T.(2002)A rabidopsis borontransporter for xylem loading.Nature 420：337-340)记载的方法进行一部分改变后的方法进行实施。以600nm处的吸光度值为指标，按照使OD₆₀₀值为0.5的方式使基因导入株(pHT007)和对照株的细胞密度大体一致，通过离心操作回收该培养液40ml的菌体。使回收的菌体悬浮在含有6.4×10、7.5×10、9.0×10、1.1×10²、1.5×10²、2.2×10²、7.4×10²或1.6×10³nM的MoO₄ ^2-的-MoSD液体培养基20ml中，按30℃，300rpm的条件振荡培养15分钟。再通过离心操作回收菌体，使用冰冷却的milliQ清洗两次，直接干燥菌体。使菌体在80℃下干燥48小时以上，测定干燥重量。酵母菌体的Mo浓度测定按与拟南芥的叶子Mo浓度测定相同的方式进行。

对于结果，将纵轴作为钼传输速度的倒数(1/[钼传输速度])、横轴为培养基的钼浓度的倒数(1/[培养基的钼浓度])，对实测值进行绘图。根据反应速度理论中被称作Michaelis-menten(米-曼)式的数学式，对该图上的实验结果绘图而连成的直线与横轴的交点的值是-1/Km，利用这一点确定钼传输体的米歇利斯常数。

[钼缺乏环境下拟南芥的培育]

钼是作为植物体内生长所必需的酶的构成成分而被利用的，植物为了生存，其体内存在某种程度的钼是不可欠缺的。植物具有从土壤中向体内吸收钼、并向必需钼的器官、组织输钼的系统，可以认为假如钼传输体负担一部分工作，则对于该钼传输体不能正常起作用的植物来说，钼传输系统会出现异常，结果可以发生生长异常。

因此，在钼存在下/不存在下栽培通过在钼传输体的基因中插入作为外来基因的T-DNA而不能正确形成钼传输体的上述拟南芥突变株(SALK_118311)和拟南芥野生株，对基生长进行比较。

拟南芥的栽培是通过对文献(Hirai，M.Y.，fujiwara，T.，Chino，M.and Naito，S.(1995)Effects of sulfate concentrations on the expression of a soybean seedstorage p rotein gene and itsreversibility in transgenic Arabidopsis thaliana.Plant Cell Physiol.36：1/331-1/339)记载的方法进行一部分改变来实施。播种在MGRL(fujiwara，T.，Hirai，M.Y.，Chino，M.，Komeda，Y.andNaito，S.(1992)Effects of sulfur nutrition on expr ession of the soybean seed storage protein genesin transgenic petunia.Plant Physiol.99：263-268)培养液或从其中除去(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O的并添加Sucrose 1％、Gellan Gum 1.2％而形成的固态培养基中，在4℃下进行48小时以上的春化处理。这些固态培养基中含有1.7×10²nM或2.0～9.0nM范围的MoO₄ ^2-。使用人工气象器，采用照明10小时/黑暗14小时的荧光照明在22℃进行栽培。

[使用涉及稻的MOTR1相同基因的酵母时传输活性的测定]

(1)OsMoTR1表达载体

1)用稻(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的基因组DNA作为模版，利用primer attB19636.m0012(5′-aaaaagcaggcttaggcgagcagagaagagaaga-3′：序列号50)和primer attB29636.m00012(5′-agaaagctgggtgcggaacgagctgtattgagt-3′：序列号51)的引物的组合对Os08g01120的ORF进行放大。

2)通过BP反应使放大产物插入到pDONR/Zeo vector(Invitrogen)中(命名为OsMoTR1entry vector)。

3)通过碱基序列分析，确认所插入的序列与Os08g01120的ORF的一致。

4)通过LR反应使OsMoTR1 entry vector与pYES-DEST52 vector(Invitrogen)进行重组(命名为OsMoTR1 expression vector)。

(2)OsMoTR2表达载体

1)用稻(Oryza sativa L.cv.Nipponbare)的基因组DNA作为模版，利用primer attB1m04384-ATG(5′-aaaaagcaggctatatggcatcctccgccggcga-3′：序列号2)和primer m04384(5′-agaaagctgggtatcaagcatctccagccccat-3′：序列号53)的引物的组合对Os01g45830的CDS进行放大。

2)通过BP反应使放大产物插入到pDONR/Zeo vector(Invitrogen)中(命名为OsMoTR2entry vector)。

3)通过碱基序列分析，确认所插入的序列与Os01g45830的CDS的一致。

4)通过LR反应使OsMoTR2 entry vector与pYES-DEST52 vector(Invitrogen)进行重组(命名为OsMoTR2 expression vector)。

(3)酵母的培育

本实验中使用的酵母(Saccharomyces cerevisiae)是BY4741株(MATa his2DO met15DOura3DO)。酵母的培育按常规方法进行。培养基是使用从Sherman(2002)的最少培养基中除去Na₂Mo₄，并添加2％半乳糖、30mg/l L-Leu、20mg/l Met、20mg/l His及20mg/l L-Trp而得到的培养基(以下有是称为“-MoSD培养基”)。但是，在[使用酵母时的传输活性测定]以外，使用由2％半乳糖替代2％葡萄糖的培养基。形质转换按上述记载的方法相同的方式进行。

(4)使用酵母时的传输活性测定

在酵母中的GAL1启动子的控制下，制作用于过剩表达Os08g01120或Os01g4583的构建物(OsMoTR1 expression vector及OsMoTR2 expression vector)。然后采用醋酸锂法的变换方法，通过形质转换将该构建物导入酵母(Saccharomyces cerevisiae，BY4741)中，得到基因导入株。同样，将pYES vector导入酵母中，得到对照株。分别在其它的-MoSD液体培养基中种植基因导入株及对照株的单菌落，在30℃，300rpm条件下进行振荡培养。酵母菌体的Mo浓度测定按与上述记载的方法相同的方式进行。

实施例2

(结果)

本发明人对拟南芥的品系Col-0和Ler的叶子的元素组成进行了比较，发现Col-0的叶子的Mo浓度约为Ler的3倍。另外，通过使用由Col-0和Ler交配形成的RI line 18系统的QTL分析，发现支配叶子Mo浓度的QTL存在于被位于第2条染色体的上臂的两个遗传标记mi238和er夹持的区域。

因此，为了鉴别决定叶子的Mo浓度的基因，对于遗传标记mi238和er之间进行重组的RI line 16系统(CL 36、59、84、90、160、177、179、191、194、237、253、295、303、358、370、395；Lister，C.and Dean，C.(1993)Recombinant inbred lines for mapping RfLP andPhenotypic markers in Arabidopsis-thaliana.Plant J.4：745-750)，研究其基因类型及叶子的Mo浓度。结果示于表2。各RI系统用CL编号表示。另外，将与RI系统同时栽培的Col-0和Ler的Mo浓度的中间值作为基准，分为比其浓度高的情况(High)和比其浓度低的情况(Low)。基因类型用SSLP标记判别(C：Col-0，L：Ler，#：not clearly determined)。将SNP60和SGCSNP300之间有重组的系统表示为recombinant。遗传标记在染色体上按mi238、SNP60、SGCSNP300、er的顺序存在。在下文中，将mi238侧作为上游，将er作为下游进行表示。

表2

叶子的Mo浓度高(显示了Col-0型的表现型)的CL 84的基因类型是SNP60和SGCSNP300所夹持的区域中由Ler型重组为Col-0型，叶子的Mo浓度低(显示了Ler型的表现型)的CL 119的基因类型是SNP60和SGCSNP300所夹持的区域中由Col-0型重组为Ler型。这些结果意味着目标基因存在于比SNP60更下游的位置。另外，叶子的Mo浓度高的CL 177的基因类型是mi238和SNP60SNP60所夹持的区域及SNP60和SGCSNP300所夹持的区域中由Col-0型重组为Ler型。该结果意味着目标基因存在于比mi238更下游且比SNP60更上游的位置。因此，这暗示着目标基因存在于SNP60和SGCSNP300所夹持的区域中。

另外，为了限定目标基因的存在区域，从使Col-0和Ler交配形成的F₁代进行自受粉得到的F₂代62系统中，选择F1/3B15_01和T19L18所夹持区域中存在重组的21系统。研究这些植株的基因类型及叶子的Mo浓度。结果示于表3中。按照Mo浓度对F₂系统进行划分，列出其编号(A02-E72)。由于选择重组体，编号不连续。将与选出的系统同时栽培的Col-0和Ler的Mo浓度的中间值作为基准，分为比其浓度高的情况(High)和比其浓度低的情况(Low)。基因类型用SSLP标记判别(C：Col-0，L：Ler，#：not clearly determined)。将F1/3B15_01和T19L18之间有重组的系统表示为recombinant。还有，遗传标记从上游开始按在染色体上按SNP60、F1/3B15_01、F1/3B15_02、F3N11_01、F3N11_02、F17H15、T19L18、SGCSNP300的顺序存在。

表3

叶子的Mo浓度高的C08的基因类型是F1/3B15_02和F3N11_01所夹持的区域中由Col-0型重组为Ler型。另外，叶子的Mo浓度低的C10的基因类型是F1/3B15_02和F3N11_01所夹持的区域中由Ler型重组为杂合子型，F3N11_02和F17H15所夹持的区域中由Ler型重组为Col-1型。这些结果意味着目标基因存在于比F1/3B15_02更下游且比F17H15更上游的位置。

通过该遗传分析，可以将基因的存在区域限定在两个SSLP标记F1/3B15_02和F17H15所夹持的172kb中。

[在At2g25680中插入外来基因片段(T-DNA)而形成的破坏株的T-DNA插入位置]

F1/3B15_02和F17H15所夹持的172kb中，存在硫酸离子传输体相同基因At2g25680。该基因具有与硫酸离子传输体相同的域，但是其功能并未被分析(非专利文献17)。从硫和Mo可以作为SO₄ ^2-与MoO₄ ^2-被植物吸收(非专利文献9)及Na₂SO₄的施用抑制了植物对Mo的蓄积(非专利文献11)，可认为与硫酸离子传输体相同的At2g25680可能涉及Mo的吸收。另外，如果将数据库中注册的Col-Or At2g25680的序列(非专利文献14)与Ler的序列(Jander，G，Norris，S.R.，Rounsley，S.D.，Bush，D.f.，Levin，I.M.and Last，R.L.(2002)Arabidopsismap-based cloning in the post-genome era.Plant Physiol.129：440-450)进行比较，则可判定作为第439个氨基酸的天冬氨酸在Ler中取代了缬氨酸，而且在起始密码子上游第27至第79个碱基在Ler中缺失。

因此，接受了从Salk Institute分发的At2g25680或其附近插入了外来基因片段(T-DNA)的独立2系统的基因破坏株SALK_118311和SALK_069683。对于这些系统，使用T-DNA插入预测部位的上游和下游的各碱基序列相同的引物和T-DNA的内部序列相同的引物(参见表1)进行PCR，分别选择纯合子中具有插入基因的系统。对于这些被选取的系统，再分析插入的T-DNA和基因组DNA边界附近的碱基序列。通过与野生株(Col-0)的碱基序列比较，可判定对于SALK_118311，left border是在从转印起始点开始的第674个碱基的位置插入的，对于SALK_069683，left border是在从转印起始点开始上游方向第419个碱基的位置插入的(图2)。

[At2g25680基因破坏株的表现型]

为了研究At2g25680的变异对拟南芥的生长产生的影响，要确认SALK_118311和SALK_069683表现型。在石棉中播种突变株及野生株Col-0和Ler，用MGRL培养液栽培30天。该MGRL培养液中的所含的Mo浓度是2.0-9.0nM的范围(以下称为“Mo缺乏条件”)或1.7×10²nM(以下称为“Mo充足条件”)。

在Mo缺乏条件下，突变株的叶子产生萎黄病，出现萎缩而形成细长形，产生形态异常。但是，该表现型在作为野生株的Col-0及Ler上也能观察到。叶子出现生长障碍的时期及其程度在突变型和野生型之间没有差异。

另一方面，在Mo充足条件下在突变株和野生株上均未观察到叶子的形态异常。但是，如果测定在Mo充足条件下栽培的突变株及野生株的叶子的Mo浓度，则突变株的Mo浓度低至野生株(Col-0)的约1/3。特别是SALK_118311的Mo浓度也比Ler的低(图3)。另外，Col-0和Ler交配形成的F₁代的叶子的Mo浓度是(Col-0)的约1/3，Mo浓度低的表现型未受到互补。该结果暗示At2g25680是决定拟南芥叶子的Mo浓度的基因。

为了探查突变株叶子中Mo浓度低的表现型的遗传形式，研究使At2g25680的突变株和野生株(Col-0)进行回交得到的后代的表现型。首先，使SALK_118311和SALK_069683分别和野生株(Col-0)进行交配，得到F₁代种子。将该F₁代种子在Mo充足条件下栽培30天，测定叶子的Mo浓度，此时F₁代的Mo浓度显示为其双亲突变株和野生株的浓度的大致中间值。

然后，使由SALK_118311和Col-0进行交配得到的F₁代植株进行自传粉，得到F₂代种子。对于该F₂代植株，同样测定叶子的Mo浓度，同时使用PCR确认是否在At2g25680中插入了T-DNA。未插入T-DNA的植株的Mo浓度和Col-0基本相同，纯合子中具有插入基因的植株的Mo浓度比Ler低。而且，杂合子中具有插入基因的植株的Mo浓度显示为这些株的大致中间值(图4)。该结果支持了叶子Mo浓度低是由At2g25680变异引起的，同时也暗示该变异是半显性的。由这些结果可确定突变株的叶子的Mo浓度低的原因在于At2g25680变异，因此将该基因命名为MoTR1(以下将SALK_118311称为MoTR1-1，将SALK_069683称为MoTR1-2)。

另外，对于在Mo充足的条件下的栽培实验中使用全部系统，并不观察叶子的形态异常。

[MoTR1在细胞内的存在位置]

通过在膜蛋白质数据库(ARAMEMNON，http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de)中进行检索，预测MoTR1具有7～12个膜贯穿区域。因此，为了研究翻译产物存在于细胞的哪个膜上，在花椰菜花叶病毒35SRNA启动子控制下制作用于表达MoTR1和GFP的融合蛋白质的构建体(pHT010，参见表1)，并将其导入洋葱表皮细胞。已有在核和细胞质中检出不与其它蛋白质融合的GFP的报导(Chiu，W.，Niwa，Y.，Zeng，W.，Hirano，T.，Kobayashi，H.and Sheen，J.(1996)Engineered GfP as a vital reporter in plants.Curr.Biol.6：325-330)。利用激光共聚集显微镜进行观察时，融合蛋白质的荧光位于细胞外缘部分(图5)。该结果暗示MoTR1是细胞膜蛋白质。

[Mo传输能力]

由于已暗示MoTR1是细胞膜蛋白质，因而可以认为MoTR1可能具有Mo传输能力。因此，为了研究MoTR1的Mo传输能力，制作用于表达酵母中的MoTR1的构建体(pHT007，参见表1)，并将其导入酵母中。在未添加Mo的培养基中对导入了该基因的菌株和对照株(vector control)进行继代培养。此时，基因导入株的增殖速度比对照株慢。继续培植使OD₆₀₀的值相同时，对照株继续培植16小时后的OD₆₀₀值和基因导入株继续培植19小时后的OD₆₀₀值基本相同。

按照使OD₆₀₀值为0.5的方式使基因导入株和对照株的细胞密度大体一致，通过离心操作回收菌体，使回收的菌体在含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的培养基进行再悬浮，振荡培养30分钟。测定菌体的Mo浓度时，基因导入株的浓度上升到对照株的80倍以上(图6)。该结果暗示MoTR1是Mo传输体。

(MoTR1的表达组织)

为了研究表达MoTR1的组织，在MoTR1的起始密码子上游方向2903bp区域上连接β-glucuronidase(GUS)基因，对拟南芥进行形质转换。对于发芽后第7天的独立基因导入株16系统，可以确认地上部分的叶柄和叶的外缘部位具有GUS活性(图7B及7C)。在根上，可确认根端有GUS活性，离根端1-6mm的区域没有活性(图7A及7F)。可观察到其上部的中柱鞘处有GUS活性，而且在被认为是侧根的区域上部可观察到皮层上有活性(图7D、7H、7I及7J)。进行同样的分析时，使用GFP作为报告子时，也获得的同样的结果(图7E及7G)。

[米歇利斯常数的确定]

从6.4×10nM的Mo培养基开始，在各种Mo浓度的培养基中培养15分钟的酵母中的Mo浓度依次为5.8、6.0、6.2、6.6、7.0、6.9、7.8、7.3(Mo[μg]/Dry weight[g])。将纵轴作为钼传输速度的倒数(1/[钼传输速度])、横轴为培养基的钼浓度的倒数(1/[培养基的钼浓度])进行绘图(参见图8)。对实测值进行绘图并进行连接后形成的直线是y＝2.6846×0.1303(R²＝0.9327)，可知Km为数十nM。

[钼缺乏环境下拟南芥的培育]

图9显示了在各种条件下对拟南芥(野生株、突变株)培养3周得到的结果。(A)是在钼存在下进行栽培的植株，(B)是在没有钼存在条件下进行栽培的植株。在各平板上，从左边开始按照野生株5个、突变株5个、野生株5个、突变株5个的顺序种植20个拟南芥个体。在给予钼条件下的(A)的平板上野生株和突变株的生长程度基本相同，与此相对，在未给予钼条件下的(B)的平板上野生株的生长受到了抑制，突变株的生长受到了显著抑制。

[使用涉及稻的MOTR1相同基因的酵母时传输活性的测定]

对稻的MOTR1、MOTR2的Mo传输活性的研究结果示于图10中。可知在含有Mo的培养基中发酵15分钟时，分别表达稻的两种MOTR1相同基因的酵母与对照株酵母相比，酵母内的Mo浓度增加量多。

实施例3

(探讨)

[MoTR1的表现型]

如果在含有含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的MGRL培养液中栽培At2g25680中插入了T-DNA的基因破坏株(MoTR1-1及MoTR1-2)，则叶子的Mo浓度低至野生株的约1/3(图3)。作为MoTR1-1及MoTR1-2的叶子中Mo浓度，杂合子中具有插入基因的系统低至野生株(Col-1)的约1/2，纯合子中具有插入基因的系统低至野生株的约1/10(图4)。这些结果暗示，MoTR1中叶子Mo浓度降低的突变是半显性的。

另一方面，MoTR1-1及MoTR1-2并未显示出叶子Mo浓度低以外的其它特征表现型。在含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的培养液中进行栽培时，在营养生长期和生殖生长期中MoTR1-1及MoTR1-2并未遭受生长障碍。由MoTR1-1及MoTR1-2得到的种子正常发芽。而且，对在不添加MoO₄ ^2-的培养液中栽培时的Mo缺乏感受性及在NO₃ ^-浓度为1/50的培养液中栽培时氮缺乏感受性进行研究，但是MoTR1-1及MoTR1-2和野生株在这些环境中的生长障碍程度不同没有显著差异。

已经报导，作为含Mo的辅酶的Mo辅因子的含量少的突变株(chl2)的硝酸还原酶的活性低，因此显示出了抗高氯酸性和对钨酸的感受性这种特征表现型(非专利文献7)。在含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的培养液中添加2mM KClO₃或0.1mM Na₂WO₄进行栽培时chl2显示出这些特征的表现型，但是在这些条件下，栽培MoTR1-1和MoTR1-2及野生株时其表现型未出现明显差异。

这些生理实验结果表明MoTR1生长所必需的培养液MoO₄ ^2-浓度少于1.7×10²nM，同时暗示野生株在体内蓄积了必需量以上的MoO₄ ^2-。虽然拟南芥的Mo贮存机理还不明确，但是在本实验条件下野生株的叶子Mo浓度与生长时期成正比。可以期待跟踪生长阶段对MoTR1的表达组织进行探查关系到Mo贮存机理的弄清。

[MoTR1的Mo传输能力]

MoTR1是编码细胞膜蛋白质的基因(图5)。作为MoTR1是确定拟南芥的叶子Mo浓度的设想，提出了两种机理假设。一种是MoTR1作为传输体直接控制Mo传输的机理，另一种是MoTR1作为感受器感知Mo浓度的变化，通过调节别的蛋白质的Mo输送活性来间接控制Mo传输的机理。在本研究中，使MoTR1在酵母中进行表达，并测定了Mo浓度。假如MoTR1是感受器，则可认为只要酵母中也不存在与拟南芥相同的信号传送机理及对该信号进行反应的的Mo传输体，菌体的Mo浓度就不会上升。另一方面，如果MoTR1是传输体，则可以推定只要翻译产物存在于细胞膜中并具有活性，则对菌体的Mo浓度多少会产生影响。在表达了MoTR1的酵母中Mo浓度上升到野生株的80倍以上暗示MoTR1是Mo传输体(图6)。

为了推测MoTR1的Mo传输能力的特性，对菌体内的Mo浓度进行概算。通常，OD₆₆₀值为0.5左右的酵母培养液中存在鲜重约为1/3mg/ml的菌体，可认为此时的干重约为0.4mg/ml(Sherman，2002)。对于本次推算，在本研究中对于转移到含有1.7×10²nM的MoO₄ ^2-的培养基中进行30分钟振荡培养的酵母的鲜重/干重比按先前例示进行假设，将鲜重和干重之差视为菌体内的液体量。在该假设下算出的振荡培养后的Mo浓度为约250μM。因此，可以认为MoTR1是具有逆浓度梯度对Mo进行浓缩的能力的传输体。

(MoTR1的表达组织和表达诱导)

对于在距At2g25680的起始密码子约2.9kb的上游启动子区域中连接(GUS)基因而得到的形质转换株，可以确认组织特殊的GUS活性(图7)。根上的表达模式与目前已报导的硝酸离子传输体AtNRT1.1的情况类似(Guo，f.Q.，Wang，R.，Chen，M.and Crawford，N.M.(2001)TheAra bidopsis dual-affinity nitrate transporter gene AtNRT1.1(CHL1)is activatedandfunctions in nascent organ development during vegetative and reproductive growth.Plant Cell 1/3：1761-1777)。由于AtNRT1.1表达的组织的NO3-的浓度高，因此可以推测这些组织中硝酸还原酶的活性上升。承担氮代谢线路上重要反应的硝酸还原酶是含钼的酶之一。因此，有可能MoTR1是用与AtNRT1.1相同的组织进行表达并且通过向硝酸还原酶提供Mo来促进氮的代谢。

作为成熟根上的GUS活性，可以确认根端侧中柱鞘中的活性，可以观察到被认为是侧根的区域上部的皮层中的活性。已经报导，侧根原基形成于中柱鞘中(casimiro，I.，Beeckman，T.，Graham，N.，Bhalerao，R.，Zhang，H.，Casero，P.，Sandberg，G.and Bennett，M.J.(2003)Dissecting Arabidopsis lateral root development.Trends Plant Sci.8：165-171)，而在chicory的侧根原基形成部位上其形成的过程中硝酸还原酶进行了表达(Vuylsteker，C，Prinsen，E.，Boutin，J.，one kelen，H.V.and Rambour，S.(1998)Evidence for nitrate reductase expression duringinitiation of lateral roots by NAA in chicory.J.Exp.Bot.49：937-944)。另外，在拟南芥中也显示出了根圈的NO₃ ^-浓度对侧根形成的控制(Zhang，H. and forde，B.G.(2000)Regulation ofArabidopsis root development by nitrate availability.J.Exp.Bot.51：51-59)。侧根形成部位前后MoTR1的表达组织的变化暗示MoTR1与利用提供Mo使硝酸还原酶活化，从而形成侧根相关。在含有各种浓度的NO₃ ^-和MoO₄ ^2-的培养液中栽培MoTR1时，可以确认侧根的形成产生了变化，由此有可能发现突变株的新表现型。

[米歇利斯常数]

所求出的米歇利斯常数与使用植物的其它必需元素及其传输体报导的米歇利斯常数相比，是非常小的值，这暗示了该钼传输体和钼具有高亲和性。

[钼缺乏环境下拟南芥的培育]

对钼缺乏环境下的拟南芥培育的研究结果是在没有钼存在下野生株的生长受到的抑制，而突变株的生长没有受到显著抑制，因此钼传输体不能正常起作用的拟南芥的钼缺乏情况弱，进一步暗示了野生株中钼传输体的重要性。即，可以确认在钼缺少的环境中，本发明的钼传输体对拟南芥的生长起着重要作用。

[表达了稻的MOTR1相同基因的酵母的Mo浓度]

对两种稻的MoTR1相同基因的Mo传输活性进行研究时，表达该基因的酵母与对照株的酵母相比，酵母内Mo浓度增加量大，因此可以认为稻的MoTR1相同基因所编码的蛋白质具有钼传输活性。

另一方面，由于MoTR1具有与硫酸离子传输体相同的域(Takaha shi，H.，Noji，M.，Hirai，M.Y.and Saito，K.(2003)Molecular regulation of assimilatory sulfur metabolism in plants.Tanpakushitsu Kakusan Koso 48：2121-2129，in Japanese)，因此MoTR1的表达量依赖于培养基中硫酸离子的浓度并被其调节。硫和氮是氨基酸的构成元素，已经报导了植物体内的硫和氮之比是将各同化线路的交点——o-acetylserin作为信号分子，通过调节反馈机理进行控制的(Kim，H.，Hirai，M.Y.，Hay ashi，H.，Chino，M.，Naito，S.and fujiwara，T.(1999)Role ofo-acetyl-L-serine in the coordinated regulation of the expression of a soybean seed storage-proteingene by sulfur and nitrogen nutrition.Planta 209：282-289)。钼是硝酸还原酶中含有的元素，植物体中的Mo存在量是决定氨基酸生物合成中可利用的氮量的因素。因此，如果MoTR1的表达量依赖于培养基中的硫酸离子浓度并被其调节，则可以认为这与已知的反馈调节机理不同，是通过从土壤中吸收Mo而调节硫和氮的比例的机理。

另外，可推测地上部分表达的MoTR1承担着向叶中分配通过导管从根部输送过来的Mo的作用。已经报导Mo在叶面中的散布对于植物的Mo缺乏是有效的，Mo是通过筛管进行移动的(非专利文献9)。通过调查营养生成后期及生殖生长期中MoTR1的表达模式，可以期待得到解析植物的Mo分配策略的线索。

[MoTR1的相同基因]

以拟南芥的全基因序列(The Arabidopsis Genome Initiative，2000)作为对象，通过BLAST、WU-BLAST2、FASTA(http://www.arabidopsis.org)等各种手段检索与MoTR1的翻译区域具有高相同性的基因时，并不存在被判定为与它们相同且相同性高的基因。另外，目前在细菌及古细菌中鉴别出的Mo传输体均为ABC-type transporter(非专利文献10)，这些序列与MoTR1的相同性低。

另一方面，MoTR1具有与硫酸离子传输体相同的域(Takaha shi，H.，Noji，M.，Hirai，M.Y.and Saito，K.(2003)Molecular regulation of assimilatory sulfur metabolism in plants.Tanpakushitsu Kakusan Koso 48：2121-2129，in Japanese)。通过基因组DNA的序列分析，可以推定拟南芥中至少存在14个硫酸离子传输体，可以认为它们构成了硫酸离子传输体族。高桥等按照序列相同性将该族进一步分为5个组，MoTR1属于组5(Sultr5)。在该分类中，组5由本文中被命名为MoTR1的At2g25680(Sultr5:2)和At1g80310(Sultr5:1)这两种基因构成。该组的基因与其它组基因的相同性比其它4组之间的相同性低(非专利文献17)。另外，还没有确认组5的基因的翻译产物具有硫酸离子传输活性的报导。

因此，MoTR1除了Mo传输能力外还可能具有硫酸离子传输能力。反之，可以认为属于硫酸离子传输体族的其它基因，特别是At1g80310的翻译产物具有Mo传输能力。另外，作为硫酸离子传输体族，其可通过高亲和性的传输体和低亲和性的传输体的巧妙谐调来应付土壤中硫酸离子浓度的变化，从而可以构建不受外部环境影响地使植物体内的硫酸离子浓度保持恒定的机制(非专利文献17)。因此，假如At1g80310是Mo传输体，则在Mo的传输和吸收上，可以通过类似的机理用MoTR1(Sultr5:2)和At1g80310(Sultr5:1)分别作为高亲和型和低亲和型进行协调应对。

工业实用性

如果使用本发明的钼传输体及对其进行编码的钼传输体基因，则可以通过控制植物对钼的吸收来提高生产性，或通过导入动物细胞中来控制细胞的活性，或用于从环境中除去钼。

Claims (9)

1.编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的钼传输体的DNA。

2.编码由序列号1所示的碱基序列或其互补序列构成的钼传输体的DNA。

3.由序列号2所示的氨基酸序列构成的钼传输体。

4.一种重组载体，其特征是，含有权利要求1或2所述的DNA，并且可以表达钼传输体。

5.一种酵母，其特征在于，导入了权利要求4所述的重组载体并且表达钼传输体。

6.一种植物细胞，其特征在于，导入了权利要求4所述的重组载体并且表达钼传输体。

7.添加吸收了钼的权利要求5所述的酵母或权利要求6所述的植物细胞或其粉碎物、干燥物、抽提物、酶处理物的钼强化食品。

8.添加吸收了钼的权利要求5所述的酵母或权利要求6所述的植物细胞或其粉碎物、干燥物、抽提物、酶处理物的钼强化饲料。

9.筛选促进或抑制钼传输体活性的物质的方法，其特征在于，在被检物质的存在下，使MoO₄ ^2-与导入了权利要求4所述的重组载体且表达钼传输体的权利要求5所述的酵母或权利要求6所述的植物细胞进行接触，测定和评价向细胞内吸收钼的程度。

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