JP2007514431A - 改変された成長特性を有する植物、およびその作製方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の、植物における発現を調節すること、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の植物における活性および/またはレベルを調節することによって、植物の成長特性を改変するための方法に関する。本発明はさらに、新規なGRUBXタンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、核酸をコードするGRUBXを含む構築物、および、改変された成長特性を有するトランスジェニック植物であって、GRUBXタンパク質をコードする核酸の、改変された発現を有する植物に関する。
Description
本発明は、植物の成長特性を改善するための方法に関する。より具体的には、本発明は、植物において、GRUBXタンパク質をコードする核酸の発現を調節することによって、ならびに/あるいは、植物におけるGRUBXタンパク質の活性および/またはレベルを調節することによって、植物の成長特性を改善するための方法に関する。本発明はさらに、新たなGRUBXタンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、GRUBXをコードする核酸を含む構築物、そして、GRUBXタンパク質をコードする核酸の、調節された発現、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の、調節された活性および/またはレベルを有する植物に関し、ここで、この植物は、対応する野生型植物と比較して、改善された成長特性を有する。
世界人口が常に増加し、そして農業のために利用可能な土地の面積が縮小するならば、農業の効率を改善し、そして園芸における植物の多様性を増大させることは、農学研究の主要な目的であり続ける。作物および園芸の改良のための従来の手段は、所望の特性を有する植物を同定するための、選択的な育種技術を利用する。しかし、このような選択的な育種技術は、いくつかの欠点を有し、その欠点とはすなわち、これらの技術は代表的には労働集約的であり、そして多くの場合、親の植物から伝えられる所望の特性を常には生じ得ない、異質な遺伝的構成成分を含む植物を生じることである。さらに、所望の特性を提供するための、適切なドナー種は、まれであり得る。分子生物学における進歩は、人類が、動物および植物の生殖質(germplasm)を操作することを可能にした。植物の遺伝工学は、遺伝物質(代表的には、DNAまたはRNAの形態における)の単離および操作、ならびに、この遺伝物質の植物への引き続く導入を必要とする。このような技術は、種々の改善された経済的特性、農学的特性、または園芸学的特性を有する植物の開発につながった。特定の経済的な目的の特性は、例えば高収量のような成長特性である。収量は通常、作物からの経済的価値の、測定可能な結果として定義される。これは、量および/または質によって定義され得る。作物の収量は、植物または作物が受ける代表的なストレスによって、不利に影響を受ける。このようなストレスとしては、非生物的なストレス(例えば、異常な高温または低温に起因する温度ストレス);栄養不足に起因するストレス;水の欠乏または過剰な水(干ばつ、氾濫)に起因するストレス、化学物質(例えば、肥料または殺虫剤)に起因するストレスが挙げられる。代表的なストレスとしてはまた、生物的なストレスが挙げられ、これは、他の植物(雑草、または高密度の植え付けの影響)、動物の疫病(放牧に起因するストレスを含む)、および病原体によって、植物に負わせられ得る。作物の収量は、その作物または植物が受ける、1つ以上のストレスに抗することによってのみ増加し得るのではなく、植物の生来の成長機構を改変することによっても増加し得る。植物の生来の成長機構は、いくつかのレベルにおいて、かつ種々の代謝プロセスによって制御される。このようなプロセスの1つは、ユビキチン媒介性タンパク質分解による、細胞内のタンパク質レベルの制御である。
ユビキチン化は、ユビキチン分子の結合体化による、タンパク質の改変をいう。ユビキチン化という用語は、多くの場合、ユビキチンタンパク質、またはユビキチンの機能を模倣するタンパク質の結合を媒介するプロセスに拡大される。ユビキチン化は、真核生物細胞が、タンパク質の安定性、機能、および細胞内(subcellular)局在性を制御するための、用途の広い手段である。この機構は、タンパク質分解、細胞周期制御、ストレス応答、DNA修復、シグナル伝達、転写調節、および小胞輸送において、中心的な役割を担う。ユビキチン媒介性タンパク質分解は、多くの細胞性プロセスの基本にあるので、高度に制御され、そして高い基質特異性、および下流のエフェクター(effector)における十分な多様性を必要とする。いくつかのユビキチン結合タンパク質が公知である。これらのタンパク質は、多くの場合、モジュール式のドメイン構造を有する。例えば、ユビキチン結合タンパク質は、代表的には、可変性のエフェクタードメインを有するユビキチン結合ドメインと結合する。その場合、ユビキチン結合ドメインを含まないが、ユビキチンと類似する三次構造を有し、従ってユビキチン化の特定の局面を模倣し得る他の物(ユビキチン様ドメイン)が存在する。
ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質に存在する、ユビキチン関連モチーフおよびドメインの数は、より多くのゲノム配列の情報が利用可能になるにつれ、増えつつある。それらのドメインのいくつかのプロトタイプは、例えば、UBA、UBD、UIM、およびUBXである(例えば、Pfamデータベース;非特許文献1を参照のこと)。UBXドメインは、長さが約80アミノ酸残基の配列で、機能未知であり、そして種々の生物体のタンパク質に存在する。これらのタンパク質のほとんどは、ヒトFAF1タンパク質、ヒトp47タンパク質、ヒトY33Kタンパク質、ヒトREP8タンパク質、およびヒトUBXD1タンパク質によって例示される、5つの進化的に保存されたファミリーの1つに属する(非特許文献2;非特許文献3)。代表的には、UBXドメインは、タンパク質のC末端に位置する。
構造的な証拠が、UBXドメインの、ユビキチン関連プロセスにおける機能を示唆する;特に、UBXドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し得る。UBXドメインを含むタンパク質は、普通、主に細胞質内に存在することが予測されるが、他の細胞内局在性もまた報告されている。例えば、多くのタンパク質の活性を調節するために用いられる、特定のタンパク質改変であるリン酸化が、FAF−1の核内への輸送にも影響することが示された(非特許文献4)。
要約すると、動物のUBXを含むタンパク質は、アポトーシス、細胞周期、または分解のためのタンパク質のターゲティングに関連する遺伝子の発現の増強に関与し得ることが、提唱されている。
アラビドプシス(この植物のゲノムは完全に配列決定された)においては、少なくとも15個のUBX含有タンパク質が存在する。これらは、配列類似性に従って、FAF1群、p47群、Y33K群、およびUBXD1群に分類され得るが、REP8に対応する群だけは、植物において存在しないようである(図1を参照のこと)。動物界におけるように、植物のタンパク質におけるUBXドメインは、他のドメイン(例えば、SEP、G6PD、PUG、またはジンクフィンガーのような)と組み合わせて存在する。UBX含有タンパク質、およびこれらのタンパク質のドメイン構造は記載され(非特許文献5を参照のこと)、そして専門化されたデータベース(例えばSMART)を用いた検索によって同定され得る(非特許文献6;非特許文献7)。
PUGドメイン(ペプチド:N−グリカナーゼ、および他の推定核UBXドメイン含有タンパク質内;非特許文献8)は、UBXドメイン(哺乳動物および植物において)、UBAドメイン(植物において)、およびUBCドメイン(プラスモディウム属において)を含む、ユビキチン媒介性タンパク質分解に中心的であるドメインを有するタンパク質内に、同時に存在する。PUG含有タンパク質(例えば、PNGase)は、折り畳まれていないタンパク質の応答、異常なタンパク質を、正常に折り畳まれたタンパク質と区別する、小胞体(ER)の品質管理監視システムにおいて、役割を担うと考えられる。いくつかの場合において、これらの誤って折り畳まれたタンパク質、および/または折り畳まれていないタンパク質は、いわゆるER関連分解機構によって分解されることが示されており、ER関連分解機構は、ユビキチン−プロテアソーム系に関与する(非特許文献9)。PUGドメインの互いに異なる形態はまた、折り畳まれていないタンパク質の応答の初期段階に機能することが公知である、IRE1p型のキナーゼにも存在する(非特許文献10)。
UBXドメインを含む、最近特徴付けられたアラビドプシスのタンパク質が、PUX1である(非特許文献11)。PUX1はアラビドプシス内の単一の遺伝子であって、そして恐らくは植物内で遍在的に発現される。このタンパク質は、AAA型ATPaseであるCDC48の、非競合的インヒビターであることが示された。PUX1は、そのUBXドメインを介して、CDC48の非六量体形態と会合するが、六量体CDC48とは会合しない。PUX1が、活性な六量体CDC48の分解を促進し、そしてこのタンパク質のN末端ドメインが、このプロセスに必要であることが、推定される。pux1ノックアウト植物は、成熟までのより早い発生を示したが、全体的な形態学的異常は有さなかった。PUX1の他に、他の2つのUBXドメイン含有タンパク質である、PUX2およびPUX3が、CDC48と相互作用することが示された(非特許文献11)。PUX2(At2g01650)は、過去に特許文献1において開示された(配列番号1および配列番号2として、それぞれ遺伝子配列およびタンパク質配列が記載される)。
国際公開第03/085115号パンフレット
Batemanら、Nucleic Acids Research(2002)30(1):276−280
Buchbergerら、J.Mol.Biol.(2001)307、17−24
Carim−Toddら、Biochim.Biophys.Acta(2001)1517、298−301
Olsenら、FEBS Lett.(2003)546、218−222
Buchberger、Trends Cell Biol.(2002)12、216−221
Schultzら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95、5857−5864
Letunicら、Nucleic Acids Res(2002)30、242−244
Doerksら、Genome Research(2002)12、47−56
Suzukiら、J.Cell Biol.(2000)149、1039−1052
ShamuおよびWalter、EMBO J.(1996)15、3028−3039
Rancourら、J.Biol.Chem.(2004)オンライン公開10.1074/jbc.M405498200
ここで、GRUBXタンパク質(成長関連UBXドメイン含有タンパク質)をコードする核酸、特に配列番号2によって例示されるGRUBXタンパク質をコードする核酸の、植物内における調節された発現が、改善された成長特性を有する植物を与えることが見出された。従って、本発明の第一の実施形態において、GRUBXタンパク質をコードする核酸の、植物内における発現を調節する工程、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の植物内における活性および/またはレベルを調節する工程を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が、ここで提供される。本発明の好ましい局面に従って、この調節された発現は、増加された発現であり、調節された活性および/またはレベルは、増加された活性および/またはレベルである。必要に応じて、改善された成長特性を有する植物が選択され得る。
GRUBXタンパク質をコードする核酸の調節された発現(増強または減少)、あるいはGRUBXタンパク質自身の活性および/またはレベルの調節は、特定の細胞または組織における、遺伝子の変化された発現、ならびに/あるいは遺伝子産物(すなわちポリペプチド)の変化された活性および/またはレベルから生じ得る。この調節された発現は、内因性のGRUBX遺伝子の変化された発現レベルに起因してもよく、および/または、植物に過去に導入された、GRUBXをコードする核酸の変化された発現に起因してもよい。同様に、GRUBXタンパク質の調節されたレベルおよび/または活性は、内因性のGRUBX遺伝子の変化された発現レベルの結果であってもよく、そして/あるいは、植物に過去に導入された、GRUBXをコードする核酸の変化された発現に起因してもよい。GRUBXタンパク質のレベルに変化がない場合において、またはGRUBXタンパク質のレベルが減少する場合においてさえ、活性は増加され得る。このことは、内因性の性質を変化させることで(例えば、野生型よりも活性な突然変異体を作製することによって)達成され得る。また、調節配列の阻害または刺激、あるいは、GRUBXをコードする天然の遺伝子、またはGRUBXをコードする導入遺伝子の発現を駆動する、新たな調節配列の準備も、包含される。このような調節配列は、植物に導入され得る。例えば、植物に導入される調節配列は、内因性のGRUBX遺伝子の発現を駆動し得るプロモーターであり得る。
遺伝子の発現、ならびにタンパク質の活性および/またはレベルは、遺伝的改変の導入(好ましくは、GRUBX遺伝子の遺伝子座への)によって調節され得る。本明細書中で定義される遺伝子の遺伝子座は、目的の遺伝子、およびコード領域より10kb上流または10kb下流を含む遺伝的領域を意味するようになる。
遺伝的改変は、例えば、以下の方法の任意の1つ(またはそれ以上)によって導入され得る;TDNAアクティベーション、TILLING、位置指定突然変異誘発、相同組換え、あるいは、GRUBXポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の、植物内への導入および発現。遺伝的改変の導入に続いて、GRUBXポリペプチドの増加された活性について選択する工程が続き、ここで活性の増加は、植物に改善された成長特性を有させる。
T−DNAアクティベーションタギング(Hayashiら、Science (1992)1350−1353)は、通常はプロモーターを含むT−DNA(翻訳エンハンサーまたはイントロンでもあり得る)を、このようなプロモーターが標的遺伝子の発現を支配するような配置で、目的の遺伝子の遺伝的領域、あるいは遺伝子のコード領域の10kB上流または10kB下流に挿入することに関連する。代表的には、標的遺伝子の発現の、その遺伝子の天然のプロモーターによる調節が破壊され、そしてその遺伝子は、新たに導入されたプロモーターに制御されるようになる。このプロモーターは、代表的にはT−DNA内に埋め込まれる。このT−DNAは、例えば、Agrobacterium感染を介して、植物のゲノム中にランダムに挿入され、そして挿入されたT−DNAの近傍の遺伝子の過剰発現を導く。生じるトランスジェニック植物は、導入されたプロモーターに近接する遺伝子の過剰発現に起因して、優性の表現型を示す。導入されるべきプロモーターは、所望の生物(この場合は植物)において遺伝子の発現を支配し得る任意のプロモーターであり得る。例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、全て、T−DNAアクティベーションにおける使用に適している。
遺伝的改変はまた、TILLING(ゲノム内標的化誘導性局所領域(Targeted Induced Local Lesions IN Genomes))の技術を用いて、GRUBX遺伝子の遺伝子座に導入され得る。これは、GRUBX活性を示し得る、GRUBX核酸の突然変異改変体を産生および/または同定、ならびに最終的には単離するために有用な、突然変異誘発技術である。TILLINGはまた、このような突然変異改変体を持つ植物の選抜を可能とする。これらの突然変異改変体はなお、その天然の形態の遺伝子によって示されるよりも、高いGRUBX活性を示し得る。TILLINGは、高密度な突然変異誘発を、ハイスループットなスクリーニング方法と組み合わせる。TILLINGに続く工程は、代表的には:
(a)EMS突然変異誘発(C Koncz、N−H Chua、J Schell編、Methods in Arabidopsis Research.World Scientific、Singapore、pp 16−82における、RedeiおよびKoncz(1992);EM Meyerowitz、CR Somerville編、Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、pp 137−172における、Feldmannら(1994);J Martinez−Zapater、J Salinas編、Methods on Molecular Biology、第82巻、Humana Press、Totowa、NJ、pp 91−104における、LightnerおよびCaspar(1998));
(b)個体のDNA調製およびプール;
(c)目的の領域のPCR増幅;
(d)ヘテロ二重鎖の形成を可能にする、変性およびアニーリング;
(e)プールにおけるヘテロ二重鎖の存在が、クロマトグラムの追加のピークとして検出される、DHPLC;
(f)変異個体の同定;ならびに
(g)変異PCR産物の配列決定
である。TILLINGの方法は、当該分野で周知である(McCallum、Nat Biotechnol.2000年4月;18(4);455−7、Stemple、Nature Rev.Genet.5、145−150、2004)。
(a)EMS突然変異誘発(C Koncz、N−H Chua、J Schell編、Methods in Arabidopsis Research.World Scientific、Singapore、pp 16−82における、RedeiおよびKoncz(1992);EM Meyerowitz、CR Somerville編、Arabidopsis.Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、pp 137−172における、Feldmannら(1994);J Martinez−Zapater、J Salinas編、Methods on Molecular Biology、第82巻、Humana Press、Totowa、NJ、pp 91−104における、LightnerおよびCaspar(1998));
(b)個体のDNA調製およびプール;
(c)目的の領域のPCR増幅;
(d)ヘテロ二重鎖の形成を可能にする、変性およびアニーリング;
(e)プールにおけるヘテロ二重鎖の存在が、クロマトグラムの追加のピークとして検出される、DHPLC;
(f)変異個体の同定;ならびに
(g)変異PCR産物の配列決定
である。TILLINGの方法は、当該分野で周知である(McCallum、Nat Biotechnol.2000年4月;18(4);455−7、Stemple、Nature Rev.Genet.5、145−150、2004)。
位置指定突然変異誘発は、GRUBX活性(例えば、陽イオン輸送活性)を保持する、GRUBX核酸またはその部分の改変体を産生するために用いられ得る。位置指定突然変異誘発を達成するためのいくつかの方法が使用可能であり、最も一般的なのはPCRに基づく方法である(例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Wiley編、http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.htmlを参照のこと)。
TDNAアクティベーション、TILLING、および位置指定突然変異誘発は、GRUBXの機能を保持する、GRUBXの新規な対立遺伝子およびGRUBXの改変体を産生し得、それゆえ、本発明の方法において有用である技術の例である。
相同組換えは、選択された核酸を、ゲノム中に、明確に選択された位置に導入することを可能にする。相同組換えは、下等生物(例えば、酵母、およびコケであるPhyscomitrella)についての生物科学において通常用いられる標準的な技術である。植物において相同組換えを行うための方法は、モデル植物について(Offringaら(1990)EMBO J.9、3077−3084)だけでなく、作物植物(例えば、イネ(Teradaら、(2002)Nature Biotechnol.20、1030−1034;または、IidaおよびTerada(2004)Curr.Opin.Biotechnol.15、132−138))についても記載されている。標的とされるべき核酸(本明細書中で前に定義したように、GRUBX核酸分子でもその改変体でもよい)は、GRUBX遺伝子の遺伝子座を標的とされる必要は無いが、例えば、高発現領域に導入され得る。標的とされるべき核酸は、内因性の遺伝子を置き換えるために用いられる、改善された対立遺伝子であっても、内因性の遺伝子に加えて導入されてもよい。
GRUBX遺伝子の発現を調節するために、あるいはGRUBXタンパク質の活性および/またはレベルを調節するために好ましいアプローチは、GRUBXタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする、単離された核酸配列を植物中に導入する工程を包含する。この核酸は、例えば形質転換によって、植物中に導入され得る。従って、本発明の好ましい局面に従って、GRUBXコード核酸の植物中への導入、および発現を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
用語GRUBXタンパク質は、本明細書中で定義される場合、少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインも含むタンパク質をいう。好ましくは、このGRUBXタンパク質は、構造的にヒトUBXD1タンパク質(SPTrEMBL AAH07414)と関連される。好ましくは、このGRUBXタンパク質は植物由来である。さらに好ましくは、このGRUBXタンパク質はナス科由来であり、より好ましくは、このGRUBXはNicotiana tabacum由来のタンパク質であり、最も好ましくは、このGRUBXは、配列番号2で表されるタンパク質であるか、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントであり、ここで、これらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントは、配列番号2の生物学的活性と類似した生物学的活性を有する。しかし、Zea mays由来のGRUBXタンパク質、Saccharum officinarum由来のGRUBXタンパク質(配列番号4)、Oryza sativa由来のGRUBXタンパク質(配列番号7)、パンコムギ種由来のGRUBXタンパク質、オオムギ種由来のGRUBXタンパク質、およびモロコシ種由来のGRUBXタンパク質を含む、単子葉植物に由来するGRUBXタンパク質が、これらの配列は配列番号2に関連されるので(図1bを参照のこと)、本発明の方法において同様に良好に用いられ得ることが理解されるべきである。
このようなGRUBXタンパク質をコードする核酸が、本発明で用いられるようにプロラミンプロモーターの制御下で、イネにおいて発現される場合、GRUBXタンパク質の活性の1つは、種子収量を増加させることであり、特に収穫指数を増加させることである。都合の良いことに、GRUBXタンパク質は、Rancourら(2004)において記載された条件下において、植物のCDC48タンパク質と相互作用し得る。
Nicotiana tabacumのGRUBXタンパク質が、SMARTツールによって分析され、そしてPfam(Version 11.0、2003年11月;Batemanら(2002)Nucl.Acids.Res.30、276−280)およびInterProデータベース(Release 7.0、2003年7月22日;Mulderら(2003)Nucl.Acids.Res.31、315−318)をスクリーニングするために用いられた。GRUBXタンパク質は、UBXドメイン(PF00789、SM00166、IPR001012)およびPUGドメイン(SM00580、IPR006567)を含む。InterProにおいて定義される場合、UBXドメインはユビキチン調節タンパク質において見い出され、このユビキチン制御タンパク質は、FAF−1(FAS−関連因子1)、ヒトRep−8再生(reproduction)タンパク質、および酵母に由来するいくつかの仮想タンパク質を含む、多数の他のタンパク質とならんで、ユビキチン化経路のメンバーである。アラビドプシスにおいては、このドメインを含むことが予測される、約20個のタンパク質が存在する。PUGドメインは、タンパク質キナーゼ、N−グリカナーゼ、および真核生物における他の核タンパク質において見い出され、そしてタンパク質−タンパク質相互作用に(総説として、SuzukiおよびLennarz(2003)Biochem Biophys Res Commun.302、1−5、およびBiochem Biophys Res Commun.303、732を参照のこと)、およびRNA結合に(Doerksら、2002)関与すると推定される。PUGドメインは、アラビドプシスのタンパク質において、多くの場合UBAドメインまたはUBXドメインと共に見出される(Doerksら、2002)。SMARTデータベース(Software Version 4.0、2003年9月15日に配列データベースをアップデート)において定義されるように、UBXドメインおよびPUGドメインについてのコンセンサスな配列を、図2aに示す;図2bは、配列番号2およびSPTrEMBL Q9ZU93の、それぞれUBXドメインおよびPUGドメインを示す;図2cはこれらの2つのタンパク質のBLASTアラインメントを示す;そして、図2dおよび図2eは、それぞれ、配列番号2と配列番号4との間のアラインメント、および、配列番号4と配列番号7との間のアラインメントを示す。PUGドメインとUBXドメインが示される。
必要に応じて、GRUBXタンパク質にジンクフィンガードメインが存在し得る。InterProに定義されるように、ジンクフィンガードメインは、Xenopus laevis転写因子TFIIIAにおいて最初に同定された、核酸結合タンパク質構造である。これらのドメインは、それ以来、多くの核酸結合タンパク質において見出されている。ジンクフィンガードメインは、C−2−C−12−H−3−H型モチーフ内に、2つの保存されたCys残基、および2つの保存されたHis残基を含む、25〜30アミノ酸残基から構成される。第2のCysと第1のHisを分ける12残基は、主に極性かつ塩基性であり、このことは、この領域が核酸結合に関与することを示す。ジンクフィンガーモチーフは、異常に短く、自己フォールディングするドメインであって、その三次構造にはZnが重大な構成要素である。ジンクフィンガードメインは、四面体アレイ内のZn原子に結合し、その結果、核酸の主溝においてヌクレオチドと相互作用し得る、指のような突起を形成する。Znは、保存されたCys残基およびHis残基と結合する。指は、核酸を含む、グアニン残基の短いひと続きの、約5塩基対に結合することが見出され、そしてRNAおよびDNAの両方に結合する能力を有する。従って、ジンクフィンガーは、新奇な核酸結合タンパク質を表し得る。Znを中心に持つドメインが、タンパク質相互作用(例えば、タンパク質キナーゼC)に用いられ得ることもまた示唆された。ジンクフィンガーの多くのクラスは、亜鉛原子の空間的な配置に関与するヒスチジン残基およびシステイン残基の数および位置に従って、特徴付けられる。特徴付けられた第一のクラス(C2H2(IPR007087)と呼ばれる)において、亜鉛を配位する残基の最初の対は、システインからなり、一方で第二の対はヒスチジンからなる。別のジンクフィンガードメイン(IPR006642)は、Saccharomyces cerevisiaeのタンパク質であるRad18において見出される型のものであり得る。ここでも、ジンクフィンガードメインは、推定核酸結合配列である。しかしながら、本明細書中で定義される場合のGRUBXタンパク質における任意のジンクフィンガードメインは、C2H2型にもRad18型にも限定されず、ジンクフィンガードメインの任意の型であり得る。
本明細書中で定義される場合、用語GRUBX核酸/遺伝子は、GRUBXタンパク質をコードする任意の核酸、またはその相補体をいう。この核酸は、この核酸が植物で発現される場合、GRUBX核酸/遺伝子の調節された発現、あるいは、GRUBXタンパク質の調節された活性および/またはレベルにつながるとの条件で、任意の天然の供給源または人工的な供給源に、(直接的または間接的(引き続いて改変される場合)のいずれかで)由来し得る。この核酸は、微生物的な供給源(例えば、細菌、酵母、または真菌)から単離されても、植物、藻類、または動物(ヒトを含む)の供給源から単離されてもよい。好ましくは、この核酸は真核生物に由来する。好ましくは、このGRUBX核酸は植物起源であり、さらに好ましくは、単子葉植物起源または双子葉植物起源であり、より好ましくは、このGRUBX核酸は、ナス科に由来するGRUBXタンパク質をコードし、さらにより好ましくは、このGRUBX核酸は、Nicotiana tabacum由来の核酸配列であり、最も好ましくは、このGRUBX核酸は、配列番号1によって表されるような核酸配列、またはその機能的部分、あるいはそれとハイブリダイズし得る核酸配列であり、このハイブリダイズする配列は、GRUBXタンパク質活性(すなわち、配列番号1の生物学的活性と類似する生物学的活性)を有するタンパク質をコードし、そしてまた、配列番号2によって表されるアミノ酸配列、あるいは、そのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸も包含する。あるいは、GRUBXタンパク質をコードする核酸は、イネ科、好ましくはOryza sativaに由来し得る。この核酸は、その天然の形態から、慎重なヒトの操作を介して、組成物および/または遺伝的環境に、実質的に改変され得る。この核酸配列は、好ましくは、相同な核酸配列(すなわち、構造的に、および/または機能的に関連した核酸配列)であり、好ましくは、同じ植物種に由来するか、または異なる植物種に由来して、植物から得られる。
用語「機能的部分」とは、GRUBXタンパク質と同じ生物学的活性を保持し、そしてUBXドメインを有し、そして好ましくはさらにPUGドメインを有し、そして必要に応じてジンクフィンガードメインを有するポリペプチドをコードする、GRUBX遺伝子の一部分をいう。用語「GRUBX核酸/遺伝子」はまた、遺伝暗号の縮重に起因する、GRUBXタンパク質をコードする核酸の改変体、GRUBXをコードする核酸の対立遺伝子改変体、GRUBXをコードする核酸の種々のスプライシング改変体、および、1つ以上の介在性配列によって中断された改変体を包含する。
都合の良いことに、本発明の方法はまた、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列(例えば、配列番号1によって表される配列)の部分を用いて、あるいは、好ましくはストリンジェントな条件下において、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする配列(このハイブリダイズする配列は、GRUBX活性を有するタンパク質をコードする)を用いて、あるいは、GRUBXタンパク質(例えば、配列番号2に記載の配列)のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを用いて、あるいは、これらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸を用いて、実行され得る。
GRUBXタンパク質(例えば、配列番号2に表されるもの)のホモログは、種々の真核生物において見出され得る。最も近縁のホモログは、一般に植物界において見出される。Arabidopsis thalianaゲノムは、少なくとも15個のGRUBXタンパク質を有するようであり、ここで、SPTrEMBL Q9ZU93およびQ8LGE5に寄託された配列(MIPS番号At2G01650、またはGenBank AY084317およびAAM60904)のホモログが、配列番号2に最も近いホモログであり、配列番号2の、他の適切なホモログとしては、配列番号3に表される核酸にコードされる、Saccharum officinarum由来の配列番号4、Oryza sativa由来の配列番号7(配列番号6に表される核酸配列によってコードされる)、および、Pinus taedaに由来する、GenBank登録番号BQ198347およびBF778922が挙げられる。
GRUBXホモログを検索し、そして同定するための方法は、十分に当業者の範囲内である。このような方法は、配列のアラインメントまたは比較のための分野において周知であるアルゴリズム(例えば、GAP(NeedlemanおよびWunsch、J.Mol.Biol.48、443−453(1970))、BESTFIT(SmithおよびWatermanの局所相同性アルゴリズム(Advances in Applied Mathematics 2、482−489(1981))を用いる)、BLAST(Altschul,S.F.、Gish,W.、Miller,W.、Myers,E.W.およびLipman,D.J.、J.Mol.Biol.215、403−410(1990))、FASTA、およびTFASTA(W.R.PearsonおよびD.J.Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85、2444−2448(1998)))を用いた、コンピューターで読み取り可能な形式の、配列番号1または配列番号2によって表される配列の、公共データベース(例えば、MIPS(Munich Information Center for Protein Sequences)(http://mips.gsf.de/)、GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)、またはEMBLヌクレオチド配列データベース(http://www.ebi.ac.uk/embl/index.html))において利用可能な配列との比較を包含する。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、米国生物工学情報センターを介して、公共に利用可能である。上記のホモログは、blastのデフォルトのパラメーター(例えば、BLASTNプログラムの高度な選択肢:G−Cost(ギャップを開くため)=5;E−Cost(ギャップを拡張するため)=2;q−Penalty(不一致のため)=−3;r−Reward(一致のため)=1;e−期待値(E)=10.0;W−ワードサイズ=11;TBLASTNプログラムの高度な選択肢:G−Cost(ギャップを開くため)=11;E−Cost(ギャップを拡張するため)=1;e−期待値(E)=10.0;W−ワードサイズ=3)を用いて同定された。より多くのゲノムが配列決定されつつあるので、さらに多くのGRUBXホモログが同定可能になることが期待される。
配列番号6によって表される配列は、これまでは未知であった。従って、本発明の二番目の実施形態において、以下:
(a)配列番号6によって表される核酸配列、またはその相補鎖;
(b)配列番号7によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列;
(c)上記の(i)または(ii)の核酸配列と(好ましくはストリンジェントな条件下において)ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は、好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列;
(d)遺伝暗号の結果として縮重された、上記の(i)〜(iii)に記載の核酸配列;
(e)(a)〜(d)に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸;
(f)(a)〜(e)に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸;
(g)(a)〜(f)に定義された配列のうちの任意の1つ以上と、75.00%、80.00%、85.00%、90.00%、95.00%、96.00%、97.00%、98.00%、または99.00%の配列同一性を有する核酸配列;
(h)上記の(a)〜(g)のうちの任意の1つに記載の核酸配列の一部分であって、この一部分は好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、一部分
を含む単離された核酸配列が提供される。
(a)配列番号6によって表される核酸配列、またはその相補鎖;
(b)配列番号7によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列;
(c)上記の(i)または(ii)の核酸配列と(好ましくはストリンジェントな条件下において)ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は、好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列;
(d)遺伝暗号の結果として縮重された、上記の(i)〜(iii)に記載の核酸配列;
(e)(a)〜(d)に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸;
(f)(a)〜(e)に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸;
(g)(a)〜(f)に定義された配列のうちの任意の1つ以上と、75.00%、80.00%、85.00%、90.00%、95.00%、96.00%、97.00%、98.00%、または99.00%の配列同一性を有する核酸配列;
(h)上記の(a)〜(g)のうちの任意の1つに記載の核酸配列の一部分であって、この一部分は好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、一部分
を含む単離された核酸配列が提供される。
配列番号4によって表される配列は、4つのEST配列(CA154270、CA144028、BQ535511、およびCA184742)から組み立てられ、そしてこれまでは未知であった。従って、以下:
(i)配列番号4において与えられるポリペプチド;
(ii)配列番号7において与えられるポリペプチド;
(iii)配列番号4または配列番号7において与えられるアミノ酸配列と、少なくとも40.00%の配列同一性を、好ましくは50.00%の配列同一性、60.00%の配列同一性、70.00%の配列同一性を、より好ましくは80%の配列同一性または90%の配列同一性を、最も好ましくは95.00%の配列同一性。96.00%の配列同一性、97.00%の配列同一性、98.00%の配列同一性、または99.00%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(iv)少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、および必要に応じてジンクフィンガードメインを含むポリペプチド;
(v)(i)〜(iv)の内の任意のものに定義されるタンパク質のホモログ、誘導体、免疫学的に活性な、および/または機能的なフラグメント
からなる群より選択される、単離されたGRUBXタンパク質が提供され、ただし、このポリペプチド配列は、配列番号2によって表される配列でも、データベースの見出し項目であるQ9ZU93、AAR01744、Q9D7L9、Q9BZV1、Q99PL6、ENSANGP00000020442、Q7SXA8、Q9V8K8、Q96IK9、ENSRNOP00000037228、またはAAH07414でもない。
(i)配列番号4において与えられるポリペプチド;
(ii)配列番号7において与えられるポリペプチド;
(iii)配列番号4または配列番号7において与えられるアミノ酸配列と、少なくとも40.00%の配列同一性を、好ましくは50.00%の配列同一性、60.00%の配列同一性、70.00%の配列同一性を、より好ましくは80%の配列同一性または90%の配列同一性を、最も好ましくは95.00%の配列同一性。96.00%の配列同一性、97.00%の配列同一性、98.00%の配列同一性、または99.00%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(iv)少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、および必要に応じてジンクフィンガードメインを含むポリペプチド;
(v)(i)〜(iv)の内の任意のものに定義されるタンパク質のホモログ、誘導体、免疫学的に活性な、および/または機能的なフラグメント
からなる群より選択される、単離されたGRUBXタンパク質が提供され、ただし、このポリペプチド配列は、配列番号2によって表される配列でも、データベースの見出し項目であるQ9ZU93、AAR01744、Q9D7L9、Q9BZV1、Q99PL6、ENSANGP00000020442、Q7SXA8、Q9V8K8、Q96IK9、ENSRNOP00000037228、またはAAH07414でもない。
用語GRUBXは、配列番号2において示される、GRUBXと相同なタンパク質を含む。従って、本発明の方法において用いられるのに好ましいホモログは、少なくともUBXドメインを含み、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを含む。GRUBXタンパク質の「ホモログ」は、改変されていない当該タンパク質と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および/またはアミノ酸挿入を有し、そして、由来する改変されていないタンパク質と類似した生物学的活性および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。このようなホモログを産生するためには、タンパク質のアミノ酸は、類似した性質(例えば、類似した、疎水性、親水性、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成または破壊する性質)を有する他のアミノ酸で置換され得る。保存的置換の表は、当該分野で周知である(例えば、Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Companyを参照のこと)。
本発明の方法において有用なホモログは、改変されていないタンパク質と、少なくとも40.00%の配列同一性または類似性(機能的な同一性)を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも50.00%の配列同一性または類似性を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも60.00%の配列同一性または類似性を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも70.00%の配列同一性または類似性を有する。代表的には、このホモログは、改変されていないタンパク質と、少なくとも80%の配列同一性または類似性を有し、改変されていないタンパク質と、好ましくは少なくとも85.00%の配列同一性または類似性を、さらに好ましくは少なくとも90.00%の配列同一性または類似性を、最も好ましくは、改変されていないタンパク質と、少なくとも95.00%の配列同一性または類似性、少なくとも96.00%の配列同一性または類似性、少なくとも97.00%の配列同一性または類似性、少なくとも98.00%の配列同一性または類似性、または少なくとも99.00%の配列同一性または類似性を有する。同一性の割合は、アラインメントプログラム(例えばGAP)を用いて計算され得る。比較的低い配列相同性(約40.00%程度の低さ)であるように見受けられ得ても、少なくともUBXドメインを有する、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを有する、そしてさらに必要に応じてジンクフィンガードメインを有する、全ての全長タンパク質を有するGRUBXタンパク質は、構造上、高度に保存される。従って、他の植物種におけるGRUBXタンパク質は、容易に発見され得る(イネおよびサトウキビの、上記の新規な配列によって証拠付けられるように)。
相同なタンパク質は、「タンパク質ファミリー」に分類され得る。タンパク質ファミリーは、機能的類似性分析および配列類似性分析(例えば、Clustal W)によって定義され得る。GRUBXと相同なタンパク質の近接結合法系統樹がClustal Wプログラムによって生成され得、そしてその構造的な関係および祖先関係の良い概観を与える(例えば、Vector NTI Suite 5.5、Informaxで作製した、図1aおよび図1bを参照のこと)。本発明の特定の実施形態において、GRUBXのホモログは、配列番号2に対応するタンパク質と同じタンパク質ファミリーに属する。
アラビドプシスのゲノムにおいて、GRUBXタンパク質の好ましいファミリーのメンバーが同定された(Q9ZU93、GenBank Refseq NM_126226)。他の植物(例えば、イネ、サトウキビ、または他の単子葉植物)においてもまた、GRUBXタンパク質のファミリーのメンバーが、上記に示したように同定された。都合の良いことに、これらのファミリーのメンバーもまた、本発明の方法において有用である。
相同性の2つの特別な形態である、オーソロガスおよびパラロガスは、遺伝子の祖先関係を記載するために用いられる、進化的な概念である。用語「パラロガス」は、ある種のゲノムに含まれる、1つ以上の遺伝子重複の結果として生じる相同な遺伝子をいう。用語「オーソロガス」は、これらの遺伝子の祖先関係に起因する異なる生物における相同な遺伝子をいう。本明細書中で用いられる場合、用語「ホモログ」はまた、本発明の方法において有用なタンパク質のパラログおよびオーソログを包含する。オーソロガスな遺伝子は、例えばBLASTプログラムを用いて、目的の照会遺伝子で、1つ以上の遺伝子データベースを照会することで同定され得る。次いで、この検索の結果から生じる最も順位の高い対象遺伝子を、再びBLAST分析にかけて、照会遺伝子と再び一致する対象遺伝子のみが、真のオーソロガスな遺伝子として保持される。例えば、イネにおけるオーソログが検索される場合、目的の配列は、NCBIにおいて利用可能な、Oryza sativa Nipponbare由来の28,469個の全長cDNAクローンに対してblast検索される。ヌクレオチドから始める場合には、BLASTnまたはtBLASTXが、あるいは、タンパク質から始める場合には、BLASTPまたはTBLASTNが、標準のデフォルト値で使用され得る。blastの結果は、フィルター処理され得る。次いで、フィルター処理された結果またはフィルター処理されていない結果のいずれかの全長配列が、目的の配列が由来する生物(この場合、Nicotiana tabacum)の配列に対してブラストバック(blast back)(第二のblast検索)される。次いで、第一のblast検索および第二のblast検索の結果が比較される。第二のblast検索の結果が、最も類似性の高いヒットとして、照会GRUBX核酸またはGRUBXポリペプチドを与える場合、オーソログが見つけられる。特定の照会配列について、GRUBXのパラログと最も高いヒットが見つけられる場合、このような照会配列もまた、GRUBX活性を有し、そして少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、ならびに必要に応じてジンクフィンガードメインも含むとき、GRUBXのホモログと見なされる。生じた配列がClustalWで分析され、そして近接結合法系統樹として可視化される場合、この結果はさらに精密にされる。この方法は、多くの異なる種におけるオーソログを同定する際に使用され得る。
関連するタンパク質の群に含まれる、機能的なオーソログを同定するためのさらなる方法は、このタンパク質ファミリーのメンバーの発現パターンおよび組織分布を決定することであり、それによって、同じ組織に存在し、そして類似した発現パターンを有する配列は、関連する機能を遂行することが予測される。タンパク質の機能的なホモログを同定するためのさらなる方法は、類似する保存的ドメイン構造を有する配列を同定することによる。同じドメインを保持し、そして特に、そのドメインの分布が保存される場合、そのタンパク質は、類似した機能を遂行することが予測される。従って、化学的構造および調節(発現パターン、組織特異性)における類似性は、GRUBXの機能的なホモログを同定するために有用であり得る。
GRUBXの「ホモログ」は、改変されていないタンパク質と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、および/またはアミノ酸欠失を有するタンパク質を包含する。
タンパク質の「置換改変体」は、アミノ酸配列の少なくとも1残基が除かれ、そして異なる残基がその場所に挿入されるタンパク質である。アミノ酸置換は、代表的には単一の残基のものであるが、そのポリペプチド上におかれる機能的な制約に依存して密集され得;挿入は、通常約1アミノ酸残基〜10アミノ酸残基程度であり、そして欠失は、約1残基〜20残基の範囲である。好ましくは、アミノ残置換は保存的アミノ酸置換を含む。
タンパク質の「挿入改変体」は、タンパク質の予め決められた部位に、1つ以上のアミノ酸残基が導入されるタンパク質である。挿入は、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸の、アミノ末端融合および/またはカルボキシ末端融合、ならびに配列内挿入を含み得る。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシ末端融合よりも小さく、ほぼ1残基〜10残基程度である。アミノ末端融合タンパク質またはペプチド、あるいはカルボキシ末端融合タンパク質またはペプチドの例としては、酵母ツーハイブリッド系にて用いられる転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、(ヒスチジン)6−タグ、グルタチオンS−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインA、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、Tag−100エピトープ、c−mycエピトープ、FLAG(登録商標)−エピトープ、lacZ、CMP(カルモジュリン結合ペプチド)、HAエピトープ、プロテインCエピトープ、およびVSVエピトープが挙げられる。
タンパク質の「欠失改変体」は、タンパク質からの1つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。タンパク質のアミノ酸改変体は、当該分野で周知のペプチド合成技術(例えば、固相ペプチド合成など)を用いて、または組換えDNA操作によって、容易に作製され得る。タンパク質の置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体を産生するための、DNA配列を操作するための方法は、当該分野で周知である。例えば、DNA内の予め決められた部位に置換突然変異を作製するための技術は、当業者にとって周知であり、M13突然変異誘発、T7−Gen in vitro mutagenesis(USB、Cleveland、OH)、QuickChange Site Directed mutagenesis(Stratagene、San Diego、CA)、PCR媒介性位置指定突然変異誘発、または他の位置指定突然変異誘発プロトコルが挙げられる。
用語「誘導体」とは、タンパク質の天然に存在する形態のアミノ酸配列(例えば、配列番号2または配列番号4に示されるような)と比較して、置換、欠失、または天然に存在するアミノ酸残基および天然には存在しないアミノ酸残基の付加を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素をいう。GRUBXの「改変体」は、そのポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、天然に存在する変化したアミノ酸残基、グリコシル化したアミノ酸残基、アシル化したアミノ酸残基、または天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。改変体はまた、由来するアミノ酸配列と比較して、1つ以上の非アミノ酸置換(例えば、レポーター分子または他のリガンドであって、結合したレポーター分子がアミノ酸配列の検出を促進するように、そのアミノ酸配列に共有結合的に、または非共有結合的に結合する、レポーター分子または他のリガンド、および、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然には存在しないアミノ酸残基)を含み得る。
GRUBXタンパク質の「活性なフラグメント」は、タンパク質の、少なくとも80個の連続するアミノ酸残基を包含し、この残基は、天然に存在するタンパク質と類似した生物学的活性および/または機能的活性を保持する。この活性なフラグメントは、少なくともUBXドメインを含み、好ましくはこの活性なフラグメントはUBXドメインおよびPUGドメインを含む。
都合の良いことに、本発明の方法はまた、GRUBX活性を保持するポリペプチドをコードする、DNAまたは核酸配列の部分を用いて実行され得る。DNA配列の部分とは、本来の(より大きな)DNA分子に由来する、またはこれから調製されるDNAの一片をいい、このDNA部分は、植物内で発現される場合、改善された成長特性を有する植物を生じる。この部分は少なくとも200ヌクレオチドを含み、そして少なくともUBXドメインをコードする配列を含み、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインをコードする配列を含み、そして必要に応じてジンクフィンガードメインをコードする配列を含む。一部分は、例えば、GRUBX核酸分子に1つ以上の欠失を作製することで、調製され得る。この部分は、付加的な制御エレメントを有する、または付加的な制御エレメントを有さない多くの遺伝子を含んでもよく、単にスペーサー配列などのみを含んでもよい。この部分は、単離された形態であってもよく、あるいは、例えば、いくつかの活性(その内の1つは、植物内でプロラミンプロモーターの制御下で発現される場合、種子の収量を増加させる)を併せるタンパク質を産生するために、他のコード配列(または非コード配列)と融合されてもよい。好ましくは、この部分は、配列番号1、配列番号3、または配列番号6のうちの任意の1つである。
本発明はまた、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列を包含し、この核酸配列もまた、本発明の方法の実行に有用であり得る。本明細書中で定義される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。このハイブリダイゼーションのプロセスは、全体として溶液中で起こり得る(すなわち、両方の相補的な核酸が溶液中にある)。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR;およびこれに基づく全ての方法)差引きハイブリダイゼーション、ランダムプライマー伸長法、ヌクレアーゼS1マッピング、プライマー伸長法、逆転写法、cDNA合成、RNAのディファレンシャルディスプレイ、およびDNA配列決定が挙げられる。このハイブリダイゼーションプロセスはまた、マトリックス(例えば、磁性ビーズ、セファロースビーズ、または他の任意の樹脂)に固定される相補的な核酸の1つと共に起き得る。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、ポリ(A+)mRNAの単離が挙げられる。このハイブリダイゼーションプロセスはさらに、固体支持体に固定される(例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜、あるいは、例えば写真平板によって、例えば珪質ガラス(siliceous glass)支持体に固定される(後者は、核酸アレイまたはマイクロアレイとして、あるいは核酸チップとして公知である))相補的な核酸の1つと共に起き得る。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、RNAおよびDNAのゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションが起こるためには、核酸分子は一般的に、二本鎖が2つの単鎖に融解し、そして/または、短鎖の核酸からヘアピンまたは他の二次構造を除くために、温度的にまたは化学的に変性される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、条件(例えば、温度、塩濃度、およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成)によって影響される。
高い選択性を必要とする適用のために、当業者は、代表的には、ハイブリッドを形成するために、比較的ストリンジェントな条件を用いることを望み、例えば、比較的低量の塩および/または高温の条件(例えば、約50℃〜約70℃の温度にて、約0.02M〜約0.15MのNaClによって提供されるような)を選択する。従って、ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシーな条件は、高温および/または低塩濃度(塩としては、NaClおよびNa3−クエン酸が挙げられる)を含むが、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの含有、および/または、ハイブリダイゼーション緩衝液中の化合物(例えばSDS(ドデシル硫酸ナトリウム))濃度の低下、および/または、ハイブリダイゼーション緩衝液からの化合物(例えば、硫酸デキストラン、またはポリエチレングリコール(分子の集合を促進する))の排除によっても影響を受け得る。十分に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、前出の、本発明のDNA配列に相同な核酸の単離に、特に好ましい。相同性に寄与する要素としては、対立性、遺伝暗号の縮重、および好ましいコドン使用頻度の相違が挙げられる。
核酸ハイブリダイゼーション実験(例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション)の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存的であり、そして異なる環境パラメーターのもとで異なる。例えば、配列が長いほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。Tmは、完全に一致するプローブに対して、標的配列の50%がハイブリダイズする、定義されたイオン強度およびpHのもとでの温度である。特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション洗浄後の機能である。このような洗浄の重要な因子としては、最後の洗浄溶液のイオン強度および温度が挙げられる。
一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびpHのもとでの、特異的な配列についての温度融点(thermal melting point)(Tm)よりも約50℃低いように選択される。Tmは、完全に一致するプローブに対して、標的配列の50%がハイブリダイズする、定義されたイオン強度およびpHのもとでの温度である。Tmは、溶液の条件およびプローブの塩基組成に依存し、そして以下の式:
Tm=79.8℃+(18.5×log[Na+])+(58.4℃×%[G+C])−(820×(二重鎖内の#bp)−1)−(0.5×%ホルムアミド)
を用いて計算され得る。
Tm=79.8℃+(18.5×log[Na+])+(58.4℃×%[G+C])−(820×(二重鎖内の#bp)−1)−(0.5×%ホルムアミド)
を用いて計算され得る。
より好ましいストリンジェントな条件は、温度がTmより20℃低い場合であり、最も好ましいストリンジェントな条件は、温度がTmより10℃低い場合である。また、非特異的な結合は、多数の公知の技術(例えば、タンパク質含有溶液による膜のブロッキング、ハイブリダイゼーション緩衝液への異質なRNA、DNA、およびSDSの添加、および、RNaseによる処理)のうちの任意の1つを用いて制御され得る。
洗浄条件は、代表的には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにおいて、またはそれ以下で行われる。一般的には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、または遺伝子増幅検出手順に適切な、ストリンジェントな条件は、上記に示したとおりである。よりストリンジェントな、またはよりストリンジェントでない条件もまた選択され得る。
ストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、Sambrookら(2001)Molecular Cloning:a laboratory manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、CSH、New York、または、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.(1989)に、参照が都合よく作製され得る。低いストリンジェンシー条件の例は、37℃〜45℃にて、2〜3時間、4〜6×SSC/0.1〜0.5%w/vのSDSである。ハイブリダイゼーションに関与する核酸の供給源および濃度に依存して、異なるストリンジェンシーの条件(例えば、中間のストリンジェント条件)が用いられ得る。中間のストリンジェント条件の例としては、45℃以上にて、2〜3時間、1〜4×SSC/0.25%w/vのSDSが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、60℃にて、1〜3時間、0.1〜1×SSC/0.1%w/vのSDSが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間に変化され得、ストリンジェンシー条件を維持するか変えるかのどちらかである、種々のパラメーターを知っている。例えば、別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、65℃にて4×SSCでのハイブリダイゼーション、続いて65℃にて約1時間、0.1×SSC内での洗浄である。あるいは、別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、42℃にて、50%ホルムアミド、4×SSCである。なお別の、ストリンジェントな条件の例としては、6×SSC、0.05×BLOTTO内で62℃でのハイブリダイゼーション、および2×SSC、0.1%w/vのSDSで、62℃での洗浄が挙げられる。
本発明の方法はまた、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体を用いて行われ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「選択的スプライシング改変体」は、選択されたイントロンおよび/またはエキソンが切除、置換、または付加された、核酸配列の改変体を包含する。このような改変体は、タンパク質の生物学的活性が影響を受けないままであるものであり、このことは、そのタンパク質の機能的なセグメントを選択的に保持することで達成され得る。このようなスプライシング改変体は、天然で見つかっても、合成であってもよい。このようなスプライシング改変体を作製する方法は、当該分野で周知である。従って、本発明の別の局面において、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体の、植物内における発現を調節する工程、ならびに/あるいは、この選択的スプライシング改変体によってコードされるGRUBXタンパク質の活性および/またはレベルを調節する工程を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。好ましくは、このスプライシング改変体は、配列番号1によって表される配列のスプライシング改変体である。
都合の良いことに、本発明の方法はまた、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体、好ましくは配列番号1によって表される配列の対立遺伝子改変体を用いて行われ得る。対立遺伝子改変体は天然に存在し、そして本発明の方法に包含されるのは、これらの天然の対立遺伝子の使用である。対立遺伝子改変体は、一塩基多型(SNP)、および小挿入/欠失多型(Small Insertion/Deletion Polymorphism)(INDEL)を包含する。INDELの大きさは、通常100bp未満である。SNPおよびINDELは、ほとんどの生物の、天然に存在する多型株における、配列改変体の最大のセットを形成する。
特定の従来の育種計画における(例えば、マーカーに補助される育種における)これらの対立遺伝子改変体の使用もまた、本発明に包含され;このことは、本発明の方法における対立遺伝子改変体の使用に加えてであり得る。このような育種計画は、時々、植物の突然変異誘発性処理による、植物における対立遺伝子改変体の導入を必要とする。1つの適切な突然変異誘発方法は、EMS突然変異誘発である。次いで、対立遺伝子改変体の同定が、例えばPCRによって行われ得る。このことに、該当するGRUBX配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜のための選抜工程が続き、そしてこの対立遺伝子改変体は、植物における改善された成長特性を引き起こす。選抜は、代表的には、該当する配列の異なる対立遺伝子改変体(例えば、配列番号1の、異なる対立遺伝子改変体)を含む植物の成長能力をモニターすることで行われる。成長能力のモニターは、温室で行われても、圃場で行われてよい。さらなる必要に応じた工程としては、優れた対立遺伝子改変体が同定された植物を、別の植物と交配させる工程が挙げられる。このことは、例えば、興味のある表現型特性の組み合わせを作製するために用いられ得る。このように、GRUBX遺伝子の突然変異は天然に起こり得るので、これらは、より高い収量を示す植物の選抜のための基本を形成し得る。従って、本発明の別の局面において、改善された成長特性を有する植物を選抜するための方法であって、植物における改善された成長特性を生じさせる、GRUBX配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜に基づく方法が提供される。
本発明の方法はまた、(天然の、または人工の)染色体(例えば、細菌人工染色体(BAC))の少なくとも一部分を植物に導入することによって行われ得て、この染色体は、少なくとも、GRUBXタンパク質をコードする遺伝子/核酸配列(例えば、配列番号1または配列番号3)を、好ましくは、1つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバー、ならびに/あるいは、GRUBXの発現および/または活性の調節タンパク質をコードする核酸配列と共に含む。従って、本発明のさらなる局面において、少なくともGRUBXタンパク質をコードする少なくとも遺伝子/核酸を含む染色体の、少なくとも一部分を植物中に導入することによって、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
本発明の別の局面において、育種計画内で、GRUBXタンパク質をコードする核酸による優位性が得られ得る。この核酸配列は、少なくともGRUBXタンパク質をコードする核酸配列、および好ましくは1つ以上の関連するファミリーのメンバーも含む、染色体またはその一部分上に存在し得る。このような育種計画の例において、植物内においてGRUBXタンパク質をコードする核酸の発現の調節を可能とする遺伝子であって、GRUBXタンパク質自身をコードする遺伝子であっても、GRUBXタンパク質をコードする遺伝子の発現、および/またはGRUBXタンパク質自身の活性に、直接的にまたは間接的に影響を与え得る、他の任意の遺伝子であってもよい遺伝子と、遺伝的に連鎖し得るDNAマーカーが同定される。次いで、このDNAマーカーは、改善された成長特性を有する植物を選抜するために、育種計画において用いられ得る。
従って、本発明は、育種計画における、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の使用にわたる。
GRUBX核酸またはその改変体、あるいはGRUBXポリペプチドまたはそのホモログは、GRUBX遺伝子またはその改変体と遺伝的に連鎖し得るDNAマーカー、所望の形質、または量的形質遺伝子座(QTL)が同定される育種計画において、用途を見出し得る。この所望形質またはQTLは、所望の形質に影響を与える単一の遺伝子、または連鎖した遺伝子の集団を含み得る。GRUBXまたはその改変体、あるいはGRUBXまたはそのホモログは、分子マーカーを定義するために用いられ得る。次いで、このDNAマーカーまたはタンパク質マーカーは、改善された成長特性を有する植物を選抜するために、育種計画において用いられ得る。GRUBX遺伝子またはその改変体は、例えば、配列番号1によって表される核酸であっても、上記で言及したホモログのうちの任意のものをコードする核酸であってもよい。
また、GRUBXの対立遺伝子改変体は、マーカーで補助される育種計画において用途を見出し得る。このような育種計画は、時々、例えばEMS突然変異誘発を用いる植物の突然変異誘発性処理によって、対立遺伝子変化の導入を必要とし;あるいは、この計画は、いわゆる「天然の」起源(故意のものでない原因の)の対立遺伝子変化の収集から始め得る。次いで、対立遺伝子改変体の同定が、例えばPCRによって行われる。このことに、該当する配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜のための選抜工程が続き、この対立遺伝子改変体は、植物における改善された成長特性(例えば増加した収穫指数)を引き起こす。選抜は、代表的には、該当する配列の異なる対立遺伝子改変体(例えば、配列番号1の、または、上記で言及した植物ホモログのうちの任意のものをコードする核酸の、異なる対立遺伝子改変体)を含む植物の成長能力をモニタリングすることで行われる。成長能力は、温室または圃場でもモニタリングされる。さらなる必要に応じた工程としては、増加したGRUBX活性を生じる、優れた対立遺伝子改変体が同定された植物を、別の植物と交配させる工程が挙げられる。このことは、例えば、興味のある表現型特性の組み合わせを作製するために用いられ得る。
また、GRUBX核酸またはその改変体は、このGRUBX核酸またはその改変体が一部分である遺伝子を、遺伝的におよび物理的にマッピングするためのプローブとして、ならびに、これらの遺伝子と連鎖する形質についてのマーカーとして使用され得る。このような情報は、所望の表現型を有する株を開発するために、植物育種において有用であり得る。GRUBX核酸またはその改変体のこのような使用は、長さが少なくとも10ヌクレオチドの核酸配列のみを必要とする。GRUBX核酸またはその改変体は、制限断片長多型(RFLP)マーカーとして使用され得る。制限酵素消化した植物のゲノムDNAのサザンブロットは、GRUBX核酸またはその改変体によってプローブされ得る。次いで、生じるバンドパターンが、遺伝地図を作製するために、コンピュータープログラム(例えば、MapMaker(Landerら(1987)Genomics 1、174−181))を用いて遺伝的分析に供され得る。さらに、この核酸は、定義された遺伝的交配の親および子孫を代表する個体のセットの、制限エンドヌクレアーゼ処理したゲノムDNAを含むサザンブロットをプローブするために用いられ得る。この集団を用いて過去に得られた遺伝地図(Botsteinら(1980)Am.J.Hum.Genet.32、314−331)における、GRUBX核酸またはその改変体の位置を計算するために、DNA多型の分離が記述され、そして用いられる。
遺伝的マッピングにおける使用のための、植物遺伝子由来のプローブの生成および使用は、BematzkyおよびTanksley(Plant Mol.Biol.Reporter 4、37−41、1986)に記載される。多くの刊行物が、上記に概説した方法論またはその改変を用いた、特定のcDNAクローンの遺伝的マッピングを記載する。例えば、F2交雑集団、戻し交配集団、ランダムに交配した集団、近隣同質遺伝子系統(near isogenic line)、および個体の他のセットが、マッピングに用いられ得る。このような方法論は、当業者にとって周知である。
また、核酸プローブが、物理的マッピング(すなわち、物理的地図上への配列の配置;Non−mammalian Genomic Analysis:A Practical GuideにおけるHoheiselら、Academic press、1996、pp.319−346、およびそこに引用される参考文献を参照のこと)のために用いられ得る。
別の実施形態において、この核酸プローブは、直接的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)マッピングにおいて用いられ得る(Trask(1991)Trends Genet.7、149−154)。FISHマッピングの現在の方法は、大きなクローン(数kb〜数百kb;Laanら(1995)Genome Res.5、13−20を参照のこと)の使用に好都合であるが、感度における改善が、より短いプローブを用いるFISHマッピングの実行を可能とし得る。
遺伝的マッピングおよび物理的マッピングの、種々の核酸増幅に基づいた方法が、この核酸を用いて行われ得る。例としては、対立遺伝子特異的増幅(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med.11、95−96)、PCR増幅フラグメントの多型(CAPS;Sheffieldら(1993)Genomics 16、325−332)、対立遺伝子特異的ライゲーション(Landegrenら(1988)Science 241、1077−1080)、ヌクレオチド伸長反応(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18、3671)、放射線ハイブリッドマッピング(Walterら(1997)Nat.Genet.7、22−28)、およびハッピーマッピング(Happy Mapping)(DearおよびCook(1989)Nucleic Acid Res.17、6795−6807)が挙げられる。これらの方法について、増幅反応またはプライマー伸長反応における使用のためのプライマー対を設計し、そして生成するために、この核酸配列が用いられる。このようなプライマーの設計は、当業者にとって周知である。PCRに基づく遺伝的マッピングを用いる方法において、マッピング交配の親の間の、即時の核酸配列に対応する領域におけるDNA配列の相違を同定することが必要であり得る。しかしながら、このことは一般的には、マッピング方法に不要である。
このようにして、変化されたGRUBX活性を有し、改善された成長特性を示す、改善された植物の生成、同定、および/または単離が行われ得る。
本発明の別の特長に従って、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の、植物内における発現を調節する工程、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質のレベルおよび/または活性を調節する工程を包含し、ここで、上記核酸配列および上記タンパク質は、以下:
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体であるか、またはスプライシング改変体によってコードされる、上記のGRUBXタンパク質;
(ii)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体であるか、または対立遺伝子改変体によってコードされる、上記のGRUBXタンパク質;
(iii)GRUBXタンパク質をコードし、そして人工染色体の少なくとも一部分上に含まれる核酸配列であって、この人工染色体はまた、好ましくは、1つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバーを含む、核酸配列;
(iv)GRUBXをコードする核酸の機能的部分;
(v)GRUBXをコードする核酸にハイブリダイズし得る配列;
(vi)GRUBXタンパク質のホモログ、誘導体、および活性なフラグメント
から選択される改変体を含む、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体であるか、またはスプライシング改変体によってコードされる、上記のGRUBXタンパク質;
(ii)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体であるか、または対立遺伝子改変体によってコードされる、上記のGRUBXタンパク質;
(iii)GRUBXタンパク質をコードし、そして人工染色体の少なくとも一部分上に含まれる核酸配列であって、この人工染色体はまた、好ましくは、1つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバーを含む、核酸配列;
(iv)GRUBXをコードする核酸の機能的部分;
(v)GRUBXをコードする核酸にハイブリダイズし得る配列;
(vi)GRUBXタンパク質のホモログ、誘導体、および活性なフラグメント
から選択される改変体を含む、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
本発明の好ましい局面に従って、核酸の増強された発現または増加された発現が構想される。遺伝子または遺伝子産物の増強された発現または増加された発現を得るための方法は、当該分野で良く記述されており、そして、例えば、(強力な)プロモーターに駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして役立つ単離された核酸は、GRUBX核酸またはその改変体の発現を上方制御するように、ポリヌクレオチドの非相同的na形態の、適切な部位(代表的には上流)に導入され得る。例えば、内因性のプロモーターが、突然変異、欠失、および/または置換によってインビボで変化させられても(Kmiec、米国特許第5,565,350号;Zarlingら、PCT/US93/03868号を参照のこと)、単離されたプロモーターが、本発明の遺伝子の発現を制御するように、本発明の遺伝子と適切な配向および距離で、植物細胞に導入されてもよい。好ましくは、本発明に有用な核酸は、植物または植物細胞内で過剰発現される。本明細書中で用いられる場合、用語過剰発現とは、本来の野生型の発現レベルに付加的である発現の任意の形態を意味する。好ましくは、植物に導入されるべき核酸、および/または、植物内で過剰発現されるべき核酸は、作動可能に連結されるプロモーターに関してセンス方向である。好ましくは、過剰発現されるべき核酸はGRUBXタンパク質をコードし、さらに好ましくは、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列は双子葉植物から単離され、好ましくはナス科から単離され、さらに好ましくは、ここでこの配列はNicotiana tabacumから単離され、最も好ましくは、この核酸配列は配列番号1またはその一部分によって表されるか、あるいは、配列番号2によって表されるアミノ酸配列、または、そのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。あるいは、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列は、MIPS番号At2g01650、配列番号3もしくは配列番号6によって表されるか、またはそれらの一部分であるか、あるいは、Q9ZU93、配列番号4もしくは配列番号7によって表されるアミノ酸配列をコードするか、またはそれらのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。本発明の適用性は、配列番号1によって表される核酸の使用にも、配列番号2のアミノ酸配列をコードする核酸配列に基づくものでもないが、配列番号2のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする他の核酸配列、または配列番号1の部分、または配列番号1とハイブリダイズする配列が、本発明の方法において用いられ得ることが、注意されるべきである。特に、本発明の方法に有用な核酸は、少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインも含むタンパク質をコードする。
本発明のさらなる実施形態に従って、本発明に従った方法において有用なヌクレオチド配列の導入および/または発現を促進する遺伝子構築物およびベクターが提供される。従って、本発明の第三の実施形態に従って、以下:
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸;
(ii)(i)の核酸配列の発現を調節し得る、1つ以上の調節配列;および、必要に応じて、
(iii)転写終結配列
を含む遺伝子構築物が、GRUBXタンパク質をコードする上記の核酸が、GenBank登録番号AX927140において表される核酸でない場合に、提供される。
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸;
(ii)(i)の核酸配列の発現を調節し得る、1つ以上の調節配列;および、必要に応じて、
(iii)転写終結配列
を含む遺伝子構築物が、GRUBXタンパク質をコードする上記の核酸が、GenBank登録番号AX927140において表される核酸でない場合に、提供される。
本発明に従った方法において有用な構築物は、当業者に周知である組換えDNA技術を用いて作製され得る。この遺伝子構築物は、市販され得る、植物形質転換に適切でかつ目的の遺伝子の形質転換細胞における発現に適切なベクターに挿入され得る。この遺伝子構築物は、原核生物宿主細胞および/または真核生物宿主細胞における発現を可能にする、1つ以上の調節配列に、核酸配列が作動可能に連結された発現ベクターであり得る。
本発明の好ましい実施形態に従って、この遺伝子構築物は、核酸配列を過剰発現するように設計された発現ベクターである。この核酸配列は、GRUBXタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列(例えば、本明細書中で前に記載された核酸配列のうちの任意のもの)であり得る。好ましい核酸配列は、配列番号1によって表される配列、もしくはその一部分、もしくはそれにハイブリダイズし得る配列、または配列番号2によって表される配列をコードする核酸配列、もしくはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される配列をコードする核酸配列である。好ましくは、この核酸は、作動可能に連結される調節配列に関してセンス方向にクローン化される。
植物は、目的の配列(すなわち、GRUBXタンパク質をコードする核酸の発現を調節し得る核酸配列)を含むベクターを形質転換され、この配列は、1つ以上の調節配列(少なくともプロモーター)に作動可能に連結される。用語「調節エレメント」「調節配列」および「プロモーター」は、全て本明細書中で交換可能に用いられ、そして、連結される配列の発現に影響し得る、調節核酸配列をいうように、広い文脈の中で解釈されるべきである。上述の用語によって包含されるのは、古典的な真核生物ゲノム遺伝子に由来する転写調節配列(正確な転写開始に必要なTATAボックスを、CCAATボックス配列と共に、または含まずに、含む)、ならびに、発達的な刺激および/または外部的な刺激に応答して、あるいは組織特異的な様式で、遺伝子発現を変化させる、付加的な調節エレメント(すなわち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー)である。古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列もまた、この用語の範囲内に含まれ、この場合、−35ボックス配列、および/または−10ボックス転写調節配列を含み得る。用語「調節エレメント」はまた、細胞、組織、または器官における核酸分子の発現を与える、活性化する、または増強する、合成的な融合分子または誘導体を包含する。本明細書中で用いられる場合、用語「作動可能に連結された」とは、プロモーター配列が、目的の遺伝子の転写を開始し得るような、プロモーター配列と目的の遺伝子との間の機能的な連結をいう。
都合の良いことに、任意の型のプロモーターが、所望の結果に依存する核酸配列の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、単子葉植物(例えば、イネまたはトウモロコシ)において活性であるプロモーターが挙げられる。
好ましくは、GRUBXタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し得る核酸配列は、種子優先プロモーターに作動可能に連結される。本明細書中で定義される場合、用語「種子優先」とは、種子組織において主に発現されるプロモーターをいうが、この組織に排他的である必要は無い。用語「種子優先」は、種子において活性である全てのプロモーターを包含する。種子組織は、胚乳、アリューロン、または胚を含む、種子の任意の部分を包含する。好ましくは、この種子優先プロモーターはプロラミンプロモーター、あるいは、類似した強さのプロモーターおよび/または類似した発現パターンを有するプロモーターである。最も好ましくは、プロラミンプロモーターは、配列番号5の発現カセットにおけるヌクレオチド1〜654によって表される。プロモーターの強さおよび/または発現パターンは、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子と結合すること、および植物の種々の組織における、このレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによって分析され得る。当業者に周知である1つの適切なレポーター遺伝子は、細菌性のβ−グルクロニダーゼである。他の種子優先プロモーターの例を表1に示し、そしてこれらのプロモーターは、本発明の方法にとって有用である。
(表1:本発明の実行において用いるための種子優先プロモーターの例)
また、必要に応じて、1つ以上の終結配列が、植物に導入される構築物内において用いられ得る。用語「終結」は、一次転写物の3’プロセシングおよびポリアデニル化、ならびに転写の終止を合図する、転写単位の末端におけるDNA配列である調節配列を包含する。付加的な調節エレメントとしては、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが挙げられ得る。当業者は、本発明の実行において用いるために適切であり得る終結配列およびエンハンサー配列に気付く。このような配列は公知であるか、当業者によって容易に得られ得る。
本発明の遺伝子構築物はさらに、特定の細胞型における維持および/または複製に必要な、複製起点の配列を含み得る。1つの例は、遺伝子構築物が、エピソーム様遺伝的エレメント(例えば、プラスミド分子またはコスミド分子)として細菌細胞内で維持されるために必要な場合である。好ましい複製起点としては、f1−oriおよびcolE1が挙げられるが、これらに限定されない。
この遺伝子構築物は、必要に応じて、選択的マーカー遺伝子を含み得る。本明細書中で用いられる場合、用語「選択的マーカー遺伝子」は、本発明の核酸構築物をトランスフェクトまたは形質転換された細胞の同定および/または選別を促進するために、発現される細胞に表現型を与える任意の遺伝子を含む。適切なマーカーは、抗生物質耐性または除草剤耐性を与えるか、新規の代謝特性を導入するか、または視覚的な選択を可能にするマーカーから選択され得る。選択的マーカー遺伝子の例としては、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子(例えば、ネオマイシンおよびカナマイシンをリン酸化するnptII、またはハイグロマイシンをリン酸化するhpt)、除草剤に対する耐性を与える遺伝子(例えば、Bastaに対する耐性を提供するbar;グリフォセートに対する耐性を提供するaroAまたはgox)、または代謝特性を提供する遺伝子(例えば、マンノースを単独の炭素源として植物に利用させるmanA)が挙げられる。視覚的なマーカー遺伝子は、色(例えば、β−グルクロニダーゼ、GUS)、発光(例えばルシフェラーゼ)、または蛍光(緑色蛍光タンパク質、GFPおよびその誘導体)の形成を生じる。
好ましい実施形態において、上記で言及したような遺伝子構築物は、好ましくは種子優先プロモーター(例えば、イネプロラミンプロモーター)であるプロモーターと結合されたGRUBXをセンス方向に含む。従って、本発明の別の局面は、プロラミンプロモーター、Nicotiana tabacum GRUBX遺伝子、およびT−zein+T−rubiscoδGA転写終結配列を含む、配列番号5と本質的に類似した発現カセットを含むベクター構築物である。配列番号5と本質的に類似する配列は、配列番号2と相同なタンパク質をコードするか、または配列番号1にハイブリダイズする第一の核酸配列を包含し、この第一の核酸配列は、プロラミンプロモーターまたは類似した発現パターンを有するプロモーターと作動可能に連結され、加えて、または代わりに、この第一の核酸は転写終結配列と連結される。
従って、本発明の別の局面に従って、以下:
(i)配列番号1によって表される核酸配列、またはその相補鎖;
(ii)配列番号2によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列;
(iii)上記の(i)または(ii)の核酸配列と(好ましくはストリンジェントな条件下において)ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は好ましくは、GRUBXタンパク質活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列;
(iv)遺伝暗号の結果として縮重される、上記の(i)〜(iii)に記載の核酸配列;
(v)(i)〜(iv)に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸配列;
(vi)(i)〜(v)に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸配列
を含む群から選択される、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列が配置される発現カセットを含む、核酸構築物が提供される。
(i)配列番号1によって表される核酸配列、またはその相補鎖;
(ii)配列番号2によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列;
(iii)上記の(i)または(ii)の核酸配列と(好ましくはストリンジェントな条件下において)ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は好ましくは、GRUBXタンパク質活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列;
(iv)遺伝暗号の結果として縮重される、上記の(i)〜(iii)に記載の核酸配列;
(v)(i)〜(iv)に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸配列;
(vi)(i)〜(v)に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸配列
を含む群から選択される、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列が配置される発現カセットを含む、核酸構築物が提供される。
また、本発明は、本発明に従った方法によって獲得可能な植物を包含する。従って、本発明は、本発明に従った方法によって獲得可能な植物を提供し、この植物は改善された成長特性を有し、そしてこの植物は、変化されたGRUBXタンパク質活性および/またはレベル、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質をコードする核酸の変化された発現を有するが、このGRUBXタンパク質は、GenBank登録番号AX927140によって表される核酸配列によってはコードされない。
従って、本発明の第四の実施形態に従って、本発明の核酸分子の植物内への導入および発現を包含する、改善された成長特性を有するトランスジェニック植物の産生のための方法が提供される。
より具体的には、本発明は、改善された成長特性を有するトランスジェニック植物の産生方法を提供し、この方法は:
(a)植物または植物細胞に、GRUBXタンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする核酸配列、それとハイブリダイズし得る核酸配列、またはその一部分を導入する工程;
(b)植物の成長を促進する条件下において上記の植物細胞を培養する工程
を包含する。
(a)植物または植物細胞に、GRUBXタンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする核酸配列、それとハイブリダイズし得る核酸配列、またはその一部分を導入する工程;
(b)植物の成長を促進する条件下において上記の植物細胞を培養する工程
を包含する。
GRUBXタンパク質自身、および/またはGRUBX核酸自身は、植物細胞に直接導入されても、植物自身に直接導入されても(組織、器官、または植物の他の任意の部分への導入を含む)よい。本発明の好ましい特徴に従って、この核酸は好ましくは形質転換によって植物に導入される。好ましくは、この核酸は配列番号1によって表されるか、またはその一部分またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、あるいは、配列番号2またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表されるアミノ酸配列をコードする核酸である。あるいは、この核酸配列は、MIPS番号At2g01650、配列番号3、配列番号6のいずれかによって、またはその一部分によって、または上述の配列のうちの任意のものにハイブリダイズし得る配列によって表される。あるいは、このアミノ酸配列は、SPTrEMBL Q9ZU93、GenBank登録番号AAR01744、配列番号4、配列番号7のうちの任意のものによって、あるいは、それらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントによって表される配列であり得る。
本明細書中でいわれる場合、用語「形質転換」は、外因性のポリヌクレオチドの宿主細胞への移行を、移行のために用いられる方法に無関係に、包含する。器官形成によってであれ、胚形成によってであれ、引き続くクローン増殖の可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築物を形質転換され得、そしてそこから植物全体が再生される。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって利用可能な、かつ最も適したクローン増殖系に依存して変化する。例示的な組織標的としては、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織(例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根端分裂組織)、および誘導性分裂組織(例えば、子葉分裂組織、および胚軸分裂組織)が挙げられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に一過性に導入されても、安定的に導入されてもよく、そして非組み込み的に(例えば、プラスミドとして)維持されてもよい。あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。次いで、生じるトランスジェニック植物細胞は、当業者に公知の様式で、トランスジェニック植物を再生するために用いられ得る。
植物種の形質転換は、現在ではかなり慣例的な技術である。都合の良いことに、いくつかの形質転換方法のうちの任意のものが、目的の遺伝子を適切な祖先細胞に導入するために用いられ得る。形質転換方法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーションの使用、遊離のDNAの取り込みを増加させる化学物質、DNAの植物への直接的な注入、パーティクルガンボンバードメントの使用、ウイルスまたは花粉を用いる形質転換、およびマイクロプロジェクション(microprojection)の使用が挙げられる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム/ポリエチレングリコール法(Krens,F.A.ら、1882、Nature、296、72−74;Negrutiu I.ら、1987年6月、Plant Mol.Biol.8、363−373);プロトプラストのエレクトロポレーション(Shillito R.D.ら、1985、Bio/Technol、3、1099−1102);植物材料へのマイクロインジェクション(Crossway A.ら、1986、Mol.Gen Genet、202、179−185);DNAまたはRNA被覆粒子ボンバードメント(Klein T.M.ら、1987、Nature、327、70)(非組み込み的な)ウイルスによる感染などから選択され得る。GRUBX遺伝子を発現する形質転換イネ植物は、好ましくは、イネの形質転換のための周知の方法(例えば以下のうちの任意のものに記載される:公開された欧州特許出願EP 1198985 A1、AldemitaおよびHodges(Planta、199、612−617、1996);Chanら(Plant Mol.Biol.22(3)491−506、1993)、Hieiら(Plant J.6(2)271−282、1994)、これらの開示は、その全体が示されるかのように、本明細書中で参考として援用される)のうちの任意のものを用いる、アグロバクテリウム媒介性形質転換を介して産生される。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、Ishidaら(Nat.Biotechnol.1996年6月;14(6):745−50)またはFrameら(Plant Physiol.2002年5月;129(1):13−22)のいずれかに記載されるようなものであり、これらの開示は、その全体が示されるかのように、本明細書中で参考として援用される。
一般的には、形質転換の後、植物細胞または細胞分類が、目的の遺伝子と共に同時に移行された、植物が発現できる遺伝子によってコードされる、1つ以上のマーカーの存在について選択され、続いて形質転換された材料が植物全体に再生される。
DNA移行および再生に続いて、形質転換されたことが推定される植物は、例えばサザンブロット分析を用いて、目的の遺伝子の存在、コピー数、および/またはゲノムの組織化(genomic organisation)について評価され得る。あるいは、または加えて、新たに導入されたDNAの発現レベルが、ノーザン分析および/またはウエスタン分析を用いてモニタリングされ得、両方の技術は、当業者にとって周知である。
作製された形質転換植物は、種々の手段(例えば、クローン増殖または古典的な育種技術)によって増殖され得る。例えば、第一世代(すなわちT1)のトランスジェニック植物は、自家受粉して同型接合の第二世代(すなわちT2)形質転換体を生じ、そしてこのT2植物はさらに、古典的な育種技術を通して増殖され得る。
作製された形質転換生物は、種々の形態をとり得る。例えば、これらは、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞とのキメラ;クローンの形質転換体(例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換される);形質転換された組織と形質転換されていない組織との接木(例えば、植物において、形質転換された台木が形質転換されていない接ぎ穂に接木される)であり得る。
本発明は明白に、本明細書中で記載された方法のうちの任意のものによって作製された、任意の植物細胞または植物、ならびに、全ての植物の部分、その零余子、および子孫に広がる。本発明はさらに、上述の方法のうちの任意のものによって作製された、一次的な、形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞、組織、器官、または植物全体の子孫を包含する範囲に及び、唯一の必要条件は、その子孫が、本発明に従った方法による親によって提供される遺伝子型特性および/または表現型特性と同じ遺伝子型特性および/または表現型特性を示すことである。また、本発明は、GRUBXタンパク質をコードする、単離された核酸分子を含む宿主細胞を含む。本発明に従った好ましい宿主細胞は植物細胞である。従って、本発明はまた、改善された成長特性を有する宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、またはトランスジェニック植物を包含し、これらの成長特性は、この宿主細胞、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞が、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の増加した発現、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の増加した活性および/またはレベルを有するという点で特徴付けられる。
本発明はまた、植物の収穫可能な部分(例えば、種子、葉、果実、花、茎または茎培養物、根茎、根、塊茎、および鱗茎)、ならびに、それに直接的に由来する生産物(例えば、乾燥ペレットまたは乾燥粉末、油、脂質および脂肪酸、デンプン、またはタンパク質)に及ぶが、これらに限定されない。
本明細書中で用いられる場合、用語「植物」は、植物全体、植物の祖先および子孫、植物の部分、植物細胞、植物組織、および植物器官を包含する。従って、用語「植物」はまた、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、花、果実、種子、根(根茎および塊茎を含む)、苗条、鱗茎、茎、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を包含する。本発明の方法に特に有用な植物としては、藻類、シダ類、Viridiplantae上科に属する全ての植物が挙げられ、特に、Abelmoschus亜種、Acer亜種、Actinidia亜種、Agropyron亜種、Allium亜種、Amaranthus亜種、Ananas comosus、Annona亜種、Apium graveolens、Arabidopsis thaliana、Arachis亜種、Artocarpus亜種、Asparagus officinalis、Avena sativa、Averrhoa carambola、Benincasa hispida、Bertholletia excelsea、Beta vulgaris、Brassica亜種、Cadaba farinosa、Camellia sinensis、Canna indica、Capsicum亜種、Carica papaya、Carissa macrocarpa、Carthamus tinctorius、Carya亜種、Castanea亜種、Cichorium endivia、Cinnamomum亜種、Citrullus lanatus、Citrus亜種、Cocos亜種、Coffea亜種、Cola亜種、Colocasia esculenta、Corylus亜種、Crataegus亜種、Cucumis亜種、Cucurbita亜種、Cynara亜種、Daucus carota亜種、Desmodium亜種、Dimocarpus longan、Dioscorea亜種、Diospyros亜種、Echinochloa亜種、Eleusine coracana、Eriobotrya japonica、Eugenia uniflora、Fagopyrum亜種、Fagus亜種、Ficus carica、Fortunella亜種、Fragaria亜種、Ginkgo biloba、Glycine亜種、Gossypium hirsutum、Helianthus亜種、Hibiscus亜種、Hordeum亜種、Ipomoea batatas、Juglans亜種、Lactuca sativa、Lathyrus亜種、Lemna亜種、Lens culinaris、Linum usitatissimum、Litchi chinensis、Lotus亜種、Luffa acutangula、Lupinus亜種、Macrotyloma亜種、Malpighia emarginata、Malus亜種、Mammea americana、Mangifera indica、Manihot亜種、Manilkara zapota、Medicago sativa、Melilotus亜種、Mentha亜種、Momordica亜種、Morus nigra、Musa亜種、Nicotiana亜種、Olea亜種、Opuntia亜種、Ornithopus亜種,Oryza亜種、Panicum miliaceum、Passiflora edulis、Pastinaca sativa、Persea亜種、Petroselinum crispum、Phaseolus亜種、Phoenix亜種、Physalis亜種、Pinus亜種、Pistacia vera、Pisum亜種、Poa亜種、Populus亜種、Prosopis亜種、Prunus亜種、Psidium亜種、Punica granatum、Pyrus communis、Quercus亜種、Raphanus sativus、Rheum rhabarbarum、Ribes亜種、Rubus亜種、Saccharum亜種、Sambucus亜種、Secale cereale、Sesamum亜種、Solanum亜種、Sorghum bicolor、Spinacia亜種、Syzygium亜種、Tamarindus indica、Theobroma cacao、Trifolium亜種、Triticosecale rimpaui、Triticum亜種、Vaccinium亜種、Vicia亜種、Vigna亜種、Vitis亜種、Zea mays、Zizania palustris、Ziziphus亜種、他を含む一覧から選択される、飼料(fodder)または飼料(forage)のマメ科植物、観賞用植物、食用作物、木、または低木を含む、単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。
本発明の好ましい特徴に従って、上記の植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、菜種、または綿を含む作物植物である。さらに好ましくは、本発明に従った植物は単子葉植物(例えば、サトウキビ)であり、最も好ましくは、穀類(例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ(sorghum)またはカラスムギ)である。しかし、公知の真核生物のGRUBXホモログの内のドメイン保存性は、細胞の代謝において、等しく保存された機能を示唆するので、本発明の方法が広範囲の植物に適用され得ると考えられる。
都合の良いことに、本発明に従った方法の実行は、種々の改善された成長特性を有する植物を生じ、このような改善された成長特性としては、それぞれ対応する野生型の植物と比較して、改善された成長、改善された収量および/または改善された生物体量、改変された構造、および改変された細胞分裂が挙げられる。
本発明は、植物の成長特性を改善する方法、または改善された成長特性を有する植物を作製する方法に関連し、ここで上記の成長特性は、以下:増加した収量、増加した生物体量、増加した総地上部分(above ground area)、増加した植物の高さ、増加した腋芽数、増加した第一円錐花序の数、増加した第二円錐花序の数、増加した総種子数、増加した詰まった種子数、植物あたりの増加した総種子収量、増加した種子生物体量、増加した種子の大きさ、増加した種子の体積、増加した収穫指数、増加した千粒重(TKW)、変化された生活環時間(cycling time)および/または変化した成長曲線から選択される任意の1つ以上を含む。本発明はまた、上記で言及した成長特性の1つを、他の成長特性の1つに対する不利を引き起こすことなく、変化する方法(例えば、同じ数の詰まった種子および同じ種子収量を保持する一方での、地上の緑色組織部分の増加)を提供する。
用語「増加した収量」は、対応する野生型の植物の生物体量と比較して、植物の1つ以上の部分における生物体量の増加を包含する。この用語はまた種子収量の増加を包含し、種子収量の増加は、それぞれ、対応する野生型植物と比較して、種子の生物体量(種子重量)の増加、および/または(詰まった)種子の数の増加、および/または種子の大きさの増加、および/または種子の体積の増加を包含する。トウモロコシについては、種子収量の増加は、穂あたりの(種子の)列の増加、および/または列あたりの穀粒の数の増加に反映され得る。稲を例に取る場合、収量の増加は、以下:ヘクタールまたはエーカーあたりの植物の数、植物あたりの円錐花序の数、円錐花序あたりの小穂の数、円錐花序あたりの花の数の1つ以上における増加、特に、詰まった種子の割合の増加によって明らかにされ得る。種子の大きさおよび/または体積の増加はまた、種子の組成に影響し得る。種子収量の増加は、花の数および/または大きさの増加に起因し得る。収量の増加はまた、総生物体量を収穫可能な部分(例えば種子)の収量で割った割合として表される収穫指数;または千粒重を増加させうる。増加した収量はまた、高密度での植栽の能力(ヘクタールまたはエーカーあたりの植物の数)を包含する。
用語「改変された細胞分裂」は、細胞分裂の増加または減少、あるいは異常な細胞の分裂/細胞質分裂、変化した分裂面、変化した細胞極性、変化した細胞分化を包含する。この用語はまた、核内分裂、母性効果変異(acytokinesis)、倍数性、多糸性、および核内倍加のような現象を包含する。
増加した生物体量および高さを有する植物は、対応する野生型の植物と比較される場合、改変された成長速度を示すと考えられ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「改変された成長速度」は、植物の生活環における1つ以上のステージにおいて、植物の1つ以上の部分(緑色生物体量を包含し、そして種子を包含する)における、より速い成長の速度を包含するが、これに限定されない。用語「改変された成長」は、増強された活力、より早い開花、改変された生活環時間を包含する。成長速度が十分に増加される場合、結果として生じる、より短い生活環時間が、一度の通常の成長期間内でのさらなる収穫を可能にし得る。いくつかの植物の場合、同じ根茎からの収穫のさらなる回数も、可能となり得る。植物の収穫周期の改善は、(任意の特定の植物が成長され得、そして収穫され得る回数(約一年)の数の増加に起因して)エーカーあたりの一年間の生物体量生産の増加につながり得る。作物の生長のための土地の制限は、植栽の時点(早い時期)または収穫の時点(遅い時期)のいずれかにおいて、多くの場合、有害な環境条件によって決定されるので、成長速度の増加はまた、野生型の対照よりも、より広範囲の地理的地域における、改変された植物の栽培を可能にし得る。このような有害な条件は、収穫周期が短くされる場合、回避され得る。改変された成長を有する植物は、改変された成長曲線を示し得、そして改変されたTmid値またはT90値(それぞれ、対応する野生型の植物と比較して、最大面積の半分に達するのに必要な時間、またはその面積の90%に達するのに必要な時間)を有し得る。
本発明の好ましい特徴に従って、本発明に従った方法の実行は、増加した収量を有する植物を生じる。好ましくは、増加した収量は、コントロールの植物と比較して、少なくとも収穫指数の増加を含む。従って、本発明に従って、植物の収量、特に収穫指数を増加させる方法が提供され、この方法は、植物における、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の発現を増加させる工程、および/またはGRUBXタンパク質自体の活性を増加させる工程を包含し、ここで好ましくは、このGRUBXタンパク質は、配列番号1によって表される核酸配列もしくはその一部分によって、または、それらとハイブリダイズし得る配列によってコードされるか、あるいは、このGRUBXタンパク質は、配列番号2によって表されるか、またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される。あるいは、このGRUBXは、MIPS番号At2g01650、配列番号3のうちの任意のものによって表される核酸配列、またはそれらの一部分、またはそれらとハイブリダイズし得る配列によって表される核酸配列によってコードされ得るか、あるいはここで、このGRUBXは、SPTrEMBL Q9ZU93、配列番号4のうちの任意のものによって表されるか、またはこれらの任意のもののホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される。
本発明の方法は、植物の収穫指数を増加させるために用いられるので、本発明の方法は、作物植物に適用されることが好ましい。従って、本発明の方法は、特に、種子のために栽培される作物植物(例えば穀類)にとって有用である。従って、本発明の特定の実施形態は、穀類の収穫指数を増加させる方法に関連する。
植物がストレスのない条件下にあろうと、または植物がコントロールの植物と比較して種々のストレスに曝されていようと、収量および/または成長の増加は生じる。植物は、代表的には、よりゆっくりと成長することで、ストレスへの曝露に応答する。重度のストレスの状態において、植物は完全に成長を止めすらし得る。一方で、穏やかなストレスは、成長を再開し得ることなく完全に成長を中止する植物を生じない、植物が曝される任意のストレスであると、本明細書中で定義される。農業の実施(灌漑、施肥、農薬処理)における発達に起因して、重度のストレスは、栽培される作物植物において多くの場合遭遇するものではない。結果として、穏やかなストレスによって誘導される損なわれた成長が、多くの場合、農業にとって望ましくない特徴である。穏やかなストレスは、植物が曝され得る代表的なストレスである。これらのストレスは、植物が曝される、毎日の生物的なストレス、および/または非生物的な(環境の)ストレスであり得る。代表的な非生物的すなわち環境のストレスとしては、異常な高温または低温/凍結に起因する温度ストレス、塩ストレス、水ストレス(乾燥または過剰な水)が挙げられる。非生物的ストレスはまた、化学物質によって引き起こされ得る。生物的ストレスは、代表的には、病原体(例えば、細菌、ウイルス、真菌、または昆虫)によって引き起こされるストレスである。
「改変された構造」は、細胞分裂における変化に起因し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「構造」は植物の構造的特徴または構造的特徴の組み合わせの、任意の1つ以上を含む、植物の外観または形態学を包含する。このような構造的特徴としては、任意の細胞、組織、または器官、あるいは、植物の細胞、組織、または器官の群(特に、根、葉、苗条、茎または腋芽、葉柄、トリコーム、花、花序(単子葉植物および双子葉植物について)、円錐花序、花弁、柱頭、花柱、雄ずい、花粉、胚珠、種子、胚、内胚乳、種皮、アリューロン、繊維、形成層、木部、心材、柔組織、通気組織、篩要素、師部、または維管束組織が挙げられる)の、形、大きさ、数、位置、質感、配置、およびパターンが挙げられる。従って、改変された構造は、植物の改変された成長の全ての局面を含む。
本発明はまた、植物の成長特性を改善する上での、好ましくは、植物の収量および/または生物体量を増加させる上での、GRUBXタンパク質をコードする核酸の使用、およびその部分またはそれとハイブリダイズする核酸の使用に関連する。本発明はまた、植物の成長特性を改善する上での、GRUBXタンパク質の使用、ならびに、そのホモログ、誘導体、および活性なフラグメントの使用に関連する。この核酸配列は、好ましくは、配列番号1、配列番号6によって表されるか、またはその部分、またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、あるいは、配列番号2、配列番号4、配列番号7によって表されるアミノ酸配列、またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。
本発明はまた、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列およびその改変体の、そして、GRUBXタンパク質自体、ならびにそのホモログ、誘導体、および活性なフラグメントの、成長調節因子としての使用に関連する。本明細書中で以前に記載した核酸配列(ならびに、その部分、および、それにハイブリダイズし得る配列)、および本明細書中で以前に記載したアミノ酸配列(ならびにそのホモログ、誘導体、および活性なフラグメント)が、本明細書中で以前に記載したように、植物の成長特性の改善において有用である。従って、これらの配列は、植物の成長を刺激または阻害するための、成長調節因子としての用途を見出す。従って、本発明は、植物の成長特性を改善する上での使用のための、GRUBXタンパク質、または配列番号2によって表されるタンパク質、あるいはそれらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを含有する組成物を提供する。本発明はさらに、植物の成長特性を改善する上での使用のための、GRUBXタンパク質をコードする核酸、または配列番号1によって表される核酸、あるいは、それらの一部分、またはそれらとハイブリダイズする配列を含有する組成物を提供する。本発明はまた、成長調節因子としての使用のための、上述のアミノ酸配列の内の任意のものによって表されるタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを含有する組成物を提供する。
ここで、本発明は以下の実施例に関して記載され、これらは例示のみのためのものである。
DNA操作:他に述べない限り、組換えDNA技術は、(Sambrook (2001)Molecular Cloning:a laboratory manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,CSH、New York)またはAusubelら(Current Protocols in Molecular Biology、New York:John Wiley and Sons、1998)の第1巻および第2巻に記載される標準のプロトコルに従って行われる。植物分子研究のための標準の材料および方法は、R.D.D.Croyによる、BIOS Scientific Publications Ltd(UK)およびBlackwell Scientific Publications(UK)から刊行される、Plant Molecular Biology Labfax(1993)に記載される。
(実施例1:CDS0669配列のクローニング)
(タバコからのGRUBX遺伝子フラグメントのクローニング)
同調させたタバコBY2細胞培養物(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow−2)に対し、cDNA−AFLP実験を行い、そしてさらなるクローニングのために、細胞周期を調節した、配列タグを発現したBY2を選抜した。この発現した配列タグを、タバコcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして目的の全長cDNA(すなわち、GRUBX遺伝子をコードするもの(CDS0669))を単離するために用いた。
(タバコからのGRUBX遺伝子フラグメントのクローニング)
同調させたタバコBY2細胞培養物(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow−2)に対し、cDNA−AFLP実験を行い、そしてさらなるクローニングのために、細胞周期を調節した、配列タグを発現したBY2を選抜した。この発現した配列タグを、タバコcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして目的の全長cDNA(すなわち、GRUBX遺伝子をコードするもの(CDS0669))を単離するために用いた。
(BY2細胞の同調)
タバコBY2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow−2)培養細胞懸濁液を、以下のように、アフィディコリンをもちいて早期S期で細胞を止めることにより同調した。Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2の細胞懸濁液を、記載された(Nagataら、Int.Rev.Cytol.132、1−30、1992)ように維持した。同調のために、7日目の定常培養物を、DNAポリメラーゼα阻害薬剤であるアフィディコリン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;5mg/l)を補充された新鮮な培地に、10倍まで希釈した。24時間後、新鮮な培地で何度か洗浄することによって、細胞を停止から解放し、その後に、これらの細胞周期の進行が再開した。
タバコBY2(Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow−2)培養細胞懸濁液を、以下のように、アフィディコリンをもちいて早期S期で細胞を止めることにより同調した。Nicotiana tabacum L.cv.Bright Yellow 2の細胞懸濁液を、記載された(Nagataら、Int.Rev.Cytol.132、1−30、1992)ように維持した。同調のために、7日目の定常培養物を、DNAポリメラーゼα阻害薬剤であるアフィディコリン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO;5mg/l)を補充された新鮮な培地に、10倍まで希釈した。24時間後、新鮮な培地で何度か洗浄することによって、細胞を停止から解放し、その後に、これらの細胞周期の進行が再開した。
(RNA抽出およびcDNA合成)
総RNAを、LiCl沈降(Sambrookら、2001)をもちいて調製し、そしてポリ(A+)RNAを、Oligotexカラム(Qiagen、Hilden、Germany)を製造業者の使用説明書に従って用いて、500μgの総RNAから抽出した。1μgのポリ(A+)RNAから始めて、ビオチン化オリゴ−dT25プライマー(Genset、Paris、France)およびSuperscript II(Life Technologies、Gaithersburg、MD)を用いた逆転写によって、一本鎖cDNAを合成した。Escherichia coliリガーゼ(Life Technologies)、DNAポリメラーゼI(USB、Cleveland、OH)、およびRNAse−H(USB)を用いた鎖の置換(strand displacement)によって、二本鎖合成を行った。
総RNAを、LiCl沈降(Sambrookら、2001)をもちいて調製し、そしてポリ(A+)RNAを、Oligotexカラム(Qiagen、Hilden、Germany)を製造業者の使用説明書に従って用いて、500μgの総RNAから抽出した。1μgのポリ(A+)RNAから始めて、ビオチン化オリゴ−dT25プライマー(Genset、Paris、France)およびSuperscript II(Life Technologies、Gaithersburg、MD)を用いた逆転写によって、一本鎖cDNAを合成した。Escherichia coliリガーゼ(Life Technologies)、DNAポリメラーゼI(USB、Cleveland、OH)、およびRNAse−H(USB)を用いた鎖の置換(strand displacement)によって、二本鎖合成を行った。
(cDNA−AFLP分析)
500ngの二本鎖cDNAを、記載された(Vosら、Nucleic Acids Res.23(21)4407−4414.1995;Bachemら、Plant J.9(5)745−53、1996)AFLP分析に改変を加えたAFLP分析のために用いた。用いた制限酵素はBstYIおよびMseI(Biolabs)であり、そして2つの別個の工程において消化を行った。1つの酵素による最初の制限消化の後、3’末端フラグメントをDynaビーズ(Dynal、Oslo、Norway)に、そのビオチン化した尾部によって捕捉し、一方で他のフラグメントを洗い流した。第二の酵素による消化の後、遊離した制限フラグメントを収集し、引き続くAFLP工程におけるテンプレートとして用いた。前増幅のために、選択的ヌクレオチドを有さないMseIプライマーを、3’のほとんどのヌクレオチドとしてTまたはCのいずれかを含むBstYIプライマーと合わせた。PCR条件は記載された(Vosら、1995)とおりであった。得られた増幅混合物を600倍に希釈し、そして5μlを、P33標識されたBstYIプライマーおよびAmplitaq−Goldポリメラーゼ(Roche Diagnostics、Brussels、Belgium)を用いた選択的増幅のために用いた。増幅産物を、Sequigelシステム(Biorad)を用いて、5%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。乾燥したゲルをKodak Biomaxフィルムに曝し、そしてPhosphorImager(Amersham Pharmacia Biotech、Little Chalfont、UK)においてスキャニングした。
500ngの二本鎖cDNAを、記載された(Vosら、Nucleic Acids Res.23(21)4407−4414.1995;Bachemら、Plant J.9(5)745−53、1996)AFLP分析に改変を加えたAFLP分析のために用いた。用いた制限酵素はBstYIおよびMseI(Biolabs)であり、そして2つの別個の工程において消化を行った。1つの酵素による最初の制限消化の後、3’末端フラグメントをDynaビーズ(Dynal、Oslo、Norway)に、そのビオチン化した尾部によって捕捉し、一方で他のフラグメントを洗い流した。第二の酵素による消化の後、遊離した制限フラグメントを収集し、引き続くAFLP工程におけるテンプレートとして用いた。前増幅のために、選択的ヌクレオチドを有さないMseIプライマーを、3’のほとんどのヌクレオチドとしてTまたはCのいずれかを含むBstYIプライマーと合わせた。PCR条件は記載された(Vosら、1995)とおりであった。得られた増幅混合物を600倍に希釈し、そして5μlを、P33標識されたBstYIプライマーおよびAmplitaq−Goldポリメラーゼ(Roche Diagnostics、Brussels、Belgium)を用いた選択的増幅のために用いた。増幅産物を、Sequigelシステム(Biorad)を用いて、5%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。乾燥したゲルをKodak Biomaxフィルムに曝し、そしてPhosphorImager(Amersham Pharmacia Biotech、Little Chalfont、UK)においてスキャニングした。
(AFLPフラグメントの特徴付け)
異なって発現した転写物(その中で、(部分的な)転写物が配列番号1(すなわちCDS0669)に対応する)に対するバンドをゲルから単離し、そして溶出したDNAを、選択的増幅と同じ条件下で再増幅した。選択的BstYIプライマーを用いる、再増幅したポリメラーゼ連鎖反応産物の直接的な配列決定か、またはフラグメントをpGEM−T easy(Promega、Madison、WI)にクローン化した後の、個々のクローンの配列決定のいずれかによって、配列情報を得た。得られた配列を、BLAST配列アラインメント(Altschulら、Nucleic Acids Res.25(17)3389−3402 1997)によって、公共的に利用可能なデータベースに存在するヌクレオチド配列およびタンパク質配列に対して比較した。利用可能な場合、有意な相同性を見出す機会を増やすために、タグ配列を、より長いESTまたは単離されたcDNA配列と置換した。引き続いて、配列番号1(CDS0669)に対応する物理的なcDNAクローンを、以下のように、市販のタバコcDNAライブラリーから増幅した。
異なって発現した転写物(その中で、(部分的な)転写物が配列番号1(すなわちCDS0669)に対応する)に対するバンドをゲルから単離し、そして溶出したDNAを、選択的増幅と同じ条件下で再増幅した。選択的BstYIプライマーを用いる、再増幅したポリメラーゼ連鎖反応産物の直接的な配列決定か、またはフラグメントをpGEM−T easy(Promega、Madison、WI)にクローン化した後の、個々のクローンの配列決定のいずれかによって、配列情報を得た。得られた配列を、BLAST配列アラインメント(Altschulら、Nucleic Acids Res.25(17)3389−3402 1997)によって、公共的に利用可能なデータベースに存在するヌクレオチド配列およびタンパク質配列に対して比較した。利用可能な場合、有意な相同性を見出す機会を増やすために、タグ配列を、より長いESTまたは単離されたcDNA配列と置換した。引き続いて、配列番号1(CDS0669)に対応する物理的なcDNAクローンを、以下のように、市販のタバコcDNAライブラリーから増幅した。
(GRUBX遺伝子(CD0669)のクローン化)
挿入物の平均的な大きさが1,400bpであるcDNAライブラリーを、活性に分裂する、同調させていないBY2タバコ細胞から単離したポリ(A+)RNAから調製した。これらのライブラリーの挿入物を、attB Gatewayカセット(Life Technologies)を含むベクターpCMVSPORT6.0内にクローン化した。このライブラリーから、46,000クローンを選抜し、384ウェルのマイクロタイタープレートに配列し、引き続いてナイロンフィルター上に二連でスポットした。配列したクローンを、プローブとして数百の放射標識されたタグのプール(配列CDS0669、配列番号1に対応するBY2−タグを含む)を用いてスクリーニングした。陽性のクローンを単離し(その中で、クローンがCDS0669、配列番号1に対応する)、配列決定し、そしてタグ配列と整列させた。タグとのハイブリダイゼーションが失敗した場合、タグに対応する全長cDNAを、PCR増幅によって選抜した:タグ特異的プライマーは、primer3プログラム(http://www−genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)を用いて設計し、そして部分的cDNA挿入物を増幅するために、共通のベクタープライマーと組み合わせて用いた。50,000cDNAクローン、100,000cDNAクローン、150,000cDNAクローン、および300,000cDNAクローンに由来するDNAのプールを、PCR増幅におけるテンプレートとして用いた。次いで、増幅産物をアガロースゲルから単離し、クローン化し、配列決定し、そしてこれらの配列をそのタグの配列と整列させた。次に、配列番号1のヌクレオチド配列に対応する全長cDNAを、LR反応を介して、pCMVsport6.0ライブラリーベクターから、Gateway(登録商標)ドナーベクターであるpDONR201(Invitrogen、Paisley、UK)にクローン化し、結果としてエントリークローンp77を生じた(図3)。
挿入物の平均的な大きさが1,400bpであるcDNAライブラリーを、活性に分裂する、同調させていないBY2タバコ細胞から単離したポリ(A+)RNAから調製した。これらのライブラリーの挿入物を、attB Gatewayカセット(Life Technologies)を含むベクターpCMVSPORT6.0内にクローン化した。このライブラリーから、46,000クローンを選抜し、384ウェルのマイクロタイタープレートに配列し、引き続いてナイロンフィルター上に二連でスポットした。配列したクローンを、プローブとして数百の放射標識されたタグのプール(配列CDS0669、配列番号1に対応するBY2−タグを含む)を用いてスクリーニングした。陽性のクローンを単離し(その中で、クローンがCDS0669、配列番号1に対応する)、配列決定し、そしてタグ配列と整列させた。タグとのハイブリダイゼーションが失敗した場合、タグに対応する全長cDNAを、PCR増幅によって選抜した:タグ特異的プライマーは、primer3プログラム(http://www−genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html)を用いて設計し、そして部分的cDNA挿入物を増幅するために、共通のベクタープライマーと組み合わせて用いた。50,000cDNAクローン、100,000cDNAクローン、150,000cDNAクローン、および300,000cDNAクローンに由来するDNAのプールを、PCR増幅におけるテンプレートとして用いた。次いで、増幅産物をアガロースゲルから単離し、クローン化し、配列決定し、そしてこれらの配列をそのタグの配列と整列させた。次に、配列番号1のヌクレオチド配列に対応する全長cDNAを、LR反応を介して、pCMVsport6.0ライブラリーベクターから、Gateway(登録商標)ドナーベクターであるpDONR201(Invitrogen、Paisley、UK)にクローン化し、結果としてエントリークローンp77を生じた(図3)。
(実施例2:ベクター構築)
引き続いて、エントリークローンp77を、p0830(Oryza sativa形質転換に用いるデスティネーションベクター(destination vector))を用いるLR反応に用いた。このベクターは、以下のものをT−DNA境界内に機能的要素として含む:植物の選択的マーカー;視覚的マーカー発現カセット;および、エントリークローンに既にクローン化された目的の配列との、LRインビボ組換えを意図するGatewayカセット。種子優先発現のためのプロラミンプロモーター(PRO0090)が、このGatewayカセットの上流にあった。LR組換え工程の後、結果として生じる発現ベクターp72(図4)を、アグロバクテリウム LBA4404株に形質転換し、引き続いてOryza sativa植物に形質転換した。
引き続いて、エントリークローンp77を、p0830(Oryza sativa形質転換に用いるデスティネーションベクター(destination vector))を用いるLR反応に用いた。このベクターは、以下のものをT−DNA境界内に機能的要素として含む:植物の選択的マーカー;視覚的マーカー発現カセット;および、エントリークローンに既にクローン化された目的の配列との、LRインビボ組換えを意図するGatewayカセット。種子優先発現のためのプロラミンプロモーター(PRO0090)が、このGatewayカセットの上流にあった。LR組換え工程の後、結果として生じる発現ベクターp72(図4)を、アグロバクテリウム LBA4404株に形質転換し、引き続いてOryza sativa植物に形質転換した。
(実施例3:PRO0090−CDS0669構築物を用いた、イネの形質転換)
Oryza sativa japonica Nipponbare品種の、成熟した乾燥種子から穀を取った(dehusk)。この種子を70%エタノール中で1分間インキュベートし、次いで0.2%のHgCl2内で30分間処理し、そして滅菌した蒸留水による15分間の洗浄を6回行うことで、滅菌を行った。次いで、この滅菌種子を、2,4−Dを含む培地(カルス誘導培地)上で発芽させた。暗黒化での4週間のインキュベートの後、胚形成性の胚盤由来のカルスを切除し、そして同じ培地上で増殖させた。2週間後、このカルスを、同じ培地上でさらに2週間継代培養することで、増加または増殖させた。共培養(co−cultivation)の3日前に、胚形成性カルス片を、細胞分裂活性を促進するために、新鮮な培地上で継代培養した。共培養には、バイナリーベクターであるp72を持つアグロバクテリウム LBA4414株を用いた。このアグロバクテリウム株を、適切な抗生物質を含むAB培地上で、28℃にて3日間培養した。次いで、この細菌を収集し、そして液体共培養培地に、約1のOD600で懸濁した。この懸濁物をペトリ皿に移し、そしてこのカルスを懸濁物に15分間浸した。次に、このカルス組織をフィルター紙上にブロット乾燥し、固化した共培養培地に移して、そして暗黒化、25℃で3日間インキュベートした。その後、共培養したカルスを、適切な濃度で選択因子が存在する、2,4−D含有培地上で、暗黒化、28℃で4週間増殖させた。この期間の間、早く成長する耐性カルスの島が発生した。この物質の、再生培地への移行、および明所でのインキュベートに際して、胚形成能力が開放され、そして次の4〜5週間で苗条が発生した。カルスから苗条を切除し、そしてオーキシン含有培地上で2〜3週間インキュベートし、そこから土壌に移した。硬化した苗条を、温室内で、短い日数、高湿度下で成長させた。最終的に、移植から3〜5ヶ月後に、種子を収穫した。この方法は、単一遺伝子座形質転換体を、50%を越える割合で産生した(AldemitaおよびHodges、Planta 199、612−617、1996;Chanら、Plant Mol.Biol.22(3)、491−506、1993;Hieiら、Plant J.6(2)、271−282、1994)。
Oryza sativa japonica Nipponbare品種の、成熟した乾燥種子から穀を取った(dehusk)。この種子を70%エタノール中で1分間インキュベートし、次いで0.2%のHgCl2内で30分間処理し、そして滅菌した蒸留水による15分間の洗浄を6回行うことで、滅菌を行った。次いで、この滅菌種子を、2,4−Dを含む培地(カルス誘導培地)上で発芽させた。暗黒化での4週間のインキュベートの後、胚形成性の胚盤由来のカルスを切除し、そして同じ培地上で増殖させた。2週間後、このカルスを、同じ培地上でさらに2週間継代培養することで、増加または増殖させた。共培養(co−cultivation)の3日前に、胚形成性カルス片を、細胞分裂活性を促進するために、新鮮な培地上で継代培養した。共培養には、バイナリーベクターであるp72を持つアグロバクテリウム LBA4414株を用いた。このアグロバクテリウム株を、適切な抗生物質を含むAB培地上で、28℃にて3日間培養した。次いで、この細菌を収集し、そして液体共培養培地に、約1のOD600で懸濁した。この懸濁物をペトリ皿に移し、そしてこのカルスを懸濁物に15分間浸した。次に、このカルス組織をフィルター紙上にブロット乾燥し、固化した共培養培地に移して、そして暗黒化、25℃で3日間インキュベートした。その後、共培養したカルスを、適切な濃度で選択因子が存在する、2,4−D含有培地上で、暗黒化、28℃で4週間増殖させた。この期間の間、早く成長する耐性カルスの島が発生した。この物質の、再生培地への移行、および明所でのインキュベートに際して、胚形成能力が開放され、そして次の4〜5週間で苗条が発生した。カルスから苗条を切除し、そしてオーキシン含有培地上で2〜3週間インキュベートし、そこから土壌に移した。硬化した苗条を、温室内で、短い日数、高湿度下で成長させた。最終的に、移植から3〜5ヶ月後に、種子を収穫した。この方法は、単一遺伝子座形質転換体を、50%を越える割合で産生した(AldemitaおよびHodges、Planta 199、612−617、1996;Chanら、Plant Mol.Biol.22(3)、491−506、1993;Hieiら、Plant J.6(2)、271−282、1994)。
(実施例4:PRO0090−CDS0669構築物を形質転換されたトランスジェニックイネの評価)
約15〜20個の、独立したT0イネ形質転換体を産生した。この一次形質転換体を、成長させ、そしてT1種子を収穫するために、組織培養チャンバーから温室へ移した。T1子孫が、導入遺伝子の存在/非存在について3:1に分離する、6つの事象を保持した。これらの事象のそれぞれについて、視覚的なマーカーの発現をモニタリングすることによって、導入遺伝子を含む約10個のT1実生(ヘテロ接合体およびホモ接合体)、および導入遺伝子を欠失している約10個のT1実生(ヌル接合体(nullizygote))を選択した。栄養成長および種子生産量に関する多くのパラメーターを評価し、そして全てのデータを以下に概説するように、統計学的に分析した:
(統計学的分析:t検定およびF検定)
植物の表現型特性の全体的な評価に関する統計学的モデルとして、二元ANOVA(改変体の分析)を用いた。本発明の遺伝子を形質転換された、全ての事象の全ての植物の、測定された全てのパラメーターについて、F検定を行った。このF検定は、全ての形質転換事象にわたるこの遺伝子の効果を調べるために、そしてこの遺伝子の全体的な影響(本明細書中で「全体的遺伝子効果」ともいわれる)を確認するために行われる。F検定の値が、このデータが有意であることを示す場合、「遺伝子の」効果が存在すると結論されるが、このことは、この遺伝子の存在または位置だけが、表現型の相違の原因となることを意味するものではない。真の全体的遺伝子効果についての有意性の閾値は、このF検定について、5%の確率水準に設定される。
約15〜20個の、独立したT0イネ形質転換体を産生した。この一次形質転換体を、成長させ、そしてT1種子を収穫するために、組織培養チャンバーから温室へ移した。T1子孫が、導入遺伝子の存在/非存在について3:1に分離する、6つの事象を保持した。これらの事象のそれぞれについて、視覚的なマーカーの発現をモニタリングすることによって、導入遺伝子を含む約10個のT1実生(ヘテロ接合体およびホモ接合体)、および導入遺伝子を欠失している約10個のT1実生(ヌル接合体(nullizygote))を選択した。栄養成長および種子生産量に関する多くのパラメーターを評価し、そして全てのデータを以下に概説するように、統計学的に分析した:
(統計学的分析:t検定およびF検定)
植物の表現型特性の全体的な評価に関する統計学的モデルとして、二元ANOVA(改変体の分析)を用いた。本発明の遺伝子を形質転換された、全ての事象の全ての植物の、測定された全てのパラメーターについて、F検定を行った。このF検定は、全ての形質転換事象にわたるこの遺伝子の効果を調べるために、そしてこの遺伝子の全体的な影響(本明細書中で「全体的遺伝子効果」ともいわれる)を確認するために行われる。F検定の値が、このデータが有意であることを示す場合、「遺伝子の」効果が存在すると結論されるが、このことは、この遺伝子の存在または位置だけが、表現型の相違の原因となることを意味するものではない。真の全体的遺伝子効果についての有意性の閾値は、このF検定について、5%の確率水準に設定される。
(4.1 栄養成長の測定:)
選択されたT1植物(導入遺伝子を有する約10個、および導入遺伝子を含まない約10個)を温室に移した。それぞれの植物は、表現型のデータを、対応する植物に明らかに結びつけるために、独自のバーコード標識を受けた。この選択されたT1植物を、以下の環境設定:明期=11.5時間、日光強度=30,000lux以上、日中温度=28℃以上、夜間温度=22℃、相対湿度=60〜70%、のもと、直径10cmの鉢の中で、土壌上で成長させた。トランスジェニック植物、および対応するヌル接合体を、無作為の位置で、隣り合わせて成長させた。播種の段階から、成熟の段階まで、それぞれの植物を、何度かデジタル画像化キャビネットを通し、画像化した。それぞれの時点で、少なくとも6つの異なる角度から、それぞれの植物のデジタル画像(2048×1536ピクセル、1600万色)を得た。画像分析ソフトウェアを用いて、全ての植物の全てのデジタル画像から、自動化された方法にて、いくつかのパラメーターを引き出すことが出来た。
選択されたT1植物(導入遺伝子を有する約10個、および導入遺伝子を含まない約10個)を温室に移した。それぞれの植物は、表現型のデータを、対応する植物に明らかに結びつけるために、独自のバーコード標識を受けた。この選択されたT1植物を、以下の環境設定:明期=11.5時間、日光強度=30,000lux以上、日中温度=28℃以上、夜間温度=22℃、相対湿度=60〜70%、のもと、直径10cmの鉢の中で、土壌上で成長させた。トランスジェニック植物、および対応するヌル接合体を、無作為の位置で、隣り合わせて成長させた。播種の段階から、成熟の段階まで、それぞれの植物を、何度かデジタル画像化キャビネットを通し、画像化した。それぞれの時点で、少なくとも6つの異なる角度から、それぞれの植物のデジタル画像(2048×1536ピクセル、1600万色)を得た。画像分析ソフトウェアを用いて、全ての植物の全てのデジタル画像から、自動化された方法にて、いくつかのパラメーターを引き出すことが出来た。
(4.2 種子関連パラメーターの測定:)
成熟した一次円錐花序を収穫し、袋につめ、バーコードで標識し、次いで37℃の乾燥器内で3日間乾燥させた。次いで、この円錐花序を脱穀し、全ての種子を収集して計数した。送風デバイスを用いて、詰まった穀を空の穀から分離した。空の穀を捨て、残った画分を再び計数した。詰まった穀の重量を、化学天秤で測った。この手順により、種子関連パラメーターのセットを引き出すことが出来る。
成熟した一次円錐花序を収穫し、袋につめ、バーコードで標識し、次いで37℃の乾燥器内で3日間乾燥させた。次いで、この円錐花序を脱穀し、全ての種子を収集して計数した。送風デバイスを用いて、詰まった穀を空の穀から分離した。空の穀を捨て、残った画分を再び計数した。詰まった穀の重量を、化学天秤で測った。この手順により、種子関連パラメーターのセットを引き出すことが出来る。
(植物の収穫指数)
本発明の収穫指数を、総種子収量と地上部分(mm2)との間の比に係数106を掛けたものとして定義する。植物あたりの総種子収量を、上記に記載したように、植物から収穫した、全ての詰まった穀の重量を測ることで測定した。植物の地上部分は、背景から識別した地上の植物部分から、デジタル画像のピクセルの総数を計数することで決定した。この値を、異なる角度から同じ時点で撮った写真について平均化し、そして較正によって、mm2で表される物理的な面積値に変換した。実験から、この方法で測定された地上の植物部分は、植物の地上部の生物体量と相関することが示された。
本発明の収穫指数を、総種子収量と地上部分(mm2)との間の比に係数106を掛けたものとして定義する。植物あたりの総種子収量を、上記に記載したように、植物から収穫した、全ての詰まった穀の重量を測ることで測定した。植物の地上部分は、背景から識別した地上の植物部分から、デジタル画像のピクセルの総数を計数することで決定した。この値を、異なる角度から同じ時点で撮った写真について平均化し、そして較正によって、mm2で表される物理的な面積値に変換した。実験から、この方法で測定された地上の植物部分は、植物の地上部の生物体量と相関することが示された。
第一の実験で得たデータを、T2植物を用いる第二の実験において確認した。正しい発現パターンを有する3つの系統を、さらなる解析のために選抜した。T1における陽性の植物(ヘテロ接合体およびホモ接合体の両方)からの種子バッチを、マーカー発現をモニタリングすることでスクリーニングした。次いで、それぞれの選抜事象について、ヘテロ接合体の種子バッチを、T2評価のために保持した。それぞれの種子バッチの中で、同数の陽性の植物および陰性の植物を、評価のために、温室内で成長させた。
総数120のGRUBXトランスジェニック植物を、T2世代、すなわち事象あたり、導入遺伝子について20の陽性の植物体および20の陰性の植物体の、40の植物体において評価した。
重複する事象を含む2つの実験を行ったので、分析の結合を行った。このことは、2つの実験にわたる事象の一貫性を確かめるために有用であり、そして、このことが問題になる場合、結果の信頼性を増すために、両方の実験から得られる証拠を蓄積するために有用である。用いられた方法は、データの多層構造(すなわち、実験−事象−分離個体)を斟酌する、混合モデルアプローチであった。P値は、尤度比検定をχ二乗分布と比較することで得られる。
第一の実験において、T1世代の6系統を評価した。収穫指数の平均的な増加があり、そして2系統は、ヌル接合体系統と比較して、50%以上の有意な増加を有した(表2)。
(表2:最高の成果を挙げる2つのT1事象の評価)
T1世代について得られた結果を、T2世代において確認し;収穫指数の平均増加は13%であり、そしてF検定は、この増加が有意であること(p値が0.0447)を示した。さらに、これらのT2のデータを、T1世代についての結果と合わせた分析で再評価し、そして、F検定から得られたp値は、観察された効果が有意であること(p値が0.0181)を、再度示した。
ここで、本発明は、添付の図に関して記載される:
SMARTツールによって認識される、UBXドメインを含む、Arabidopsis thalianaタンパク質および動物の参照タンパク質を表す系統樹。ヒトのタンパク質は、そのGenBank登録番号NP_079517(Homo sapiens UBX domain containing 1(UBXD1))、AAP97263(Homo sapiens Fas−associated protein factor FAF1 mRNA)、NP_005662(Homo sapiens reproduction 8(D8S2298E)、REP8)によって表され、そして、ラットのタンパク質は、NP_114187(Rattus norvegicus p47 protein)によって表される。他の識別名(配列番号2、配列番号4、および配列番号7は除く)は、Arabidopsis thalianaタンパク質のGenBankまたはSPTrEMBLの登録番号である。
SMARTツールによって認識される、PUGドメインを含む植物タンパク質を表す系統樹。配列番号2および配列番号4が、Arabidopsis thalianaのタンパク質(SPTrEMBL登録番号Q9ZU93(発現されたタンパク質)、Q9FKI1(亜鉛メタロプロテイナーゼに類似)、Q9MAT3(F13M7.16タンパク質)、Q9FKC7(ゲノムDNA、第5染色体、TACクローン:K24G6)、Q9SF12(仮想タンパク質)、Q9C5S2(エンドリボヌクレアーゼ/タンパク質キナーゼ IRE1)、Q8RX75(AT5g24360/K16H17_7)、Q94IG5(Ire1ホモログ−1))と、およびイネのタンパク質であるSPTrEMBL Q7XIT1(OsIre1p)と比較される。
コンセンサス配列による、UBX1ドメインおよびPUGドメインの定義(SMARTデータベース)。コンセンサス/50%、それぞれ/65%、および/80%は、UBX1ドメインまたはPUGドメインを含む参照配列の、最大50%、最大65%、および最大80%についてコンセンサスな配列である。大文字は、種々のアミノ酸についての、標準の一文字IUPACコードであり、他の文字は、以下:
に概説するような、アミノ酸の性質を記号で表す。
配列番号2およびQ9ZU93に示される、UBXドメイン配列およびPUGドメイン配列。
Q9ZU93および配列番号2のアラインメント、PUGドメインに下線を引き、UBXドメインは太字にする。
配列番号2および配列番号4のアラインメント、PUGドメインに下線を引き、UBXドメインは太字にする。
配列番号4および配列番号7のアラインメント、PUGドメインに下線を引き、UBXドメインは太字にする。
エントリークローンp77の概略表示であって、pDONR201骨格へのGateway(登録商標)クローニングのためのAttL1部位およびAttL2部位内に、CDS0669を含む。CDS0669は、タバコGRUBXコード配列についての、内部コードである。このベクターはまた、細菌性カナマイシン耐性カセット、および細菌性複製開始点を含む。
プロラミンプロモーター(PRO0090)の制御下で、タバコGRUBX遺伝子(CDS0669)を、Oryza sativa内で発現するためのバイナリーベクター。このベクターは、左端境界(LBリピート、LB Ti C58)および右端境界(RBリピート、RB Ti C58)によって限定される、Tiプラスミド由来のT−DNAを含む。左端境界から右端境界までに、このT−DNAは:トランスジェニック植物の抗生物質選抜のためのカセット;トランスジェニック植物の視覚的なスクリーニングのためのカセット;タバコGRUBX遺伝子の発現のための、PRO0090−CDS0669−ゼインおよびrbcS−δGA二重ターミネーターのカセットを含む。このベクターはまた、細菌性複製のための、pBR322由来の複製起点、ならびに、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンによる細菌性選抜のための選抜可能マーカー(Spe/SmeR)を含む。
本発明に有用な配列の例。配列番号1および配列番号2は、実施例において用いた、それぞれGRUBX核酸およびGRUBXタンパク質の配列である。配列番号3および配列番号4は、サトウキビGRUBXオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号5は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号6および配列番号7は、イネGRUBXオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
本発明に有用な配列の例。配列番号1および配列番号2は、実施例において用いた、それぞれGRUBX核酸およびGRUBXタンパク質の配列である。配列番号3および配列番号4は、サトウキビGRUBXオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号5は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号6および配列番号7は、イネGRUBXオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
本発明に有用な配列の例。配列番号1および配列番号2は、実施例において用いた、それぞれGRUBX核酸およびGRUBXタンパク質の配列である。配列番号3および配列番号4は、サトウキビGRUBXオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号5は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号6および配列番号7は、イネGRUBXオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
Claims (34)
- 植物の成長特性を改善するための方法であって、該方法は、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の、植物内における発現を増加する工程を包含し、そして/あるいは、GRUBXタンパク質の植物内における活性を増加する工程、および/またはレベルを増加する工程を包含し、そして必要に応じて、改善された成長特性を有する植物を選択する、方法。
- 前記増加が、好ましくは、GRUBXタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座における、遺伝的改変の導入により達成される、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝的改変が、位置指定突然変異誘発、相同組換え、TILLING、およびT−DNAアクティベーションの内の1つによって達成される、請求項2に記載の方法。
- 植物の成長特性を改善するための方法であって、該方法は、GRUBXタンパク質をコードする、単離された核酸配列を、植物内に導入する工程、および植物内で発現させる工程を包含する、方法。
- 前記GRUBXタンパク質をコードする核酸が、植物内で過剰発現される、請求項4に記載の方法。
- 前記核酸が真核生物に由来する、好ましくは植物に由来する、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記核酸が双子葉植物に由来する、好ましくはナス科に由来する、より好ましくは、Nicotiana tabacumに由来する、請求項6に記載の方法。
- 前記核酸が単子葉植物に由来する、好ましくはイネ科に由来する、より好ましくは、Oryza sativaに由来する、請求項6に記載の方法。
- 請求項7に記載の方法であって、前記核酸は、配列番号1によって表されるか、または配列番号1の一部分であるか、またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、またはGRUBXタンパク質をコードし、ここで、該GRUBXタンパク質は、配列番号2で表されるか、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントである、方法。
- 請求項4〜請求項9のいずれかに記載の方法であって、前記核酸配列および前記タンパク質が、以下:
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体、またはスプライシング改変体によってコードされる、該GRUBXタンパク質;
(ii)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体、または対立遺伝子改変体によってコードされる、該GRUBXタンパク質;
(iii)人工染色体の少なくとも一部分上に含まれる核酸配列であって、該人工染色体はまた、好ましくは、1つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバーを含む、核酸配列;
(iv)GRUBXをコードする核酸の機能的部分;
(v)GRUBXをコードする核酸にハイブリダイズし得る配列;
(vi)GRUBXタンパク質のホモログ、誘導体、および活性なフラグメント
から選択される改変体を含む、方法。 - 請求項4〜請求項10のいずれかに記載の方法であって、前記GRUBXタンパク質をコードする核酸の発現が、種子優先プロモーター、好ましくはプロラミンプロモーターによって駆動される、方法。
- 請求項1〜請求項11のいずれかに記載の方法であって、前記改善された成長特性は、それぞれ対応する野生型植物と比較して、増加した収量、および/または、改変された植物構造である、方法。
- 請求項1〜請求項12のいずれかに記載の方法であって、前記増加した収量は、増加した種子の収量である、方法。
- 請求項1〜請求項13のいずれかに記載の方法であって、前記増加した収量、および前記改変された植物構造は、対応する野生型植物と比較して、以下:
(i)増加した、種子の生物体量、
(ii)増加した、種子の総数、
(iii)増加した、詰まった種子の数、
(iv)増加した、種子の大きさ、
(v)増加した、種子の体積、
(vi)増加した、収穫指数、および
(vii)増加した千粒重
の1つ以上を含む、方法。 - 植物の収量を増加させるための方法であって、該方法は、GRUBXをコードする核酸の植物における発現を増加させる工程、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の植物内における活性、および/またはレベルを増加させる工程を包含する、方法。
- 改善された成長特性を有するトランスジェニック植物を産生するための方法であって、該方法は、以下:
a.植物または植物細胞に、GRUBXタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする、核酸配列、該核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列またはその一部分を導入する工程;
b.植物の成長を促進する条件下で、該植物細胞を培養する工程
を包含する、方法。 - 改善された成長特性を有する植物を選択するための方法であって、該方法は、GRUBXをコードする配列の、優れた対立遺伝子改変体の選択に基づき、そして該対立遺伝子は、植物において改善された成長特性を生じる、方法。
- 請求項1〜請求項17のいずれかに記載の方法により得られる植物であって、ただし、前記GRUBXタンパク質は、GenBank登録番号AX927140によって表される核酸配列によってコードされるものではない、植物。
- 単離された核酸配列であって、該単離された核酸配列は、以下:
(i)配列番号6によって表される核酸配列、またはその相補鎖;
(ii)配列番号7によって表されるアミノ酸配列、あるいは、そのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列;
(iii)上記の(i)または(ii)の核酸配列と、(好ましくはストリンジェントな条件下において)ハイブリダイズし得る核酸配列であって、該ハイブリダイズする配列が、好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列;
(iv)遺伝暗号の結果として縮重している、上記の(i)〜(iii)に記載の核酸配列;
(v)(i)〜(iv)に記載の核酸配列の、対立遺伝子改変体である核酸;
(vi)(i)〜(v)に記載の核酸配列の、選択的スプライシング改変体である核酸;
(vii)(i)〜(vi)に定義される配列の内の任意の1つ以上と、75.00%の配列同一性、80.00%の配列同一性、85.00%の配列同一性、90.00%の配列同一性、95.00%の配列同一性、96.00%の配列同一性、97.00%の配列同一性、98.00%の配列同一性、または99.00%の配列同一性を有する、核酸配列;
(viii)上記の(i)〜(vii)の内の任意のものに記載の核酸配列の一部分であって、該一部分は、好ましくはGRUBX活性を有するタンパク質をコードする、一部分
を含む、単離された核酸配列。 - 単離されたタンパク質であって、該単離されたタンパク質は、以下:
(i)配列番号4において与えられるポリペプチド;
(ii)配列番号7において与えられるポリペプチド;
(iii)配列番号4または配列番号7において与えられるアミノ酸配列と、少なくとも40.00%の配列同一性、好ましくは50.00%の配列同一性、60.00%の配列同一性、70.00%の配列同一性、より好ましくは80%の配列同一性、90%の配列同一性、最も好ましくは95.00%の配列同一性、96.00%の配列同一性、97.00%の配列同一性、98.00%の配列同一性、または99.00%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド;
(iv)少なくともUBXドメインを、好ましくはUBXドメインおよびPUGドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインを含むポリペプチド;
(v)(i)〜(iv)の内の任意のものにおいて定義されるタンパク質のホモログ、誘導体、免疫学的に活性な、かつ/または機能的なフラグメント
からなる群より選択されるポリペプチドの1つの、少なくとも部分を含み、
ただし、該タンパク質配列は、配列番号2によって表される配列でも、データベースの見出し項目Q9ZU93、AAR01744、Q9D7L9、Q9BZV1、Q99PL6、ENSANGP00000020442、Q7SXA8、Q9V8K8、Q96IK9、ENSRNOP00000037228、またはAAH07414でもない、単離されたタンパク質。 - 構築物であって、該構築物は、以下:
(i)GRUBXタンパク質をコードする核酸配列;
(ii)(i)の核酸配列の、植物における発現を駆動し得る、1つ以上の調節配列;および、必要に応じて、
(iii)転写終止配列
を含み、
ただし、該GRUBXタンパク質をコードする核酸は、GenBank登録番号AX927140において表される核酸ではない、構築物。 - 請求項21に記載の構築物であって、前記GRUBXタンパク質をコードする核酸は、配列番号2によって表されるタンパク質、または請求項20の(i)〜(v)の内の任意のものに記載のタンパク質をコードする核酸配列である、構築物。
- 請求項21または請求項22に記載の構築物であって、前記調節配列が、少なくとも種子優先プロモーター、好ましくはプロラミンプロモーターを含む、構築物。
- 配列番号5と本質的に類似する発現カセットを含む構築物。
- トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞であって、該植物または植物細胞が、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の増加された発現、ならびに/あるいは、GRUBXタンパク質の増加された活性および/またはレベルを有することで特徴付けられる、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞。
- 改善された成長特性を有する、請求項25に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞。
- 請求項25または請求項26に記載のトランスジェニック植物であって、該植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、菜種、または綿を含む作物植物、好ましくは単子葉植物(例えば、サトウキビ)、最も好ましくは穀類(例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、またはカラスムギ)である、トランスジェニック植物。
- 請求項18、請求項25、請求項26、または請求項27の内の任意のものに記載の植物の、植物細胞、収穫可能な部分および/または該収穫可能な部分に直接的に由来する生産物を含む植物の部分、零余子、または子孫。
- 植物の成長特性を改善する工程における、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列、その部分、またはそれにハイブリダイズする核酸の使用。
- 植物の成長特性を改善する工程の置ける、GRUBXタンパク質、そのホモログ、その誘導体、およびその活性なフラグメントの使用。
- 植物の成長特性を改善する工程における、請求項20に記載のGRUBXタンパク質の使用。
- 植物の成長特性を改善する工程における使用のための、GRUBXタンパク質を含有する組成物。
- 植物の成長特性を改善する工程における使用のための、GRUBXタンパク質をコードする核酸を含有する組成物。
- 育種計画における、GRUBXタンパク質をコードする核酸配列の使用。
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