CN101134771A - 蛋白质及生物活性物质的提取、浓缩及组分分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明在此揭示了从大豆，花生，菜籽，低芥酸菜籽，棉籽，豆类，小麦和其它植物原料中提取，浓缩和组分分离蛋白质或同蛋白质相结合的聚合物的方法。基于冷冻沉淀的原理，本方法不用或极少用到化学品，且极少产生废液。由本方法生产出的浓缩蛋白和分离蛋白具有良好的功能特性，优质的营养，诱人的外观及平和的口感。基于同样的冷冻沉淀原理，本发明还揭示了从活组织中提取和浓缩化学成分的方法，尤其是从植物原料中提取和浓缩某些生物活性物质的方法。

Description

蛋白质及生物活性物质的提取、浓缩及组分分离方法

技术领域

本发明涉及到从油料作物、豆类和谷物等植物原料中提取、浓缩及组分分离蛋白质，尤其是食用蛋白质的方法，以及由此产生的浓缩和分离蛋白质产品。这些蛋白质产品具有优良的功能特性，丰富的营养价值，清淡的风味和口感，诱人的色泽以及高水平地保留原料中天然植物化学成分。

该发明也涉及到从活组织中提取和浓缩化学成分，尤其是从植物原料中提取和浓缩某些生物活性物质。

背景技术

植物蛋白，尤其是那些来自油料作物、豆类和谷物的蛋白质，是食用蛋白质的廉价和再生来源。但是，大多数的植物蛋白，在其自然状态下，由于风味、色泽和组织结构不佳，口感都很差；而且，由于含有一定的天然抗营养因子，其营养功能也欠佳。有关植物蛋白质的加工和利用出现在无数文章和书籍中，其中包括刘克顺(本申请人)的著作《大豆作为功能性食品和配料》，美国AOCS出版社2004年出版。

然而，目前有关植物蛋白质的提取和浓缩的方法都存在着以下一种或多种问题：(1)大多依赖酒精，碱液，酸和其它化学制剂的处理；(2)产生大量的废水废液，造成环境污染：(3)最终产品色泽差，有咸味，或其它令人不快的气味和口感；(4)由于经过强烈的化学制剂处理(比如酸或酒精)和热处理，最终产品丧失了部分关键的功能特性；(5)原料中天然存在的有益植物化学成分严重丢失；(6)产品得率往往较低。

此外，植物蛋白根据其超速离心分离的沉降系数可分为各种球蛋白。比如：大豆蛋白可分为2S，7S，11S和15S球蛋白。其中，7S和11S是大豆蛋白的主要组分。文献上有多种将大豆蛋白组分分离的方法。其目的就是可以充分利用不同组分蛋白固有的功能特性。大多数方法都遵守分段等电点沉淀的原理，即：在添加或不添加特定的盐类情况下，调节不同的pH值和温度来分离出不同的大豆蛋白组分。此类方法的代表包括：Rickertetal.(2004)(大豆球蛋白和beta-伴球蛋白分离方法的改良以及植物功能活性物质的分离，<<农业食品化学杂志>>，52：1726-1734)。美国专利6,566,134 to Bringe(2003)，和美国专利申请号20040028799 by Ishikawaetal.(2004)。然而，在这些方法中，调节pH和温度是非常麻烦和得不偿失，而且容易造成功能活性物质的损失。

还有一点，植物原料中含有许多具有生物活性和促进健康的微量成分。此前已有大量的文献报道过有关从植物原料中提取和分离生物活性成分的方法。美国专利6,703,051 to Bates and Bryan(2004)叙述了一种分离和回收大豆异黄酮和植物蛋白的方法。美国专利6,887,498 to Konwinski et al.(2005)揭示了一种生产大豆Borman-Birk胰岛素抑制剂浓缩产品的方法。美国专利6,391,848 to de Lumen and Galvez(2002)描述了“lunasin”(一种多肽的植物活性物质)的成份以及从大豆中提取该物质的方法。这些方法大多数都得经过激烈的处理，比如：加热，强酸，强碱和或各种有机溶剂，因而难以商业化。

发明内容

本发明的总目的是采用全新的、可以避免背景技术中提到的相关缺陷的方法从植物原料中提取，浓缩和组分分离蛋白质。

具体地说，本发明的一个目的就是在不用或极少用化学试剂且不会产生大量废水的前提下，从植物原料中提取和浓缩蛋白质。

另一个目的是从植物原料中提取和生产浓缩和分离蛋白，同时具有高回收率，优良的营养性、功能性和感官性(清淡的风味和口感，诱人的色泽，高分散性，等等)的特点。

再一个目的是以全脂油料作物为原料生产具有高蛋白得率的以及具有优良营养性、功能性和感官性特点的全脂浓缩蛋白质制品。

再一个目的是生产可以被认证的有机植物蛋白产品。

再一个目的是组分分离植物蛋白，例如：将那些从油料作物，豆类和谷物中提取的植物蛋白，再进行组分分离，生产出不同的组分蛋白，以满足不同的应用要求。

再一个目的是从富含蛋白质及蛋白结质合物的植物原料中提取和浓缩某些微量的生物活性物质，使其回收和应用。

再一个目的是生产富含大豆Borman-Birk胰岛素抑制剂的蛋白产品。

为实现上述目的，本发明采用如下几种技术方案：

一种从富含蛋白质的植物原料中提取和浓缩蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)制备富含蛋白质的植物原料；

(2)将制备的植物原料和一水性介质混合；

(3)在低温下保持该混合物；

(4)必要时融化上述混合物；

(5)分离上清液和沉淀物组分；

(6)恢复沉淀物组分的功能特性；

以此得到的浓缩或分离植物蛋白具有优越的功能特性，风味，感官和营养价值。

所述水性介质可以是水、碱液、盐溶液或缓冲溶液；所述植物原料可以是大豆、低芥酸菜籽、花生、棉籽、葵花籽或其它油料作物的种子。

所述步骤3的低温范围是大约摄氏零上8度到大约摄氏零下80度之间，低温处理的时间范围是大约2小时到大约30天。

步骤3中所述的将混合物置于低温之前，从混合物中除去不溶性物质获得的分离蛋白。

在步骤3之前还包括一个预处理步骤，可以是加热，酸化，加入添加剂，浓缩，稀释，澄清，发酵或其任一组合方法。

所述步骤6由以下亚步骤组成：(6a)将沉淀物组分加水制备成水溶性浆液，(6b)对水溶性浆液，从切变，加热和其组合方法中选取一种加工方法。

在步骤6之后，从加热，中和，干燥和其组合方法中选取一种加工方法。

一种从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法，包括以下步骤：

(1)制备富含蛋白质的植物原料；

(2)将上述植物原料与水介质混合；

(3)从混合物中除去非溶性物质；

(4)低温下保持含有可溶性物质的提取液；

(5)需要时，融化上述提取液；

(6)将上清液和沉淀物分离；

(7)重复步骤4，步骤5和步骤6；

(8)对每一个沉淀物组分，恢复其功能特性。

以上述从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法生产获得的植物蛋白质组分。

所述步骤4中低温是大约零上摄氏8度到大约零下摄氏80度，低温处理时间是约2小时到约20天。

在步骤7中低温处理过程中，与前面所述的环节相比，温度更低，保持的时间更长。

所述步骤8由以下亚步骤组成：(8a)将沉淀组分加水制备水溶性浆液，(8b)对水溶性浆液，进行从切变、加热和其组合方法中选取一种加工方法。

一种从植物原料中提取和浓缩生物活性物质的方法，包括以下步骤：

(1)制备含有生物活性物质的植物原料；

(2)将制备的植物原料与一溶剂混合以提取生物活性成分；

(3)在低温下保持上述的混合物；

(4)需要时融化混合物；

(5)将沉淀组分和富含活性物质的上清液分离；

(6)从上清液中分离和浓缩出生物活性物质。

所述溶剂是从水、碱溶液、盐溶液、缓冲溶液、有机溶剂、有机混合溶剂和水性有机溶剂中优选的一种；所说的低温是大约零上摄氏8度到大约零下摄氏80度。

本发明者发现，对植物原料的水溶性混合物(浆液或提取物)进行冷冻和融化(冻融)处理会引起大部分的蛋白质及其与之结合的聚合体(如当使用全脂油料作物时，蛋白质-脂类联合体)产生沉淀或聚集。温度越低，低温处理的时间越长，蛋白质或与其它大分子结合的复合物就会沉淀得越多。基于此发现，一种逐步降低温度和延长时间，即对前一次的上清液再降低一段温度和/或保持更长一段时间，使不同分子大小的蛋白质组分因而被分离出来的处理方法也在此被揭示。大分子的蛋白质在前几步的冻融处理中先沉淀，小分子蛋白质在后几步的冻融处理中沉淀。

本发明还揭示冷冻沉淀后蛋白质的功能特性，如溶解性，乳化性，以及形成凝胶的特性等，能够通过切变、加热处理或两者结合得以完全恢复。

该方法没有或极少涉及到化学试剂的应用，例如：不需要碱提取，酸沉降或酒精滤取，而且产生少量的废液。因此，可以看作是清洁的绿色技术，尤其是当利用季节或地理地域自然温差变化时。蛋白质回收率毫不次于甚至优于目前广泛使用的分离技术。此外，由于冷温处理和极少使用化学剂，分离的化学成分或化学成分组合物具有优越的营养，功能和口感质量。该技术具有广泛应用基础和范围，从植物原料中的蛋白质分离和浓缩到蛋白组分的分离，从提取和浓缩植物活性物质到分离和浓缩植物组织中的乳清蛋白。

附图说明

图1所示为水温对从脱脂豆粕(白片)中提取蛋白质和随后的冷冻沉淀和分离的影响；

图2所示为酶活性全脂大豆粉或脱脂大豆粕(白片)——冷冻时间对蛋白质沉淀和分离的影响；

图3所示为在大豆水提取液中添加化学试剂对随后蛋白质冷冻沉淀和分离的影响。

具体实施方式

本发明揭示了一种可用于提取，浓缩和组分分离蛋白质及其与之交联的其它聚合体的新方法。这些聚合体存在于各种不同的植物原料中，尤其是油料，豆类和禾谷作物的种子中，包括：大豆、花生、棉籽、葵花籽仁、豆类、小麦等。为方便起见，以下以大豆为例详述讨论这些步骤是如何完成的。对于那些具有一定技能的人来说，会很容易将这些用于大豆和大豆蛋白的具体步骤应用到其它富含蛋白质的原料和生物组织中。

一、原料的制备

该发明的主要目的是从植物原料中提取和浓缩蛋白质。虽然该发明技术可以应用于任何油料、豆类、谷物及其它包含蛋白质的植物组织，但原料最好还是呈干燥颗粒状态且其中的蛋白质没有因为受热或其它因素而变性。通常应该是“酶活性”原料。

该发明适用的大豆可以是任何已知品种。将原料加工成为干燥颗粒的过程已经是商业化可行的工艺。简而言之，原料大豆被清理和脱皮、除去灰尘，豆皮和其它外来杂质。对清理和脱皮后的豆子做以下三种选择之一的处理：

(1)轧胚并全部脱去脂肪成分成为脱脂大豆原料；(2)部分脱去脂肪并粉碎成为低脂肪大豆原料；(3)直接粉碎细粒状成为全脂大豆原料。有时，大豆需要经过一些生物处理，比如：发芽或发酵。

制备后，脱脂、低脂和全脂大豆颗粒状原料(粒，粉或片状)可以用作各种具体实验，至于哪种更适合，取决于需要和拟定的特殊产品(所求质量、成本和指标水平)，取决于本发明揭示的不同加工模式方法。

请注意，应该说，大豆、花生和其它作物的许多颗粒状原料，如粒，粉或片状，以及各种脂肪含量(全脂、低脂或脱脂)都能够商业化地获得，使得蛋白制品加工商可以绕过这些制备步骤。在此情况下，加工过程就可以直接跳到下一步骤。

二、溶解和提取可溶性成分

原料预处理步骤完成后，下一步骤定名为溶解和提取步骤。本步骤包括将大豆原料和水或其它水溶性溶剂混合搅拌，在足够的时间下，溶解原料中水溶性物质，包括蛋白质、水溶性碳水化合物(例如：低聚糖)、矿物质等。该步骤生产浆液。此处，“浆液”代表溶剂和植物物质的混合液，此时，纤维成分没有除去或减少。在使用全脂或低脂原料情况下，或制备中添加脂肪的情况下，脂肪存在于系统中，此时，浆液是蛋白质-脂肪乳化液或悬浮液。

提取步骤中，提取介质(溶剂)，原料类型，原料的加工历程，溶剂和固体物料的重量比，提取温度和取持续时间，以及混合和搅拌的方式都对以下有影响：(1)提取出的可溶性组分的含量；(2)随后步骤中蛋白质的沉淀量；(3)冻融处理后从上清液中分离沉淀蛋白质的容易程度；(4)最终产品的产量，(5)最终产品的组织结构和功能性。

提取溶剂通常是极性溶剂。一般采用水溶性溶剂为好。水溶性介质可以是水、碱溶液、乙醇水溶液、盐溶液、缓冲溶液和其它。应注意，用于提取的溶剂影响不仅仅是提取蛋白质的得率，也影响随后冷温处理时沉淀蛋白质的得率。多数情况下，水最好。

水溶性溶剂和大豆原料重量之比也影响着水溶性物质从浆液中被分离出的效率，影响着随后低温处理过程中蛋白质沉淀率，以及最终蛋白质的回收得率。总之，比例越高，蛋白质提取率就越高，蛋白质沉淀率也越高，蛋白质的生产率(回收率)就越高。但是，重量比太高，将使生产成本提高，而且增加废液。因此，水性介质和大豆原料的重量比范围一般在3∶1至50∶1之间。最佳的比例为6∶1至25∶1之间。

提取温度可以从室温到摄氏100度之间的范围内变化。它影响着提取得率，最终蛋白质的口感和色泽，以及最终蛋白质的得率。对于大豆白片，提取最高温度为摄氏50度(图1)。

对于使用的提取装置没有特别限制，一个有效的提取容器，或一个搅拌器，或一个混合器，或一个均质器，或一个震荡器，或一个挤压机，或一个超声波发生器等等均可以。

提取后，不溶解性成分(也就是已知的大豆纤维或豆渣)可以很容易地从浆液中除去或减少。任何传统的固-液分离工艺，如：沉降、饼过滤、清洁过滤、离心过滤、离心沉降、压缩分离或压滤等均可。产生的上清液称提取物。在此，“提取物”代表溶剂和植物物料的混合物，但其中纤维成分已被除去或减少。

然而，纤维的除去过程是选择性的。当目的是生产更纯的蛋白质产品时，比如：分离大豆蛋白，该过程才实施。当生产浓缩蛋白时，纤维成份可以不需脱除。当目的是提取和浓缩小分子的组分时，比如：Borman-Birk胰岛素抑制剂和低聚糖，纤维成份也可以不必脱除。

三、低温处理

水溶性混合液，无论纤维成份是否除去，无论是否做过一些预处理(此方面将在下文作一说明)，即可开始做低温处理。温度可以是任何低于摄氏10度的温度，但是，最佳温度应该是冰点及冰点以下的温度。低温处理，尤其是冷冻处理，可以引起某些物化变化而使蛋白质变性，包括冰块形成，溶质浓缩，pH值改变等。结果，在融化过程中，蛋白质沉淀，这种现象被称为冷冻沉淀作用。

本发明者发现，快速冷冻通常加速冷冻沉淀作用，故快速冷冻比缓慢冷冻要好。冷冻前，样品可以先在冷藏温度下冷却。

本发明者还发现，温度越低，蛋白质或者与之交联的聚合体，如脂肪等，沉淀或聚集的程度就越高，融化后，沉淀或聚集物分离就越容易。另一方面，温度越低，产生和保持低温的费用就越高。因此，从实践的观点看，最佳的温度范围应该是冰冻温度，即：在零下2到零下80摄氏度之间。在美国，冰箱的冰冻温度是多在零下摄氏18度左右。

此外，实验发现，低温处理的时间也深深地影响着蛋白质沉淀的数量以及随后分离的容易程度(图2)。总的来说，保持的时间越长，沉淀的蛋白质越多，且随后分离越容易。在给定的冰冻温度下和溶剂提取物的容量下，蛋白质冷沉淀作用所需要的时间一般在2小时到10天之间。通常情况下，冰冻7-10天是需要的。虽然，在低温下较长的时间可以促进更多的蛋白质沉淀，从而增加了蛋白质回收得率，但它也增加了蛋白质不可逆转地变性的风险，进而使恢复沉淀蛋白质的功能特性更困难甚至成为不可能。事实上，延长冰冻处理可以因广泛聚合作用而导致蛋白质组织变形。沉淀蛋白质结构的定向排列，取代了正常的聚集形式。此外，延长冰冻处理也增加了能源消耗成本。因此，冰冻最多不可超过30天。

四、融化

如果使用了冰冻温度且混合物已冻结，则融化步骤是必要的。该步骤可以通过把冰冻样品放置在高于0摄氏度以上的环境温度下，让它逐步解冻来完成。融化期间，环境温度可以变化。比如：先放置在室温下几小时，然后移入冰箱在冷藏温度下直到所有的冰晶全部融化。当然，样品的温度仍必须保持足够的低，不得超过8摄氏度，以阻止凝聚的蛋白质及其复合物分散，从而避免因随后的分离困难而减少蛋白质的回收得率。此外，让样品在太高的温度下融化，或保持太长的时间，微生物的作用会导致最终产品质量的退化。

实验还发现，与冰冻不同(快速冰冻会增强冷沉淀作用)，缓慢的融化会比快速融化导致更多的蛋白质沉淀。因此，最好是让冰冻样品在冰箱冷藏温度下缓慢地融化直到所有的冰都融化。根据样品的大小，融化过程可能会持续多天。另外，在融化过程中，还需要确保让混合物保持静止。摇动和任何突然的晃动都可能引起聚集物分散，从而使分离沉淀物和上清液变得困难。

还有，就是融化过程中，要确保样品不会因为生物作用和微生物作用而变质。

五、分离凝聚体和上清液

一旦低温处理完成，或一旦融化步骤完成(也就是冰晶彻底融化)，下一步骤就是分离沉淀物。分离沉淀物需要在尽可能短的时间内完成，最好在数小时内完成。任何传统的分离工艺，如离心，过滤等，都可以，滗析或虹吸上部清澈的上清液也可以。此外，分离时最好在一个较低的温度环境下进行，以避免冷凝蛋白质分散和发生质变。

运用冷冻沉淀作用技术，在浓缩和纯化植物蛋白质时，不可避免地会有一些蛋白质损失在上清液当中，就如同其它蛋白质浓缩方法一样。虽然，该发明描述的过程显得很简单，但在实际操作或生产过程中，确实需要极其小心谨慎来获取最理想的蛋白质产率。

上清液(即低温下可溶解物质)可以认为是该发明揭示的蛋白质分离提纯工艺过程中的一种副产品。但是，它含有许多有价值的成分。这些成分可以通过已知的方法，比如：用选定溶剂萃取，隔膜过滤，隔离，蒸发等，进一步回收。

六、恢复冷冻沉淀蛋白质的功能性

在加工条件得到适当的控制情况下，以本发明的工艺方法提取的冷冻沉淀蛋白质或蛋白质-脂类复合体是一种聚集或微粒状态。它给人的第一印象确确实实是个具有很糟糕的水溶性和功能性蛋白质产品。但是，本发明的另一个重大发现是冷冻沉淀蛋白质的溶解性和其它功能特性通过以下处理几乎可以完全得到恢复。处理方法和步骤包括：(1)将聚集蛋白质分散在水中形成浆液，(2)以下列方法之一处理浆液：(a)高切变环境，比如：高切变混合，搅拌或均质；(b)高温短时处理；(c)结合(a)和(b)两种作用，比如：直接蒸汽注射系统(通常被称为高压喷射蒸煮)。该重要发现为利用冷冻沉淀作用技术从食用原料中分离、浓缩和分提蛋白质排除了障碍，铺平了道路。

总之，当条件控制得当，相对于高温或化学处理得到的蛋白质制品来讲，用冷温处理得到的冷冻沉淀蛋白质的功能特性损失小且容易恢复。因此，低温和高切变处理是有效的，是考虑作为恢复冷沉淀蛋白质功能特性的首选方法。

具体地说，恢复冷冻沉淀蛋白质功能特性的首选方法中之一，就是先将湿蛋白质聚集体(即分离冷冻-融化蛋白质上清液之后的残留物)与0-4份重量比例的水混合。然后将混合物置于一台切变发生器中，比如：一台均质机，搅拌器，高切变混合器等。机械切变至少1分钟。温度保持在25-100摄氏度的范围内。处理后，原先的蛋白质悬浮液就变成了蛋白质溶液。

恢复蛋白质功能特性首选方法中之二，就是通过结合加热和高切变作用，比如用直接蒸汽喷射的高压喷射蒸煮器(jet cooker)来实现。当原料的NSI值低且最终产品是浓缩蛋白(没有通过除去纤维的步骤)时，这种特殊的处理显得尤为重要。此外，有时为了消除某些胰蛋白酶抑制素活性和/或降低微生物总数(巴氏灭菌法)而不得不对最终蛋白质产品进行热处理，喷射蒸煮处理法也很实用。

七、冷冻沉淀前的预处理

在冷温处理之前，有几种可以选择的处理方法。这些处理方法，有些只可应用在提取可溶性物质过程之前或之中。有些只可以在提取过程之后运用。另有一些预处理方法可以在提取之前、提取过程中或提取过程之后运用。所有这些处理可以被称为冷冻沉淀前的预处理。这些处理的目的是多样性的：

(1)增加可溶性物质(包括蛋白质)的提取率；(2)减少微生物数量以防止在随后的过程中物料变质；(3)恢复蛋白质可溶性及其它功能特性；(4)在随后的步骤中增加蛋白质的沉淀率；(5)方便随后的沉淀物和上清液的分离；(6)改善口味以及诸如最终产品的色泽等感官效果；(7)改善最终产品的组织结构和功能特性。

一种预处理方法是热处理。  可以在蛋白质提取步骤的过程中或之后进行，但应该是在低温处理步骤之前(图1)。它有多重目的，能够提高蛋白质的提取率，减少微生物数量和防止在以后的加工过程中腐烂变质。热处理还可以杀死某些酶以阻止风味损失。然而，蛋白质分离前的热处理，如果不控制得当的话，会导致蛋白质变性，降低蛋白质得率，变色及其它问题。它将影响冷冻沉淀蛋白质的分离和浓缩。

另一种预处理就是加入添加剂。其目的是为了增强冷冻沉淀作用，增加蛋白质的回收得率或改善可溶性物质和上清液的分离效果(图3)。例子包括：

(1)用水溶性溶剂取代纯水作提取溶剂；(2)提取后调节浆液或提取液的pH值到酸性范围内；(3)在提取前或提取后添加一定的添加剂，例如：已知的增强冷冻沉作用或其它功能的试剂。

冷沉淀作用通常被认为是因为冷冻排出了蛋白质周边水分而导致蛋白质分子之间相互作用而非与水结合的结果。在冷温处理前，一些可以“绑定”水的添加剂，如乙醇，硫酸铵和钙盐等可以直接添加到提取混合物(浆液或提取物)中以促进沉淀。

加入添加剂以及酸化的预处理，不仅增加冰冻时沉淀蛋白质的得率，而且通过减少对深度低温处理的要求和缩短冷冻时间而简化了工艺过程和降低成本。换句话说，提取混合物通过添加剂和/或酸化处理后，深低温冰冻和长时间冰冻就变得不那么重要了。

某些添加剂，比如：乙醇，虽然对增加冷沉淀蛋白质得率有效果，但是它们的使用通常会不可避免地增加额外的水洗或脱溶步骤以确保添加剂不被混入最终产品当中。某些添加剂，比如：钙盐，还能够破坏要提纯的蛋白质的结构使其变性。因此，选择和使用添加剂时需要特别小心。

其它分离前的预处理包括浓缩，稀释，澄清，发酵等，取决于选用的原材料，溶剂，和固/液比例以及要生产的最终产品。

多数情况下，在冰冻前，对提取液或浆液的预处理是没有必要的。

八、额外的分离后处理

在后分离阶段(冰冻和融化后)，除了恢复蛋白质功能特性的步骤外，需要运用一些额外的处理，包括：加热，巴氏灭菌，中和，脱溶，进一步分离，浓缩，干燥等。大多数额外的分离后处理步骤是可以选择性的，主要根据原料的采用，是否采用了冷冻沉淀前的预处理，或对最终产品特殊需求而定。

对于特定的最终产品，加热是必须的，以破坏胰蛋白酶抑制剂的活性，改善营养和功能特性，减少微生物数量(对产品进行巴氏灭菌处理)。任何加热方法，包括直接蒸汽喷入(高压喷射蒸煮)和间接蒸汽加热等，都可以运用。

低温处理前，如果在提取溶剂或提取液中添加了碱或酸，在分离冷冻沉淀蛋白质后，则酸碱中和步骤是必需的。如果低温处理前使用的盐液浓度相对较高，此时水洗将是必需的以除去部分盐分。

所有的分离后处理步骤完成之后，最后的步骤是干燥。各种干燥方法，比如喷雾干燥，转鼓干燥，冰冻干燥等那些只要不会严重地变性大豆蛋白质损坏其功能特性的加工过程都可以运用。

如果对上清液中所含的某些成分感兴趣，则可运用已知的方法，比如：蒸发，隔膜过滤，酸化，沉淀，溶剂分离，层析等方法，来浓缩和进一步分离这些成分。

九、分离不同的蛋白质组分

油料作物，豆类或谷物中的储藏蛋白质大都以不同的形式存在表现在不同的分子结构，分子量，物理化学特性，和最终用途。对于本发明描述的方法，即：在低温处理时通过控制温度和时间，加之预分离处理，使得多种大豆球蛋白的分离成为可能。在一个具体实验中，大豆蛋白提取液先在零下摄氏10度冷藏5小时，然后在冰箱温度下保持16小时。在此短暂的时间和冷冻温度不是很低的条件下，大分子蛋白质，比如：11S球蛋白，将先沉淀，而低分子蛋白将保留在溶液中。分离出来的沉淀物是富含11S的蛋白质组分。上清液继续更长时间保持在更低的温度下，比如：零下摄氏18度3天。这种更低的冷冻温度或超长的冷冻时间，使得分子量小的7S球蛋白沉淀。然后，通过滗析分离出富含7S的组分蛋白。最后保留在上清液中的成分是糖，矿物质或一些其它更小分子的蛋白质。两种不同的组分蛋白质产品再经过前述的处理以恢复其功能特性，最后进行干燥。

本发明揭示的逐步降低温度和增加冷冻时间的处理方法，即对上一步的上清液采用温度更低，时间更长的新处理步骤，逐步分离蛋白质组分。其原理是基于蛋白质的分子大小不同和对冷冻沉淀的敏感性不同。对冷冻沉淀高敏感的大分子蛋白质首先沉淀，而对冷冻沉淀不太敏感的较小分子蛋白质在后续的处理过程中沉淀。

十、浓缩蛋白质产品的特性

当酶活性大豆物料(全脂或脱脂均可)用作初始原料时，运用本发明最佳方法制作的最终浓缩或分离蛋白质产品具有优越的功能特性和外观。当溶解或分散在水中时，蛋白质产品具有极佳的溶解性和分散性。溶液或乳化液非常稳定。即使在冷藏温度下存放数天后，也只有微量的沉淀物。当加热溶液时，也没有多少沉淀物。当蛋白质产品浓度相对较高时(大约15％或更高)，在溶液被加热后冷却，蛋白质形成很强的凝胶。某些甚至在加热阶段就形成凝胶。

颜色也是诱人的。乳白到白色，接近牛奶的外观。在低温处理前前后，没有加热处理的实例中，其终产品颜色最白。

产品低聚糖含量非常低，类似商业化的大豆蛋白产品。此外，肌醇六磷酸也很低。

当不使用添加剂，并采用全脂或低脂大豆原料时，最终产品可以作为有机食品。同样，如使用那些通过二氧化碳临界萃取或机械方法除去油脂的脱脂大豆粕为原料，最终产品也可以作为有机食品。

以其优越的功能特性和其它特性，用本发明揭示的方法获得的浓缩蛋白质产品(大豆浓缩或分离蛋白制品)在各类食品业具有广泛的应用前景。作为食物配料使用这些制品的方法已是广为人知。

十一、利用自然温度变化

虽然在此揭示的新工艺与传统工艺相比具有许多优势，包括：不用或少用化学剂，产生废液少，生产浓缩和分离蛋白的过程和设备相似，最终产品具有卓越的功能特性，诱人的外观，富含有益的植物化学成份等等，但是它并不是没有什么缺陷。新方法的最大缺陷之一就是在冰冻和融化过程中需要消耗巨大的能量。

为了克服这个缺陷，需要借助于冬季和/或北方自然的低温，或者地理区域之间的自然温度变化的优势来形成和利用自然冰冻和融化的工艺。

比如：冰冻步骤可以在冬春季温度达到低于冰点的地区户外进行。为了进一步节约能源，冰冻和融化可以在两个各自独立的地区操作，即：冰冻在寒冷地区进行，然后运送到附近温暖地区进行融化。或者在温度达到低于冰点的高山顶峰冰冻，而融化则在温度达到冰点以上的山谷间进行。利用这些自然途径中的任何一种，该发明揭示的工艺就可能成为一种绿色和低耗能的植物蛋白质浓缩和提取工艺。

十二、从上清液中提取有价值的成分

分离出冷沉淀蛋白质后，上清液(冷溶解组分)通常被视为是蛋白质分离过程中的副产品。但是，由于此发明不用或少用化学剂来分离蛋白质，上清液相对清澈，这为回收和利用其中许多有价值的组分提供方便。

原始大豆原料中的自然成分大都是水溶性。它们包括：可溶性碳水化合物(大多为低聚糖)，小分子蛋白质和肽，肌醇六磷酸，磷脂，矿物质，水溶性维生素(比如：硫胺素，核黄素，烟酸，泛酸和叶酸)等。这些成分许多都具有生物活性，是促进人体健康极有价值的植物化学物质。因此，有必要回收这些组分当中的一部分。

此外，在冷冻沉淀后，当提取和分上清液中的化学成分是主要目的时，此上清液成为关注的焦点。

冷冻-融化处理后，回收可溶性的碳水化合物，生物活性蛋白质和多肽，例如：胰岛素抑制剂，lunasin及其它存在于上清液中的成分，需要另外的步骤，包括但不局限于：浓缩，超滤，酸沉，酒精浸提，丙酮浸提，钙沉淀，另一轮的低温处理，浓缩，水洗，干燥以及这些处理方法的组合。

对含有生物活性物质的上清液体进行浓缩的方法有多种，包括在加热和减压条件下浓缩，在加热和常压下浓缩，用喷雾干燥机或转鼓干燥机浓缩，用冷冻干燥浓缩，其中在加热和减压的条件下浓缩为最好。

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：提取温度的影响作用

为了研究提取温度对蛋白质提取率以及随后冰冻-融化处理时的沉淀作用的影响，采用以下实验：原料是NSI值为84的脱脂豆粕(白片，即酶活性脱脂豆粕)。用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入1000毫升水。每次实验水温变化依次为25，50，70，80，90和100摄氏度。加入70克豆粕后，高速搅拌混合物2分钟。浆液样品立刻用布过滤。纤维部分丢弃。测定滤液中蛋白质含量。滤液放置在家用冰箱冰冻室内冰冻5天，然后，在冰箱冷藏温度下融化48小时。

冰冻-融化处理使得从脱脂豆粕提取滤液中的蛋白质沉淀。上清液被小心谨慎地滗出并测量蛋白质含量。残留物就是沉淀的蛋白质。通过对比原始提取液中蛋白质含量和冰冻-融化处理之后上清液中蛋白质含量的差别来计算出沉淀的蛋白质数量。

图1显示了水温对从大豆豆粕中提取蛋白质以及随后经过低温处理后分离的影响作用。提高温度，蛋白质萃取得率先增加后降低，在50摄氏度时，萃取得率最高。另一方面，提取温度对冰冻-融化处理后的蛋白质沉降几乎没有影响。总之，大约65-78％的蛋白质可以被提取出来。大约73％的提取蛋白质经冰冻-融化处理后可以沉淀下来。因此，在本实验中，蛋白质的回收率大约为47-57％。

实施例2：冷温处理时间对蛋白质冷冻沉淀的影响

用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入1000毫升自来水和75克脱脂豆粕(NSI值为84)混合，立刻高速搅拌1.5分钟。浆液用布过滤。纤维部分丢弃。滤液分别倾倒入6个瓶子中，每个瓶装100毫升。留下一个滤液作为零时间冷冻的样品。测试它的蛋白质含量。其它六个样品放置在家庭冰箱中的冷冻室内冷冻，时间分别为4小时、12小时、1天、2天、4天和6天。在达到6个冷冻时间后，样品依次被拿出，放置在室温下融化3小时，然后再放在冰箱里融化20小时。冰冻-融化处理使提取液中的蛋白质沉淀。将上清液小心滗出并保存。搅拌后用来检测蛋白质浓度。通过对比原始提取液中蛋白质含量和冰冻-融化处理之后清澈的上清液中蛋白质含量的差别来计算出沉淀蛋白质的数量。

另一组实验采用同样的过程和步骤，但使用的是84克全脂大豆粉(100目颗粒，酶活性)。

图2显示了结果。在该试验的有限容量和条件下，随着冰冻时间的增加，以冰冻前原始滤液中总蛋白质含量的百分比表示，则沉淀蛋白质的数量也增加。在冰冻的最初3日内，增加量是引人注目的。3天之后，更长的冰冻时间对冷沉淀蛋白质的数量增加没有多大的作用。这个增加低温处理时间对沉淀蛋白质百分比变化图线对于脱脂和全脂大豆样品都是相似的，但是全脂大豆原料在达到相同的冷沉淀水平时需要的冰冻时间要短。

实施例3：添加剂或酸化对蛋白质冷冻沉淀的影响

为研究一些添加剂或调节pH值的影响作用，下面的实验采用的是全脂大豆粉(100目颗粒，酶活性)。用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器(奥斯特牌)，加入75克全脂大豆粉和1000毫升自来水然后搅拌2分钟。浆液立刻用布过滤。纤维部分丢弃。滤液用来测量蛋白质含量。提取的滤液分成7份，每份等量100毫升。依次加入以下化学剂并达到特定的浓度：氯化钠0.5％，氯化钠1.0％，氯化钙0.15％；和乙醇20％。用盐酸调节两份萃取物的pH值分别达到6.0和5.5。没有加入添加剂的水体溶剂提取液作为对照。搅拌后，样品放置在家庭冰箱中的冷冻室内(温度大约-18摄氏度)冰冻5天，然后在冰箱温度下彻底融化。冰冻-融化处理使提取滤液中的蛋白质-脂类复合物沉淀。将顶部上清液小心滗出以测量蛋白质含量。每种处理方法和对照的蛋白质沉淀百分比如图3。结果显示，乙醇，酸化和添加氯化钙非常明显地增加了蛋白质冷冻沉淀的产量。对比之下，氯化钠的添加量在0.5％或1％浓度下实际上减少了沉淀蛋白的数量。结果还显示，在冰冻-融化处理条件下，轻微的酸化，例如：调节pH值到5.5可以明显地增加蛋白质沉淀。相对比，在常规的分离蛋白质生产工艺中，为了使大多数的蛋白质沉淀，pH值不得不调节到一个很酸的范围，如：大约4.5。带有一定添加剂以及酸化的预处理，不仅能够在给定点冰冻温度下增加沉淀蛋白质的产量，而且还可以简化工艺降低对深度冰冻的要求。

实施例4：蛋白质功能恢复

冰冻-融化过程后恢复蛋白质功能特性是一个非常重要的步骤。本例中，用的是通过实施例1制得的沉淀蛋白质样品。加入2倍体积的水后缓慢混合，不会溶解和分散蛋白质沉淀物。但是，当用搅拌器高速搅拌1.5分钟后，全部样品的所有凝聚颗粒全部溶解和分散了。蛋白质的溶解性和分散型几乎达到100％。溶液或乳化液非常稳定。即使在冰箱内储存多天，底部也没有多少沉淀物产生。

在另外一套实例中，沉淀蛋白质和2倍体积的热水混合并轻轻搅拌。大多数的颗粒都溶解和分散。不过，相对于均质或高切变处理，单独加热处理对恢复蛋白质功能的效果显得不佳。结合两种作用，加热和高切变，可以说是高效的。

实施例5：生产分离大豆蛋白

用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入1000毫升自来水和75克酶活性脱脂豆粕(NSI值为84)混合，然后高速搅拌1分钟。浆液用布过滤。纤维部分丢弃。提取滤液放置在家庭冰箱中的冷冻室内冰冻5天，然后在室温下融化3小时，再放在冰箱里40小时。冰冻-融化处理使得提取液中的蛋白质沉淀。将上清液小心滗出并保存。剩余物就是分离蛋白质，将它先与1倍量的水混合，然后用家用搅拌器将悬浮液高速搅拌2分钟。它就成了稳定的乳化液并具有诱人的奶白色泽(几乎就像牛奶一样白)。

实施例6：生产浓缩大豆蛋白

生产工艺其与实施例5相同，所不同的只是在冷温处理之前没有过滤，纤维成分没有除去。浆液直接冰冻。最终产品就是具有良好溶解性和色白诱人的浓缩大豆蛋白。

实施例7：生产全脂大豆浓缩蛋白

用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入1000毫升自来水和100克酶活性全脂大豆粉(100目颗粒)，然后高速搅拌1分钟。浆液过滤以除去纤维。滤液放置在家庭冰箱中的冷冻室内冰冻6天，然后在冰箱温度下融化2天。冰冻-融化处理使得提取滤液中的蛋白质-脂类彼此结合共同沉淀。将顶部上清液小心滗出。剩余物就是全脂大豆浓缩蛋白。与2份的水混合后，用家用搅拌器高速搅拌2分钟，一种具有卓越稳定性和诱人色泽的稳定乳化液产生了。

实施例8：在冬季生产大豆浓缩蛋白

本实验是在美国密苏里州的冬季进行的。用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入1000毫升自来水和100克100目的酶活性脱脂豆粕(大豆白片)，然后高速搅拌1分钟。重复5次得到约5000毫升的浆液。将5次得到的浆液混合倒入一个6升的塑料容器中。容器放置在室外的院落中让其冷冻。室外冰冻7天后，容器取回屋内缓慢融化。完全解冻后，将上清液小心滗出。残余物就是浓缩大豆蛋白。与1份水混合后，用家庭搅拌器高速搅拌2分钟，一种具有卓越稳定性和诱人色泽的稳定乳化液产生了。

实施例9：大豆蛋白成分的分提

用一只1.5升的杯子置于一个家用搅拌器，加入150毫升自来水和20克酶活性脱脂豆粕(NSI值为84)混合，然后高速搅拌30秒。浆液过滤。滤液在置于冰冻室(零下18摄氏度)前测定总蛋白质含量。冰冻8小时后，样品先在室温内解冻2小时，然后放在冰箱温度下过夜。将上清液小心滗出并保存。检测它的蛋白质含量。沉淀物是一类富含11S的组分，包含有原始滤液中总蛋白质的大约35％。上部的溶液再次被冰冻3天，融解冻后，上清液再次小心地滗出并检测它的蛋白质含量。此残余物是富含7S的组分，占原始滤液中总蛋白质的大约30％。将富含11S和7S的蛋白质组分与2倍重量的水相混合后，用家庭搅拌器高速搅拌2分钟。两种蛋白质溶液都具有优越的稳定性而且呈乳白色。

实施例10：从悬清液中回收溶解性碳水化合物

从实施例5中得到的上清液，通过一个隔膜超滤系统过滤，该系统只允许分子量小于1000道尔顿的物质通过。将通过此隔膜超滤的液体浓缩和干燥，制成富含大豆可溶性碳水化合物的产品，其成份主要是蔗糖，蜜三糖和水苏四糖。未通过隔膜超滤体系的新的上清液，干燥后所得到的产品富含生物活性蛋白质和多肽，包括胰岛素抑制剂和lunasin等。

Claims (16)

1.一种从富含蛋白质的植物原料中提取和浓缩蛋白质的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备富含蛋白质的植物原料；

(2)将制备的植物原料和一水性介质混合；

(3)在低温下保持该混合物；

(4)必要时融化上述混合物；

(5)分离上清液和沉淀物组分；

(6)恢复沉淀物组分的功能特性；

以此得到的浓缩或分离植物蛋白具有优越的功能特性，风味，感官和营养价值。

2.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征在于所述水性介质可以是水、碱液、盐溶液或缓冲溶液；所述植物原料可以是大豆、低芥酸菜籽、花生、棉籽、葵花籽或其它油料作物的种子。

3.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征在于所述步骤3的低温范围是大约摄氏零上8度到大约摄氏零下80度之间，低温处理的时间范围是大约2小时到大约30天。

4.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征是在步骤3中所述的将混合物置于低温之前，从混合物中除去不溶性物质。

5.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征是在步骤3之前还包括一个预处理步骤，可以是加热，酸化，加入添加剂，浓缩，稀释，澄清，发酵或其任一组合方法。

6.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征是所述步骤6由以下亚步骤组成：

(6a)将沉淀物组分加水制备成水溶性浆液，

(6b)对水溶性浆液，从切变，加热和其组合方法中选取一种加工方法。

7.如权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法，其特征是在步骤6之后，从加热，中和，干燥和其组合方法中选取一种加工方法。

8.以权利要求1所述提取和浓缩蛋白质的方法生产获得的浓缩蛋白。

9.以权利要求4所述提取和浓缩蛋白质的方法生产获得的分离蛋白。

10.一种从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备富含蛋白质的植物原料；

(2)将上述植物原料与水介质混合；

(3)从混合物中除去非溶性物质；

(4)低温下保持含有可溶性物质的提取液；

(5)需要时，融化上述提取液；

(6)将上清液和沉淀物分离；

(7)重复步骤4，步骤5和步骤6；

(8)对每一个沉淀物组分，恢复其功能特性。

11.如权利要求10所述的一种从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法，其特征在于所述步骤4中低温是大约零上摄氏8度到大约零下摄氏80度，低温处理时间是约2小时到约20天。

12.如权利要求10所述的一种从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法，其特征是在步骤7中低温处理过程中，与前面所述的环节相比，温度更低，保持的时间更长。

13.如权利要求10所述的一种从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法，其特征是所述步骤8由以下亚步骤组成：

(8a)将沉淀组分加水制备水溶性浆液，

(8b)对水溶性浆液，进行从切变、加热和其组合方法中选取一种加工方法。

14.以权利要求10所述从富含蛋白质的植物原料中提出和分提蛋白质的方法生产获得的植物蛋白质组分。

15.一种从植物原料中提取和浓缩生物活性物质的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备含有生物活性物质的植物原料；

(2)将制备的植物原料与一溶剂混合以提取生物活性成分；

(3)在低温下保持上述的混合物；

(4)需要时融化混合物；

(5)将沉淀组分和富含活性物质的上清液分离；

(6)从上清液中分离和浓缩出生物活性物质。

16.如权利要求15所述的一种从植物原料中提取和浓缩生物活性物质的方法，其特征在于所述溶剂是从水、碱溶液、盐溶液、缓冲溶液、有机溶剂、有机混合溶剂和水性有机溶剂中优选的一种；所说的低温是大约零上摄氏8度到大约零下摄氏80度。

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