CN101117623B - 一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌及其获得方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产生金属蛋白酶的巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)CGMCC No1622.和获得此菌株的生产方法。通过设计DNA引物，运用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503的总DNA中扩增得到了1005碱基，将其克隆于pMD18-T载体上，对所获得的基因进行序列分析测定，含有高温中性蛋白酶基因EMP，片段大小为942个碱基，表达314个氨基酸，并利用枯草芽孢杆菌系统上进行验证，确认了所获得的基因。为能进行规模化发酵生产，提高酶产量方面提供了一条有效的途径。

Description

一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌及其获得方法 

发明领域 

本发明涉及微生物及微生物发酵领域。具体的说，本发明涉及一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌及其获得方法。 

背景技术

金属蛋白酶是一类活性中心为金属离子的中性蛋白酶。而蛋白酶作为一大类生物酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面。而高温蛋白酶具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等特性和优点，尤其是在耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等方面具有比较强的优点，有重要的应用价值，不仅如此，对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们蛋白质工程技术改造天然酶，从而提高其稳定性提供理论依据。但是，现有高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。 

根据新疆农科院微生物应用研究所1992年从新疆吐鲁番火焰山土壤中分离筛选到一株高温中性蛋白酶产生菌，该菌种经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)CGMCC NO0800(以下简称XJT9503菌)，经试验研究，确定了产酶最佳条件及酶的稳定性试验，确立了一整套科学的发酵工艺技术路线，发酵平均酶活均在10000u/ml以上，具有好的热稳定性，其最适反应pH 7.0-7.2，最适反应温度65℃，弥补了一般中性蛋白酶的不足，该技术体系已经申报国家发明专利(专利申请号为02158191.6)。 但是由于原始菌株很不稳定，在实验过程中客观存在菌种退化，造成酶产量下降，不稳定的现象。 

在工业上常用枯草杆菌，耐热芽孢杆菌，灰色链霉素，寄生曲霉，米曲霉等生产蛋白酶。利用常规生物发酵技术常因微生物生长、代谢等因素使产生的蛋白酶量有限，生产成本较高，限制了广泛使用。而且原始菌常常不稳定，使生产也出现不能正常进行的情况。因此，基因工程在酶工程领域的应用是近年来国际酶工程研究的热点，运用基因工程可改善原有酶的各种性能，如提高酶产率，增加酶的稳定性，使其在提取工艺和应用过程更易操作等优点。目前，世界上最大的工业酶制剂生产商麦诺和诺德公司(novo Nordisk)酶制剂生产菌株80％是基因工程菌。 

甲醇酵母表达系统(The Pichia Expression System)是近几年发展起来了一种表达系统，由于它综合了高表达量，容易操作，生长费用低，可将重组蛋白正确折叠并修饰等优点，使得Pichia Expression System不仅适合一般科研使用，而且也适合于工业生产。目前此系统表达量最高的破伤风毒素片段C可达12g/L，可见它在生产外源蛋白方面具有诱人的前景。国内有报道一般中性蛋白酶是将枯草芽孢杆菌A.S1398的中性蛋白酶基因，转移到“毕赤氏酵母”(甲醇酵母)细胞，酶活力已达到30000U/ml，该菌生产容易，抗污染能力强，有很好的市场前景。 

利用基因工程手段对微生物的代谢产物进行改造，既能克服原始菌不稳定的缺点，又能提高酶产率，对于更好得利用微生物为人类造福有重大意义。 

发明内容

针对现有国内外耐高温金属蛋白酶出发菌株存在产酶不稳定，酶活性不高，其耐高温特性不能稳定表达的特点。 

本发明提供能稳定产耐高温金属蛋白酶的基因工程菌。本发明采用PCR方法而获得金属蛋白酶的基因，在获得基因后，根据酵母的密码子偏爱性，利用定点突变技术进行改造，将其克隆到表达载体上，转化巴斯德酵母获得基因工程菌株，并进行发酵生产，这是一条提高酶产量的有效途径。 

本发明提供了一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌-巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)CGMCC No 1622。 

本发明还提供了获得这种耐高温金属蛋白酶基因工程菌的生产方法。该方法已具备规模工业化生产能力。 

同时，本发明提供了耐高温金属蛋白酶基因工程菌基因序列SEQ IDNO：1。 

本发明提供一种能在巴斯德毕赤酵母中有效表达的耐高温的金属蛋白酶基因序列SEQ ID NO：2，此序列是在SEQ ID NO：1序列基础上定点诱变而成，所编码的氨基酸密码子可以在巴斯德毕赤酵母中有效表达。 

本发明还提供能将耐高温的金属蛋白酶基因分泌表达到酵母细胞外的重组质粒，此质粒包含能在巴斯德毕赤酵母中有效表达的耐高温的金属蛋白酶基因序列。 

具体地，本发明提供了一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌菌株，编号 为xjemp。通过采用PCR方法获得耐高温金属蛋白酶的基因，在获得基因后，根据酵母的密码子偏爱性，利用定点突变技术进行改造，将其克隆到表达载体上，获得基因工程菌株，经微生物学鉴定，属于耐高温金属蛋白酶的巴斯德毕赤酵母。 

本发明提供了一种耐高温金属蛋白酶基因工程菌菌株，命名为xjemp，其能够稳定地生产耐高温金属蛋白酶。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，邮编：100080。保藏日期是2006年2月20日，保藏号是CGMCC.No1622。经微生物学鉴定为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。该菌株能在YPD培养基表面生长，菌落呈白色，突起于培养基表面，菌落表面湿润，有油脂光泽。该菌种可在28-32℃及pH 6.8-8.5范围内均可生长；依照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第八版，按照形态学测定，生理生化检测，该菌为巴斯德酵母菌属中的成员，定为巴斯德毕赤酵母菌。该菌种能产生耐高温金属蛋白酶，在pH6.0-8.0，温度在40-70℃范围内均有酶解特性，其最适酶解条件为65℃、pH7.2。本发明进一步建立菌种保藏、复壮及选育的系统工艺流程技术。 

同时，本发明提供了一种获得耐高温金属蛋白酶基因工程菌菌株的技术方案。具体的获得耐高温金属蛋白酶基因工程菌株工艺步骤如下： 

1.获得耐高温金属蛋白酶基因序列； 

2.将耐高温金属蛋白酶基因序列在巴斯德毕赤酵母中有效表达； 

3.获得耐高温金属蛋白酶基因分泌表达到酵母细胞外的重组质粒； 

4.获得耐高温金属蛋白酶基因序列的酵母菌。 

本发明所述的耐高温金属蛋白酶基因序列的获得，本发明具体通过设计DNA引物，用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503的总DNA中扩增得到了1005碱基，将其克隆于pMD18-T载体上，从而获得含有高温中性蛋白酶基因EMP，片段大小为942个碱基，表达314个氨基酸。 

本发明所述的将耐高温金属蛋白酶基因序列在巴斯德毕赤酵母中有效表达，本发明具体根据酵母密码子的偏爱性，利用PCR技术对不利于酵母表达的氨基酸进行了密码子替换，从而获得能有效在巴斯德毕赤酵母酵母中有效表达的高温中性蛋白酶基因序列。 

本发明所述的获得耐高温金属蛋白酶基因分泌表达到酵母细胞外的重组质粒，本发明具体通过，设计一对引物，将改造的基因两端分别加上EcorI，NotI两个酶切位点经酶切与EcorI，NotI双酶切酵母表达载体pPIC9K载体连接构建载体9TE。 

本发明所述的获得耐高温金属蛋白酶基因序列的酵母菌，本发明具体通过，将构建的好的载体9TE经过电转化方法转化蛋白酶缺失株SMD1168，经G418筛及选提取染色体做PCR鉴定确定为重组菌，将重组菌进行甲醇诱导的发酵，均有耐高温的金属蛋白酶产生。 

本发明还提供了耐高温金属蛋白酶基因工程菌的筛选方法。将挑取新鲜菌落接种BMGY培养基，28℃230rpm培养三天左右后，离心收集菌体，复接种于BMMY培养基内，28℃230rpm震荡，分别在0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样一毫升，做最佳表达条件的选择实验，由于我们构建的表达载体是分泌性表达，取上清在筛选培养 基上(含酪素的LB培养基)60℃反应看是否有透明圈即可确定是否有表达。 

本发明进一步具体阐述获得耐高温金属蛋白酶基因工程菌菌株工艺步骤： 

1.本发明中耐高温金属蛋白酶基因序列的获得。 

根据本领域公开的技术资料设计了DNA引物，用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503的总DNA中扩增得到了1005碱基，将其克隆于pMD18-T载体上(购自TAKARA)，得到质粒pEMPT，利用该质粒对所获得的基因进行序列分析测定，含有金属蛋白酶基因EMP，片段大小为942个碱基，表达314个氨基酸。 

将得到的基因与枯草芽孢杆菌载体pPL608连接，转化蛋白酶缺失菌枯草菌AB97013上，将再生培养基上生长的菌转印于含酪素培养基上筛选有透明圈产生的菌，提取质粒pPLE进行酶切，PCR鉴定，其结果证明得到的基因即为金属蛋白酶基因。 

将产物浓缩经非变性聚丙酰胺凝胶电泳，将条带切下后放在含酪素的筛选培养基上，65℃反应两小时，有透明圈产生。本领域技术人员所熟知，证明此蛋白酶基因即为高温酶蛋白酶基因。 

2.本发明可获得能将耐高温金属蛋白酶基因在酵母细胞中分泌表达的重组质粒。 

在获得高温中性蛋白酶基因EMP后，根据酵母密码子的偏爱性，对所 得到的基因进行分析，发现有表达量为零的氨基酸密码子，利用PCR技术对不利于酵母表达的氨基酸进行了密码子替换，获得了能有效在酵母，特别是巴斯德毕赤酵母中有效表达的高温中性蛋白酶基因序列。 

本发明的目的切位点经酶切与EcorI，Not I双酶切酵母表达载体pPIC9K载体(购自Invitrogen)连接构建载体9TE，经鉴定后结果证明基因改造成功，阅读框正确。鉴定是这样实现的：设计一对引物将改造的基因两端分别加上EcorI，NotI两个酶利用以下方法：EcorI，NotI酶切，用特异性引物进行PCR鉴定，通过测序最后验证。 

以上一系列实验步骤基本上是本领域技术人员已知的，例如技术人员可以利用J.Sambrook等人的《分子克隆实验指南》(科学出版社(1992))指导的方法容易地实现本发明的目的。 

3.本发明中含有耐高温金属蛋白酶基因序列酵母菌的获得。 

将上述构建的载体SacI线性化后转化巴斯德毕赤酵母蛋白酶缺失株SMD1168H，转化方法为电转化，受体菌80ul，SacI线性化的载体9TE DNA5-10ug，电击(电压1.5kv，电容25uF，电阻186Ω)，转化子经G418筛选及提取染色体做PCR鉴定确定重组菌，得到的基因工程菌，将这些株菌进行甲醇诱导的发酵，均有蛋白酶产生。 

4.本发明中耐高温金属蛋白酶基因序列在巴斯德毕赤酵母中的有效表达及耐高温金属蛋白酶基因工程菌的筛选方法。 

将重组菌在YPD平板上划线，30℃静置培养过夜，挑取新鲜菌落接种BMGY培养基，28℃250rpm培养三天左右后，至OD₆₀₀＝2-6，离心收集菌体， 复接种于BMMY培养基内至OD₆₀₀为1，28℃230rpm震荡，分别在0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样一毫升，做最佳表达条件的选择实验，由于我们构建的表达载体是分泌性表达，取上清在筛选培养基上(含酪素的LB培养基)60℃反应看是否有透明圈即可确定是否有表达。在筛选培养基上用打孔器打孔，将培养物的上清加入孔中，65℃温箱内反应一小时观察透明圈是否出现就可筛选出工程菌，并可利用透明圈的大小既可判断出哪一个工程菌产量较高。 

5.本发明获得的基因工程菌产生的耐高温金属蛋白酶的最适反应温度与最适反应PH的测定。 

依据测定酶活的方法，在测试过程中温度定为30℃，40℃，55℃，65℃，70℃测酶活，测定结果证明65℃时酶活最高；在测试过程中将酶作用的PH做一范围：PH 6.0，PH 6.5，PH 7.0，PH 7.2，PH 7.5，PH 8.0，测定结果证明PH7.2时酶活最高。 

通过实施本发明具体的技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。 

通过本发明可以获得能稳定生产耐高温的金属蛋白酶的基因工程菌，产高温蛋白酶的出发菌株一般产量低、不稳定，而利用本发明巴斯德毕赤酵母为宿主菌构建的高温金属蛋白酶的基因工程菌比较稳定，毕赤酵母自身所产蛋白较少，所产高温金属蛋白酶纯化较容易，纯化后的高温金属蛋白酶质地较纯，含杂质较少，而原始菌株自身蛋白较多，纯化困难，含杂质较多。本发明为对于更有效的利用微生物为人类造福提供一个途径。 

附图说明

图1显示为染色体PCR的电泳图 

图号说明：M：1.5kb Maker  1，2阴性对照  3，PCR产物 

1.5kb maker：15000，10000，7500，5000，4000，2500，2000，1000，750，500，250，100(bp) 

图2显示为pMD18-TE质粒PCR酶切鉴定 

图号说明： 

1.5kb maker：15000，10000，7500，5000，4000，2500，2000，1000，750，500，250，100(bp) 

1kb maker：10000，8000，6000，5000，4000，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250(bp) 

图3显示为蛋白酶基因的验证 

图4显示为质粒pPLE进行酶切，PCR鉴定 

图号说明：M：1kb maker  1、PCR鉴定结果  2、酶切鉴定结果 

1kb maker：10000，8000，6000，5000，4000，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250(bp) 

图5显示为三对定点突变引物的PCR电泳图 

M：100bp Maker 1、引物1、2PCR结果 2、引物 3、4PCR结果 

3、引物5、6PCR结果 

100bp maker：3000，2000，1500，1200，1031，900，800，700，600，500，400，300，200，100(bp) 

图6显示为突变的PCR 

图号说明：M：1kb Maker  1、突变的PCR 1kb 

100bp maker：3000，2000，1500，1200，1031，900，800，700，600，500，400，300，200，100(bp) 

1kb maker：10000，8000，6000，5000，4000，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250(bp 

图7显示为EMP基因定点改造方案 

图8显示为9TE Ecor I，Not I酶切鉴定 

1.5kb maker：15000，10000，7500，5000，4000，2500，2000，1000，750，500，250，100(bp) 

图9显示为9TE PCR鉴定 

图号说明： 

1kb maker：10000，8000，6000，5000，4000，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250(bp) 

图10显示为酵母染色体PCR鉴定图 

图号说明：1、2为重组转化子PCR鉴定图扩出1.4左右片段(引物为载体上游引物，EMP下游引物)；3为空载体转化子PCR鉴定(引物为载体上游引物，EMP下游引物)；4为空载体转化子PCR鉴定(引物为3′AOX，5′AOX) 

1kb maker：10000，8000，6000，5000，4000，3000，2500，2000，1500，1000，750，500，250(bp) 

图11显示为蛋白酶酵母表达平板检测 

图号说明：2、5、7为重组菌株，9K为空载体转化对照对照 

图12显示为工程菌所产酶最适温度测定曲线 

图13显示为工程菌所产酶最适PH测定曲线 

具体实施方式

实施例1：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)CGMCC NO0800高温金属蛋白酶的扩增及验证。 

通过设计一对引物序列：EMP1 ATA CGG GTG GTT GAC ACT 

                      EMP2 ACA TGA ATA TGG CTA GTT TGC 

利用XJT9503菌的染色体为模板，PCR扩增出1005bp的片段EMP，PCR反应在50μl体系里进行。取XJT9503提取的DNA1μl做模板，依次加入灭菌去离子水20μl，Taq酶混合溶液25μl，EMP12μl(25pmol)，EMP22μl(25pmol)，于PCR自动循环仪内扩增高温中性蛋白酶基因，循环参数为：94℃变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数为30个， 最后72℃延伸10min，循环结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外下观察，分析PCR产物，参见图1。 

将此片段连接于pMD18-T载体上(pMD18-TE)，连接条件：EMP基因PCR产物10.5ul，pMD18-T载体0.5ul，Solution I 9ul，总体积20ul，16℃，连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，加筛选底物IPTG，X-gal。挑取白色菌落提取质粒命名为pMD18-TE，经EcorI，HindIII酶切鉴定及引物EMP1、EMP2 PCR扩增鉴定证明扩增片段已与pMD18-T载体连接上后，参见图2，测序，测序结果经分析发现该序列共有核苷酸1005bp，包含一个942bp完整的阅读框。将这一完整的阅读框在基因BANK网上BLAST比较与Bacillus subtilis extracellular metalloprotease(mpr)gene有98％相似性。 

利用枯草芽孢杆菌表达系统对所得的基因进行验证：将得到的基因用XbaI，PstI两个酶从pMD18-TE上切下与已用XbaI，PstI枯草芽孢杆菌载体pPL608连接，连接条件：EMP基因7.5ul，载体1.5ul，连接缓冲液2ul，连接酶1ul，用水补足体积至20ul。16℃连接过夜，将连接产物转化蛋白酶缺失菌枯草菌AB97013上，转化方法如下： 

1.将受体菌AB97013接种于5ml LB培养液内(1％蛋白胨，0.5％的酵母抽提物，1％氯化钠)，至对数生长期，离心收集菌体，将菌体重悬于4mlSMMP+BSA液(每100ml里含蔗糖34.23克，马来酸0.464克，氯化镁0.813克，牛肉膏0.6克酵母提取物0.6克，蛋白胨2克葡萄糖0.4克氯化钠1.4克，磷酸氢二钾1.472克，磷酸二氢钾0.528克，2％BSA)。 

2.在上述菌悬浮液中加入1ml新配的溶于SMMP的溶菌酶(50mg/ml)， 混匀后37℃保温20-40分钟，用显微镜检查菌液，至95％的细菌都成了原生质球即可停止保温。在室温下3000转离心收集原生质球，用5ml SMMP+BSA洗原生质球一次，重悬于4ml SMMP+BSA液内。 

3.另一个离心管中加入约10微克连接产物加入等体积的2XSMM，加入0.5ml原生质球液，再加入1.5ml的聚乙二醇液轻轻混匀，两分钟后加入5ml SMMP+BSA，立即在室温下3000转离心，用滴管吸去上清液。小心地将转化的原生质球液悬浮在1mlSMMP+BSA，37℃保温90分钟。用SMMP液稀释原生质球，涂布于再生培养基DM3上(每100ml含琼脂0.8克，1M琥珀酸钠50ml，5％水解酪蛋白ml，10％的酵母提取物ml，3.5％的磷酸氢二钾-1.5％磷酸二氢钾10ml，50％葡萄糖1ml，2M的氯化镁1ml，2％BSA1ml)，37℃静止培养3-4天。 

将再生培养基上生长的菌转印于含酪素培养基上筛选有透明圈产生的菌，参见图3，提取质粒pPLE。枯草芽孢杆菌质粒提取方法如下： 

1.收集1.5ml培养物的菌体，用300ul 0.02MTris-0.01MEDTA缓冲液洗菌体1-2次，重悬于300ulTE内，加75微克溶菌酶(终浓度为250ug/ul)，37℃保温20分钟，加入1.5ulRNA酶，37℃保温20分钟，加入60ul 10％SDS，37℃保温约5-10分钟至溶液变为澄清而透明。 

2.加入40ul 5M NaCl，冰水浴3-4小时，沉淀蛋白质和染色体，10000转，离心20分钟，弃沉淀，上清用蛋白酶k 0.5ul(20mg/ml)处理，37℃保温20分钟。 

3.加入等体积的重蒸酚温和震荡5分钟，4000转离心15分钟，提取水相，酚-氯仿-异戊醇抽提一次，加入2.5倍无水乙醇沉淀，-20℃，过夜， 12000转离心20分钟，弃上清，沉淀溶于30ul TE中。 

将质粒pPLE进行酶切，PCR鉴定，参见图4，其结果证明得到的基因即为EMP蛋白酶基因。 

将利用枯草芽孢杆菌系统表达的产物跑非变性聚丙酰胺凝胶电泳，将条带切下后放在含酪素的筛选培养基上，65℃反应两小时，有透明圈产生。证明我们得到的此蛋白酶基因即高温酶蛋白酶基因。 

实施例2：耐高温金属蛋白酶基因的改造 

据酵母的密码子偏爱性，分析所得到的基因发现编码一些氨基酸的密码子表达量低甚至表达量为零，设计三对引物对这些密码子做了定点诱变以改造基因，参见图5、图6；改造方案参见图7。 

P1：GCACGAATTCATACGGGTGGTTGACACT 

P2：TGTAGTACGGTAGCCGTACCAG 

P3：GGCTACCGTACTACAAACAGCAGC 

P4：GTTACGATAAACAGGCGAGCCGCTTTG 

P5：CCTGTTTATCGTAACTACAGTGATACAGG 

P6：GTACGCGGCCGCACATGAATATGGCATGTTTGC 

分别以引物P1，P3配对，P4、P5配对，P6，P2配对以质粒pMD18-TE为模板做PCR，条件94℃变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数为30个，回收上述PCR三段产物，再将这三段混合做模板，以P1、P2配对做引物，扩出一长段产物，即为改造基因。 

实施例3：酵母表达载体的构建及含有耐高温金属蛋白酶基因的基因 工程菌的获得 

将改造的基因经EcorI，NotI酶切与EcorI，NotI双酶切酵母表达载体pPIC9K载体连接构建载体9TE，经鉴定后测序结果证明基因改造成功，阅读框正确，参见图8、图9。 

将已构建好的酵母表达载体，SacI线性化CIAP去磷酸化，电转化蛋白酶缺失酵母菌株SMD1168，转化方法如下： 

1.取一SMD1168单菌落于5m1YPD培养液中，30℃震荡过夜，取20ul已培养好的菌接入100mlYPD培养液中，30℃培养直至细胞密度达1-2A OD₆₀₀。根据公式12A OD600＝5X10⁷cell/ml计数细胞。 

2.收集细胞在8ml预处理液(100mM醋酸锂，10mM DTT，0.6mM山梨糖醇，10mM Tris-Hcl，PH＝7.9)内，室温放置30分钟。 

3.离心收集细胞，重悬于1.5ml冰欲冷的1M山梨糖醇内，洗上三次，重悬细胞至细胞浓度为10¹⁰cell/ml。 

4.将细胞与溶3ngDNA的1ul水混合，放在0.2cm狭逢的电转化杯内，冰上放置5分钟。 

5.脉冲电压1.5KV、25uF，电击，电转化的细胞用1ml1M冰欲冷山梨糖醇稀释。转化菌涂布于RDB平板上(1M山梨糖醇，2％葡萄糖，1.34％YNB，4X10^-5生物素，2％琼脂)30℃培养4-6天。 

将菌落转接于筛选平板含G418的YPD板(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)，接单菌落于液体YPD摇菌提染色体，方法如下： 

1.1500g，5分钟离心收集细胞，用无菌水洗一遍细胞，用200ul SCED缓冲液(1M山梨糖醇，10mM柠檬酸钠PH＝7.5，10mM DTT，10mM EDTA) 重悬细胞。 

2.加10ul蜗牛酶，37℃温育一小时。加150ul 2％SDS，轻轻混匀，在冰上放置5分钟，加225ul 5M乙酸钾PH8-9，轻柔混匀。 

3.10000g离心5-10分钟，上清用等体积的酚仿抽提，上清用两倍体积乙醇沉淀，10000g离心20分钟，用PH7.4TE溶沉淀，用于PCR鉴定。用载体的引物5′AOX1 GACTGGTTCCAATTGACAAGCT及P2：TGTAGTACGGTAGCCGTACCAG配对，PCR鉴定，条件94℃变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数为30个，参见图10。 

实施例4：耐高温金属蛋白酶基因在酵母中表达 

将已构建好的酵母表达载体，SacI线性化CIAP去磷酸化，电转化酵母细胞，转化菌涂布于RDB平板上30℃培养4-6天，将菌落转接于筛选平板(含G418的YPD板)，摇菌提染色体，PCR鉴定后，参见图10。 

将鉴定过的四株重组菌株，一株空载体转化重组菌划板，挑取新鲜菌落接种BMGY培养基(1％的酵母抽提物，2％的蛋白胨，100mM磷酸缓冲液，PH＝6.0，1.34％YNB，4X10^-5的生物素，1％的甘油)，28℃250rpm，震荡培养三天左右后至OD₆₀₀＝2-6，离心收集菌体，复接种于BMMY培养基(1％酵母抽提物，2％的蛋白胨，100mM磷酸缓冲液，PH＝6.0，1.34％的YNB，4X10^-5的生物素，0.5％甲醇)内，稀释至OD₆₈₀，28℃230rpm震荡，来诱导表达。每24小时添加甲醇至终浓度0.5％，分别在0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样一毫升，做最佳表达条件的选择实验，由于我们构建的表达载体是分泌性表达，取上清在筛选培养基上(琼脂2％，酪素1％)60℃反应看是否有透明圈即可确定是否有表达，重复五批次，发现一株重组菌株36h在即有透明圈产生而空载体转化株无透明圈产生，参见图11，证明我们构建的工程菌可以正常表达。在60h，透明圈最大，后来逐渐变小，消失。证明重组基因工程菌在36h即开始表达，在60h达到产酶高峰。 

收集60h时的发酵液，做最适温度，最适PH值实验，以确定工程菌所产的酶与原始菌产的酶性质一致。 

实施例5：耐高温金属蛋白酶最适反应温度的确定 

根据中华人民共和国轻工业部于1993-07-29发布，并于1994-03-01实施的《中华人民共和国行业标准》QB/T 1803、1804-93，QB/T 1805、1806-93，工业酶制剂通用试验方法，及该高温中性蛋白酶特性，在测试过程中温度定为30℃，40℃，55℃，65℃，70℃测酶活，pH为7.2。测OD680的值，以此为依据绘制最适温度曲线，参见图12。具体操作如下： 

(1)定义 

1克固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度下和pH条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。 

(2)福林法 

2.1原理 

XJT9503高温中性蛋白酶在65℃，pH7.2条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。 

2.2试剂与溶液 

2.2.1福林试剂的制备 

适用于常规实验室制备方法。 

使用溶液：一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 

2.2.2碳酸钠溶液(Na₂CO3)＝0.4mol/L 

称取无水碳酸钠(Na₂CO3)42.4g，用水溶解并定溶至1000ml。 

2.2.3三氯乙酸(CooHCCl₃ COOH)＝0.4mol/L 

称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定溶至1000ml。 

2.2.40.02M、pH7.2磷酸缓冲液的配制 

称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.12H₂O)4.90g和磷酸二氢钠(NaH₂PO₄.2H₂O)0.99g，加水溶解并定溶至1000ml。 

2.2.5 50g/L酪素溶液 

称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的pH7.2的磷酸缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于冰箱中保存，有效期为三天。 

2.2.6 100ug/ml L-酪氨酸标准溶液 

称取恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60ml溶解后定溶至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。 

2.3仪器和设备 

2.3.1恒温水浴65±0.2℃、40±0.2℃。 

2.3.2分光光度计  应符合GB 9721的规定。 

2.2.4测定步骤 

2.2.4.1标准曲线的绘制 

a.L-酪氨酸标准溶液 

按下表配制 

管号	酪氨酸标准溶液浓   度ug/ml	取100ug/ml酪氨酸标准溶   液体积ml	取水的体积   ml
				0	0	0	10
1	10	1	9

2	20	2	8
				3	30	3	7
4	40	4	6
				5	50	5	5

b.分别取上述溶注液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/ml碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20分钟，取出用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。 

根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在100左右。 

2.2.4.2待测酶样的制备与测定 

a.称取酶粉1-2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00ml)，用少量pH7.2的磷酸缓冲液溶解，并用捣研，然后将上清液倾入容量瓶中，沉渣中再添加适量缓冲液，研捣3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当的浓度，供测试用(稀释至测试液吸光值在0.25-0.45范围内)，稀释好的酶液置于冰箱中保存。 

b.测定 

先将酪素溶液放入65℃恒温水浴中，预热5分钟。 

c.计算 

          X＝A*K*4/10*N 

式中：X-样品的酶活力，u/ml(u/g)； 

A-样品平行试验的平均吸光度； 

K-吸光常数； 

4-反应试剂的总体积，ml； 

10-反应时间10分钟，以分钟计； 

N-稀释倍数。 

所测定的结果表示为整数。平行试验相对误差不超过3％。 

实施例6：耐高温金属蛋白酶最适PH的确定 

方法同上述实例5，将酶作用的PH做一范围：PH 6.0，PH 6.5，PH 7.0，PH 7.2，PH 7.5，PH 8.0测定OD₆₈₀的值，以此为依据绘制最适PH曲线，参见图13。 

        SEQUENCE LISTING 

                SEQUENCE LISTING 

Claims (1)

1.一种具有产生耐高温金属蛋白酶的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)CGMCCNo.1622。

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