CN101117354B

CN101117354B - 一种酯化松花粉多糖及制备方法和用途

Info

Publication number: CN101117354B
Application number: CN2007100171363A
Authority: CN
Inventors: 耿越; 刘志河; 刘辉; 石丽花; 王凤芹; 王桐
Original assignee: YANTAI NEW ERA HEALTH INDUSTRY Co Ltd; Shandong Normal University
Current assignee: YANTAI NEW ERA HEALTH INDUSTRY Co Ltd; Shandong Normal University
Priority date: 2007-09-04
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2027-09-04
Also published as: CN101117354A

Abstract

本发明提供一种酯化松花粉多糖及制备方法和用途，该制备方法按如下步骤进行：a.先将蜂花粉加蒸馏水浸泡，然后水煎煮2-4次，每次3-5小时，合并煎煮液，经离心，得上清液；b.将上清液减压浓缩至上清液体积的10～20％，得浓缩液；c.向浓缩液中加入浓缩液2-4倍体积的乙醇，混匀后静置，离心，收集沉淀；d.将沉淀复溶后，用Sevag法去除蛋白，将去除蛋白的松花粉多糖用重量浓度为40-80％乙醇沉淀，得沉淀松花粉多糖；e.将沉淀松花粉多糖溶于甲酰胺中，然后再于搅拌和不高于45℃条件下缓慢加入用氯磺酸和吡啶混合而成的酯化试剂，酯化反应3-5h，经中和脱氨，透析，醇沉，脱水干燥，得产品。用于对肠道平滑肌的抑制和癌症的治疗。

Description

一种酯化松花粉多糖及制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及采用松花粉为原料制备的酯化松花粉多糖及制备方法，另外，还涉及该酯化松花粉多糖在制药领域中的用途。

背景技术：

研究发现多糖有增进免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗衰老、抗凝血、降血脂、降血糖等功能。应用于临床的多糖有香菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖等。且某些多糖经酯化改性后在抗病毒、抗肿瘤等方面活性可大大增强。

CN200610075839.7公开了具有调节血脂、血糖、血压，抗疲劳，提高免疫力功效的松花粉多糖及其制备方法。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种采用松花粉为原料制备的可以对肠道平滑肌有较强的抑制作用，具有抑制癌细胞增殖的酯化松花粉多糖；目的之二是提供该酯化松花粉多糖的制备方法；目的之三是提供该酯化松花粉多糖的用途。

本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现：

该酯化松花粉多糖是以松花粉为原料，经水提、醇沉，Sevag法去蛋白，磺化法制备而成的粉剂。

本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现：

该制备方法按如下步骤进行：

a.先将蜂花粉加蒸馏水浸泡，然后水煎煮2-4次，每次3-5小时，合并煎煮液，经离心，得上清液；

b.将上清液减压浓缩至上清液体积的10～20％，得浓缩液；

c.向浓缩液中加入浓缩液2-4倍体积的乙醇，混匀后静置，离心，收集沉淀；

d.将沉淀复溶后，用Sevag法去除蛋白，将去除蛋白的松花粉多糖用重量浓度为40-80％乙醇沉淀，得沉淀松花粉多糖；

e.将沉淀松花粉多糖溶于甲酰胺中，然后再于搅拌和不高于45℃条件下缓慢加入用氯磺酸和吡啶混合而成的酯化试剂，酯化反应3-5h，经中和脱氨，透析，醇沉，脱水干燥，得产品。

本发明的目的之二还可通过如下技术措施来实现：

a工序所述的松花粉为破壁松花粉；a工序所述的蒸馏水浸泡时间为8-16小时，浸泡后搅拌成粘液状。

本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现：

本发明的酯化松花粉多糖用于对肠道平滑肌的抑制和癌症的治疗。可对肠道平滑肌有较强的抑制作用，可抑制癌细胞的增殖，促进免疫细胞增殖和活性。

破壁松花粉加入蒸馏水，浸泡过夜。然后搅拌成粘液状，蒸馏水煮沸3-5小时，离心，收集上清液。沉淀再次加蒸馏水煮沸1-3次，合并多次上清液。上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原来体积的10～20％。在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀。

将沉淀复溶后，用常规Sevag法去除蛋白，按照Sevag方法，以松花粉提取液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以4000-6000rpm/min离心15-20min，收集上清液，反复30～40次，直至紫外检测无蛋白吸收峰。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以4000-6000rpm/min离心15-20min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

将去蛋白的松花粉多糖复溶后，用终浓度为40％、60％、80％的酒精沉淀，得到三种不同级分的多糖。沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

取200～1000mg的60％分级沉淀松花粉多糖，置于35mL无水甲酰胺中，室温搅拌10-20min，然后逐渐加入酯化试剂(取10mL吡啶置于烧杯中，冰盐浴，在搅拌条件下缓慢加入10mL氯磺酸，控制滴加速度使温度保持在室温以下，得白色粘稠物质，为酯化试剂)，不高于45℃条件下搅拌反应3-5h。

冷却后，2.5mol/LNaOH中和脱氨，脱氨至中性后，将溶液移入透析袋，流水透析3-4天，双蒸水透析1-2天，充分清除小分子物质，加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。酯化松花粉多糖由硫酸基法测得其硫酸基取代度为1.471，和苯酚-硫酸法所测结果一致，表明酯化成功。

恒温水浴锅水温保持在37±0.5℃，麦氏浴槽内盛37℃台氏液15mL，将小鼠禁食12h，自由饮水。引颈处死后，剖开腹腔，分别剪取1～2cm长的十二指肠一段放入37℃台氏液内，洗出其内容物。然后把肠段移入37℃新鲜台氏液中。在肠段两端各系条丝线，一端系于张力换能器的应变弹簧片上，另一端连于玻璃钩上，以便固定肠肌。将玻璃钩连同肠肌放入麦氏浴槽中，将玻璃钩固定于浴槽底部。张力换能器与BL-410生物信号记录分析系统通道I连接。选择实验项目中“消化道平滑肌的生理特性”实验模块，设置控制参数：增益500mv，时间常数DC，频率30Hz，扫描速度4s/div。平衡30分钟后加入酯化松花粉多糖溶液，以未酯化松花粉多糖为对照，记录、处理和存储实验数据，以描记线离开基线后上升到达峰顶后下降回到基线，继而向基线下方延伸到谷底后再回到基线的过程作为一个收缩波。峰顶和谷底之间的幅度即为该收缩波的幅度。统计学处理数据均以均值±标准差(x±S)表示，组间数据采用t检验。结果表明酯化松花粉多糖对肠道平滑肌张力幅度有一定抑制作用，在0.285mg/mL浓度时开始对肠道平滑肌有显著性的抑制作用(p＜0.05)，抑制率为28.57％，明显强于未酯化多糖对肠道平滑肌的抑制作用。

将适应饲养一周后小鼠随机分组，雌雄各半。无菌条件下用5mL无菌注射器取S180小鼠腹水放入无菌容器内，稀释后以血球计数板显微镜下计数，用无菌生理盐水稀释至肿瘤细胞数为10⁷个/mL，每只0.3mL接种于小鼠左腋皮下

小鼠接瘤后次日起腹腔注射给药，给药剂量为空白组(生理盐水)，阳性对照组(20mg/kg

d环磷酰胺)，实验组I(50mg/kg

d酯化多糖)。实验组II(20mg/kg

d酯化多糖)，实验组III(5mg/kg

d酯化多糖)，每日一次，每次注射量0.5mL，连续注射8～12天。停止注射后次日将小鼠断颈处死，称取体重，取出肿瘤，脾脏，胸腺，分别称重记录并计算。

抑瘤率＝(空白组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白组平均瘤重

体重增量＝实验后去瘤平均体重-实验前平均体重

胸腺指数＝(实验组平均胸腺重-空白组平均胸腺重)/空白组平均体重

脾脏指数＝(实验组平均脾脏重-空白组平均脾脏重)/空白组平均体重

酯化松花粉多糖对S180瘤有抑制性，但不具有剂量依赖关系，以20mg/kg

d时抑瘤率最高，为69.27％，高于同剂量环磷酰胺66.64％的抑瘤率。体外细胞培养实验表明酯化松花粉多糖抑癌途径为对癌细胞增殖的直接抑制作用及对免疫细胞增殖和活性的促进作用。

将本发明与CN200610075839.7相比，本发明样品为松花粉提取所得多糖酯化后的产物；制备方法中使用Sevag法去蛋白提取多糖，磺化法制备酯化多糖；功能为抑制肠道平滑肌和抑制肿瘤。而CN200610075839.7样品为松花粉提取所得多糖；制备方法中用酶解法去除杂质；所得多糖未加改性，功能为调节血脂、血糖、血压，抗疲劳，提高免疫力。所以两者的样品、制备方法和功能有显著区别。

酯化松花粉多糖对肠肌生理活性的影响：

恒温水浴锅水温保持在37±0.5℃，麦氏浴槽内盛37℃台氏液15mL，将小鼠禁食12h，自由饮水。引颈处死后，剖开腹腔，分别剪取1～2cm长的十二指肠一段放入37℃台氏液内，洗出其内容物。然后把肠段移入37℃新鲜台氏液中。在肠段两端各系条丝线，一端系于张力换能器的应变弹簧片上，另一端连于玻璃钩上，以便固定肠肌。将玻璃钩连同肠肌放入麦氏浴槽中，将玻璃钩固定于浴槽底部。张力换能器与BL-410生物信号记录分析系统通道I连接。选择实验项目中“消化道平滑肌的生理特性”实验模块，设置控制参数：增益500mv，时间常数DC，频率30Hz，扫描速度4s/div。平衡30分钟后加入多糖溶液，记录、处理和存储实验数据，以描记线离开基线后上升到达峰顶后下降回到基线，继而向基线下方延伸到谷底后再回到基线的过程作为一个收缩波。峰顶和谷底之间的幅度即为该收缩波的幅度。滴加酯化松花粉多糖溶液，以未酯化松花粉多糖为对照，记录数据。统计学处理数据均以均值±标准差(x±S)表示，组间数据采用t检验。

酯化松花粉多糖在0.285mg/mL浓度时开始对肠道平滑肌有显著性的抑制作用(P＜0.05)，抑制率为28.57％，明显强于未酯化松花粉多糖对肠道平滑肌的抑制作用。结果如表1。

表1.酯化松花粉多糖对肠道平滑肌的作用

Figure 2007100171363100002DEST_PATH_IMAGE002

^**为P＜0.01，^*为P＜0.05

酯化松花粉多糖的抗肿瘤活性：

将适应饲养一周后的50只小鼠随机分成5组，每组10只，雌雄各半。分别标记为空白组、阳性对照组、实验组I、实验组II、实验组III、，称重并用苦味酸溶液编号。

无菌条件下用5mL无菌注射器共取S180小鼠腹水6mL放入无菌容器内，稀释后以血球计数板显微镜下计数，用无菌生理盐水稀释至肿瘤细胞数为10⁷个/mL，每只0.3mL接种于小鼠左腋皮下

d环磷酰胺)，实验组I(50mg/kg

d酯化多糖)。实验组II(20mg/kg

d酯化多糖)，实验组III(5mg/kg

d酯化多糖)，每日一次，每次注射量0.5mL，连续注射8天。

第9日将小鼠断颈处死，称取体重，取出肿瘤，脾脏，胸腺，分别称重记录并计算。

抑瘤率＝(空白组平均瘤重-实验组平均瘤重)/空白组平均瘤重；

体重增量＝实验后去瘤平均体重-实验前平均体重；

胸腺指数＝(实验组平均胸腺重-空白组平均胸腺重)/空白组平均体重；

脾脏指数＝(实验组平均脾脏重-空白组平均脾脏重)/空白组平均体重；

d时抑瘤率最高，为69.27％，高于同剂量环磷酰胺66.64％的抑瘤率。结果如表2。

表2.酯化多糖对S180小鼠瘤重、胸腺指数、脾脏指数的影响

^**为P＜0.01，^*为P＜0.05

具体实施方式：

实施例1：

酯化松花粉多糖的制备：

取破壁松花粉150g，加入2000mL蒸馏水，浸泡过夜。然后搅拌成粘液状，蒸馏水煮沸5小时，离心，收集上清液。沉淀再次加蒸馏水煮沸1次，合并2次的上清液。上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原来体积的20％。在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀。

将沉淀加水复溶后，用常规Sevag法去除蛋白，按照Sevag方法，以松花粉提取液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以4000rpm/min离心20min，收集上清液，反复30次，紫外检测无蛋白吸收。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以6000rpm/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

按多糖液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以4000rpm/min离心15min，收集上清液，反复30次，紫外检测无蛋白吸收峰。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以5000rpm/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

将去除蛋白的松花粉多糖加水复溶后，用终浓度为60％的酒精沉淀，得到三种不同级分的多糖。沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚干燥，称重。

取200mg60％分级沉淀花粉多糖，置于35mL无水甲酰胺中，室温搅拌10min，然后逐渐加入酯化试剂(取10mL吡啶置于烧杯中，冰盐浴，在搅拌条件下缓慢加入10mL氯磺酸，使温度保持在室温以下并控制滴加速度，得白色粘稠物质，为酯化试剂)，控制温度为25℃，搅拌反应5h。

冷却后，用2.5mol/LNaOH中和脱氨，脱氨至中性后，将溶液移入透析袋，流水透析3天，双蒸水透析1天，充分清除小分子物质，加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重，得301.2mg酯化多糖，得率150.6％。酯化松花粉多糖由硫酸基法测得其硫酸基取代度为1.471，和苯酚-硫酸法所测结果一致，表明酯化成功。

实施例2：

酯化松花粉多糖的制备：

取破壁松花粉150g，加入2000mL蒸馏水，浸泡过夜。然后搅拌成粘液状，蒸馏水煮沸3小时，离心，收集上清液。沉淀再次加蒸馏水煮沸3次，合并4次的上清液。上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原来体积的10％。在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀。

将沉淀加水复溶后，用常规Sevag法去除蛋白，按照Sevag方法，以松花粉提取液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以6000rpm/min离心15min，收集上清液，反复40次，紫外检测无蛋白吸收峰。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以4000rpm/min离心20min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

按多糖液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以4000rpm/min离心15min，收集上清液，反复40次，紫外检测无蛋白吸收峰。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以5000rpm/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

将去除蛋白的松花粉多糖加水复溶后，用终浓度为40％的酒精沉淀，得到三种不同级分的多糖。沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚干燥，称重。

取1000mg40％分级沉淀花粉多糖，置于70mL无水甲酰胺中，室温搅拌10min，然后逐渐加入酯化试剂(取20mL吡啶置于烧杯中，冰盐浴，在搅拌条件下缓慢加入20mL氯磺酸，使温度保持在室温以下并控制滴加速度，得白色粘稠物质，为酯化试剂)，控制温度为45℃，搅拌反应3h。

冷却后，用2.5mol/LNaOH中和脱氨，脱氨至中性后，将溶液移入透析袋，流水透析4天，双蒸水透析2天，充分清除小分子物质，加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重，得1500.1g酯化多糖，得率150.1％。

实施例3：

酯化松花粉多糖的制备：

取破壁松花粉150g，加入2000mL蒸馏水，浸泡过夜。然后搅拌成粘液状，蒸馏水煮沸4小时，离心，收集上清液。沉淀再次加蒸馏水煮沸2次，合并3次的上清液。上清液用旋转蒸发仪减压浓缩至原来体积的15％。在浓缩液中加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀。

将沉淀加水复溶后，用常规Sevag法去除蛋白，按照Sevag方法，以松花粉提取液∶氯仿∶正丁醇＝1∶0.2∶0.04的比例混匀，以435000rpm/min离心15min，收集上清液，反复35次，紫外检测无蛋白吸收峰。最后在上清中加入3倍体积的95％乙醇，充分混匀，静置过夜后，以5000rpm/min离心15min，收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重。

将去除蛋白的松花粉多糖加水复溶后，用终浓度为80％的酒精沉淀，得到三种不同级分的多糖。沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚干燥，称重。

取500mg80％分级沉淀花粉多糖，置于35mL无水甲酰胺中，室温搅拌10min，然后逐渐加入酯化试剂(取10mL吡啶置于烧杯中，冰盐浴，在搅拌条件下缓慢加入10mL氯磺酸，使温度保持在室温以下并控制滴加速度，得白色粘稠物质，为酯化试剂)，控制温度为35℃，搅拌反应4h。

冷却后，用2.5mol/LNaOH中和脱氨，脱氨至中性后，将溶液移入透析袋，流水透析3天，双蒸水透析1天，充分清除小分子物质，加入3倍体积95％乙醇，充分混匀。静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀依次加无水乙醇、丙酮、乙醚脱水干燥，称重，得753.5mg酯化多糖，得率150.7％。

Claims

1.一种酯化松花粉多糖，其特征在于该酯化松花粉多糖是以松花粉为原料，先将松花粉加蒸馏水浸泡，然后水煎煮2-4次，每次3-5小时，合并煎煮液，经离心，得上清液；将上清液减压浓缩至上清液体积的10～20％，得浓缩液；向浓缩液中加入浓缩液2-4倍体积的乙醇，混匀后静置，离心，收集沉淀；将沉淀复溶后，用Sevag法去除蛋白，将去除蛋白的松花粉多糖用重量浓度为40-80％乙醇沉淀，得沉淀松花粉多糖；将沉淀松花粉多糖溶于甲酰胺中，然后再于搅拌和不高于45℃条件下缓慢加入用氯磺酸和吡啶混合而成的酯化试剂，酯化反应3-5h，经中和脱氨，透析，醇沉，脱水干燥制成的粉剂产品。

2.一种酯化松花粉多糖的制备方法，其特征在于该制备方法按如下步骤进行：

a.先将松花粉加蒸馏水浸泡，然后水煎煮2-4次，每次3-5小时，合并煎煮液，经离心，得上清液；

b.将上清液减压浓缩至上清液体积的10～20％，得浓缩液；

3.根据权利要求2所述的酯化松花粉多糖的制备方法，其特征在于a工序所述的松花粉为破壁松花粉。

4.根据权利要求2所述的酯化松花粉多糖的制备方法，其特征在于a工序所述的蒸馏水浸泡时间为8-16小时，浸泡后搅拌成粘液状。