CN101113955B - 检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料及其制备方法，属于检测有机磷农药的传感材料及其制备方法。本发明材料由TPPS和面粉组成，其材料的制备方法是以市售面粉为原料，制备出植物酯酶液，并配制TPPS溶液，再依次将植物酯酶、TPPS固定在戊二醛活化过的K9玻璃片上，晾干而得成品。由于本发明材料组分简单、成本低廉；材料的制备方法简单、操作简便；本发明制备出的产品使用方便，检测灵敏性好、检出限低、能有效检测微痕量的DMMP。故本发明可广泛应用于蔬菜、水果等农产品及环境中的微痕量有机磷农药的残留检测，也可用于对食品和环境安全评价、监控其有机磷农药的污染情况等。
Description
技术领域
本发明属于检测有机磷农药的传感材料及其制备方法，特别涉及检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料及其制备方法。
背景技术
甲基磷酸二甲酯(DMMP)是一种有机磷农药，自20世纪80年代以来，有机磷农药成为农林生产、采后保鲜等过程中使用最广的农药种类。长期大量地使用有机磷农药，在得到效益的同时，也产生了广泛的副作用。人们日常食用的蔬菜、水果等食品中会有有机磷农药的残留，通过食物链作用，在人体累积容易致畸、致癌、致突变，还对生态环境造成严重的污染与危害。目前，在食品安全乃至人们的日常生活方面，有机磷农药残留污染已成为一个非常严重的问题。因此，实现微痕量DMMP的简便、灵敏、经济的快速检测，对食品及环境安全评价、监控有机磷农药污染等方面具有重要意义，可以切实保障人民生命安全。
在微痕量DMMP的检测材料方面，近几年国内外学者将研究重点放在了生物酶的开发和利用上。一般多选用乙/丁酰胆碱酯酶等动物性胆碱酯酶。但是动物性酯酶一般从动物血液或组织中提取，不仅取材不便，而且价格昂贵，限制其在现场快速检测方面的应用。我国也有一些学者将植物酯酶作为农残检测的酶标记物之一。如公开号为CN1279292A的“快速测定有机磷农药的植物酯酶片”专利，公开的酶片制备方法是将磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和面粉混合后，用模具在压片机上压成片，即为酶片。再如公开号为CN1366065A的“快速检测痕量有机磷和氨基甲酸酯农药的方法”专利，公开的酶的固定化方法是在缓冲液中加入牛血清白蛋白和戊二醛，再与酶液混合，加入塑料条的小孔中，待自然晾干后即可将酶固定到孔的内壁。在这两项专利中，由于用来源丰富、价廉易得的植物酯酶代替动物酯酶，大大降低了检测成本。但是由于它们都只对酶做了固定化处理，检测时除了待测样品外，还需另外加入底物和显色剂。这样不但增加了检测步骤，延长了检测时间，使用不方便。而且由于所用显色剂本身的灵敏性和检测方法的局限，其检出限较高，对含量较低的农药残留不能有效检出，而这轻微的农残可能导致慢性病，依然会威胁人们的生命安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料及其制备方法，具有生产成本低，可以实现对微痕量DMMP实时、快速的检测，检测过程中不需要样品之外的其他试剂等特点。
本发明的目的是这样实现的：一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料，由磺酸基四苯基卟啉(TPPS)和面粉组成，其组分的重量百分数为：
磺酸基四苯基卟啉(TPPS)：0.02％～0.37％
面粉：99.63％～99.98％
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，以市售面粉为原料，制备出植物酯酶酶液，并配制TPPS溶液，再依次将植物酯酶、TPPS固定在经戊二醛活化过的K9玻璃片上，晾干后即可得到成品。其具体的方法步骤如下：
(1)酶液的制备
以市售面粉为原料，按面粉：蒸馏水的重量比为1∶4～6的比例，在面粉中加入蒸馏水，搅拌10～60min后，再以3000～6000r/min的离心速度，离心分离10-15min，收集上层清液，静置8～24h，就制备出植物酯酶酶液。
(2)TPPS溶液的配制
在无水乙醇溶液中加入TPPS固体粉末，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为30.08～111.3μmol/L的TPPS溶液。
(3)K9玻璃片活化
将K9玻璃片用无水乙醇清洗表面，使其表面洁净，再将表面洁净的K9玻璃片放入戊二醛溶液中，浸泡20～120min进行活化，然后取出，再将活化后的K9玻璃片放入pH值为7.5～8.18的磷酸盐缓冲液中，备用。其磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾溶液。
(4)酶的固定化
在第(1)～(3)步完成后，取出第(3)步活化后的K9玻璃片，放入第(1)步制备出的植物酯酶酶液中，浸泡80～100min，进行酶的固定化，然后取出固定化酶的K9玻璃片，再放入pH值为7.5～8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，备用。
(5)TPPS的固定化
在第(4)步完成后，取出第(4)步固定化酶后的K9玻璃片，放入第(2)步制备出的TPPS溶液中，浸泡作用2～5min，进行TPPS固定化，取出其K9玻璃片，自然风干或将载玻片放入干燥器中干燥，就制备出检测DMMP材料的成品。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
(1)检测DMMP的材料成本低。本发明中选用的酶是从市售面粉中直接提取的，与动物酯酶相比，大大降低了检测成本。
(2)制备检测DMMP材料的方法简单、操作简便。本发明的制备方法仅包括酶液的制备、TPPS溶液的配制、K9玻璃片的活化、酶及TPPS的固定化等简单步骤及简便的操作，且制备条件温和，容易得到成品。
(3)使用方便。采用本发明的材料对DMMP进行检测，不需准备除样品以外的其他试剂，直接进行检测，操作方便。
(4)可以有效地进行实时检测。应用本发明制得的新材料进行检测时，样品和传感膜的反应可在几秒中内完成，可以方便地进行实时检测，切实保障人民生命安全。
(5)检测灵敏性好、检出限低、检测效果好。应用本发明制得的新材料进行检测，检出限可低至0.05ppb，是同类传感膜或酶片达不到的，检测效果好，能检测微痕量的DMMP。
本发明可广泛应用于蔬菜、水果等农产品及环境中的微痕量有机磷农药的残留检测中，也可用于对食品和环境安全评价、监控其有机磷农药的污染情况等。
附图说明
图1为应用实施例4的材料检测0.05ppbDMMP所得的光谱图。
其中：曲线(1)为该材料与DMMP作用前的光谱；曲线(2)为该材料与50ppt DMMP作用后的光谱；曲线(3)为曲线(1)与曲线(2)的差谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的组分和重量百分数为：
磺酸基四苯基卟啉(TPPS)：0.09％
面粉：99.91％
实施例2
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的组分和重量百分数为：
磺酸基四苯基卟啉(TPPS)：0.02％
面粉：99.98％
实施例3
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的组分和重量百分数为：
磺酸基四苯基卟啉(TPPS)：0.37％
面粉：99.63％
实施例4
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其具体的方法步骤如下：
(1)酶液的制备
以市售面粉为原料，按面粉：蒸馏水的重量比为1∶5的比例，在面粉中加入蒸馏水，搅拌30min后，再以4000r/min的离心速度，离心分离12min，收集上层清液，静置12h，就制备出植物酯酶酶液。
(2)TPPS溶液的配制
在无水乙醇溶液中加入TPPS固体粉末，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为84.23μmol/L的TPPS溶液。
(3)K9玻璃片活化
将K9玻璃片用无水乙醇清洗表面，使其表面洁净，再将表面洁净的K9玻璃片放入戊二醛溶液中，浸泡20min进行活化，然后取出，再将活化后的K9玻璃片放入pH值为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，备用。
(4)酶的固定化
在第(1)～(3)步完成后，取出第(3)步活化后的K9玻璃片，放入第(1)步制备出的植物酯酶酶液中，浸泡90min，进行酶的固定化，然后取出固定化酶的K9玻璃片，再放入pH值为8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，备用。
(5)TPPS的固定化
在第(4)步完成后，取出第(4)步固定酶化后的K9玻璃片，放入第(2)步制备出的TPPS溶液中，浸泡作用3min，进行TPPS固定化，取出其K9玻璃片，自然风干，就制备出检测DMMP材料的成品。
实施例5
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其具体的方法步骤如下：
(1)酶液的制备
以市售面粉为原料，按面粉：蒸馏水的重量比为1∶4的比例，在面粉中加入蒸馏水，搅拌60min后，再以6000r/min的离心速度，离心分离10min，收集上层清液，静置24h，就制备出植物酯酶酶液。
(2)TPPS溶液的配制
在无水乙醇溶液中加入TPPS固体粉末，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为30.08μmol/L的TPPS溶液。
(3)K9玻璃片活化
将K9玻璃片用无水乙醇清洗表面，使其表面洁净，再将表面洁净的K9玻璃片放入戊二醛溶液中，浸泡30min进行活化，然后取出，再将活化后的K9玻璃片放入pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，备用。
(4)酶的固定化
在第(1)～(3)步完成后，取出第(3)步活化后的K9玻璃片，放入第(1)步制备出的植物酯酶酶液中，浸泡100min，进行酶的固定化，然后取出固定化酶的K9玻璃片，再放入pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，备用。
(5)TPPS的固定化
在第(4)步完成后，取出第(4)步固定酶化后的K9玻璃片，放入第(2)步制备出的TPPS溶液中，浸泡作用2min，进行TPPS固定化，取出其K9玻璃片，自然风干，就制备出检测DMMP材料的成品。
实施例6
一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其具体的方法步骤如下：
(1)酶液的制备
以市售面粉为原料，按面粉：蒸馏水的重量比为1∶6的比例，在面粉中加入蒸馏水，搅拌10min后，再以3000r/min的离心速度，离心分离15min，收集上层清液，静置8h，就制备出植物酯酶酶液。
(2)TPPS溶液的配制
在无水乙醇溶液中加入TPPS固体粉末，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为111.3μmol/L的TPPS溶液。
(3)K9玻璃片活化
将K9玻璃片用无水乙醇清洗表面，使其表面洁净，再将表面洁净的K9玻璃片放入戊二醛溶液中，浸泡120min进行活化，然后取出，再将活化后的K9玻璃片放入pH值为8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，备用。
(4)酶的固定化
在第(1)～(3)步完成后，取出第(3)步活化后的K9玻璃片，放入第(1)步制备出的植物酯酶酶液中，浸泡80min，进行酶的固定化，然后取出固定化酶的K9玻璃片，再放入pH值为8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中，备用。
(5)TPPS的固定化
在第(4)步完成后，取出第(4)步固定酶化后的K9玻璃片，放入第(2)步制备出的TPPS溶液中，浸泡作用5min，进行TPPS固定化，取出其K9玻璃片，将载玻片放入干燥器中干燥，就制备出检测DMMP材料的成品。
实验结果
用实施例4制备出的K9玻璃片进行试验，首先将K9玻璃片放入兰达(LAMBDA)500分光光度计中采集其光谱信息，再取出K9玻璃片，在其上滴加一定浓度的DMMP溶液，滴加完毕后，可立即用分光光度计采集光谱信息，最后通过系统自带的UV WinLab软件，分析K9玻璃片与DMMP作用前后的光谱变化，实现对DMMP的检测。实验结果如图1所示。
从图1知，光谱(1)为传感材料未与DMMP作用前的光谱(350～500nm)；光谱(2)为传感材料与0.05ppb DMMP作用后的传感材料的光谱；光谱(3)为光谱(1)与光谱(2)的差谱，显示传感材料与0.05ppb DMMP作用前后的光谱变化。从差谱上可以看出，传感材料与被检测物DMMP作用后，其光谱性质发生了很大的改变，表现为在422nm处出现了一个新的吸收峰。根据这种变化，就可以判断被检测物DMMP是否存在。因此该材料可以检测DMMP。不仅如此，从差谱上还可以看出，0.05ppb的DMMP都可以对材料的光谱性质产生如此大的影响，说明该材料对DMMP有很好的敏感性，可以检测微痕量DMMP。
Claims (5)
1.一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料，其特征在于其组分和重量百分数为：
磺酸基四苯基卟啉：0.02％～0.37％
面粉：99.63％～99.98％。
2.按照权利要求1所述的检测微痕量甲基磷酸二甲酯的材料，其特征在于其组分和重量百分数为：磺酸基四苯基卟啉0.09％、面粉99.91％；或磺酸基四苯基卟啉0.02％、面粉99.98％；或磺酸基四苯基卟啉0.37％、面粉99.63％。
3.一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其特征在于具体的方法步骤如下：
(1)酶液的制备
以市售面粉为原料，按面粉∶蒸馏水的重量比为1∶4～6的比例，在面粉中加入蒸馏水，搅拌10～60min后，再以3000～6000r/min的离心速度，离心分离10-15min，收集上层清液，静置8～24h；
(2)磺酸基四苯基卟啉溶液的配制
在无水乙醇溶液中加入磺酸基四苯基卟啉固体粉末，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为30.08～111.3μmol/L的磺酸基四苯基卟啉溶液；
(3)K9玻璃片活化
将K9玻璃片用无水乙醇清洗表面，再将表面洁净的K9玻璃片放入戊二醛溶液中，浸泡20～120min进行活化，然后取出，再将活化后的K9玻璃片放入pH值为7.5～8.18的磷酸盐缓冲液中，其磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠溶液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾溶液；
(4)酶的固定化
在第(1)～(3)步完成后，取出第(3)步活化后的K9玻璃片，放入第(1)步制备出的植物酯酶酶液中，浸泡80～100min，进行酶的固定化，然后取出固定化酶的K9玻璃片，再放入pH值为7.5～8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中；
(5)磺酸基四苯基卟啉的固定化
在第(4)步完成后，取出第(4)步固定化酶后的K9玻璃片，放入第(2)步制备出的磺酸基四苯基卟啉溶液中，浸泡作用2～5min，进行磺酸基四苯基卟啉固定化，取出其K9玻璃片，自然风干或将载玻片放入干燥器中干燥。
4.按照权利要求3所述的检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其特征在于具体方法步骤中：
(1)酶液的制备
面粉∶蒸馏水的重量比为1∶4，搅拌60min，离心速度为6000r/min，离心分离10min，静置24h；
(2)磺酸基四苯基卟啉溶液的配制
制备出浓度为30.08μmol/L的磺酸基四苯基卟啉溶液；
(3)K9玻璃片活化
浸泡30min进行活化，将活化后的K9玻璃片放入pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中；
(4)酶的固定化
浸泡100min，再放入pH值为7.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中；
(5)磺酸基四苯基卟啉的固定化
浸泡作用2min。
5.按照权利要求3所述的检测微痕量甲基磷酸二甲酯材料的制备方法，其特征在于具体方法步骤中：
(1)酶液的制备
面粉∶蒸馏水的重量比为1∶6，搅拌10min后，离心速度为3000r/min，离心分离15min，静置8h；
(2)磺酸基四苯基卟啉溶液的配制
制备出浓度为111.3μmol/L的磺酸基四苯基卟啉溶液；
(3)K9玻璃片活化
浸泡120min进行活化，将活化后的K9玻璃片放入pH值为8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中；
(4)酶的固定化
浸泡80min，再放入pH值为8.18的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中；
(5)磺酸基四苯基卟啉的固定化
浸泡作用5min。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
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