CN101113463A - 一种乳酸链球菌素的制备方法 - Google Patents

一种乳酸链球菌素的制备方法 Download PDF

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一种乳酸链球菌素的制备方法，它涉及一种活性小分子肽的制备方法。它解决了现有乳酸链球菌素分离制备方法中乳酸链球菌产率和蛋白利用率低的缺陷。乳酸链球菌素按以下步骤制备：(一)从发酵液底部通入洁净空气，并收集泡沫；(二)消泡处理；(三)过滤发泡液；(四)超滤；(五)盐析；(六)离心，之后固相物再次溶解、喷雾干燥，即得到乳酸链球菌素。本发明生产菌处于生长对数期，具有旺盛生长能力；在泡沫收集过程中生产菌一直保持旺盛生长，可以继续生产乳酸链球菌素，提高了生产菌的生产能力和乳酸链球菌素的产量。本发明在发泡的过程中收集泡沫，解决发酵过程中产物对生产菌的抑制作用，提高了发酵液中蛋白利用率和产物的产量。

Description

一种乳酸链球菌素的制备方法
技术领域
本发明涉及一种活性小分子肽的制备方法。
背景技术
乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌代谢合成的一种由34个氨基酸组成的多肽，分子式C143H228O37N42S7，分子量为3348；乳酸链球菌素由亲水端和疏水端构成，是典型的表面活性物质。Nisin是高效、无毒生物防腐剂，目前已广泛应用于乳及乳制品、发酵饮料、罐装食品、植物蛋白食品、肉类及肉制品的防腐。
发明专利申请“乳酸菌肽的分离制备方法”(申请号：200410020391，公开号：CN1743339A)虽然采用了“发泡法”，适合低浓度表面活性物质的分离，能在很小浓度下快速分离有效成分(乳酸链球菌素)，而且具有大幅度降低能耗，减少生产、分离成本；提高Nisin分离效率；及用盐量大幅度减少的优点。但是此方法仍然存在乳酸链球菌和蛋白利用率低的缺陷，蛋白利用率仅为20％。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的乳酸链球菌素分离制备方法中乳酸链球菌产率和蛋白利用率低的缺陷，而提供的一种乳酸链球菌素的制备方法。
乳酸链球菌素按以下步骤制备：(一)从已经培养了9～15h的乳酸链球菌发酵液底部通入洁净空气，并收集泡沫；(二)消泡处理；(三)过滤发泡液；(四)超滤：浓缩乳酸链球菌素；(五)盐析；(六)离心，之后固相物再次溶解、喷雾干燥，即得到乳酸链球菌素。
本发明中培养了9～15h的生产菌(乳酸链球菌)处于生长对数期，具有旺盛生长能力；在泡沫收集过程中生产菌(乳酸链球菌)一直保持旺盛生长、延长了发酵时间，乳酸链球菌可以继续生产乳酸链球菌素，提高了生产菌的产率和产量。本发明在“发泡”的过程中收集泡沫，去除了产物(乳酸链球菌素)对生产菌(乳酸链球菌)的抑制作用，提高了发酵液中蛋白利用率和产物(乳酸链球菌素)的产量。而且乳酸链球菌素的生产和分离同时进行，大大的缩短了生产周期。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式乳酸链球菌素按以下步骤制备：(一)从已经培养了9～15h的乳酸链球菌发酵液底部通入洁净空气，并收集泡沫；(二)消泡处理；(三)过滤发泡液；(四)超滤：浓缩乳酸链球菌素；(五)盐析；(六)离心，之后固相物再次溶解、喷雾干燥，即得到乳酸链球菌素。
本实施方式用灭菌的管道导出泡沫，直到泡沫产生量降低到难以收集为止，一般收集时间为9～12h。本实施方式发泡是在培养了9～15h的乳酸链球菌发酵液中进行，此时发酵液中乳酸链球菌为优势菌种，杂菌难以生长。
本实施方式乳酸链球菌素的产量提高了20％～40％，发酵液中蛋白利用率为82％～85％。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(一)中洁净空气的通入速率为1×10-6～1×10-3m3/s。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(一)收集泡沫过程中乳酸链球菌发酵液的温度为25～35℃、pH值保持为5.5～6.5。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(二)向收集的泡沫中加入酸性溶液将pH值调节到2.0～3.5，然后立即升温至60～90℃、并保持60～90℃的温度10～30min。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
本实施方式经消泡处理形成的发泡液的体积为原乳酸链球菌发酵液总体积的10％～30％，其中含有95％以上的乳酸链球菌素。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四的不同点是：步骤(二)中加入的酸性溶液为盐酸、乙酸、硫酸或磷酸。其它步骤及所选参数与实施方式四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(三)中采用膜孔径为0.1～0.2微米的陶瓷膜过滤发泡液，陶瓷膜的工作频率为20～60Hz、进膜压力为2～8MPa、工作温度为25～65℃。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
本实施方式步骤(三)可完全去处乳酸链球菌菌体。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(四)中采用膜孔径为3～100纳米的超滤膜，超滤膜的工作频率为20～60Hz、进膜压力为2～8MPa、工作温度为25～65℃。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
本实施方式可截留分子量大于1000的分子，能够完全截留乳酸链球菌素。本实施方式可除去大量水分及小分子杂质，以提高乳酸链球菌素的纯度。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(五)盐析：按浓缩液与氯化钠2～3∶1的重量比向浓缩液中添加氯化钠。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式八的不同点是：步骤(五)盐析的时间为1～2h。其它步骤及所选参数与实施方式八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(六)中以2000～3000r/min的速度进行离心。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤(六)中离心得到的固相物用pH值为2～3.5的盐酸完全溶解，之后再加入固相物质量50％～80％的氯化钠和固相物质量10％～20％的奶粉，然后再在180～250℃的条件下喷雾干燥。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式十二：本实施方式乳酸链球菌素按以下步骤制备：(一)从已经培养了10h的乳酸链球菌发酵液底部按5×10-4m3/s的速率通入洁净空气，并收集泡沫，收集泡沫过程中乳酸链球菌发酵液的温度为30℃、pH值保持为6；(二)消泡处理：向收集的泡沫中加入盐酸溶液将pH值调节到3.0，然后立即升温至70℃、并保持70℃的温度20min，形成发泡液；(三)过滤发泡液：采用膜孔径为0.1微米的陶瓷膜过滤发泡液，陶瓷膜的工作频率为50Hz、进膜压力为5MPa、工作温度为30℃；(四)超滤：采用膜孔径为40纳米的超滤膜，超滤膜的工作频率为40Hz、进膜压力为5MPa、工作温度为50℃，浓缩乳酸链球菌素；(五)盐析：按浓缩液与氯化钠2.5∶1的重量比向浓缩液中添加氯化钠，盐析时间为1～2h；(六)以2500r/min的速度离心，之后离心得到的固相物再用pH值为3的盐酸完全溶解，然后再加入固相物质量60％的氯化钠和固相物质量15％的奶粉，再在200℃的条件下喷雾干燥，即得到乳酸链球菌素。
膜分离技术具有结构简单、操作容易、无需加热、能耗低、速度快等特点。本实施方式采用了陶瓷膜和超滤膜两步膜分离技术，浓缩倍数高、大幅度缩短了膜浓缩的过液量和时间，有效的缓解了分离和浓缩膜的运行压力，减少盐析过程中的用盐量，提高乳酸链球菌素产量的同时节约生产成本。
本实施方式膜分离步骤自动化程度高，无任何化学成分添加，对产物活性结构无破坏，提高产品品质。本实施方式浓缩效果好、产品纯度高，可达92％，乳酸链球菌素回收率高，达95％以上。本实施方式绿色环保、不产生新的污染源，噪音低。

Claims (10)

1.一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于乳酸链球菌素按以下步骤制备：(一)从已经培养了9～15h的乳酸链球菌发酵液底部通入洁净空气，并收集泡沫；(二)消泡处理；(三)过滤发泡液；(四)超滤：浓缩乳酸链球菌素；(五)盐析；(六)离心，之后固相物再次溶解、喷雾干燥，即得到乳酸链球菌素。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(一)中洁净空气的通入速率为1×10-6～1×10-3m3/s。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(一)收集泡沫过程中乳酸链球菌发酵液的温度为25～35℃、pH值保持为5.5～6.5。
4.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(二)向收集的泡沫中加入酸溶液将pH值调节到2.0～3.5，然后立即升温至60～90℃、并保持60～90℃的温度10～30min。
5.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(三)中采用膜孔径为0.1～0.2微米的陶瓷膜过滤发泡液，陶瓷膜的工作频率为20～60Hz、进膜压力为2～8MPa、工作温度为25～65℃。
6.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(四)中采用膜孔径为3～100纳米的超滤膜，超滤膜的工作频率为20～60Hz、进膜压力为2～8MPa、工作温度为25～65℃。
7.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(五)盐析：按浓缩液与氯化钠2～3∶1的重量比向浓缩液中添加氯化钠。
8.根据权利要求7所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(五)盐析的时间为1～2h。
9.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(六)中以2000～3000r/min的速度进行离心。
10.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素的制备方法，其特征在于步骤(六)中离心得到的固相物用pH值为2～3.5的盐酸完全溶解，之后再加入固相物质量50％～80％的氯化钠和固相物质量10％～20％的奶粉，然后再在180～250℃的条件下喷雾干燥。
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