CN104839855B - 一种液体Nisin防腐剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液体Nisin防腐剂的制备方法，属于生物工程领域，包括以下步骤：乳酸链球菌素发酵液经过预处理后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高效价的乳酸链球菌素溶液，按照比例添加保护剂、稳定剂后，获得一种液体Nisin防腐剂。本发明的防腐剂防腐效果更加突出，使用更加方便，同时克服了nisin在提取过程中的收率过低的困难，是一种极具有市场前景的防腐剂产品。与传统的粉状防腐剂相比，液态防腐剂防腐性能更加突出，使用更加便利，同时也简化了乳酸链球菌素的提取步骤，减少了提取过程中的损失率，降低了生产成本。

Description

一种液体Nisin防腐剂的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种液体Nisin防腐剂的制备方法。

背景技术

乳酸链球菌素(肽)，乳链菌肽(Nisin)，是由乳酸链球菌(Streptococcus lactis)或乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)部分菌株发酵产生的由34个氨基酸组成的小分子多肽类化合物，分子量约为3510，它能有效地抑制引起食品腐败的革兰氏阳细菌及其孢子的生长，延长食品货架期，继1961年FAO/WHO批准Nisin作为食品添加剂使用后，全世界已有50多个国家和地区批准其作为食品防腐剂。1990年，我国将其列入国家标准GB2760-86，可以用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。由于Nisin容易被人体消化道中的一些蛋白酶所降解，不会在人体内蓄积，是世界公认安全的天然防腐剂。

长期以来，乳酸链球菌素生产过程中，面临的最大的问题是提取收率过低，由于nisin是一种小分子多肽，在其提取过程中，条件控制不恰当会发生活性的丧失，常见的提取方法有以下几种，①有机溶剂法，陈秀珠等利用正丙醇从氯化钠饱和的发酵液中提取2次，利用丙酮沉淀得到nisin粗品，然后将粗制品溶于0.05mol/L HAc-NaAc(pH3.6)缓冲液，并用缓冲液透析24h，离心分离再经CM-SephadexC-25柱层析，得到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的乳链组分，活率回收仅为41.7％。②菌体吸附法，吴琼等和叶嗣颖等对nisin随pH的改变吸附nisin的规律进行研究，通过调整pH，使乳酸乳球菌选择性地吸附、释放nisin，并达到了较好的效果，但是存在活性损失率偏高的问题。③膜分离法，Daoudi L.等利用分子截留量为1000道尔顿的中空纤维膜对经过离心处理除菌的发酵液进行超滤，最终浓缩率达到5，收率达到74.2％，膜分离法也存在一定的问题，如在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低。④盐析法，Daoudi L.等利用盐析法收集沉淀得到nisin粗制品，收率仅为60％，而且盐析法由于大量使用硫酸铵、氯化钠等，废水中含盐量高，对环境造成严重的污染。⑤泡沫分离技术是二十世纪开发的一种分离技术，1977年被引入生物分离领域，并用于多种具有表面活性的蛋白质及酶的分离纯化，并在实验室阶段取得良好的分离效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有乳酸链球菌素生产过程中存在的提取收率较低，成本较高，市场竞争力不足的问题，乳酸链球菌素发酵液(效价10000～14000IU/mL)经过预处理后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高效价的乳酸链球菌素溶液，按照比例添加保护剂、稳定剂后，获得一种液体Nisin防腐剂。

本发明解决技术问题所采取的技术方案是：

一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：乳酸链球菌素发酵液经过预处理后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高效价的乳酸链球菌素溶液，添加保护剂和稳定剂后，得到液体Nisin防腐剂(稳定性及瞬时稳定性更好)；

所述预处理前乳酸链球菌素发酵液效价10000～14000IU/mL；

所述高效价的乳酸链球菌素溶液效价100000IU/mL以上。

进一步的，所述乳酸链球菌素发酵液的预处理为：调节发酵液pH到1.5-3.0，加热0.5-2h使乳酸链球菌素从菌体上分离下来后，进行陶瓷膜过滤除去菌体及大分子蛋白。

进一步的，陶瓷膜截留分子量为5万-10万道尔顿。

进一步的，除菌后的清液经过泡沫分离的方式进行浓缩，具体为在泡沫分离设备内，通过不断通入气体进行吹泡，形成大量泡沫，使用泡沫收集装置收集泡沫后，进行消泡处理，得到高效价的乳酸链球菌素液体溶液(利用通气鼓泡在发酵液中形成的气泡为载体，对发酵液中的Nisin以泡沫形式与发酵液分离，再收集泡沫并消泡回收Nisin)。

进一步的，通入泡沫分离装置的气体为空气、二氧化碳、氮气中的一种或者几种。

进一步的，消泡的方式为物理消泡、化学消泡的一种或两种；

所述化学消泡为添加聚醚类消泡、食用油类消泡的一种或两种。

进一步的，所述保护剂为1-2％的氯化钠、0.02-0.8％的蔗糖、0.01-0.5％的谷氨酸钠、0.05-0.6％的麦芽糊精；

所述保护剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准。

进一步的，所述稳定剂为0.01-1％的山梨醇、0.02-0.6％的微晶纤维素、0.0001-0.0005％的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0005-0.001％的吐温-20；

所述稳定剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准。

本发明的有益效果是：

本专利创新性的利用泡沫分离技术分离、纯化、浓缩除菌之后的乳酸链球菌素发酵液，通过通入空气、二氧化碳、氮气中的一种或者几种组合的气体，收集泡沫后消泡处理，得到高效价的Nisin溶液，原始发酵液效价一般为10000～14000IU/mL，经过鼓泡处理后得到的高效价溶液一般为100000IU/mL以上，鼓泡浓缩过程收率达到95％以上，同时浓缩倍数为8-10倍，而一般利用双效蒸发浓缩乳酸链球菌素，其收率只有70-85％。

同时本专利又创新性的在高效价的Nisin溶液中加入保护剂和稳定剂，保护剂为1-2％的氯化钠、0.02-0.8％的蔗糖、0.01-0.5％的谷氨酸钠、0.05-0.6％的麦芽糊精，稳定剂为0.01-1％的山梨醇、0.02-0.6％的微晶纤维素、0.0001-0.0005％的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0005-0.001％的吐温-20。加入保护剂、稳定剂之后，各成分协同增效，防腐效果远高于单一的Nisin产品，由于是液态防腐剂，在食品中更容易混匀，渗透，对瞬时高温等的处理不会发生效价的损失，同时，使得该液体防腐剂的储存时间能达到12月以上，不发生效价的下降，不影响其在食品中的防腐效果。

相比于粉状Nisin的产品，该液体防腐剂制备过程中减少盐析、喷雾干燥等过程中乳酸链球菌素效价的损失，降低了成本，同时使用过程中直接将液体加入食品中即可，不用经过溶解一步，GB2760规定食品中的最大使用量为0.5g/kg，折合每kg食品需要450000IU的Nisin，本发明的液态防腐剂效价为100000IU/mL以上，折合每kg食品添加量为4.5mL，不会影响食品固有的口感，而且使用更加方便，防腐效果更加突出。

本发明创新性的开发出一种液态Nisin的防腐剂，防腐效果更加突出，使用更加方便，同时克服了Nisin在提取过程中的收率过低的困难，是一种极具有市场前景的防腐剂产品。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)发酵液预处理，陶瓷膜膜过滤除去菌体及大分子的蛋白等杂质，得到Nisin的发酵清液。

(2)泡沫分离浓缩，在泡沫分离装置中通入空气，控制空气流量为3-6L/h，并收集泡沫液。

(3)泡沫消泡处理，利物理消泡原理，结合加入聚氧乙烯聚丙烯甘油醚进行消泡处理，得到高效价的Nisin溶液(100000IU/mL)。

(4)保护剂的添加，开启搅拌，分别添加2％的氯化钠、0.5％的蔗糖、0.3％的谷氨酸钠、0.6％的麦芽糊精，并搅拌均匀，使各种保护剂溶解完全。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

(5)稳定剂的添加，开启搅拌，分别添加0.8％的山梨醇、0.4％的微晶纤维素、0.0003％的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0006％的吐温-20，并搅拌均匀，使各种稳定剂溶解完全，即得到液体Nisin防腐剂。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

实施例2

(1)发酵液预处理，陶瓷膜膜过滤除去菌体及大分子的蛋白等杂质，得到Nisin的发酵清液。

(2)泡沫分离浓缩，在泡沫分离装置中通入二氧化碳和空气，其比例为0.1:1，控制空气流量为5-8L/h，并收集泡沫液。

(3)泡沫消泡处理，利用物理消泡原理，结合加入食用油进行消泡处理，得到高效价的Nisin溶液(100000IU/mL)。

(4)保护剂的添加，开启搅拌，分别添加1.8％的氯化钠、0.6％的蔗糖、0.2％的谷氨酸钠、0.4％的麦芽糊精，并搅拌均匀，使各种保护剂溶解完全。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

(5)稳定剂的添加，开启搅拌，分别添加0.05％的山梨醇、0.02％的微晶纤维素、0.0001％的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0005％的吐温-20，并搅拌均匀，使各种稳定剂溶解完全。即得到液体Nisin防腐剂。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

实施例3

(1)发酵液预处理，陶瓷膜膜过滤除去菌体及大分子的蛋白等杂质，得到Nisin的发酵清液。

(2)泡沫分离浓缩，在泡沫分离装置中通入二氧化碳、空气和氮气，其比例为0.1：1：0.05，控制流量为8-10L/h，并收集泡沫液。

(3)泡沫消泡处理，利物理消泡原理，结合加入食用油进行消泡处理，得到高效价的Nisin溶液，效价为100000IU/mL。

(4)保护剂的添加，开启搅拌，分别添加2％的氯化钠、0.8％的蔗糖、0.1％的谷氨酸钠、0.5％的麦芽糊精，并搅拌均匀，使各种保护剂溶解完全。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

(5)稳定剂的添加，开启搅拌，分别添加0.03％的山梨醇、0.015％的微晶纤维素、0.0003％的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0004％的吐温-20，并搅拌均匀，使各种稳定剂溶解完全。即得到液体Nisin防腐剂。添加量均以步骤(3)中的高效价的Nisin溶液的重量为基准。

实施例4

(1)将上述实施例2中制备的液体Nisin产品装入经高压灭菌的20ml取样瓶中，封口，在室温条件下不同时间测定乳酸链球菌素的效价，并与不加保护剂和稳定剂的液体Nisin样品做对比，其结果如下表1所示：不加保护剂和稳定剂的液体Nisin样品保存5个月，效价为原来的90％，而加保护剂和稳定剂的液体Nisin样品保存5个月后，效价仍为原来的99％以上，效果要好于不加稳定剂和保护剂的液体Nisin样品。

表1

(2)将上述实施例3中制得的液体Nisin样品100ml，pH为3.0，在121℃下处理5-20min后，定容至100ml，考察液体Nisin效价是否有损失，同时与不加保护剂的液体Nisin样品做对比，结果如下表2所示：高温处理20min后，不加保护剂和稳定剂的液体Nisin效价损失原来的10.4％，而加保护剂和稳定剂的Nisin样品，效价还有原来的99％，几乎没有损失。

表2

(3)将实施例3制备的液体Nisin加入到不同食品中，加入量为4.5mL/kg，并与Nisin固体粉末做对比，考察其防腐效果，室温为20℃，结果如下表3所示，液体Nisin防腐效果不逊于固体Nisin，也延长了食品的保存时间，同时使用更加方便。

表3

Claims (4)

1.一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：乳酸链球菌素发酵液经过预处理后，进行陶瓷膜过滤除菌，除菌后清液经过泡沫分离方式进行浓缩，得到高效价的乳酸链球菌素溶液，添加保护剂和稳定剂后，得到液体Nisin防腐剂；

所述预处理前乳酸链球菌素发酵液效价10000~14000IU/mL；

所述高效价的乳酸链球菌素溶液效价100000IU/mL以上；

所述乳酸链球菌素发酵液的预处理为：调节发酵液pH到1.5-3.0，加热0.5-2h使乳酸链球菌素从菌体上分离下来后，进行陶瓷膜过滤除去菌体及大分子蛋白；所述陶瓷膜截留分子量为5万-10万道尔顿；

所述保护剂为1-2%的氯化钠、0.02-0.8%的蔗糖、0.01-0.5%的谷氨酸钠、0.05-0.6%的麦芽糊精；所述保护剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准；

所述稳定剂为0.01-1%的山梨醇、0.02-0.6%的微晶纤维素、0.0001-0.0005%的聚氧乙烯聚丙烯甘油醚、0.0005-0.001%的吐温-20；所述稳定剂的添加量均以乳酸链球菌素溶液的重量为基准。

2.根据权利要求1所述的一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，除菌后的清液经过泡沫分离的方式进行浓缩，具体为在泡沫分离设备内，通过不断通入气体进行吹泡，形成大量泡沫，使用泡沫收集装置收集泡沫后，进行消泡处理，得到高效价的乳酸链球菌素液体溶液。

3.根据权利要求2所述的一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，通入泡沫分离装置的气体为空气、二氧化碳、氮气中的一种或者几种。

4.根据权利要求2所述的一种液体Nisin防腐剂的制备方法，其特征在于，消泡的方式为物理消泡、化学消泡的一种或两种；

所述化学消泡为添加聚醚类消泡、食用油类消泡的一种或两种。