CN111499703A - 一种高收率乳酸链球菌素的提取方法 - Google Patents

一种高收率乳酸链球菌素的提取方法 Download PDF

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叶艇
金陈斌
杨云霞
孟根水
姚雨丰
许峰
雷涛
陈艺强
周斌
朱勇刚
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Abstract

本发明提供了一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，属于生物工程领域。包括以下步骤：吸附：取乳酸链球菌素发酵液，加入大孔吸附树脂，调节pH为2.0～5.0，调节温度20℃～50℃，搅拌条件下静态吸附，待吸附完全后，用纯化水洗涤3～5BV；解吸：上柱开始解吸，解吸剂为酸‑有基化合物体系，解吸流速为1BV/h；浓缩盐析：将解吸液pH调回到2.0，于20～40℃下减压浓缩，浓缩至有机化合物占总含量的5％‑30％；于浓缩液中加入20％v/m的NaCl盐析；盐析液抽滤得乳酸链球菌素湿粉。本发明提供了一种提取收率高，成本低，产品稳定且颜色差异性小的乳酸链球菌素提取方法。

Description

一种高收率乳酸链球菌素的提取方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及细菌素的分离方法，特指一种高收率乳酸链球菌素的提取方法。
背景技术
乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽或音译为尼辛，由乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成。由于乳酸链球菌素可抑制大多数革兰氏阳性细菌，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。食用后在人体中通过酶分解生成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂，乳酸链球菌素是一种具有抑菌功效多肽，能在酶的作用下分解为氨基酸，并且被人体所吸收，安全系数极高，因此被世界各国允许在食品中添加。乳酸链球菌素一般做成不同效价盐制剂，并且在PH等于2的时候溶解度最高，耐热性好，PH大于5时，溶解性和耐热性都有明显的下降。乳酸链球菌素对革兰氏阳性细菌的抑制作用尤为突出，譬如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等，特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有明显的抑制作用。
目前乳酸链球菌素的提取方法有利用正丁醇萃取以及膜分离提取等工艺，但存在提取收率不高，提取成本高，产品因色泽差异大而极不稳定。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的收率不高，成本高，产品色泽差异大等不足，提供一种高收率的乳酸链球菌素的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，包括以下步骤：
①、吸附：取乳酸链球菌素发酵液，加入大孔吸附树脂，调节pH为2.0～5.0，调节温度20℃～50℃，搅拌条件下静态吸附，待吸附完全后，用纯化水洗涤3～5BV；
②、解吸：上柱开始解吸，解吸剂为酸-有基化合物体系，解吸流速为1BV/h；
③、浓缩盐析：将解吸液pH调回到2.0，于20～40℃下减压浓缩，浓缩至有机化合物占总含量的5％-30％；于浓缩液中加入20％v/m的NaCl盐析；盐析液抽滤得乳酸链球菌素湿粉；
④、干燥：将乳酸链球菌素湿粉进行喷雾干燥，得乳酸链球菌素产品。
本发明进一步设置为：步骤①中乳酸链球菌素发酵液为陶瓷膜透过液。
本发明进一步设置为：步骤①中pH为2.5～3.5。
本发明进一步设置为：步骤②中解吸剂为盐酸-乙醇体系、盐酸-丙酮体系或柠檬酸-丙酮体系。
本发明进一步设置为：步骤②中柠檬酸-乙醇体系中柠檬酸浓度为1.5mol/L～2.5mol/L。
本发明进一步设置为：所述柠檬酸与乙醇体积比为1：1～1：1.5。
本发明进一步设置为：步骤③温度为25℃～35℃。
本发明进一步设置为：步骤③中盐析NaCl用量优选的为17％。
本发明进一步设置为：⑤、母液回收：将盐析液中加入1％v/m～3％v/m的活性炭，85℃下吸附并脱色1小时、抽滤，滤液作为解吸剂再次使用。
本发明进一步设置为：步骤⑤中活性炭用量为2％v/m。
本发明相比现有技术具有以下有益的技术效果：
1.本发明采用酸-有机化合物体系的作复合解吸剂，解吸彻底，且用量少，收率大；同时干燥后所得乳酸链球菌素颜色差异性较低，颜色更白并稳定，大幅提L了乳酸链球菌素的纯度；
2、本发明所采用的母液回收，加入活性炭后进行脱色抽滤，所得滤液再次作为解吸剂使用，使得解吸剂的用量较传统会更少，成本得以大幅降低；
3、本发明采用盐析提取Nisin湿粉，其较传统通过丙酮分离分层提取效率会更高。
具体实施方式
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而并非全部实施例。
实施例1.
取10L破壁后的发酵乳酸链球菌素液，检测效价9620IU/ml,加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取样检测吸附残液效价为2026IU/ml，将树脂和发酵液分离，清洗表面残渣，一L树脂清洗废水量为4L左右，每L树脂吸附量在0.75(十亿)，将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.6％。
实施例2.
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8624IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取样检测吸附残液效价为160IU/ml，将树脂与清液分离，清洗表面残渣，一L树脂清洗废水量为500ml左右，每L树脂吸附量在0.85(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.8％。
值得一提的是，近年来膜分离技术发展迅速，陶瓷膜分离技术以其分离精度高、耐高温、耐酸碱、易清洗等优势在发酵液分离提取行业占用重要地位。在乳酸链球菌素行业中，逐渐呈现以陶瓷膜技术代替传统工艺的趋势。陶瓷膜微滤能够作为发酵液的过滤工艺，陶瓷超滤膜、陶瓷纳滤膜能够作为滤液的浓缩工艺，提高过滤、浓缩的效果，提高产品质量
实施例3.
实施例2的陶瓷膜清液作为实验树脂的吸附对象。
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在2.0左右，待PH稳定后，取样检测吸附残液效价为2621IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.6(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.2％。
实施例4.
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在2.5左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，检测效价为1026IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.75(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.1％。
实施例5.
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调节酸的PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为145IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.85(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.7％。
实施例6.
取10L陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.5左右，待PH稳定后，吸附残液有少量絮状物析出，取吸附残液，将PH调回到2.0，絮状物溶解，检测效价为794IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.79(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为97.8％。
实施例7.
取10L陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在4.0左右，待PH稳定后，吸附残液有少量絮状物析出，取吸附残液，将PH调回到2.0，絮状物溶解，检测效价为824IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.78(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为95.8％。
实施例8.
取10L陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在4.5左右，待PH稳定后，吸附残液有大量絮状物析出，取吸附残液，将PH调回到2.0，絮状物溶解，检测效价为814IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.78(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为92.5％。
实施例9.
取10L陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在5.0左右，待PH稳定后，吸附残液有大量絮状物析出，取吸附残液，将PH调回到2.0，絮状物溶解，检测效价为1614IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.78(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为90.6％。
实施例10.
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在2.75左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为185IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.84(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.2％。
实施例11.
取10L的陶瓷膜清液，检测效价为8664IU/ml，加入1L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.25左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为160IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，每L树脂吸附量在0.85(十亿)。将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸收率为98.1％。
实施例12.
取80L的陶瓷膜清液，检测效价为8364IU/ml，加入8L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为0IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，待用。
实施例13.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用1mol/L的盐酸丙酮水溶(1/1)体系解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为3L,解吸收率为97.2％。
实施例14.
取1L实施例12的树脂，检将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸丙酮水溶液(1/1)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为2.5L,解吸收率为98.2％。
实施例15.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用1mol/L的盐酸乙醇水溶液(1/1)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为240，解吸液体积为3.0L,解吸收率为94.7％。
实施例16.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用1mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为2.5L,解吸收率为98.8％。
实施例17.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为2.2L,解吸收率为98.4％。
实施例18.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.5)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为3.0L,解吸收率为97.4％。
实施例19.
取1L实施例12的树脂，将树脂装柱，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.25)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为2.5L,解吸收率为98.8％。
实施例20.
取50L的陶瓷膜清液，检测效价为8364IU/ml，加入5L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为0IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，将树脂装柱，，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.25)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为10,将解吸液PH调到2.0，平均分成5份。
实施例21.
取1份实施例20的解吸液，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为20°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取检测，浓缩收率为97.6％，浓缩时间为154h。
实施例22.
取1份实施例20的解吸液，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为30°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取检测，浓缩收率为98.3％，浓缩时间为126min。
实施例23.
取1份实施例20的解吸液，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为40°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取检测，浓缩收率为96.8％，浓缩时间为102min。
实施例24.
取1份实施例20的解吸液，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为25°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取检测，浓缩收率为98.0％，浓缩时间为138min。
实施例25.
取1份实施例20的解吸液，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为35°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取检测，浓缩收率为98.6％，浓缩时间为113min。
实施例26.
取50L的陶瓷膜清液，检测效价为8364IU/ml，加入5L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为0IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，将树脂装柱，，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.25)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为10,将解吸液PH调到2.0，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为35°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取出，检测含量，然后平均分成5等分。
实施例27.
取一份实施例26的浓缩液，加入10％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为1560IU/ml，湿粉收率为92.4％。
实验28.
取一份实施例26的浓缩液，加入15％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为185IU/ml，盐析收率为96.2％。
实施例29.
取一份实施例26的浓缩液，加入20％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为65IU/ml，盐析收率为99.2％。
实施例30.
取一份实施例26的浓缩液，加入25％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为33IU/ml，盐析收率为99.4％。
实施例31.
取一份实施例26的浓缩液，加入30％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为45IU/ml，盐析收率为99.3％。
实施例32.
取一份实施例26的浓缩液，加入17％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，检测母液的含量为68IU/ml，盐析收率为99.2％。
实施例33.
取20L的陶瓷膜清液，检测效价为8364IU/ml，加入2L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为0IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，将树脂装柱，，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.25)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为10,将解吸液PH调到2.0，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为35°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取出，加入17％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，将母液取出，平均分成2份。
实施例34.
取一份实施例33的母液，加入1％的活性炭，85℃下吸附脱色1小时，抽滤，取滤液，检测透光度为92.8％。
实施例35.
取一份实施例33的母液，加入2％的活性炭，85℃下吸附脱色1小时，抽滤，取滤液，检测透光度为96.2％。
实施例36.
取20L的陶瓷膜清液，检测效价为8364IU/ml，加入2L的大孔吸附树脂，机械搅拌，调酸酸控制PH在3.0左右，待PH稳定后，取吸附残液，将PH调回到2.0，效价为0IU/ml，将树脂和清液分离，清洗表面残渣，将树脂装柱，，用2mol/L的柠檬酸乙醇水溶液(1/1.25)解吸，待解吸出口PH和解吸液相近时停止解吸，检测出口含量为0，解吸液体积为10,将解吸液PH调到2.0，用旋转蒸发器进行减压浓缩，温度设为35°，浓缩至有大量气泡产生时，停止浓缩，将浓缩液取出，加入17％的盐，搅拌一段时间后放置2h，然后抽滤，将湿粉取出，进行喷雾干燥，将母液取出，用2％的活性碳脱色，将脱色后的母液套用。从陶瓷膜清液到湿粉总收率在90－95％之间，且颜色较传统工艺更浅。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
①、吸附：取乳酸链球菌素发酵液，加入大孔吸附树脂，调节pH为2.0～5.0，调节温度20℃～50℃，搅拌条件下静态吸附，待吸附完全后，用纯化水洗涤3～5BV；
②、解吸：上柱开始解吸，解吸剂为酸-有基化合物体系，解吸流速为1BV/h；
③、浓缩盐析：将解吸液pH调回到2.0，于20～40℃下减压浓缩，浓缩至有机化合物占总含量的5％-30％；于浓缩液中加入20％v/m的NaCl盐析；盐析液抽滤得乳酸链球菌素湿粉；
④、干燥：将乳酸链球菌素湿粉进行喷雾干燥，得乳酸链球菌素产品。
2.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤①中乳酸链球菌素发酵液为陶瓷膜透过液。
3.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤①中pH为2.5～3.5。
4.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤②中解吸剂为盐酸-乙醇体系、盐酸-丙酮体系或柠檬酸-丙酮体系。
5.根据权利要求4所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤②中柠檬酸-乙醇体系中柠檬酸浓度为1.5mol/L～2.5mol/L。
6.根据权利要求4所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：所述柠檬酸与乙醇体积比为1：1～1：1.5。
7.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤③温度为25℃～35℃。
8.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤③中盐析NaCl用量优选的为17％。
9.根据权利要求1所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：⑤、母液回收：将盐析液中加入1％v/m～3％v/m的活性炭，85℃下吸附并脱色1小时、抽滤，滤液作为解吸剂再次使用。
10.根据权利要求9所述的一种高收率乳酸链球菌素的提取方法，其特征在于：步骤⑤中活性炭用量为2％v/m。
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