CN101108128A - 光学式葡萄糖测定仪片及其制造方法 - Google Patents

光学式葡萄糖测定仪片及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供抑制乃至防止传感检测膜中的第1、第2酶随时间推移的劣化可能的光学式葡萄糖测定仪片。该光学式葡萄糖测定仪片具备基片，在基片的主面上形成的、用于使光入射到上述基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件，在位于光学元件之间的上述基片主面上形成的葡萄糖传感检测膜，该传感检测膜含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶和负离子性纤维素衍生物，上述传感检测膜具有上述第1、第2酶中的任一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶和发色剂保持在上述负离子性纤维素衍生物上的结构。

Description

光学式葡萄糖测定仪片及其制造方法
技术领域
本发明涉及光学式葡萄糖测定仪片(glucose sensor chip)及其制造方法。
背景技术
作为光学式葡萄糖测定仪片，例如正在开发用皮下组织的体液抽出间接地调查血糖值的低侵袭型血糖测定用的传感检测片(sensor chip)。该传感检测片具有具备玻璃基片，在该基片表面形成的、用于使光入射该基片内、使光放出的一对光栅，以及在位于该光栅之间的上述基片表面形成的葡萄糖传感检测膜的结构。该葡萄糖传感检测膜含有发色剂(例如3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ))、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶(例如葡萄糖氧化酶(GOD))、和由该第1酶产生的生成物发生反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶(例如过氧化酶(POD))、以及像膜形成高分子化合物(例如羟乙基纤维素(HEC)那样的纤维素衍生物)。
在像这样结构的葡萄糖测定仪片中，在皮肤和上述传感检测膜之间配置薄片状凝胶，一加上电场，皮下组织液中的葡萄糖就从皮肤透过凝胶到达上述传感检测膜。此时，是上述传感检测膜中的发色剂的TMBZ起因于葡萄糖和GOD、POD的反应而发色。在该状态，光入射到上述基片中，若在该基片表面和上述一方的光栅上发生折射，该光就向上述基片和含有已发色的TMBZ的传感检测膜的界面传播，在基片和另一方的光栅的界面发生折射，例如用受光元件接受光。该已受光的激光强度，与通过上述葡萄糖传感检测膜的发色剂的发色在非发色时用受光元件接受的光强度(初期强度)相比，成为降低的值，从该降低率检测出上述葡萄糖的浓度。
但是，在上述传感检测膜的长期保存、使用中，其中的第1、第2酶，活性急剧地降低而劣化。作为该劣化原因，可举出传感检测膜的pH值变化、第1、第2酶的离子强度的变化和第1、第2酶的水解。第1、第2酶一劣化，第1酶和是测定对象的葡萄糖的反应就变得不充分。和该葡萄糖的反应性的降低，使在此后发生的、由和第2酶的反应引起的发色剂发色的物质的产生降低，作为结果，产生和发色剂的反应降低、发色程度的降低，而导致葡萄糖测定仪片的灵敏度降低。
发明内容
本发明是提供能抑制乃至防止传感检测膜中的第1、第2酶的随时间推移的劣化可能的光学式葡萄糖测定仪片及其制造方法。
按照本发明的第1方式，提供光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，具备
基片、
用于在上述基片的主面上形成的、使光入射到上述基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件、以及
在位于上述光学元件之间的上述基片主面上形成的葡萄糖传感检测膜，该膜含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶和非离子性纤维素衍生物，
上述传感检测膜具有上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶和发色剂保持在上述非离子性纤维素衍生物上的结构。
按照本发明的第2方式，提供光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，具备
玻璃基片、
用于在上述玻璃基片的主面上形成的、使光入射到上述玻璃基片内、使光放出到上述玻璃基片外的一对光学元件、
在形成上述光学元件的上述基片主面上形成的、由高于上述基片的折射率的树脂构成的光反射路层，
在上述光反射路层的上述光学元件之间形成的葡萄糖传感检测膜，该膜含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶和非离子性纤维素衍生物，
上述传感检测膜具有上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶和发色剂保持在上述非离子性纤维素衍生物上的结构。
按照本发明的第3方式，提供光学式葡萄糖测定仪片的制造方法，其特征在于，包括
使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶中的任一个酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在其他的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，或者上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加各混合液，或者上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，利用上述的任一个过程制备葡萄糖传感检测膜形成用涂布液的工序，
在基片上形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件的工序，以及
在上述光学元件之间的上述基片区域上涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液、进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜的工序。
按照本发明的第4方式，提供光学式葡萄糖测定仪片的制造方法，其特征在于，包括
使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶的任一个酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在其他的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，或者上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加各混合液，或者上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，利用上述的任一个工序制备葡萄糖传感检测膜形成用涂布液的过程，
在玻璃基片的主面上形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件的工序，
在形成上述光学元件的上述基片的主面上形成由高于上述基片的折射率的树脂构成的光反射路层的工序，以及
在上述光反射路层上的上述光学元件之间涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜的工序。
发明效果
按照本发明，提供通过抑制乃至防止传感检测膜中的第1、第2酶水时间推移而劣化，连续长时间地高灵敏度且稳定地检测葡萄糖可能的光学式葡萄糖测定仪片及其制造方法。
附图说明
图1表示有关第1实施方式的葡萄糖测定仪片的断面图。
图2表示有关第2实施方式的葡萄糖测定仪片的断面图。
图3表示随实施例1、2和对比例1的葡萄糖测定仪片中的保存期间的经过的吸光度(灵敏度)变化的线图。
具体实施方式
以下，参照附图详细地说明有关本发明实施方式的光学式葡萄糖测定仪片。
(第1实施方式)
图1是表示有关第1实施方式的光学式葡萄糖测定仪片的断面图。
玻璃基片1，在主面例如具有3nm以上厚度的SiO2表层2。为了在上述SiO2表层2的两端部附近表面使光入射到该基片1内、或者使基片1内的光放出，分别形成一对光学元件，例如一对光栅3。再者，也可以用棱镜等代替光学元件。这些光栅3，由具有高于上述SiO2表层2的折射率的，例如氧化钛制作。为了遮盖上述光栅3，可以形成具有比上述光栅3低的折射率的保护膜。该保护膜由和使用的药液·检测体不发生反应的材料，例如氟树脂制作。
在位于上述光栅3之间的上述基片1的SiO2表层2上形成葡萄糖传感检测膜4。该葡萄糖传感检测膜4含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶以及非离子性纤维素衍生物，上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶、离子性聚合物、缓冲剂和发色剂具有保持在上述非离子性纤维素上的结构。
这里，用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆第1、第2酶中的至少一个的标准，由下面说明的随时间劣化的大小来决定。
即，在第1酶中添加葡萄糖，使通过反应生成的生成物作用于特定的发色剂而发色，测定此时的吸光度。使第1酶在一定的温度和湿度的氛围中暴露一定时间后，在该第1酶中添加葡萄糖，使通过反应生成的生成物作用于特定的发色剂而发色，测定此时的吸光度。求出后者对前者的吸光度的降低率。
另外，在葡萄糖中添加第1酶和第2酶，使通过和第1酶的生成物反应而的生成物质作用于特定的发色剂而发色，测定此时的吸光度。在一定的温度和湿度的氛围气中使第2酶暴露和上述第1酶的吸光度测定相同的时间后，将该第2酶和第1酶一起添加在葡萄糖中，使通过和第1酶的生成物反应而生成的物质作用于特定的发色剂而发色，测定此时的吸光度。求出后者对前者的吸光度的降低率。
将起因于上述第1酶的随时间劣化的吸光度的降低率和起因于上述第2酶的随时间劣化的吸光度的降低率进行比较，选择吸光度的降低率大的酶，用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆。另外，无论在第1、第2酶的哪一个中，在吸光度的降低率的绝对值大的情况下，都优先选择用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆两者。
上述葡萄糖传感检测膜4中的酶和发色剂，例如通过下述表1所示的组合而使用。
表1
      第1酶   第2酶 发色剂
氧化酶 葡萄糖氧化酶 过氧化酶 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺
N，N′-双(2-羟基-3-磺基丙基)三嗪
3，3′二氨基联苯胺
己糖激酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物
2-(4-玫红苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓
3，3′-[3，3′-二甲氧基-(1，1′-联苯基)-4，4′-二基]双(2，5-二苯基)-2H-四唑氯化物
还原酶 葡萄糖脱氢酶 磷钼酸 氨基苯酸盐
在上述葡萄糖传感检测膜4中使用的非离子性纤维素衍生物，是与膜形成有关的高分子化合物。作为该非离子性纤维素衍生物，例如可举出像甲基纤维素、乙基纤维素那样的烷基纤维素；像羟乙基纤维素、羟丙基纤维素那样的羟基烷基纤维素；像羟丙基甲基纤维素、羟丙基乙基纤维素、羟丙基二乙基纤维素、羟丙基乙基甲基纤维素那样的羟烷基烷基纤维素；以及微纤维化纤维素等，它们能够以单体或者混合物的形态使用。
上述离子性聚合物，在长时间的保存、使用中，具有抑制来自上述第1、第2酶的盐析出的机能。对于该离子性聚合物来说，有正离子性聚合物和负离子性聚合物。作为正离子性聚合物，例如可举出含有氨基、胍基、双胍基等阳离子性基的聚合物。若具体地例示正离子性聚合物，可举出聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯基吡啶、聚赖氨酸等。作为负离子性聚合物，例如可举出含有磷酸酯、羧酸酯和磺酸酯等阴离子性基的聚合物。若具体地例示负离子性聚合物，可举出聚苯乙烯磺酸、聚乙烯硫酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、或者像羧甲基纤维素、乙酸纤维素那样的纤维素衍生物等。在这些离子性聚合物中，优先选择负离子性聚合物。
上述缓冲剂，在长时间的保存、使用中，抑制上述第1、第2酶的pH和离子强度，具有抑制这些酶的形态、结构的变化的机能。作为该缓冲剂，例如可以使用磷酸缓冲剂、乙酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、硼酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、碳酸缓冲剂等。
通过用放入这样的缓冲剂的离子性聚合物被覆第1、第2酶中的至少一个酶，在长时间保存、使用中，在抑制来自酶的盐的析出的同时，抑制酶的形态、结构的变化，使维持高的活性状态成为可能。
在上述葡萄糖传感检测膜4中，允许含有交联性高分子化合物。作为该交联性高分子化合物，例如可举出具有选自羟基、羧基、氨基、离子性官能基的至少一个基的亲水性单体和疏水性单体的共聚物。该亲水性单体和疏水性单体的共聚物，用实验已证实，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱和甲基丙烯酸丁酯的共聚物是特别优选的。
上述交联性高分子化合物，在上述葡萄糖传感检测膜中，相对该葡萄糖传感检测膜的整个组成物，优选含有10-4～10重量％。交联性高分子化合物的含量，相对整个组成物若不到10-4重量％，防止在加温状态膜结构发生溶解而崩溃，或防止保持在膜结构中的空隙内的发色剂或酶等溶出到外部介质中就变得困难。另一方面，交联性高分子化合物的含量若超过10重量％，葡萄糖传感检测膜中的发色剂或酶的量，就相对地降低，而有片灵敏度降低的担心。
上述葡萄糖传感检测膜4，允许在膜结构的空隙中还含有用于赋予透水性的聚乙二醇或者乙二醇。借此，提高亲水性，在将水作为葡萄糖导入用的介质的情况下，反应灵敏度提高。
接着，说明上述的图1中所示的光学式葡萄糖测定仪片的作用。
使具有贯通凹部(well)的连接头(未图示)接触检体，例如人体的皮肤，使该葡萄糖传感检测膜4位于凹部侧地将上述的传感片安装在该连接头上。连接头避免葡萄糖传感检测膜4和检体直接接触，有助于提高传感检测的再现性。由此产生的空隙、上述凹部内使抽出介质(例如和水、生理食盐水等液体，检体或传感检测膜不直接发生反应，溶合在一起的介质)充满，通过从外部在检体上施加微小电压，皮下组织液中的葡萄糖从皮肤抽出到抽出介质中，再从抽出介质浸透到上述传感检测膜4中。构成葡萄糖传感检测膜4的第1、第2酶(氧化或者还原酶)、以及发色剂的组合，例如是上述表1所示的葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化酶(POD)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ))时，浸透在传感检测膜4中的葡萄糖通过GOD进行分解而产生过氧化氢，通过POD使该过氧化氢分解而放出活性氧，利用该活性氧使TMBZ发色。也就是说，TMBZ的发色程度根据葡萄糖量发生变化。
在这样的状态，使来自上述激光源(激光二极管)5的激光通过未图示的偏振光滤光器，通过入射到上述基片1里面侧，该激光在基片1的SiO2表层2和左侧的光栅3的界面发生折射，再在SiO2表层2和含有已发色的发色剂的葡萄糖传感检测膜4的界面发生折射，向含有SiO2表层2的基片1传播。此时，进行传播的光的急减波(evanesent wave)基于葡萄糖传感检测膜4中的葡萄糖量，根据发色程度被吸收。向基片1传播的光从右侧的光栅12放出，用受光元件(例如光电二极管)6接受光。已受光的激光强度，与在传感检测膜4的非发色时已受光的光强度(初期强度)相比，成为降低的值，从其降低率检测出葡萄糖量成为可能。
下面，说明上述图1中所示的光学式葡萄糖测定仪片的制造方法。
首先，用以下的方法制备葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。
(1)预先将使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶的任一种酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液混合。在该混合工序中，上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆。接着，将该混合液添加在另外的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中，通过混合来制备用上述离子性聚合物被覆的一种酶和另外的酶、上述发色剂一起分散在膜形成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物中的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。
(2)上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合。在该混合工序中，上述第1、第2酶分别用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆。接着，将这些混合液添加在发色剂和非离子性纤维素衍生物中，通过混合来制备分别用上述离子性聚合物被覆的第1、第2酶和上述发色剂一起分散在膜形成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物中的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。
(3)上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合。在该混合工序中，上述第1、第2酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆。接着，该将混合液添加在发色剂和非离子性纤维素衍生物中，通过混合来制备用上述离子性聚合物被覆的第1、第2酶与上述发色剂一起分散在膜成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物中的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。
接着，在该基片上，利用氧化钛膜的成膜、图案形成来形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件，例如光栅。接着，通过在这些光栅间的上述基片区域上涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥，形成葡萄糖传感检测膜来制造光学式葡萄糖测定仪片。
以上，在利用第1实施方式的光学式葡萄糖测定仪片的葡萄糖量的检测中，因为第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，所以葡萄糖传感检测膜在长时间保存、使用中在抑制盐从酶析出的同时，也抑制酶的形态、结构的变化，而能够维持高活性状态。其结果，能够提供连续长时间高灵敏度而且稳定地检测检体中的葡萄糖量可能的光学式葡萄糖测定仪片。
另外，按照第1实施方式的方法，预先将使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶的任一种酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液混合，将该混合液添加在另外的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中，或者将上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液混合，将各混合液添加在发色剂和非离子性纤维素衍生物中，或者上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂水溶液预先混合，将该混合液添加在发色剂和非离子性纤维素衍生物中，利用上述任一工序能够制备第1、第2酶中的至少一个酶用放入上述缓冲剂的离子性聚合物被覆、而且和发色剂一起分散在膜形成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物中的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。此后，在基片上形成一对光栅，通过在这些光栅间的上述基片区域上涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜，就能够制造连续长时间高灵敏度而且稳定地检测检体中的葡萄糖量可能的光学式葡萄糖测定仪片。
(第2实施方式)
图2是表示有关第2实施方式的光学式葡萄糖测定仪片的断面图。
为了使光入射到玻璃基片11、并使该光放出，在玻璃基片11主面的两端部附近形成光学元件的一对光栅12。这些光栅12由具有高于上述基片11的折射率的例如氧化钛制作。由高于上述基片11的折射率的热固性或者光固性的树脂构成的光反射路层13，在包含上述光栅12的上述基片11的主面上形成。光反射路层13的主面，要平行于包含上述光栅12的上述基片11的主面地形成。
葡萄糖传感检测膜14在对应于上述光栅12间的上述光反射路层13部分上形成。该葡萄糖传感检测膜14具有和上述第1实施方式相同的结构，即使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶的至少一种酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶、离子性聚合物、缓冲剂和发色剂被保持在上述非离子性纤维素衍生物上的结构。
这里，用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆第1、第2酶中的至少一个酶的标准，是和上述第1实施方式中说明的相同。
上述光反射路层13，表面是平滑的，优选具有10μm以上、最好10～200μm的厚度。具有10μm以上厚度的光反射路层，抑制光的传播时的光强度的衰减成为可能，例如除了激光光源以外，使用LED(发光二极管)光源成为可能。
上述葡萄糖传感检测膜14中的第1、第2酶和发色剂，例如以上述表1所示的组合使用。
上述葡萄糖传感检测膜14中的离子性聚合物、缓冲剂和非离子性纤维素衍生物，可以使用和上述第1实施方式中列举的相同的离子性聚合物、缓冲剂和非离子性纤维素衍生物。
在上述葡萄糖传感检测膜14中，如上述第1实施方式中所说明，还允许含有交联性高分子化合物，并且允许含有聚乙二醇或者乙二醇。
下面，说明上述图2所示的光学式葡萄糖测定仪片的作用。
使具有贯通凹部的连接头(未图示)接触检体，例如人体的皮肤，使该葡萄糖传感检测膜14位于凹部侧地将上述的传感片安装在该连接头上。在上述凹部内充满含有水的抽出介质，通过从外部施加微小电压，皮下组织中的葡萄糖从皮肤抽出到介质中，再浸透到上述传感检测膜14中。构成葡萄糖传感检测膜14的第1、第2酶(氧化或者还原酶)和发色剂的组合，例如是上述表1所示的葡萄糖氧化酶(GOD)、过氧化酶(POD)和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ))时，浸透在传感检测膜14中的葡萄糖通过GOD进行分解而产生过氧化氢，通过POD使该过氧化氢分解而放出活性氧，利用该活性氧使TMBZ发色。也就是说，TMBZ的发色程序根据葡萄糖量发色变化。
在这样的状态，来自上述光源(例如激光二极管)15的激光通过未图示的偏振光滤光器，通过入射到上述基片11里面侧，该激光器光通过基片11在其主面和左侧的光栅12的界面发生折射，入射到光波导路层13中，再在该光波导路层13和含有已发色的发色剂的葡萄糖传感检测膜14的界面发生折射向该光波导路层13传播。此时，进行传播的光的急减波基于上述葡萄糖传感检测膜14中的葡萄糖量，根据发色程度被吸收。向上述光波导路层13传播的光从右侧的光栅12放出，用受光元件(例如光电二极管)16接受光。已受光的激光强度，与在传感检测膜14的非发色时已受光的光强度(初期强度)相比，成为降低的值，从其降低率检测出葡萄糖量成为可能。
下面，说明上述的图2中所示的光学式葡萄糖测定仪片的制造方法。
首先，使用和上述第1实施方式相同的3种方法中的任一种方法，来制备用放入土述缓冲剂的离子性聚合物被覆第1、第2酶中的至少一个酶，而且和发色剂一起分散在膜形成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物中的的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。
接着，利用氧化钛膜的成膜、图案形成在玻璃基片的主面上形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件，例如光栅。随后，在已形成上述光栅的上述基片的主面上形成由高于上述基片的折射率的热固化或者光固化树脂构成的光反射路层。通过连续在上述光反射路层上的上述光栅之间涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜来制造光学式葡萄糖测定仪片。
以上，在利用第2实施方式的光学式葡萄糖测定仪片的葡萄糖量的检测中，葡萄糖传感检测膜和上述第1实施方式相同地第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，因此在长时间保存、使用中，在抑制盐从酶中析出的同时，抑制酶的形态、结构的变化，能够维持活性状态。其结果，能够提供连续长时间高灵敏度而且稳定地检测检体中的葡萄糖量可能的光学式葡萄糖测定仪片。
另外，按照第2实施方式，能够和第1实施方式相同地制备第1、第2酶中的至少一个酶预先用放入上述缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且和发色剂一起分散在膜形成高分子化合物的非离子性纤维素衍生物的葡萄糖传感检测膜形成用涂布液。此后，在玻璃基片的主面上形成一对光栅，在已形成光栅的上述基片的主面上形成高于上述基片的折射率的光反射路层，通过在上述光反射路层的上述光栅之间涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜，就能够制造连续长时间高灵敏度而且稳定地检测检体中的葡萄糖量可能的光学式葡萄糖测定仪片。
以下，说明本发明的实施例。
实施例1
0.67mg/mL的过氧化酶(POD)溶液(溶解在0.01mol/L的磷酸缓冲液(pH：6.0)中)和5.33mg/mL的葡萄糖氧化酶(GOD)溶液(溶解在0.01mol/L的磷酸缓冲液(pH：6.0)中)的混合液9μL与负离子性聚合物的1重量％的羧甲基纤维素(CMC)水溶液1μL混合，进行搅拌。将9μL得到的混合液添加在143.6μL异丙醇(IPA)和116.6μL纯水、1体积％的聚乙二醇(PEG)的异丙醇溶液6μL以及1mg/mL的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMBZ)的异丙醇溶液60μL、2重量％的羧乙基纤维素(HEC)水溶液64μL和1重量％的交联高分子化合物(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰基胆碱和甲基丙烯酸丁酯的共聚物)水溶液0.8μL中，进行混合、搅拌，制备成400μL萄糖传感检膜形成用涂布液。
接着，准备在主面具有厚10nm的SiO2表层的、折射率1.52的无碱玻璃基片，利用溅射使折射率2.2～2.4、厚50nm的氧化钛膜在该基片的SiO2表层上成膜。接着，通过抗蚀剂的抹涂、干燥、光刻(lithography)在该氧化钛膜上形成抗蚀图案。接着通过以抗蚀图案作为掩模，利用活性离子蚀刻选择地去除氧化钛膜，在上述SiO2表层的两端部附近表面形成光栅后，利用抛光去除抗蚀图案。
接着，利用氧RIE将上述基片干洗后，用切割裁断成17mm×6.5mm的尺寸而形成片状。接着，在位于上述基片的光栅之间的传感检测膜形成区域的表面滴下8μL上述葡萄糖传感检测膜生成用涂布液。通过惰性气体的净化、真空干燥进行干燥，形成多孔质(透水性)、厚0.8μm的葡萄糖传感检测膜，来制造上述图1所示的光学式葡萄糖测定仪片。再者，已滴下的葡萄糖传感检测膜生成用涂布液的液滴是具有以下的组成的液滴。
磷酸缓冲液：0.000525mol/L、
磷酸缓冲剂：0.0003mol/L、
PEG：0.15容积％、
TMBZ：0.15mg/L、
POD：0.0015mg/L、
GOD：0.012mg/L、
CMC(负离子性聚合物)：0.0005重量％、
HEC：0.64重量％、
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰基胆碱和甲基丙烯酸丁酯的共聚物：0.002重量％。
实施例2
代替实施例1的负离子性聚合物的CMC，使在葡萄糖传感检测膜生成用涂布液中成为0.0008μmg/L地配合正离子性聚合物的聚赖氨酸，除此以外，和实施例1同样地形成传感检测膜，制成上述图1所示的光学式葡萄糖测定仪片。
对比例1
除了不含离子性聚合物和磷酸钠缓冲剂以外，使用和实施例1相同的各种成分，用1次混合制备葡萄糖传感检测膜生成用涂布液，使用该涂布液和实施例1相同地形成葡萄糖传感检测膜，制成上述图1所示的光学式葡萄糖测定仪片。
关于得到的实施例1、2和对比例1的光学式葡萄糖测定仪片，利用以下的方法测定了随时间推移的葡萄糖的灵敏度(吸光度)。
即，使具有贯通凹部的连接头接触适当的平板(例如玻璃板)，使该葡萄糖传感检测膜位于凹部侧地在该连接头上安装各传感检测片，将凹部区划。在使含有1mg/dL的葡萄糖的水溶液充满凹部的状态(温度35℃)，如图1所示，通过使来自激光二极管5的激光通过偏振光滤光器，入射到所示基片1里面侧，使该激光器光在基片1的SiO2表层2和左侧的光栅3的界面折射，再在SiO2表层2和含有已发色的发色剂的葡萄糖传感检测膜4的界面折射，向含有SiO2表层2的基片1传播，用光电二极管6接受通过在右侧的光栅3和基片1的界面折射而传播的激光，测定该激光的光强度(吸光度)。
在实施例1、2中将传感检测片保存1天后，14天后、40天后和100天后，进行同样的操作，在对比例1中保存1天后，7天后和90天后，进行同样的操作，分别测定吸光度。
这些结果示于图3中。
如从图3可知，对比例1的传感检测片，即使7天的保存后，灵敏度也比保存前降低，在90天的保存后，灵敏度比保存前显著地降低。
与此相反，实施例1、2的传感检测片，即使保存100天后，也具有接近保存前的灵敏度。特别是具备含负离子性聚合物的葡萄糖传感检测膜的实施例1的传感检测片，与具备含正离子性聚合物的葡萄糖传感检测膜的实施例2相比，可知伴随经过保存期的灵敏度的维持性能高。
再者，至于具有由高于基片的折射率的热固性树脂或光固性树脂构成的光反射路层的、图2所示的葡萄糖传感检测片，即使在和实施例1同样地长期保存后，维持高灵敏度也是可能的。
另外，在上述实施方式·实施例中，葡萄糖传感检测膜保持的第1、第2酶、发色剂除了各自仅选择一种材料，也可以根据使用目的使多种材料混合存在。
再有，在上述实施方式中，作为基片使用玻璃，但如果是具有传播透过参照光的特性，该材质就不限定。也可以使用由单晶体形成的膜体或热固性树脂材料、热塑性树脂材料、感光性树脂材料等各种树脂材料。

Claims (12)

1.光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，具备
基片、
用于在上述基片的主面上形成的、使光入射到上述基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件、以及
在位于上述光学元件之间的上述基片主面上形成的葡萄糖传感检测膜，该膜含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶和非离子性纤维素衍生物，
上述传感检测膜具有上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶和发色剂保持在上述非离子性纤维素衍生物上的结构。
2.光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，具备
玻璃基片、
用于在上述玻璃基片的主面上形成的、使光入射到上述玻璃基片内、使光放出到上述玻璃基片外的一对光学元件、
在形成上述光学元件的上述基片主面上形成的、由高于上述基片的折射率的树脂构成的光反射路层、以及
在上述光反射路层的上述光学元件之间形成的葡萄糖传感检测膜，该膜含有发色剂、使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使上述发色剂发色的物质的第2酶和非离子性纤维素衍生物，
上述传感检测膜含有上述第1、第2酶中的至少一个酶用放入缓冲剂的离子性聚合物被覆，而且这些酶和发色剂保持在上述非离子性纤维素衍生物上的结构。
3.根据权利要求1或2所述的光学式葡萄糖测定仪片，上述第1酶是葡萄糖氧化酶，上述第2酶是过氧化酶，上述发色剂是3，3′，5，5′-四甲基联苯胺或者N，N′-双(2-羟基-3-磺基丙基)三嗪中的至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述离子性聚合物是负离子性聚合物。
5.根据权利要求4所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述负离子性聚合物是含有选自由磷酸酯、羧酸酯和磺酸酯组成的组中的至少一个阴离子基的聚合物。
6.根据权利要求1或2所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述负离子性纤维素衍生物是选自由烷基纤维素、羟烷基纤维素和羟烷基烷基纤维素组成的组中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述传感检测膜还含有交联性高分子化合物。
8.根据权利要求7所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述交联性高分子化合物是选自具有羟基、羧基、氨基、离子性官能基中的至少一个基的亲水性单体和疏水性单体的共聚物。
9.根据权利要求8所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述亲水性单体和疏水性单体的共聚物是2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰基胆碱和甲基丙烯酸丁酯的共聚物。
10.根据权利要求1或2所述的光学式葡萄糖测定仪片，其特征在于，上述葡萄糖传感检测膜还含有用于赋予透水性的聚乙二醇或者乙二醇。
11.光学式葡萄糖测定仪片的制造方法，其特征在于，包括
使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶中的任一个酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在其他的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，或者上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，将各混合液添加在发色剂和非离子性纤维素衍生物中，或者上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，利用上述的任一个工序制备葡萄糖传感检测膜形成用涂布液的工序，
在基片上形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件的工序，以及
在上述光学元件之间的上述基片区域上涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜的工序。
12.光学式葡萄糖测定仪片的制造方法，其特征在于，包括
使葡萄糖氧化或者还原的第1酶、通过和该第1酶的生成物发生反应而产生使发色剂发色的物质的第2酶中的任一个酶与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在其他的酶、发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，或者上述第1、第2酶分别与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加各混合液，或者上述第1、第2酶的两者与离子性聚合物和缓冲剂的水溶液预先混合，在发色剂和非离子性纤维素衍生物中添加该混合液，利用上述的任一个工序制备葡萄糖传感检测膜形成用涂布液的过程，
在玻璃基片的主面上形成用于使光入射到该基片内、使光放出到上述基片外的一对光学元件的工序，
在形成上述光学元件的上述基片的主面上形成由高于上述基片的折射率的树脂构成的光反射路层的工序，以及
在上述光反射路层上的上述光学元件之间涂布上述葡萄糖传感检测膜形成用涂布液，进行干燥而形成葡萄糖传感检测膜的工序。
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