JP2008022763A - 光学式グルコースセンサチップおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】センシング膜中の第１、第２の酵素の経時的な劣化を抑制ないし防止することが可能な光学式グルコースセンサチップを提供する。
【解決手段】基板と、基板の主面に形成され、前記基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、光学要素間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含むグルコースセンシング膜とを備え、前記センシング膜は前記第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有することを特徴とする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、光学式グルコースセンサチップおよびその製造方法に関する。

光学式グルコースセンサチップとしては、例えば皮下組織の体液抽出で血糖値を間接的に調べる低侵襲型血糖測定用のものが開発されている。このセンサチップは、ガラス基板と、この基板表面に形成され、その基板内に光を入射、放出させるための一対のグレーティングと、このグレーティング間に位置する前記基板表面に形成されるグルコースセンシング膜とを備えた構造を有する。このグルコースセンシング膜は、発色剤（例えば３、３’、５、５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ））、グルコースを酸化または還元させる第１酵素（例えばグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ））、この第１酵素による生成物と反応して発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素（例えばペルオキシダーゼ（ＰＯＤ））、および膜形成高分子化合物（例えばヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）のようなセルロース誘導体）を含有する。

このような構造のグルコースセンサチップにおいて、皮膚と前記センシング膜の間にシート状ゲルを配して電界をかけると、皮下組織液中のグルコースが皮膚からゲルを透過して前記センシング膜に到達する。このとき、前記センシング膜中の発色剤であるＴＭＢＺがグルコースとＧＯＤ，ＰＯＤの反応に起因して発色する。この状態で光を前記基板に入射しその基板表面と前記一方のグレーディングで屈折させると、その光は前記基板と発色したＴＭＢＺを含むセンシング膜の界面を伝播し、基板と他方のグレーティングの界面で屈折し、例えば受光素子で受光される。この受光したレーザ光強度は、前記グルコースセンシング膜の発色剤の発色により非発色時に受光素子で受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率から前記グルコースの濃度を検出する。

しかしながら、前記センシング膜の長期間の保存、使用において、その中の第１、第２の酵素は活性が急激に低下して劣化する。この劣化原因としては、センシング膜のｐＨ変化、第１、第２の酵素のイオン強度の変化および第１、第２の酵素の加水分解が挙げられる。第１、第２の酵素が劣化されると、第１酵素と測定対象であるグルコースとの反応が不十分になる。このグルコースとの反応性の低下は、その後に起こる、第２酵素との反応による発色剤を発色させる物質の発生を低下させ、結果として発色剤との反応低下、発色度合の低下を生じてグルコースセンサチップの感度低下を招く。

本発明は、センシング膜中の第１、第２の酵素の経時的な劣化を抑制ないし防止することが可能な光学式グルコースセンサチップおよびその製造方法を提供しようとするものである。

本発明の第１の態様によると、基板と、
前記基板の主面に形成され、前記基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
前記光学要素間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含むグルコースセンシング膜と
を備え、
前記センシング膜は、前記第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有することを特徴とする光学式グルコースセンサチップが提供される。

本発明の第２の態様によると、ガラス基板と、
前記ガラス基板の主面に形成され、前記ガラス基板内に光を入射させ、前記ガラス基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
前記光学要素が形成された前記基板の主面に形成され、前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層と、
前記光反射路層上の前記光学要素間に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含むグルコースセンシング膜と
を備え、
前記センシング膜は、前記第１、第２のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有することを特徴とする光学式グルコースセンサチップが提供される。

本発明の第３の態様によると、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、または前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、各混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、或いは前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、いずれかによりグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する工程と、
基板にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素を形成する工程と、
前記光学要素間の前記基板領域上に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成する工程と
を含むことを特徴とする光学式グルコースセンサチップの製造方法が提供される。

本発明の第４の態様によると、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、または前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、各混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、或いは前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、いずれかによりグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する工程と、
ガラス基板の主面にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素を形成する工程と、
前記光学要素が形成された前記基板の主面に前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層を形成する工程と、
前記光反射路層上の前記光学要素間に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成する工程と
を含むことを特徴とする光学式グルコースセンサチップの製造方法が提供される。

本発明によれば、センシング膜中の第１、第２の酵素の経時的な劣化を抑制ないし防止することによって、グルコースを長期間に亘って高感度かつ安定的に検出することが可能な光学式グルコースセンサチップおよびその製造方法を提供することができる。

以下、本発明の実施形態に係る光学式グルコースセンサチップを図面を参照して詳細に説明する。

（第１実施形態）
図１は、第１実施形態に係る光学式グルコースセンサチップを示す断面図である。

ガラス基板１は、主面に例えば３ｎｍ以上の厚さのＳｉＯ₂表層２を有する。一対の光学要素、例えば一対のグレーティング３は、前記ＳｉＯ₂表層２の両端部付近表面にその基板１内に光を入射、あるいは基板１内の光を放出させるためにそれぞれ形成されている。なお、光学要素はプリズムなどで代用してもよい。これらのグレーティング３は、前記ＳｉＯ₂表層２より高い屈折率を有する例えば酸化チタンから作られる。前記グレーティング３に比べて低屈折率を有する保護膜を、前記グレーティング３を覆うように形成してもよい。この保護膜は、使用する薬液・検体と反応しない材料、例えばフッ素樹脂から作られる。

グルコースセンシング膜４は、前記グレーティング３間に位置する前記基板１のＳｉＯ₂表層２に形成されている。このグルコースセンシング膜４は、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含み、前記第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素、イオン性ポリマー、緩衝剤および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有する。

ここで、第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素を緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆う基準は、次に説明する経時劣化の大小により決定する。

すなわち、第１酵素にグルコースを添加し、反応させることにより生成した生成物を特定の発色剤に作用させて発色させ、このときの吸光度を測定する。第１酵素を一定の温度および湿度の雰囲気に一定時間曝した後、この第１酵素にグルコースを添加し、反応させることにより生成した生成物を特定の発色剤に作用させて発色させ、このときの吸光度を測定する。前者に対する後者の吸光度の低下率を求める。

また、グルコースに第１酵素および第２酵素を添加し、第１酵素の生成物と反応することにより生成した物質を特定の発色剤に作用させて発色させ、このときの吸光度を測定する。第２酵素を一定の温度および湿度の雰囲気に前記第１酵素の吸光度測定と同様な時間曝した後、この第２酵素を第１酵素と共にグルコースに添加し、第１酵素の生成物と反応することにより生成した物質を特定の発色剤に作用させて発色させ、このときの吸光度を測定する。前者に対する後者の吸光度の低下率を求める。

前記第１酵素の経過劣化に起因する吸光度の低下率と前記第２酵素の経過劣化に起因する吸光度の低下率とを比較し、吸光度の低下率の大きい酵素を選択し、緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆う。また、第１、第２の酵素のいずれにおいても吸光度の低下率の絶対値が大きい場合には両者を緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆うことが好ましい。

前記グルコースセンシング膜４中の酵素および発色剤は、例えば下記表１に示す組み合わせにより用いられる。

前記グルコースセンシング膜４に用いる非イオン性セルロース誘導体は、膜形成に関与する高分子化合物である。この非イオン性セルロース誘導体としては、例えばメチルセルロース、エチルセルロースのようなアルキルセルロース；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのようなヒドロキシアルキルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース、ヒドロキシジエチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロースのようなヒドロキシアルキルアルキルセルロース；およびミクロフィブロ化セルロース等を挙げることができ、これらは単体または混合物の形態で用いることができる。

前記イオン性ポリマーは、長期間の保存、使用において前記第１、第２の酵素からの塩の析出を抑制する機能を有する。このイオン性ポリマーには、正イオン性ポリマーおよび負イオン性ポリマーがある。正イオン性ポリマーとしては、例えばアミノ基、グアニジノ基、ビグアニド基等のカチオン性基を含むポリマーが挙げられる。正イオン性ポリマーを具体的に例示すると、ポリアリルアミン塩酸塩、ポリビニルピリジン、ポリリジン等が挙げられる。負イオン性ポリマーとしては、例えばリン酸エステル、カルボキシレート、およびスルホン酸エステル等のアニオン性基を含むポリマーが挙げられる。負イオン性ポリマーを具体的に例示すると、ポリスチレンスルホン酸、ポリビニル硫酸、ポリアスパラギン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリフマル酸、またはカルボキシメチルセルロース、酢酸セルロースのようなセルロース誘導体等が挙げられる。これらのイオン性ポリマーの中で負イオン性ポリマーが好ましい。

前記緩衝剤は、長期間の保存、使用において前記第１、第２の酵素のｐＨおよびイオン強度を制御してそれら酵素の形態、構造の変化を抑制する機能を有する。この緩衝剤としては、例えばリン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、炭酸緩衝剤等を用いることができる。

このような緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素を覆うことによって、長期間の保存、使用において酵素のからの塩の析出を抑制すると共に、酵素の形態、構造の変化を抑制して高い活性状態を維持することが可能になる。

前記グルコースセンシング膜４には、架橋性高分子化合物を含むことを許容する。この架橋性高分子化合物としては、例えばヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つに基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体を挙げることができる。この親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体は、特に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体であることが好ましいことを実験にて確認している。

前記架橋性高分子化合物は、前記グルコースセンシング膜にこのグルコースセンシング膜の全組成物に対し１０^-4〜１０重量％含有されることが好ましい。架橋性高分子化合物の含有量を全組成物に対して１０^-4重量％未満にすると、加温状態で膜構造が溶解して崩壊したり、膜構造中の空隙に保持している発色剤や酵素等が外部媒体に溶出したりすることを防ぐことが困難になる。一方、架橋性高分子化合物の含有量が１０重量％を超えると、グルコースセンシング膜中の発色剤や酵素の量が相対的に低下してチップ感度が低下する虞がある。

前記グルコースセンシング膜４は、膜構造の空隙中に透水性を付与するためのポリエチレングリコールまたはエチレングリコールをさらに含むことを許容する。これにより親水性が高まり、水をグルコース導入用の媒体にする場合には反応感度が高まる。

次に、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップの作用を説明する。

検体、例えば人体の皮膚に貫通穴（ウエル）を有するアダプタ（図示せず）を当接させ、このアダプタに前述したセンサチップをそのグルコースセンシング膜４がウエル側に位置するように取り付ける。アダプタはグルコースセンシング膜４が検体と直接接触するのを回避させ、センシングの再現性を高めることに寄与する。これにより生じる空隙、前記ウエル内に抽出媒体（例えば水、生理食塩水などの液体、検体やセンシング膜と直接的に反応せず、馴染むもの）を満たし、外部から検体に微小電圧を加えることにより、皮下組織液中のグルコースは皮膚から抽出媒体に抽出され、さらに抽出媒体から前記センシング膜４に浸透する。グルコースセンシング膜４を構成する第１、第２の酵素（酸化または還元酵素）、および発色剤の組み合わせが、例えば前記表１に示すグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）および３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）である場合、センシング膜４に浸透されたグルコースはＧＯＤによりを分解して過酸化水素を発生し、ＰＯＤによりこの過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素によりＴＭＢＺを発色させる。つまり、グルコース量に応じてＴＭＢＺの発色度合が変化する。
このような状態で、前記レーザ光源（例えばレーザダイオード）５からレーザ光を図示しない偏光フィルタを通して前記基板１裏面側に入射することにより、そのレーザ光が基板１のＳｉＯ₂表層２と左側のグレーティング３の界面で屈折し、さらにＳｉＯ₂表層２と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜４の界面で屈折してＳｉＯ₂表層２を含む基板１を伝播する。この際、伝播する光のエバネッセント波は前記グルコースセンシング膜４でのグルコース量に基づく発色度合に応じて吸収される。前記基板１を伝播した光は、右側のグレーティング１２から放出され、受光素子（例えばフォトダイオード）６で受光される。受光したレーザ光強度は、センシング膜４の非発色時に受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率からグルコース量を検出することが可能になる。

次に、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップの製造方法を説明する。

まず、以下の方法でグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する。

（１）グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合する。この混合工程において、前記第１、第２の酵素のうちのいずれ一方の酵素は緩衝剤が取り込まれたイオン性ポリマーで被覆される。つづいて、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加し、混合することにより、前記イオン性ポリマーで覆われた一方の酵素が他方の酵素、前記発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する。

（２）前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合する。この混合工程において、前記第１、第２の酵素はそれぞれ緩衝剤が取り込まれたイオン性ポリマーで被覆される。つづいて、これらの混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加し、混合することにより、前記イオン性ポリマーでそれぞれ覆われた第１、第２の酵素が前記発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する。

（３）前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合する。この混合工程において、前記第１、第２の酵素は緩衝剤が取り込まれたイオン性ポリマーで被覆される。つづいて、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加し、混合することにより前記イオン性ポリマーで覆われた第１、第２の酵素が前記発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する。

次いで、基板にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素、例えばグレーティングを酸化チタン膜の成膜、パターニングにより形成する。つづいて、これらグレーティング間の前記基板領域上に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成することにより光学式グルコースセンサチップを製造する。

以上、第１実施形態の光学式グルコースセンサチップによるグルコース量の検出において、グルコースセンシング膜は第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われているため、長期間の保存、使用において酵素からの塩の析出を抑制すると共に、酵素の形態、構造の変化を抑制して高い活性状態を維持することができる。その結果、検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度かつ安定的に検出することが可能な光学式グルコースセンサチップを提供することができる。

また、第１実施形態の方法によればグルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、または前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、各混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、或いは前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、いずれかによって第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が前記緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで予め覆われ、かつ発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製できる。この後、基板に一対のグレーティングを形成し、これらのグレーティング間の前記基板領域上に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成することによって、検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度かつ安定的に検出することが可能な光学式グルコースセンサチップを製造することができる。

（第２実施形態）
図２は、第２実施形態に係る光学式グルコースセンサチップを示す断面図である。

ガラス基板１１主面の両端部付近には、光学要素である一対のグレーティング１２がその基板１１に光を入射、放出させるためにそれぞれ形成されている。これらのグレーティング１２は、前記基板１１より高い屈折率を有する例えば酸化チタンから作られている。前記基板１１より高屈折率の熱硬化性または光硬化性の樹脂からなる光反射路層１３は、前記グレーティング１２を含む前記基板１１の主面に形成されている。光反射路層１３の主面は、前記グレーティング１２を含む前記基板１１の主面に平行になるように形成されている。

グルコースセンシング膜１４は、前記グレーティング１２間に対応する前記光反射路層１３部分の上に形成されている。このグルコースセンシング膜１４は、前記第１実施形態と同様な構造、すなわちグルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素、イオン性ポリマー、緩衝剤および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有する。

ここで、第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素を緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆う基準は、前記第１実施形態で説明したのと同様である。

前記光反射路層１３は、表面が平滑で、１０μｍ以上、より好ましくは１０〜２００μｍの厚さを有することが好ましい。１０μｍ以上の厚さを有する光反射路層は、光の伝播時における光強度の減衰を抑えることが可能になり、例えばレーザ光源のほかにＬＥＤ光源を用いることが可能になる。

前記グルコースセンシング膜１４中の第１、第２の酵素および発色剤は、例えば前記表１に示す組み合わせで用いられる。

前記グルコースセンシング膜１４中のイオン性ポリマー、緩衝剤および非イオン性セルロース誘導体は、前記第１実施形態に挙げたものと同様なものを用いることができる。

前記グルコースセンシング膜１４中には、前記第１実施形態で説明したように架橋性高分子化合物をさらに含むこと、ポリエチレングリコールまたはエチレングリコールをさらに含むことを許容する。

次に、前述した図２に示す光学式グルコースセンサチップの作用を説明する。

検体、例えば人体の皮膚に貫通穴（ウエル）を有するアダプタ（図示せず）を当接させ、このアダプタに前述したセンサチップをそのグルコースセンシング膜１４がウエル側に位置するように取り付ける。前記ウエル内に水を含む抽出媒体を満たし、外部から微小電圧を加えることにより、皮下組織液中のグルコースは皮膚から媒体に抽出され、さらに前記センシング膜１４に浸透する。グルコースセンシング膜１４を構成する第１、第２の酵素（酸化または還元酵素）および発色剤の組み合わせが、例えば前記表１に示すにグルコースオキシターゼ（ＧＯＤ）、ペルオキシターゼ（ＰＯＤ）および３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）である場合、センシング膜１４に浸透されたグルコースはＧＯＤによりを分解して過酸化水素を発生し、ＰＯＤによりこの過酸化水素を分解して活性な酸素を放出し、この活性な酸素によりＴＭＢＺを発色させる。つまり、グルコース量に応じてＴＭＢＺの発色度合が変化する。
このような状態で、前記光源（例えばレーザダイオード）１５からレーザ光を図示しない偏光フィルタを通して前記基板１１裏面側に入射することにより、そのレーザ光は基板１１を通してその主面と左側のグレーティング１２の界面で屈折されて光導波路層１３に入射され、さらにこの光導波路層１３と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜１４の界面で屈折されてその光導波路層１３を伝播する。この際、伝播される光のエバネッセント波は前記グルコースセンシング膜１４でのグルコース量に基づく発色度合に応じて吸収される。前記光導波路層１３を伝播した光は、右側のグレーティング１２から放出され、受光素子（例えばフォトダイオード）１６で受光される。受光したレーザ光強度はセンシング膜１４の非発色時に受光した光強度（初期強度）に比べて低下した値になり、その低下率からグルコース量を検出することが可能になる。

次に、前述した図２に示す光学式グルコースセンサチップの製造方法を説明する。

まず、前述した第１実施形態と同様な３つの方法のいずれかにより第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が前記緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで予め覆われ、かつ発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する。

次いで、ガラス基板の主面にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素、例えばグレーティングを酸化チタン膜の成膜、パターニングにより形成する。つづいて、前記グレーティングが形成された前記基板の主面に前記基板より高屈折率の熱硬化性または光硬化性の樹脂からなる光反射路層を形成する。ひきつづき、前記光反射路層上の前記グレーティング間に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成することによって、光学式グルコースセンサチップを製造する。

以上、第２実施形態の光学式グルコースセンサチップによるグルコース量の検出において、グルコースセンシング膜は前述した第１実施形態と同様に第１、第２の酵素の少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われているため、長期間の保存、使用において酵素からの塩の析出を抑制すると共に、酵素の形態、構造の変化を抑制して活性状態を維持することができる。その結果、検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度かつ安定的に検出することが可能な光学式グルコースセンサチップを提供することができる。

また、第２実施形態によれば第１実施形態と同様に第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が前記緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで予め覆われ、かつ発色剤と共に膜形成高分子化合物である非イオン性セルロース誘導体に分散されたグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製できる。この後、ガラス基板の主面に一対のグレーティングを形成し、前記グレーティングが形成された前記基板の主面に前記基板より高屈折率の光反射路層を形成し、前記光反射路層上の前記グレーティング間に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成することによって、検体中のグルコース量を長期間に亘って高感度かつ安定的に検出することが可能な光学式グルコースセンサチップを製造することができる。

以下、本発明の実施例を説明する。

（実施例１）
０．６７ｍｇ／ｍＬのペルオキシターゼ（ＰＯＤ）溶液（０．０１モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．０）に溶解）および５．３３ｍｇ／ｍＬのグルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）溶液（０．０１モル／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ：６．０）に溶解）の混合液９μＬを負イオン性ポリマーである１重量％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液１μＬと混合、撹拌した。得られた混合液から９μＬをイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）１４３．６μＬと純水１１６．６μＬと１体積％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のイソプロピルアルコール溶液６μＬと１ｍｇ／ｍＬの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）のイソプロピルアルコール溶液６０μＬと２重量％のヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）水溶液６４μＬと１重量％の架橋高分子化合物（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体）水溶液０．８μＬとに添加し、混合、撹拌してグルコースセンシング膜生成用塗布液４００μＬを調製した。

次いで、主面に厚さ１０ｎｍのＳｉＯ₂表層を有する屈折率１．５２の無アルカリガラス基板を用意し、この基板のＳｉＯ₂表層に屈折率２．２〜２．４、厚さ５０ｎｍの酸化チタン膜をスパッタリングにより成膜した。つづいて、この酸化チタン膜に上にレジストの塗付、乾燥、リソグラフィーによりレジストパターンを形成した。ひきつづき、レジストパターンをマスクとしてリアクティブイオンエッチングにより酸化チタン膜を選択的に除去することにより、前記ＳｉＯ₂表層の両端部付近表面にグレーティングを形成した後、レジストパターンをアッシングにより除去した。

次いで、前記基板を酸素ＲＩＥによりドライ洗浄した後、ダイシングにより１７ｍｍ×６．５ｍｍの寸法に裁断してチップ形状にした。つづいて、前記グルコースセンシング膜生成用塗布液を前記基板のグレーティング間に位置するセンシング膜形成領域の表面に８μＬ滴下した。不活性ガスのパージ、真空乾燥により乾燥させて多孔質（透水性）で厚さ０．８μｍのグルコースセンシング膜を形成し、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップを製造した。なお、滴下されたグルコースセンシング膜生成用塗布液の液滴は以下の組成を有するものであった。

・リン酸緩衝液：０．０００５２５モル／Ｌ、
・リン酸緩衝剤：０．０００３モル／Ｌ、
・ＰＥＧ：０．１５体積％、
・ＴＭＢＺ：０．１５ｍｇ／ｄＬ、
・ＰＯＤ：０．００１５ｍｇ／ｍＬ、
・ＧＯＤ：０．０１２ｍｇ／ｍＬ、
・ＣＭＣ（負イオン性ポリマー）：０．０００５重量％、
・ＨＥＣ：０．６４重量％、
・２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体：０．００２重量％。

（実施例２）
実施例１の負イオン性ポリマーであるＣＭＣの代わりに正イオン性ポリマーであるポリリジンをグルコースセンシング膜生成用塗布液の液滴中に０．０００８μｍｇ／Ｌになるように配合した以外、実施例１と同様にセンシング膜を形成し、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップを製造した。

（比較例１）
イオン性ポリマーおよびリン酸ナトリウム緩衝剤を含まない以外、実施例１と同様な各種成分を用いて１回の混合でグルコースセンシング膜生成用塗布液を調製し、この塗布液を用いて実施例１と同様にセンシング膜を形成し、前述した図１に示す光学式グルコースセンサチップを製造した。

得られた実施例１，２および比較例１の光学式グルコースセンサチップについて、以下の方法により径時的なグルコースの感度（吸光度）変化を測定した。

すなわち、貫通穴（ウエル）を有するアダプタを適切な平板（例えばガラス板）に当接させ、このアダプタに各センサチップをそのグルコースセンシング膜がウエル側に位置するように取り付け、ウエルを区画した。ウエルにグルコースを１ｍｇ／ｄＬを含む水溶液を満たした形態（温度３５℃）において、図１に示すようにレーザダイオード５からレーザ光を偏光フィルタを通して前記基板１裏面側に入射することにより、そのレーザ光を基板１のＳｉＯ₂表層２と左側のグレーティング３の界面で屈折させ、さらにＳｉＯ₂表層２と発色した発色剤を含むグルコースセンシング膜４の界面で屈折してＳｉＯ₂表層２を含む基板１を伝播させ、右側のグレーティング３と基板１の界面での屈折により伝播したレーザ光をフォトダイオード６で受光し、そのレーザ光強度（吸光度）を測定した。

同様な操作を実施例１，２ではセンサチップを１日保存後、１４日間保存後、４０日間保存後、および１００日間保存後に行い、比較例１では１日保存後、７日間保存後および９０日間保存後に行って吸光度をそれぞれ測定した。

これらの結果を図３に示す。

図３から明らかように比較例１のセンサチップは、７日間の保存後でも保存前に比べて感度が低下し、さらに９０日間の保存後では保存前に比べて感度が著しく低下することがわかる。

これに対し、実施例１、２のセンサチップは１００日間の保存後でも保存前に近似した感度を有することがわかる。特に、負イオン性ポリマーを含むグルコースセンシング膜を備えた実施例１のセンサチップは、正イオン性ポリマーを含むグルコースセンシング膜を備えた実施例２のセンサチップに比べて保存期間の経過に伴う感度の維持性能が高いことがわかる。

なお、基板より高屈折率の熱硬化性樹脂または光硬化性樹脂からなる光反射路層を有する図２に示すグルコースセンサチップをおいても、実施例１と同様に長期保存後でも高い感度を維持することが可能であった。

また、前記実施形態・実施例においてはグルコースセンシング膜が保持する第１酵素、第２酵素、発色剤はそれぞれ一種の材料のみが選択され加えられているが、使用目的に応じて複数の材料を混在させてもよい。

さらに、前記実施形態においては基板としてガラスを用いているが、参照光を伝播し透過する特性を有していれば、この材質は限定されない。単結晶による膜体や、熱硬化性樹脂材料、熱可塑性樹脂材料、光硬化性樹脂材料など、種々の樹脂材料を用いることもできる。

第１実施形態に係るグルコースセンサチップを示す断面図。 第２実施形態に係るグルコースセンサチップを示す断面図。 実施例１、２および比較例１のグルコースセンサチップにおける保存期間の経過に伴う吸光度（感度）の変化を示す線図。

符号の説明

１，１１…ガラス基板、２…ＳｉＯ₂表層、３，１２…グレーディング、４，１４…グルコースセンシング膜、５，１５…レーザ光源（レーザダイオード）、６，１６…受光素子（フォトダイオード）。

Claims (12)

1. 基板と、
   前記基板の主面に形成され、前記基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
   前記光学要素間に位置する前記基板主面に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含むグルコースセンシング膜と
   を備え、
   前記センシング膜は、前記第１、第２の酵素のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有することを特徴とする光学式グルコースセンサチップ。
2. ガラス基板と、
   前記ガラス基板の主面に形成され、前記ガラス基板内に光を入射させ、前記ガラス基板外に光を放出させるための一対の光学要素と、
   前記光学要素が形成された前記基板の主面に形成され、前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層と、
   前記光反射路層上の前記光学要素間に形成され、発色剤、グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより前記発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素および非イオン性セルロース誘導体を含むグルコースセンシング膜と
   を備え、
   前記センシング膜は、前記第１、第２のうちの少なくとも一方の酵素が緩衝剤を取り込んだイオン性ポリマーで覆われ、かつこれら酵素および発色剤が前記非イオン性セルロース誘導体で保持された構造を有することを特徴とする光学式グルコースセンサチップ。
3. 前記第１酵素は、グルコースオキシターゼであり、前記第２酵素はペルオキシターゼであり、前記発色剤は、３，３，５，５−テトラメチルベンジジンまたはＮ，Ｎ’−ビス（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）トリジンの少なくともいずれか一方であることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
4. 前記イオン性ポリマーが負イオン性ポリマーであることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
5. 前記負イオン性ポリマーがリン酸エステル、カルボキシレートおよびスルホン酸エステルからなる群から選ばれる少なくとも１つのアニオン性基を含むポリマーであることを特徴とする請求項４記載の光学式グルコースセンサチップ。
6. 前記非イオン性セルロース誘導体は、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロースおよびヒドロキシアルキルアルキルセルロースの群から選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
7. 前記センシング膜は、架橋性高分子化合物をさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
8. 前記架橋性高分子化合物は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、イオン性官能基から選ばれる少なくとも１つの基を持つ親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体であることを特徴とする請求項７記載の光学式グルコースセンサチップ。
9. 前記親水性モノマーと疎水性モノマーとの共重合体は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体であることを特徴とする請求項８記載の光学式グルコースセンサチップ。
10. 前記グルコースセンシング膜は、透水性を付与するためのポリエチレングリコールまたはエチレングリコールをさらに含むことを特徴とする請求項１または２記載の光学式グルコースセンサチップ。
11. グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、または前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、各混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、或いは前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、いずれかによりグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する工程と、
    基板にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素を形成する工程と、
    前記光学要素間の前記基板領域上に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成する工程と
    を含むことを特徴とする光学式グルコースセンサチップの製造方法。
12. グルコースを酸化または還元させる第１酵素、この第１酵素の生成物と反応することにより発色剤を発色させる物質を発生する第２酵素のいずれ一方の酵素をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を他方の酵素、発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、または前記第１、第２の酵素をそれぞれイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、各混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、或いは前記第１、第２の酵素の両方をイオン性ポリマーおよび緩衝剤の水溶液と予め混合し、この混合液を発色剤および非イオン性セルロース誘導体に添加するか、いずれかによりグルコースセンシング膜形成用塗布液を調製する工程と、
    ガラス基板の主面にこの基板内に光を入射させ、前記基板外に光を放出させるための一対の光学要素を形成する工程と、
    前記光学要素が形成された前記基板の主面に前記基板より高屈折率の樹脂からなる光反射路層を形成する工程と、
    前記光反射路層上の前記光学要素間に前記グルコースセンシング膜形成用塗布液を塗布、乾燥してグルコースセンシング膜を形成する工程と
    を含むことを特徴とする光学式グルコースセンサチップの製造方法。

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