CN101099493A - 中华根瘤菌制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种中华根瘤菌制剂及其应用，属微生物技术领域。本发明制剂的生产步骤为：a.生产菌株为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7，CGMCC NO.1829；b.将中华根瘤菌N7接种到配方为牛肉膏3g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化钠0.5g/L、其余为蒸馏水、pH 7.0－7.2的培养液中，在转速为150rpm，温度为28－30℃下培养48小时，获得液体发酵种子；c.将液体发酵种子接种到发酵罐中，液体培养基配方(g/L)：葡萄糖20～30，硫酸氨2～5，磷酸二氢钾0.5～1，磷酸氢二钾0.5～1，氯化钙0.1，硼砂0.005，钼酸钠0.005，消泡剂0.5～1；操作条件为：发酵温度29－30℃、接种量5～10％，搅拌速度120－150rpm，通气量5－10％，发酵时间为45－48小时。本发明具有烟碱降解率高，并能够提高烟草的品质，作为降解烟草或烟草废弃物中的烟碱的应用。

Description

中华根瘤菌制剂及其应用
技术领域：
本发明涉及一种中华根瘤菌制剂及其应用，属微生物农药技术领域。
背景技术：
烟碱(俗称尼古丁)是烟草生物碱中的主要成分，是影响烟叶品质的重要因素之一，也是烟草工业生产废水、废物中的主要有害成分。烟碱进入人体后90％被肺部吸收，进入血液6秒钟后即可到达大脑，严重影响人体的呼吸系统和交感神经。在香烟生产过程中，烟碱的含量过高会增加烟气的刺激性，影响卷烟吸味，安全性也差。如何把烟草的烟碱含量控制到人们所期望的范围，是烟草科技工作者和环境保护者研究的热点课题。降低烟草中的烟碱含量的方法通常利用农业操作在烟草生长过程中控制烟碱的含量和利用物化手段在烟草加工过程中降低烟叶中的烟碱含量，但由于以上方法操作性不强、效果不明显，国内外的研究正趋向于利用微生物降解烟碱。
微生物特别是细菌广泛存在于各种生态条件下，特定的环境孕育了特殊的微生物类群。早在20世纪三、四十年代就有关于从土壤中分离可代谢尼古丁微生物的报道。1947年Enders等就发现酵母菌可以降解烟碱，随后研究人员相继发现了许多可以降解烟碱的微生物如球形节杆菌(Arthrobacter globiformils)、烟草节杆菌(A.nicotianae)、噬烟碱节杆菌(A.nicotinovorans)、氧化节杆菌(A.oxydans)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、棒杆菌菌(Corynebacterium sp.)、烟草微球菌(Micrococcus nicotianae)等。这些微生物多数是通过富集培养，然后以尼古丁为唯一碳氮源分离而得。
虽然目前微生物降解尼古丁的机理还不是十分明确，但国内外仍然有许多应用微生物活体降解烟碱的报道。烟草加工过程中产生的许多固态或液态废物主要含有大量的尼古丁等生物碱类有毒物质，平均含量达18000mg/kg干重。这些废物如不及时处理会给人们的生存和生活带来极大的危害。1997年Civilini等报道了采用P.putida和A.oxidanspAO1处理尼古丁废弃物的渗洗液，结果表明P.putida的处理效果最好。Brown&Williamson烟草公司利用纤维单胞菌来降低烟草中的烟碱和硝酸盐含量。结果显示，将经过处理的白肋烟和其它烟叶混合，与未经处理的白肋烟叶片相比，混合烟丝的硝酸盐含量从1.63％降至1.04％，烟碱从1.79％降至1.32％。将这些经过处理的混合烟丝制成卷烟后，烟气分析表明，硝酸盐、氰化氢和烟碱各降低了38.8％、19.7％和153％。由此可见，通过微生物手段降低尼古丁含量和消除污染在生产中具有很高的实际应用价值，其意义不但可以提高烟叶资源的利用率，取得丰厚的经济效益，而且还可以改善生态环境，获得显著的社会效益，利用微生物降解烟碱前景广阔。
中华根瘤菌是我国科学家发现的一个根瘤菌的新属，在豆科作物固氮等领域得到了广泛的研究和应用，但在降解烟碱的方面，在国内外还未见到报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种烟碱降解率高，并能够提高烟草品质的中华根瘤菌制剂及其应用。
本发明是这样实现的：
1、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7的获得
选自烟草叶片，烟叶样品研磨，稀释涂布平板，在M9+烟碱培养基：Na2HPO412.8g、KH2PO43.0g、NaCl0.5g、NH4Cl 0.5g、琼脂粉17g、烟碱10g(单独灭菌)、10.0g维生素B1(单独灭菌)1μg/ml、pH自然，于28℃温度下培养2d，挑取能够在平板上健康生长的细菌菌落，其中有一菌落表现较好，定名为N7菌株。
对N7菌株进行生物学和生化试验，革兰氏阴性菌。杆状，0.6～0.8μm×1.2～3.0μm。不产生芽孢。鞭毛周生1～3根。好氧。NA培养基上菌落呈圆形、凸起、有粘液，在酵母膏-甘露醇-无机盐琼脂上3天后直径一般为2～3mm。最适生长温度为25～35℃，该菌株能在38℃和10℃能生长；最适pH6.0～8.0。可以利用以下物质作为唯一碳源：葡萄糖、D-阿拉伯糖、纤维二糖、果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、甘露醇、L-古酰胺、乳糖、D-核糖、琥珀酸盐、木糖和D-松二糖。不能利用以下碳源：酒石酸胺、草酸胺、纤维素、卫毛醇、岩糖、甘氨酸、山梨糖、藻元酸钠和香草酸。在YMA培养基上产酸。可生长于1.0％NaCl。可以利用氯化铵和硝酸盐作为碳源，利用蛋白胨能力差。氧化酶和接触酶为阳性。
对该菌进行16SrDNA序列测定，GenBank注册号： DQ659139。通过序列比对和生化特性将N7鉴定为中华根瘤菌属的某个种(Sinorhizobium sp.)。
本发明所述的中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7已于2006年10月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市海淀区中关村北一条13号，保藏编号为CGMCC NO.1829，分类命名为：中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)。
2、制备中华根瘤菌制剂，
本发明中使用的比例为g/L。
a.斜面培养：培养基为营养琼脂培养基，28～30℃保温培养28h。
b.摇瓶种子培养：将中华根瘤菌N7斜面菌种接种到配方为牛肉膏3g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化钠0.5g/L、其余为蒸馏水、pH7.0-7.2的培养液中，摇瓶转速为150rpm，在28-30℃温度下培养48h，获得液体发酵种子。
c.液体发酵工艺：将发酵种子接种到装有液体培养基配方(g/L)：葡萄糖20～30；硫酸氨2～5；磷酸二氢钾0.5～1，磷酸氢二钾0.5～1，氯化钙0.1，硼砂0.005，钼酸钠0.005，消泡剂0.8，其余为水的发酵罐中，在发酵温度29-30℃、接种量5～10％、发酵罐搅拌速度120-150rpm、通气量5-10％、发酵时间45-48小时的条件下得到中华根瘤菌制剂，放入容器中避光保存，1星期内使用完毕。其中，接种量和通气量比例采用体积百分比。
本发明的中华根瘤菌制剂作为降解烟草或烟草废弃物中的烟碱的应用。
本发明的中华根瘤菌制剂具有烟碱降解率高，并能够提高烟草品质等优点。
附图说明：
附图为N7菌株在含有烟碱的液体中的生长和烟碱降解效果图(实施1)。
具体实施方式：
实施例1：(用于含烟碱液体)
一、制备中华根瘤菌制剂：
制剂采用的菌种为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7菌株。
a.发酵菌种培养：将中华根瘤菌N7斜面菌种接种到配方(g/L)为牛肉膏3、蛋白胨0.5、氯化钠0.5、其余为蒸馏水、pH7.0的培养液中，摇瓶转速为150rpm，在28℃温度下培养48小时，获得液体发酵种子。
b.发酵罐发酵：将试管种接种到装有液体培养基配方(g/L)：葡萄糖20；硫酸氨2；磷酸二氢钾0.5，磷酸氢二钾0.5，氯化钙0.1，硼砂0.005，钼酸钠0.005，消泡剂0.5，其余为水的发酵罐中，在发酵温度29℃、接种量5％。发酵罐搅拌速度120rpm、通气量5％、发酵时间45小时的条件下得到中华根瘤菌制剂。其中，接种量和通气量比例采用体积百分比。
二、中华根瘤菌制剂的应用：
将降烟碱降解制剂接种(接种量1％)到含有0.1％烟碱的M9液体中，30℃150rpm药瓶培养，每隔2小时取样检测溶液的烟碱含量，和代表菌体数量的溶液OD600值。应用结果见附图，降解24小时后烟碱含量为0.014％，即应用制剂将溶液中的烟碱降解了86％。
实施例2：(用于含烟碱液体)
基本同实施例1。不同之处为：试管种培养中：pH为7.2、温度30℃；发酵工艺中：葡萄糖30；硫酸氨5；磷酸二氢钾1，磷酸氢二钾1，消泡剂1，发酵温度30℃、接种量10％。发酵罐搅拌速度150rpm、通气量10％、发酵时间48小时。
实施例3：(用于烤烟烟叶处理)
中华根瘤菌制剂的制备基本同实施例1。不同之处为：发酵菌种培养中：pH为7.1、温度29℃。发酵工艺中：将发酵种子接种到装有液体培养基配方：葡萄糖28，硫酸氨3，磷酸二氢钾0.8，磷酸氢二钾0.8，消泡剂0.8；发酵温度29.5℃、接种量8％。发酵罐搅拌速度130rpm、通气量8％、发酵时间46小时。
本发明的烟碱降解制剂的应用：将本发明的制剂用水稀释10倍，放入长×宽×高为1.5m×0.5m×1m的水泥池中。将成熟好的烟叶采收后编杆。编杆后的烟叶放入含有菌剂的池中浸泡均匀，取出，自然流失掉多余的溶液，然后装入烤房中，按常规的烘烤方法进行烘烤。烘烤后的烟叶进行烟碱的检测，结果表明，本发明的烟碱降解制剂可以降低22.6％的烤烟烟碱。
使用本发明制剂后的烤烟的烟叶感官质量评吸结果表明：烟叶的劲头明显降低，香气质和香气量有不同程度改善；刺激性明显减弱，杂气明显减轻。

Claims (2)

1、一种中华根瘤菌制剂，由生产菌株经发酵种子培养、发酵罐发酵后得到，其特征在于该制剂由下列步骤得到：
a.选用的生产菌株为中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7，CGMCC NO.1829；
b.发酵种子培养：将中华根瘤菌N7斜面菌种接种到配方为牛肉膏3g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化钠0.5g/L、其余为蒸馏水、pH 7.0-7.2的培养液中，摇瓶转速为150rpm，在28-30℃温度下培养48h，获得液体发酵种子；
c.发酵罐发酵：将液体发酵种子接种到装有液体发酵体系的发酵罐中发酵；培养基配方为：葡萄糖20～30g/L，硫酸氨2～5g/L，磷酸二氢钾0.5～1g/L，磷酸氢二钾0.5～1g/L，氯化钙0.1g/L，硼砂0.005g/L，钼酸钠0.005g/L，消泡剂0.5～1g/L；操作条件为：发酵温度29-30℃，接种量5～10％，发酵罐搅拌速度120-150rpm，通气量5-10％，发酵时间为45-48小时。
2、权利要求1所述中华根瘤菌制剂的应用，其特征在于该制剂作为降解烟草或烟草废弃物中的烟碱的应用。
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