CN101097220A - 一种血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动分析法及液体稳定试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法及其液体型稳定试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。其特点是：通过血清的铜、锌、铁和其结合蛋白的快速裂解技术及在蛋白解离剂存在下的血清蛋白稳定技术的应用，使血清中的铜、锌、铁在匀相条件下快速从其结合蛋白上裂解开来，并在表面活性剂的存在下与一种水溶性的吡啶偶氮染料5-Br-PADCAP发生灵敏的显色反应，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中铜、锌、铁的含量测定。采用本法制备的液体型测定试剂稳定、方便、抗干扰能力强，对自动生化分析仪管道无污染，特别适合进行血清铜、铁、锌的批量自动化检测。

Description

一种血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动分析法及液体稳定试剂

技术领域

本发明涉及血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法及其液体型隐定试剂，可广泛应用在医学及生物化学技术领域。

背景技术

铜、锌、铁是人体所必需的微量元素，在人体内有多方面的生理功能。众多的临床资料表明，某些疾病的发生同人体内铜、锌、铁的含量密切相关，如血清铜升高可见于甲状腺机能亢进、白血病、何杰金氏病、血色沉着症、胆汁性肝硬化、伤寒、肺结核、恶性贫血、风湿病和恶性肿瘤等病症，血清铜降低可见于婴儿贫血、婴儿营养不良，肝豆状核变性等疾病。血清锌升高常见于工业污染引起的急性锌中毒。血清锌降低则见于中毒性肝硬变、肺癌、心肌梗塞、营养不良、恶性贫血、肠胃吸收障碍、尿毒症、和妊娠等病症。血清铁增高见于溶血性贫血，再障性贫血，巨红细胞性贫血等。血清铁降低见于缺铁性贫血，慢性长期失血，恶性肿瘤等。因此，准确测定血清铜、锌、铁的含量具有重要的临床价值。

目前，临床上测定血清铜、锌、铁的方法主要为原子吸收分光光度法和使用络合剂显色的比色法。其中原子吸收分光光度法需要专用昂贵仪器，不适于常规分析；比色法虽准确、简便，但均存在操作烦琐，血清铜、锌、铁解离速度慢，显色时间长等的缺点，有的还需去除血清蛋白，用剧毒氰化钾掩蔽干扰离子、再用水合氯醛解蔽等步骤，只能以手上工法进行检测。

本发明的目的是为了解决上述技术的不足，通过运用一种使血清铜、锌、铁快速从其结合蛋白质解离的技术和一种在蛋白质解离剂存在下的血清蛋白稳定技术，向临床提供一种直接使用、无需复溶、稳定性强、测定结果受外界干扰小，且对自动生化分析的管道无污染的匀相自动化测定技术及其相应的液体稳定试剂。该测定试剂置2-8℃保存可至少可稳定12个月，提供的方法和试剂可以应用于目前广泛使用的监床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。

发明内容

本发明提供了一种基于5-Br-PADCAP为显色剂的血清铜、锌、铁匀相自动化分析法及其液体型稳定试剂，用于体液样的蛋白质解离剂存在下的血清蛋白稳定技术本中铜、锌、铁的测定。该测定体系主要是通过微量元素和其结合蛋白的快速裂解技术及在蛋白质解离剂存在下的血清蛋白稳定技术的应用，使血清中的铜、锌、铁在匀相条件下快速从其结合蛋白上裂解开来，并在表面活性剂的存在下与一种水溶性的吡啶偶氮染料5-Br-PADCAP发生灵敏的显色反应，产物的吸光度大小与血清中的铜、锌、铁含量成正比，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中铜、锌、铁的含量测定。

为了达到理想的检测效果与足够的稳定性，本发明提供的两点终点法血清铜、锌、铁匀相自动化检测试剂，特别可以分为A、B二个组份。两个组份的具体成份组成可表述如下。

A组份：

缓冲液        100mmol/L

解离剂        15mmol/L

表面活性剂    30ml/L

稳定剂        15g/L

防腐剂        1g/L

去干扰剂      25mmol/L

B组份：

5-Br-PADCAP   12mmol/L

缓冲液        120mmol/L

防腐剂        1g/L

表面活性剂    15ml/L

为了提高上述测定试剂的准确性和稳定性，消除测定结果受外界的多种干扰，所述的两点终点法测定试剂中用于测定血清铜和铁的缓冲液可以为GOOD’S缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液，特别优选的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液；用于血清锌测定的缓冲液可以为GOOD’S缓冲液、Tris-HCl缓冲液、NH₃·H₂O-NH₄Cl缓冲液、三乙醇胺-HCl缓冲液等，特别优选的缓冲液为Tris-HCl缓冲剂。解离剂可以是异氰硫酸胍、盐酸胍、尿素其中的一种或几种的组合物。表面活性剂可以为SDS、Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、Tritonx-100、F68、F-88等非离子型表面活性剂其中的一种或几种的组合，测定血清铜和铁时特别优选的表面活性剂是Tween80，测定血清锌时特别优选的表面活性剂是Tritonx-100。稳定剂可以是氯化钠、抗生素、多元醇、牛血清白蛋白(BSA)、冠醚等。去干扰剂可以是抗坏血酸、过氧化氢、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钾、硫脲、焦磷酸钠、氟化钠、铜试剂、柠檬酸三钠等，其中测定血清铜的试剂特别添加的去干扰剂是过氧化氢和硫脲，测定血清铁时特别添加的去干扰剂是抗坏血酸和氟化钠，测定血清锌时特别添加的去干扰剂是铜试剂和柠檬酸三钠。防腐剂可以是NaN₃、PC系列防腐剂等。

具体实施方式

实施例1：血清铜两点终点法测定试剂，缓冲剂优选为醋酸-醋酸钠缓冲液，其中A组份中特别优选pH3.5醋酸-醋酸钠缓冲液，B组份中特别优选pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液；解离剂特别优选异氰硫酸胍；表面活性剂优选为Tween80；稳定剂优选为氯化钠；去干扰剂优选为氧化氢和硫脲的组合；防腐剂优选为PC300。在上述试剂组成中，血清铜可被pH3.5醋酸-醋酸钠缓冲液、异氰硫酸胍共同作用而快速从血清蛋白质中解离开来，Tween80、氯化钠可使血清蛋白质在血清铜快速解离的过程中保持足够的稳定性，避免由于蛋白质的变性而引起测量体系吸光度的异常升高。

A组份：

PH3.5醋酸-醋酸钠缓冲液    100mmol/L

解离剂异氰硫酸胍          50mmol/L

表面活性剂Tween80         50ml/L

稳定剂NaCl                9g/L

防腐剂PC300               1g/L

去干扰剂过氧化氢          15ml/L

硫脲                      25mmol/L

B组份：

5-Br-PADCAP               10mmol/L

PH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液    200mmol/L

防腐剂PC300               1g/L

表面活性剂Tween80         10ml/L

在实施例1的试剂用于测定样本时，采用的测定方法为两点终点法，温度为37℃，R1∶样本∶R2为200∶20∶50，测定主/副波长为546/660nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育300秒后读取第1点吸光度，然后加入R2继续孵育300秒后读取第2点吸光度。

用本法和原子吸收分光光度法同时测定了20例血清铜标本。表1为本实例1测定值与常规原子吸收法测定值对照表，图1根据表1数据制成。本实施例和原子吸收法的相关系数r为0.9908，两者显示了极好的相关性。

表1

原子吸收法测定值(μmol/L)	实施例1测定值(μmol/L)
		15.30	15.56
14.22	14.52
		13.32	13.54
10.32	10.23
		12.53	12.85
17.88	17.23
		14.21	14.45
14.23	14.67
		17.29	17.53
13.67	13.63
		14.32	14.76
17.23	17.23
		14.23	14.22
11.32	11.63
		17.74	18.01
16.25	16.05
		17.39	17.53
14.22	14.34
		14.98	14.58
15.20	15.56

实施例2：血清铁两点终点法测定试剂，缓冲液优选为醋酸-醋酸钠缓冲液，其中A组份中特别优选PH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液，B组份中特别优选pH7.0醋酸-醋酸钠缓冲液；解离剂特别优选盐酸胍；表面活性剂优选为Tween80，稳定剂优选为氯化钠，去干扰剂优选为抗坏血酸和氟化钠的组合，防腐剂优选为PC800。在上述试剂组成中，用于血清铁快速解离的组合物pH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液、盐酸胍；用于保持解离过程中血清蛋白质稳定性的组合物是Tween80、氯化钠。

A组份：

PH4.0醋酸-醋酸钠缓冲液    120mmol/L

解离剂盐酸胍              50mmol/L

表面活性剂Tween80         50ml/L

稳定剂NaCl                9g/L

防腐剂PC800               1g/L

去干扰剂抗坏血酸          2g/L

氟化钠                    30mmol/L

B组份：

5-Br-PADCAP               12mmol/L

PH7.0醋酸-醋酸钠缓冲液    120mmol/L

防腐剂PC800               1g/L

表面活性剂Tween80         15ml/L

实施例2的测定方法与实施例1相同，用本法和原子吸收分光光度法同时测定了20例血清铁标本。表2为本实施例2测定值与常规原子吸收法测定值对照表，图2根据表2数据制成。本实施例和原子吸收法的相关系数r为0.9962，两者显示了极好的相关性。

表2

原子吸收法测定值(μmol/L)	实施例2测定值(μmol/L)
		17.85	18.58
16.33	16.23
		12.97	12.58
16.57	16.21
		23.55	22.83

18.36	17.89
		16.58	16.52
14.96	14.85
		15.63	16.6
16.88	16.52
		21.85	21.55
12.36	12.56
		28.63	28.95
9.25	9.56
		25.03	25.78
23.57	23.54
		27.21	28.01
16.32	16.25
		15.21	15.42

实施例3：血清锌两点终点法测定试剂，缓冲液优为PH8.0 Tris-HCl缓冲液：解离剂特别优选尿素；表面活性剂优选为TritonX-100，稳定剂优选为乙二醇，去干扰剂优选为铜试剂和柠檬酸三钠的组合，防腐剂优选为叠氮钠。在上述试剂组成中，用于血清锌快速解离的组合物为PH8.0 Tris-HCl缓冲液、尿素；用于保持解离过程中血清蛋白质稳定性的组合物是TritonX-100、乙二醇。

A组份：

PH8.0 Tris-HCl缓冲液      10mmol/L

解离剂尿素                80mmol/L

表面活性剂TritonX-100     10ml/L

稳定剂乙二醇              50g/L

防腐剂叠氮钠              0.9g/L

去干扰剂铜试剂            12mmol/L

柠檬酸三钠                18mmol/L

B组份：

5-Br-PADCAP             12mmol/L

pH8.0 Tris-HCl缓冲液    150mmol/L

防腐剂叠氮钠            0.9g/L

TritonX-100             10ml/L

实施例3的测定方法与实施例1相同，用本法和原子吸收分光光度法同时测定了20例血清锌标本，测定结果如表3所示。图3根据表3的数据制成。本发明虽然试剂组成简单，操作简便，但同样显出与常规原子吸收极好的相关性(r＝0.9952)。

表3

原子吸收法测定值(μmol/L)	实施例3测定值(μmol/L)
		15.41	15.55
14.15	14.36
		12.13	12.37
10.21	10.53
		12.42	12.88
21.01	21.75
		15.42	15.54
15.47	15.84
		16.85	16.72
17.42	17.03
		16.50	16.99
18.92	18.66
		11.82	11.93
11.03	11.54
		13.28	13.36
18.75	18.96
		17.35	17.75
15.22	15.76

14.36	14.56
		16.88	16.89

上述实施例试剂的配制方法仅用于说明本发明的原理和其应用，但本发明绝不局限于上述例举的应用范围。

附图说明

图1至图3分别是本发明的实施例1至实施例3的测得值与原子吸收分光光度法(《全国临床检验操作规程》第二版所推荐)测得值的相关性示意图。

Claims (4)

1、一种血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法，其特征是采取一定的解离体系、蛋白稳定体系、去干扰剂，使血清中的铜、锌、铁在匀相条件下快速从其结合蛋白上裂解开来，并在表面活性剂的存在下与一种水溶性的吡啶偶氮染料5-Br-PADCAP发生灵敏的显色反应，在自动生化分析仪上以两点终点法的测量模式实现对样本中铜、锌、铁的含量测定。

2、根据权利要求1所述，其特征在于：采用两点终点法检测血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法液体稳定试剂，其特征是它分为二个组份。A、B二个组份的成份组成是：

A组份：

缓冲液        10-150mmol/L

解离剂        25-100mmol/L

表面活性剂    5-75ml/L

稳定剂        5-100g/L

防腐剂        0.1-2g/L

去干扰剂      5-50mmol/L

B组份：

5-Br-PADCAP   2-30mmol/L

缓冲液        50-200mmol/L

防腐剂        0.1-2g/L

表面活性剂    5-50ml/L

3、根据权利要求1所述的血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法液体稳定试剂，其特征是：分析血清铜、铁时所采取的蛋白稳定体系是表面活性剂Tween80、NaCl；分析血清锌时所采取的蛋白稳定体系是表面活性剂TritonX-100、乙二醇。

4、根据权利要求1所述的血清铜、锌、铁的5-Br-PADCAP匀相自动化分析法液体稳定试剂，其特征是：分析血清铜时所采取的去干扰剂为过氧化氢、硫脲的组合物；分析血清铁时所采取的去干扰剂为抗坏血酸、氟化钠的组合物；分析血清锌时所采取的去干扰剂为铜试剂、柠檬酸三钠的组合物。

Images