CN101094844B - 苯并二氢吡喃衍生物，药物及其在治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

描述了新型苯并二氢吡喃衍生物和中间体化合物，含有它们的组合物，它们的制备方法和作为治疗性药物，特别是抗癌症和化疗选择性药物的应用。

Description

苯并二氢吡喃衍生物,药物及其在治疗中的应用

发明领域

本发明涉及某些新型苯并二氢吡喃衍生物、含有所述衍生物的组合物、其制备方法及其作为治疗性药物，特别是作为抗癌症和化疗选择性药物的应用。

发明背景

已知有超过700种天然产生的不同异黄酮，其中一些的生物学特性可能有治疗益处。

US5,726,202总体上公开了某些异黄烷化合物，特别是用于治疗良性前列腺肥大的3，4-二芳基苯并二氢吡喃与苯并二氢吡喃(centchrOman)。

WO01/17986也公开了某些异黄烷化合物。

发明概述

本发明人惊奇地发现显示有重要治疗活性的一组新的通式(I)所示化合物，所述活性包括对癌症的强抗癌症活性、化疗选择性和辐射敏化。

因此，本发明的一方面提供通式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：

其中

R₁是氢、烷基、环烷基或C(O)R₇，

R₂和R₃独立为氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、卤素或OC(O)R₇，除了R₂和R₃不都是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、酰基、氨基、C_1-4-烷基氨基或二(C_1-4-烷基)氨基、OC(O)R₇或OR₈，

R₇是氢、烷基、环烷基、芳基、芳基烷基或氨基，和

R₈是芳基，例如苯基，或芳基烷基，如苄基，和

R₉是氢、羟基、烷基、烷氧基、环烷基或卤素。

在本发明优选的实施方案中，R₉是氢。因此，本发明另一方面提供式(I-a)所示化合物

其中

R₁是氢、烷基、环烷基或C(O)R₇，

R₂和R₃独立为氢、羟基、烷氧基、卤素或OC(O)R₇，除了R₂和R₃不均是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、酰基、OC(O)R₇、氨基，和

R₇是氢、烷基、环烷基、芳基、芳基烷基或氨基。

本发明另一方面提供制备式(I)所示化合物的方法，所述方法包括使式(II)所示化合物的酮基或其含有对应于式(I)所示化合物中R₉的取代基的类似物的酮基与芳基化试剂W^-M⁺反应形成式(III)所示中间体叔醇或其受保护的衍生物或其盐(或其含有对应于式(I)所示化合物中R₉的取代基的类似物)，该中间体脱水形成式(IV)所示化合物(或其含有对应于式(I)所示化合物中R₉的取代基的类似物)，然后还原其双键(例如通过氢化)并任选脱保护以形成式(I)所示化合物：

其中(II)所示化合物为：

式(II)中

R₁是烷基或保护基团，例如Si(R₁₀)₃，

R₂和R₃独立为氢、烷氧基或OSi(R₁₀)₃，除了R₂和R₃不都是氢，和

R₁₀独立为烷基或芳基，

所述芳基化试剂W^-M⁺中，

W^-是任选取代的芳基和

M⁺是一个或多个抗衡离子，优选[MgBr]⁺，

式(III)所示中间体叔醇为：

式(IV)所示化合物为：

本发明另一方面提供通式(III)所示化合物，含有该化合物的组合物及其应用。

另一方面提供了通式(IV)所示化合物，含有该化合物的组合物及其应用。

因此，本发明另一方面提供了式(I)所示化合物在治疗，特别是化疗和/或作为辐射敏化剂或化疗致敏剂(chemosensitising agent)中的应用。

本发明另一方面提供一种治疗、预防或缓解疾病或病症的方法，所述方法包括给予对象任选与载体和/或赋形剂结合的一种或多种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物。

本发明另一方面提供一种或多种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物在制备治疗疾病或病症的药物中的应用。

本发明另一方面提供一种治疗、预防或缓解疾病或病症的药物，所述药物包含一种或多种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物。

本发明另一方面提供药物组合物，所述组合物含有与一种或多种药物载体、赋形剂、辅助剂和/或稀释剂结合的一种或多种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物。

本发明0另一方面提供含有一种或多种式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物的饮料或食物。

从以下描述和权利要求书以及附图可明白本发明的这些和其它方面。

附图简述

图1比较了脱氢牛尿酚(DHE，图A)、3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(本发明的HMC化合物1，图B)和顺式铂氨(图C)在新生儿包皮成纤维细胞中的毒性。

图2比较了HMC与顺式铂氨在黑色素瘤细胞中的效力。

图3代表了p.o(口服)给予(50mg/kg)BALB/c小鼠后，HMC(A)和DHE(B)的游离形式和总体形式的药物动力学分布情况。

图4比较了20％羟丙基-β-环糊精配制的HMC以50mg/kg剂量i.v(静脉内)和i.p(腹膜内)给予后，HMC血清浓度的药物动力学分布情况。

图5比较了腹膜内给予20％HPBCD(载体对照，qd×15)或HMC(100mg/kg，qd×15)治疗携带HPAC胰腺癌肿瘤的裸鼠得到的平均肿瘤体积数据。数据表示为平均值±SEM^*，斯氏T-检验，p<0.01。

图6比较了腹膜内给予20％HPBCD(载体对照，qd×15)或HMC(100mg/kg，qd×15)治疗携带HPAC胰腺癌肿瘤的裸鼠得到的平均最终肿瘤质量数据。数据表示为平均值±SEM^*，斯氏T-检验，p<0.01。

图7比较了腹膜内给予20％HPBCD(载体对照，qd×15)或HMC(100mg/kg，qd×15)治疗携带HPAC胰腺癌肿瘤的裸鼠得到的平均最终肿瘤质量数据。数据表示为平均值±SEM^*，斯氏T-检验，p<0.01。

图8总结了用DHC和HMC处理黑色素瘤细胞24和48小时的凋亡发生率。

图9代表用HMC和DHE处理恶性黑色素瘤细胞(Mel-RM和Me4405)导致选择性启动程序性细胞死亡。用相同浓度的DHE和HMC以及相同接触时间不诱导正常成纤维细胞(MRC-5)凋亡。

图10代表MM200黑色素瘤细胞系中HMC-顺式铂氨的协同性细胞毒性数据的3D分析。采检测了5-天联合方案(图10A)或24小时HMC→抗癌顺次(anti-cancersequence)(图10B)方案中HMC-顺式铂氨组合的效果。各联合实验检验10、5、2和1μM的HMC。参见表8的原始数据。

图11代表了本发明化合物6和7抑制小鼠巨噬细胞中TNFα产生的百分比。

图12是3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇的¹Hn.m.r.图谱。

发明详述

本发明人发现通式(I)所示的一类异黄烷衍生物显示惊人和出乎意料的生物学和药学特性。

据信，本发明式(I)所示化合物对正常细胞具有优良的毒性分布状况和良好的生物利用度。令人惊奇的是，本发明化合物显示的抗癌症活性明显优于已知的癌症治疗(药物)或至少与之相当。

式(I)所示化合物具有抵御各种人和动物来源癌细胞的细胞静止(活性)和细胞毒性。癌细胞表示这些细胞显示恶性特征，其与非癌细胞的区别在于不受控制的生长和除非成功治愈否则最终威胁生命的特性。

发现能对式(I)所示化合物起反应的癌细胞是上皮来源(例如，前列腺、卵巢、子宫颈、乳腺、胆囊、胰腺、结肠直肠、肾脏和非小细胞肺癌细胞)，间充质来源(例如，黑色素瘤、间皮瘤和肉瘤癌细胞)和神经来源(例如，神经胶质瘤癌细胞)。发现一组相关化合物对癌细胞显示如此强的细胞毒性，但对非癌细胞(例如，源自人包皮的角化细胞)毒性低是极其罕见且令人吃惊的。这种癌细胞选择性极其罕见且出乎意料。

式(I)所示化合物的优点是对标准抗癌药物不灵敏的熟知癌细胞显示有细胞毒性。发现对癌症，例如胆管癌、胰腺癌和黑色素瘤有如此强的活性极其罕见且出乎意料。

有利地，式(I)所示化合物也出乎意料地显示能使癌细胞对辐射敏感，这意味着这些化合物可降低杀伤这些细胞所需的γ-射线用量，或者它们能将癌细胞从辐射耐受状态转化为辐射敏感状态。

此外，认为式(I)所示化合物具有化疗致敏活性，即它们增加化疗药物(特别是对癌细胞)的细胞毒性和/或能将癌细胞从化疗耐受性转化为化疗敏感状态。

本发明化合物也为非癌细胞提供化疗和/或辐射保护性特性。由于常规治疗方法对非癌细胞的毒性可导致化疗和放疗产生创伤性副作用，这具有明显的治疗意义。

上述特性能提供明显的临床益处。

可利用本发明化合物的辐射和/或化疗保护特性来保护健康个体免遭辐射和/或化学毒素作用，或减轻其作用。

因此，本发明也提供式(I)所示化合物在降低肿瘤的生长速率或减小所述肿瘤大小来治疗癌症患者中的应用，所述治疗可单用所述化合物和/或彼此联用和/或联用其它抗癌症药物和/或联用放疗进行治疗。

单用本发明化合物或在上述联合治疗中使用可降低标准抗癌症治疗时患者通常经历的不良副作用。利用本发明化合物可能意味着在这种治疗中可利用较低剂量，对于癌症患者这代表了重要进步。

式(I)所示化合物中R₃优选在3-位。

在本发明另一方面，R₉是C_1-4-烷基，例如甲基。

式(I-a)所示化合物中优选：

R₁是氢、C_1-4-烷基或C(O)R₇，

R₂和R₃独立为氢、羟基、C_1-4-烷氧基、卤素或OC(O)R₇，只要R₂和R₃不都是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、酰基、OC(O)R₇和

R₇是C_1-4-烷基、苯基或苄基，

或其药学上可接受的盐或衍生物。

式(I-a)所示化合物中更优选：

R₁是氢、甲基、乙基、丙基、异丙基或乙酰基，

R₂和R₃独立为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、溴、氯、氟或乙酰氧基，除了R₂和R₃不都是氢，

R₄是氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或乙酰氧基，和

R₅和R₆独立为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、乙酰基或乙酰氧基，

或其药学上可接受的盐或衍生物。

特别优选的式(I-a)所示化合物具有以下取代基：

R₁是氢、甲基或乙酰基，

R₂和R₃独立为氢、羟基、甲氧基、溴或乙酰氧基，除了R₂和R₃不都是氢，

R₄和R₆独立为氢、羟基、甲氧基或乙酰氧基，和

R₅是氢，

或其药学上可接受的盐或衍生物。

本发明也可延伸至式(I-b)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：

其中：

R₁代表氢或C_1-6-烷基，更优选氢或甲基，特别是氢。

R₂代表氢、羟基或C_1-6-烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基，更优选羟基或甲氧基，特别是羟基。

R₃代表氢、羟基、C_1-6-烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基，更优选氢或甲氧基，特别是氢，前提是R₂和R₃不都是氢，

R₄代表氢、羟基、C_1-6-烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、C_1-6-烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基，特别是氢、羟基、甲氧基或甲基，特别是甲氧基或羟基，

R₅代表氢、C_1-6-烷氧基、C_1-6-烷基，特别是氢、甲氧基、羟基，特别是氢。

本发明的优选化合物包括通式(I-c)所示化合物或其药学上可接受的盐或衍生物：

其中：

R₁是氢或C₁-C₆烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，

R₂是羟基或C_1-6-烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基，和

R₄是羟基或C_1-6-烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基。

式(I-c)所示化合物中更优选R₁是氢或甲基，特别是氢。

式(I-c)所示化合物中更优选R₂是羟基或甲氧基，特别是羟基。

式(I-c)所示化合物中更优选R₄是羟基或甲氧基，特别是甲氧基。

本发明另一方面提供式(I-d)所示化合物：

其中：

R₁是氢、烷基、环烷基或C(O)R₇，和

R₃是羟基、烷氧基、烷基、环烷基、卤素或OC(O)R₇，除了R₂和R₃不都是氢，

R₄是氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、酰基、氨基、C_1-4-烷基氨基或二(C_1-4-烷基)氨基或OC(O)R₇，和

R₇是氢、烷基、环烷基、芳基、芳基烷基或氨基。

本发明还有一方面提供式(I-e)所示化合物：

其中：

R₁是氢、烷基、环烷基或C(O)R₇，和

R₂和R₃独立为氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、卤素或OC(O)R₇，除了R₂和R₃不都是氢，

式(I-e)所示化合物中更优选R₁代表氢或甲基，特别是氢。

式(I-e)所示化合物中更优选R₂代表羟基或C₁-C₆烷氧基，例如甲氧基。

式(I-e)所示化合物中更优选R₃代表氢、羟基或甲氧基，特别是氢。

本发明其它方面提供式(I-f)所示化合物：

其中：

R₁是氢、烷基、环烷基或C(O)R₇，和

R₃是羟基、烷氧基、烷基、环烷基、卤素或OC(O)R₇，除了R₂和R₃不均是氢，

R₄是氢、羟基、烷氧基、烷基、环烷基、酰基、氨基、C_1-4-烷基氨基或二(C_1-4-烷基)氨基、OC(O)R₇或OR₈，和

R₇是氢、烷基、环烷基、芳基、芳基烷基或氨基，和

R₈是芳基，例如苯基，或芳基烷基，如苄基。

式(I-f)所示化合物中优选R₁代表氢或甲基，特别是氢。

式(I-f)所示化合物中优选R₂代表羟基或C₁-C₆烷氧基，例如甲氧基，特别是羟基。

式(I-f)所示化合物中优选R₃代表氢或C_1-6-烷氧基，例如甲氧基，特别是氢。

式(I-f)所示化合物中优选R₃位于3-位。

式(I-f)所示化合物中优选R_4a代表氨基、C_1-4-烷基氨基或二(C_1-4-烷基)氨基，特别是氨基。

特别优选的式(I)所示化合物包括：

3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(HMC；化合物1)；

3-(4-羟苯基)-4-苯基苯并二氢吡喃-7-醇(化合物2)；

3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物3)；

3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物4)；

3-(4-羟苯基)-4-(4-甲基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物5)；

3-(4-甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-7-甲氧基苯并二氢吡喃(化合物6)；

3-(4-羟苯基)-4-(2，6-二甲氧基-4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物7)；

3-(4-羟苯基)-4-(2-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物8)；

3-(4-羟苯基)-4-(3-酰基-2-羟基-4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物9)；

3-(3-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物10)；

3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(HHC；化合物11)；

3-(4-溴苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物12)；

3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物13)；

3-(4-羟苯基)-4-(3-氨基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物14)；

3-(4-羟苯基)-4-(4-苯氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(化合物15)；

3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-8-甲基苯并二氢吡喃-7-醇(化合物16)。

或其药学上可接受的盐。

本发明式(I)所示化合物包含两个手性中心。本发明包括所有对映异构体和非对映异构体及其任何比例的混合物。本发明也可延伸至分离的对映异构体或成对的映异构体。本领域技术人员熟知分离对映异构体和非对映异构体的方法。

本领域技术人员应明白在式(I)所示化合物中，杂环上的芳基取代基相对于彼此可以是顺式或反式。式(I)所示化合物的这些取代基最好是顺式。

本发明特别优选的化合物是(1)号化合物，HMC的顺式异构体或其药学上可接受的盐：

类似地，特别优选的化合物是顺式构型的(2)-(16)号化合物。

式(III)和(IV)所示化合物是本文所述的中间体。(1)-(16)号化合物的各相应的异黄酮-4-醇和异黄酮-2-烯中间体也是本发明的优选化合物。

例如，式(III)和(IV)所示化合物中W代表了以下基团：

或其受保护的衍生物，其中R₄、R₅和R₆a如以上式(I)所示化合物所定义。

本文所用的术语“异黄酮”应取广义包括异黄酮、异黄烯(isoflavenes)、异黄烷(isoflavans)、异黄烷酮(isoflavanones)、异黄烷醇(isoflavanols)等。

术语“烷基”应包括1-6个碳原子的直链和支链饱和烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。烷基更优选含有1-4个碳原子，特别是甲基、乙基、丙基或异丙基。

环烷基包括C_3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

烷基或环烷基可任选被一个或多个以下基团取代：氟、氯、溴、碘、羧基、C₁-C₄-烷氧基羰基、C₁-C₄-烷基氨基-羰基、二-(C₁-C₄-烷基)-氨基-羰基、羟基、C₁-C₄-烷氧基、甲酰氧基、C₁-C₄-烷基-羰氧基、C₁-C₄-烷硫基、C₃-C₆-环烷基或苯基。

烷基优选不具有任何取代基。

术语“芳基”应包括苯基、苄基、联苯基和萘基，这些基团可任选被以下一个或多个基团取代：C₁-C₄-烷基、羟基、C₁-C₄-烷氧基、羰基、C₁-C₄-烷氧基羰基、C₁-C₄-烷基羰氧基、硝基或卤素。

术语“卤代”应包括氟代、氯代、溴代和碘代，优选氟代和氯代，更优选氟代。例如，“卤代烷基”包括一卤代、二卤代与最多全卤代烷基。优选的卤代烷基是三氟甲基和五氟乙基。

本发明化合物包括各种盐，例如酸加成盐、阴离子盐和两性离子盐，特别包括本领域技术人员已知的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指带电荷并能与药学制剂联合给予(例如作为盐的抗衡阳离子或抗衡阴离子)的有机或无机部分。本领域技术人员已知药学上可接受的阳离子，其包括但不限于：钠、钾、钙、锌和季胺。本领域技术人员已知药学上可接受的阴离子，其包括但不限于：氯离子、乙酸根、甲苯磺酸根、柠檬酸根、碳酸氢根和碳酸根。

药学上可接受的盐包括从以下酸形成的盐：乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、肉桂酸、乙磺酸、延胡索酸、谷氨酸、戊二酸、葡糖酸、盐酸、氢溴酸、乳酸、马来酸、苹果酸、甲磺酸、萘甲酸、羟基萘甲酸、萘磺酸、萘二磺酸、萘丙烯酸、油酸、草酸、草酰乙酸、磷酸、丙酮酸、对甲苯磺酸、酒石酸、三氟乙酸、三苯基乙酸、丙三羧酸、水杨酸、硫酸、氨基磺酸、磺胺酸和琥珀酸。

术语“药学上可接受的衍生物”或“药物前体”指给予受者后能直接或间接提供母体化合物或代谢物，或能显示其自身活性的活性化合物衍生物，包括例如磷酸衍生物和磺酸衍生物。因此，衍生物包括溶剂化物、药学上的活性酯、药物前体等。也包括在生理条件下可切割的离去基团的衍生物，在体内切割而提供本发明化合物或它们的活性部分。离去基团可包括酰基、磷酸酯(基团)、硫酸酯(基团)、磺酸酯(基团)，优选单、二和全酰氧基取代的化合物，其中一个或多个侧羟基(pendanthydroxy)受酰基，优选乙酰基的保护。本发明的酰氧基取代化合物通常容易切断为相应的羟基取代化合物。

在适于促进本发明化合物和它们的起始材料合成的场合，可采用本领域技术人员已知的化学官能团保护、脱保护、合成子和其它技术。

可采用本领域熟知的方法对本发明化合物和衍生物上的官能团进行保护，例如T.W.Greene，《有机合成的保护基团》(Protective Groupsin Organic Synthesis)，John Wiley&Sons，纽约，1981所述。

羟基保护基团包括但不限于：羧酸酯，例如乙酸酯；芳酯，例如苯甲酸酯；缩醛/缩酮，例如丙酮化合物和亚苄基；醚，例如邻-苄基和对-甲氧基苄基醚；四氢吡喃醚和甲硅烷基醚，例如叔丁基二甲基甲硅烷基醚。

可通过，例如酸或碱催化水解或还原，如氢化来除去保护基团。甲硅烷基醚可能需要氟化氢或氟化四丁铵来断裂。

医药化学领域的技术人员应明白可将式(I)所示化合物转化为式(I)所示其它化合物，例如当式(I)所示化合物带有一个或多个羟基取代基时，可通过用卤化试剂处理所述醇将这些羟基取代基中的一个或多个转化为卤素取代基，例如溴代、氯代或碘代。卤化试剂包括诸如NBS、氢溴酸、氯气等化合物。在诸如卤化的过程中，可能需要利用保护基团来保护分子中的其它官能团。

酚型羟基不难通过用卤化试剂处理转化为相应的卤素化合物。然而，所需卤素化合物的制备可通过，例如有HCl存在时在温度降低条件下，如0℃用NaNO₂处理合适的芳基胺起始物质以形成相应的叠氮盐。然后用CuCl、CuBr、KI或HBF₄处理将叠氮基(盐)转化为所需的卤素化合物。

制备式(I)所示化合物的通用方法包括用还原剂处理式(IV)所示化合物得到式(I)所示化合物或其受保护衍生物的步骤：

其中R₁、R₂、R₃和W如上式(II)所示化合物的相关定义。

本领域技术人员熟知还原剂，包括氢化物来源，例如硼氢化物和碱金属硼氢化物，但当利用合适的催化剂，例如钯碳时催化氢化中可包括氢。其它合适的氢化物来源包括三乙酰氧基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢四丁铵(tetrabutyl ammoniumtriacetoxyborohydride)和氰基硼氢化钠。

优选采用氢化还原式(IV)所示化合物中的双键。

通过使式(III)所示化合物或其受保护的衍生物脱水制备式(IV)所示化合物：

其中R₁、R₂、R₃和W如上式(II)所示化合物的相关定义。

可通过，例如本领域技术人员熟知的酸、碱催化来脱水或通过将叔醇转化为较好的离去基团来促进脱水。

式(III)所示化合物优选脱水，例如用对甲苯磺酸处理。

可通过用芳基化试剂处理式(II)所示化合物或其受保护的衍生物来制备式(III)所示化合物：

其中R₁、R₂、R₃和W如上式(II)所示化合物的相关定义，所述芳基化试剂例如是式W^-M⁺所示化合物，其中W-是任选取代的芳基，M⁺是一个或多个反离子，优选[MgBr]⁺。

可通过格利雅化学方法制备芳基化试剂W^-M⁺，其中卤代芳基化合物(V)或其受保护的衍生物可与金属，例如镁反应从而得到芳基化试剂：

其中

R₄、R₅和R₆独立为氢、烷氧基、烷基、酰基、OC(O)R₇、受保护的羟基，例如OSi(R₁₀)₃或受保护的氨基，例如三甲基甲硅烷基氨基苯基卤化物和

R₁₀独立为烷基或芳基，和

X是卤素，优选溴。

所述卤代芳基化合物(V)宜选自：

其中R₄、R₅、R₆和X如上式(V)所示化合物的定义。

芳基化试剂与式(II)所示酮反应得到相应的本发明异黄烷-4-醇(III)、异黄-3-烯(IV)和异黄烷(I)。

或者，可通过使式(II)所示化合物与类似于式(V)所示化合物的化合物反应来制备式(III)所示化合物，其中X代表在通过本领域技术人员熟知的芳基部分与酮的亲核加成形成产物的过程中丧失的任何合适的离去基团L。

优选保护式(II)所示酮基化合物任何游离的醇、酯或其它这种反应基团，例如亲核加成反应中的叔丁基二甲基甲硅烷基醚。

可通过还原式(VI)所示化合物或其受保护衍生物中的烯酮(eneone)双键来制备式(II)所示化合物：

其中R₁、R₂和R₃如上式(II)所示化合物的定义。

上述的是合适的还原剂。优选通过，例如氢化实现碳-碳双键的还原。

可利用以下方案1所述和公布的国际申请号WO01/17986(其内容纳入本文作为参考)所述的通用合成方法得到通式(VI)所示化合物。方案1描述了典型的合成方法。

方案1

采用苯乙酸衍生基团上的不同取代方式可得到各种3-苯基取代的苯并二氢吡喃。

采用芳基化试剂(V)的不同取代方式可得到各种4-苯基取代的苯并二氢吡喃。

可利用这些方法所用化合物的类似物，所述类似物包含对应于式(I)所示化合物所定义的R₉取代基。

本文所用的术语“治疗”、“预防”或“防止”、“缓解”等可认为是其最广的范围。具体地说，术语“治疗”不一定意味着治疗某动物直至康复。因此，“治疗”包括缓解某具体病症的症状或严重性或防止或降低患某具体病症的风险。

本发明的治疗性治疗所需的一种或多种式(I)所示化合物的用量取决于许多因素，包括具体的应用，所用具体化合物的性质，所治疗的疾病，给药方式和患者的状况。

可以常规实施的方式和用量给予式(I)所示化合物。参见，例如Goodman和Gilman，《治疗学的药理学基础》(The pharmacological basis of therapeutics)，第七版，(1985)。所用的具体剂量取决于所治疗的病症、对象的状态、给药途径和上述其它熟知的因素。总之，每位患者的日剂量可以是0.1mg-5g；通常是0.5mg-1g；优选50mg-200mg。取决于待治疗或缓解病症的严重性，给药长度可视需要在一周到数月或数年时间内每日或每两日给予一剂量到每日给药两次或三次。

还应知道对于任何具体的对象，可根据个体需要和实施或监督化合物给予人员的职业判断来随时调节具体剂量方案。

可采用这些活性化合物作短期治疗来稳定或降低或缓解癌症。可采用长期治疗来防止高危患者发生癌症。

一般通过混合本发明化合物(为方便起见下文称为“活性化合物”)与本领域熟知的一种或多种药学上或兽医学上可接受的载体和/或赋形剂来制备用于治疗本文所述治疗性适应症的药物组合物。

当然，就与制剂中的任何其它成分相容而言，载体必须是可接受的，并且必须对对象无害。载体或赋形剂可以是固体或液体，或(同时是)二者，优选与化合物配制为单位剂量，例如片剂，以重量计可含有多达100％的活性化合物，优选以重量计0.5％-59％的活性化合物。

可将一种或多种活性化合物掺入通过任何熟知的药学技术制备的本发明制剂中，所述技术一般包括混合诸组分(任选包含一种或多种辅助成分)构成。药物组合物中活性化合物的优选浓度取决于药物的吸收、分布、灭活和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。

本发明制剂包括适合于口服、直肠、经眼、含服(例如，舌下)、胃肠外(例如，皮下、肌肉内、真皮内或静脉内)、透皮给药(包括经鼻、口、阴道或直肠粘膜给药)以及作为吸入剂的那些制剂，虽然在任何给定的情况中最合适的途径取决于所治疗疾病的性质和严重性以及所用具体活性化合物的性质。

适合于口服给药的制剂可以离散单位存在，例如各含有预定含量活性化合物的胶囊、囊剂、糖锭或片剂；粉末或粒剂；水性或非水性液体配制的溶液或悬浮液；水包油或油包水乳剂。可采用任何合适的药学方法制备这种制剂，所述方法包括混合活性化合物与合适的载体(可含有一种或多种上述辅助成分)。

一般可通过均匀且紧密混合活性化合物与液体或细分级的固体载体(或二者)，然后(如果需要)使得到的混合物成形，例如形成单位剂量来制备本发明制剂。例如，可通过压缩或模塑含有活性化合物与(任选)一种或多种其它成分的粉末或颗粒来制成片剂。

可利用合适的机器压缩自由流动的化合物，例如任选与黏合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性/分散剂混合的粉末或颗粒来制成压缩片剂。可利用合适的机器模塑用惰性液体黏合剂润湿的粉末状化合物来制成模塑片剂。

适合于含服(舌下)给药的制剂包括含有用调味基(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)配制的活性化合物的糖锭；和含有惰性基(例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)配制的化合物的软锭剂。

适合于眼部给药的制剂包括含有用眼可接受的载体或稀释剂配制的活性化合物的液体、凝胶和乳膏。

适合于胃肠外给药的本发明组合物可方便地含有活性化合物的无菌水性制品，所述制品宜与所需受者的血液等渗。这些制品优选静脉内给予，虽然也可通过皮下、肌肉内或真皮内注射给予。通过混合所述化合物与水或甘氨酸缓冲液并使得到的溶液无菌并且与血液等渗不难制备这种制品。本发明的可注射制品通常含有0.1％-60％w/v的活性化合物，以0.1ml/分钟/kg的速率给予。

例如，可利用盐水作为载体与合适的增溶剂，例如环糊精或其衍生物来制备用于输液的制剂。合适的环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、二甲基-β-环糊精、2-羟乙基-β-环糊精、2-羟丙基-环糊精、3-羟丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。更优选环糊精速是羟丙基-β-环糊精。环糊精的合适衍生物包括US5,134,127所述环糊精的

磺基丁基醚衍生物或其类似物。

适合于直肠给药的制剂优选以单位剂量栓剂存在。适合于阴道给药的制剂优选以单位剂量阴道栓剂存在。可通过混合活性化合物与一种或多种常规固体载体，例如可可油，然后使得到的混合物成形来制备这些制剂。

适合于局部给予皮肤的制剂或组合物宜采取软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶、喷剂、气溶胶或油的形式。可用的载体包括凡士林(Vasoline)、含香料的润滑剂(lanoline)、聚乙二醇、醇类或其两种或更多种的组合。活性化合物的浓度通常是0.1％-5％w/w，更具体地说是0.5％-2％w/w。这种组合物的实例包括化妆品护肤乳膏。

适合于透皮给药的制剂可以离散的贴剂存在，所述贴剂适应于长期与受者表皮紧密接触。对于所述活性化合物，这种贴剂含有的活性化合物宜是例如，0.1M-0.2M浓度的任选缓冲的水溶液。参见例如Brown，L等，(1998)。

适合于透皮给药的制剂也可通过离子电渗递送(参见，例如Panchagnula R等，2000)，其通常采取活性化合物的任选缓冲水溶液形式。合适的制剂包含柠檬酸或Bis/Tris缓冲液(pH6)或乙醇/水并含有0.1M-0.2M活性成分。

适合于吸入的制剂可作为溶液、悬浮液或乳液形式的喷剂组合物递送。吸入喷剂组合物还可含有药学上可接受的推进剂，例如二氧化碳或一氧化二氮或含有氢的碳氟化合物，例如1，1，1，2-四氟乙烷、1，1，1，2，3，3，3-六氟-正丙烷或其混合物。

活性化合物可以食品的形式提供，例如加入、混合入、涂布于、组合或以其它方式加入食品。术语食品以其最广泛的含义使用，包括液体制剂，例如含有奶制品的饮料和其它食品，如健康棒(health bar)、甜食等。按照标准操作不难制备含有本发明化合物的食物制品。

可给予人或其它动物这些治疗方法、应用和组合物，包括哺乳动物，例如陪伴和家养动物(如狗和猫)和家畜(如，牛、绵羊、猪和山羊)，鸟类(如鸡、火鸡、鸭)，海洋动物，包括水产养殖动物(如鱼、甲壳类和贝类)等。

活性化合物或其药学上可接受的衍生物、药物前体或盐也可与不影响所需作用的其它活性物质，或与能增加所需作用的物质，例如抗生素、抗真菌剂、抗炎药或抗病毒化合物共同给予。所述活性药物可包含两种或多种异黄酮或其衍生物的组合或协同混合物。活性化合物也可与降脂药，例如丙丁酚和烟酸；血小板凝集抑制剂，如阿司匹林；抗血栓药物，例如酮苄香豆素；钙通道阻断剂，例如异搏定、地尔硫

和硝苯吡啶；血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂，例如开搏通和依那普利；和β-阻断剂，例如心得胺、特布他林和拉贝洛尔联合给予。这些化合物也可与非类固醇抗炎药，例如布洛芬、吲哚美辛、阿司匹林、非诺洛芬、甲灭酸、氟灭酸和亚磺酰茚乙酸联合给予。这些化合物也可与皮质类固醇或抗呕吐药，例如zofran

联合给予。

式(I)所示化合物似乎特别适合于和一种或多种抗癌药，例如顺式铂氨、脱氢牛尿酚(DHE)、红豆杉醇(紫杉醇)、吉西他滨、阿霉素、拓扑替康和/或喜树碱，特别是顺式铂氨、脱氢牛尿酚(DHE)、红豆杉醇联用。与只用一种药物相比，这提高了治疗效果，例如以协同作用的形式。具体地说，本发明化合物，特别是HMC(即化合物1)似乎是化疗致敏剂并能增加与其共同给予的一种或多种抗癌症药物的细胞毒性。即使所述抗癌症药物通过不同的机理起作用似乎依然是这样，例如认为顺式铂氨通过与核DNA相互作用而起作用；认为红豆杉醇通过将细胞阻断在细胞周期的G2/M期并阻止它们形成正常的有丝分裂装置而起作用；认为吉西他滨通过将其自身掺入细胞的DNA而最终阻止有丝分裂；认为阿霉素是拓扑异构酶II抑制剂，从而阻止DNA复制和转录；认为拓扑替康是拓扑异构酶I抑制剂。

有趣的是，在一些情况中，这种癌细胞的细胞毒性增加并不伴有非癌细胞的毒性相应增加。

尽管此观察结果对于许多癌症的治疗具有重要意义，但对于诸如黑色素瘤等极为难治的癌症尤其重要。

共同给药可同时或依次进行。可通过在同时或相似时间在同一单位剂量中或在单独和分开的单位剂量中同时给予化合物。依次给药可视需要以任何顺序进行，给予第二种或后面的活性药物时，通常第一种或先给予的活性药物正在发挥其生理作用，特别需要累积或协同作用时。

本发明也延伸至含有组合治疗剂的包装。

本发明优选合成方法中所用的化合物可得自本领域技术人员不难鉴定的许多来源。例如，黄豆苷原不难得到或用本领域已知的标准方法合成。合适的方法见，例如公布的国际专利申请WO98/08503和WO00/49009及其引用的参考文献，这些文献均全文纳入本文作为参考。

上述式(II)、(III)和(IV)所示化合物是产生式(I)所示活性异黄酮化合物的中间体。这些中间体也代表了本发明的其它方面。

经管不想受理论的束缚，但认为本发明化合物能调节动物细胞中各种信号转导过程，这些信号转导过程涉及广泛的对所有动物细胞的存活和功能至关重要的各种功能。因此，这些化合物在动物，包括人中具有广泛且重要的健康益处，特别是这些化合物可能预防和治疗重要且常见的人类疾病、病症和功能，这代表了出乎意料的实质性益处。

因此，本发明化合物似乎具有TNFα抑制剂的活性。有人假设TNFα是受到严密调节的细胞因子网络的一部分，能激活多种信号转导途径并诱导或抑制各种基因。TNFα能提供癌细胞的存活信号，因此其称为肿瘤促进因子。作为炎症的中心介质，TNFα在慢性炎性刺激和随后发生的恶性疾病之间提供分子联系。因此，本发明化合物抑制TNFα可能提供一种施加抗癌症和/或抗炎性活性的机制。或者，这些化合物可用作化学预防性药物(chemopreventative agent)。

本发明的具体益处在于(a)这些化合物可靶向大范围的信号转导过程，(b)对各种过程的调节包括上调一些过程和下调一些过程，和(c)对诸信号转导过程的这种广泛且不同的作用也伴有对各种重要酶的独立作用，所述酶对于新陈代谢和类固醇产生重要。

本发明的异黄酮化合物对正常细胞显示良好的体外毒性分布状况。异黄酮具有广泛的活性，显著优于脱氢牛尿酚或至少与之相当。异黄酮对以白血病、神经胶质瘤、前列腺癌、卵巢癌和肺癌为代表的癌细胞有高度活性。异黄酮化合物对黑色素瘤和胆管癌(胆囊癌)癌细胞显示有效活性。对结肠直肠癌细胞观察到良好活性。

利用如生长在大腿上并接受几次剂量的局部辐射(只对带有肿瘤的腿)的人表皮样外阴癌A431肿瘤检验了体内辐射敏感性。4天的辐射治疗方案(2.5Gy/天)可延迟肿瘤生长，可通过监测肿瘤生长延迟来评估辐射剂量和测试化合物联合的效果。只用辐射估计可延迟肿瘤生长约6天。可单独测定利用口服给予的测试化合物(所致)的肿瘤生长延迟。然后，通过检测肿瘤生长延迟来测定A431肿瘤经测试化合物介导而对辐射敏感提供了证据，所述肿瘤生长延迟采用口服给予测试化合物预先治疗动物然后实施上述标准放疗方案。与单用辐射或测试化合物治疗方案的最多10天相比，采用组合治疗平均生长延迟最多30天是本发明化合物辐射敏感特性的证据。

例如，可采用产克隆试验利用人表皮样外阴癌A431细胞系检测对单用辐射或联用测试化合物的反应从而在体外检验辐射敏感作用。将导致细胞10％毒性的药物剂量可与递增剂量的辐射联用。可采用产克隆试验测定化合物的合适剂量。测试化合物介导辐射敏感作用的证据是，例如与采用相应的单一治疗方案的10％毒性相比，采用化疗放疗对细胞的毒性大于20％。

本发明化合物可用于治疗、预防或缓解与细胞异常存活、细胞异常增殖、细胞异常迁移、血管生成异常、雌激素/雄激素平衡失常、类固醇生成失调或异常、退化(包括血管壁退化改变)、炎症和免疫失衡相关的疾病。

以下非限制性实施例和附图进一步阐述了本发明。

实施例

在以下实施例和附图中，缩写“DHE”用于指脱氢牛尿酚；“HMC”用于指1号化合物，即3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-苯并二氢吡喃-7-醇；“HHC”用于指11号化合物，即3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)-苯并二氢吡喃-7-醇。

1.0合成

实施例1：4’，7-二乙酰氧基黄豆苷原

将黄豆苷原(2.0g)、乙酸酐(10ml)和吡啶(2ml)的混合物在105-110℃加热1小时。混合物冷却至室温后，再搅拌30分钟，期间二乙酸盐结晶从溶液中结晶。滤出产物，用水彻底洗涤，甲醇重结晶得到无色棱状的4＇，7-二乙酰氧基黄豆苷原(2.4g，90％)。

实施例2：7-乙酰氧基-3-(4-乙酰氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮

21向4＇，7-二乙酰氧基黄豆苷原(0.50g，1.5mmol)的乙酸乙酯(80ml)溶液中加入钯碳(5％，0.02g)，混合物于室温在氢气气氛中搅拌72小时。经硅藻土(Celite)过滤除去催化剂，真空蒸发得到的滤液。残留物经乙醇重结晶得到无色片状的7-乙酰氧基-3-(4-乙酰氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(0.40g，80％)。

实施例3：7-羟基-3-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-4-酮

向4＇，7-二乙酰氧基二氢黄豆苷原(0.26g，0.08mmol)的无水乙醇(5.0ml)悬浮液中加入咪唑(0.63g)，混合物在氩气中回流45分钟。减压浓缩溶液，向残留物中加入蒸馏水(10ml)。混合物冷冻静置过夜，滤出得到的沉淀物。粗产物经乙酸乙酯/二氯甲烷重结晶得到白色粉末状的7-羟基-3-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(0.14g，71％)。

实施例4：7-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-3-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)苯基)苯并二氢吡喃-4-酮

在2L圆底烧瓶中混合7-羟基-3-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(42g)、咪唑(130g)、叔丁基二甲基甲硅烷基氯(127g)和N，N-二甲基甲酰胺(500ml)，室温在氮气气氛中搅拌16小时。加入冷却的H₂O(200ml)猝灭反应，在冰浴中冷却反应混合物。滤出得到的白色固体，用水清洗。乙醇重结晶得到白色绒毛状晶体的产物(35.7g)。

实施例5：7-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-3-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-醇

在2-颈圆底烧瓶中称入7-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-3-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-醇(25g)，在氮气气氛中吹扫。向反应容器中加入无水THF(80ml)得到清澈的略带黄色溶液。连接上冷凝器，将反应容器置于冰浴中。在10分钟期间向反应混合物中滴加可购得的溴化4-甲氧基苯基镁(0.5M的THF溶液)225ml。仍旧在氮气气氛中滴加湿醚(50：50H₂O：乙醚)来猝灭反应，随着H₂O的加入量增加，形成了白色沉淀物。向反应混合物中加入更多的H₂O，然后用乙醚萃取。

合并有机层，用水、盐水洗涤，无水MgSO₄干燥，旋转蒸发仪除去溶剂得到清澈的黄色油状物，其固化过夜后得到灰白色固体。粗产物无需纯化即可用于下一步骤。

实施例6：3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并吡喃-7-醇

在连接有冷凝器的2-颈5L圆底烧瓶中混合7-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)-3-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-醇(42g)、pTsOH(435g)、沸石(boiling chip)和2.5L乙醇。反应(体系)加热回流3小时。将溶剂真空浓缩至约100ml，然后倒入冷却的搅拌的水(700ml)中。然后用乙酸乙酯萃取混合物，用水(3×2L)、盐水(1×500ml)洗涤合并的有机层，无水硫酸镁干燥，真空除去溶剂得到红色/棕色油状物。将油状物溶解于甲醇(约100ml)，置于冰箱中过夜。

过夜后形成白色沉淀物，滤出并用甲醇清洗。真空浓缩滤液得到棕色油状物。

实施例7：3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-苯并二氢吡喃-7-醇

在2-颈500ml圆底烧瓶中混合3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)-2H-苯并吡喃-7-醇25，5g(70毫摩尔)、10％Pd/Al₂O₃3.95g和200ml乙醇。采用标准条件低压氢化反应(体系)3小时。反应(体系)经硅藻土过滤除去催化剂，乙醇(300ml)清洗。将滤液浓缩至约50ml，然后倒入冷却的搅拌的水(1.4L)中。形成浅橙色沉淀物，随后形成棕色油状物。然后用乙醚萃取混合物，用水(3×1L)、盐水(1×500ml)洗涤合并的有机层，无水硫酸镁干燥并过滤。真空除去溶剂得到红色/棕色油状物。产物经乙醚(约100ml)重结晶得到棕色固体，用冷却的乙醚清洗该固体得到灰白色晶体11.3g。1H NMR图谱和编号方案如下所示。

在上述通用方法中，可用合适的取代基或合成子或其衍生物任选取代或保护这些结构。熟练的合成化学家可确定这些化合物的存在，例如其盐、乙酸盐、苄基或甲硅烷氧基衍生物。

采用本领域已知的标准方法不难烷化(MeI/碱)、酰化(Ac₂O/Py)或甲硅烷化(Cl-SiR₃/碱base)和类似地保护羟基。

实施例8：3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)-苯并二氢吡喃-7-醇

将3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇(3.17g)转移至圆底烧瓶中，用氮气吹扫。向烧瓶中滴加乙酸(13ml)配制的33重量％溴化氢，内含物在130℃加热回流7小时。将反应混合物置于冰浴中，利用氢氧化钠溶液(40％w/v)调节至pH6。用乙酸乙酯萃取混合物，用水和盐水再次洗涤乙酸乙酯层，然后经硫酸镁干燥。过滤混合物，真空除去溶剂得到棕色固体(2.89g)。将固体溶解于最少量的乙酸乙酯中，用硅胶60H，200-400目进行柱层析，乙酸乙酯：氯仿(40：60)用作洗脱剂)纯化。得到纯度约80％的3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇，利用半制备型高效液相色谱(HPLC)进一步纯化。¹Hn.m.r.见图12。

2.0材料与方法

2.1.组织培养

人胰腺癌细胞系HPAC(CRL-2119)常规培养在含有HEPES(15mM)、胰岛素(0.002mg/ml)、转铁蛋白(0.005mg/ml)、氢化可的松(40ng/ml)、表皮生长因子(10ng/ml)的1：1混合的DMEM(Dulbecco改进的Eagle培养基，Sigma)加Ham F12(Sigma)培养基中。卵巢癌细胞系CP70由Gil Mor(耶鲁大学)博士馈赠，培养在1：1混合的DMEM加Ham F12培养基中，SKOV-3(卵巢癌细胞系)购自ATCC，培养在McCoys5a培养基中。乳腺癌细胞系MDA-MB-468培养在Leibovitz L-15培养基中。黑色素瘤细胞系MM200由Peter Hersey(纽卡斯尔大学)馈赠，A2058由PeterParsons博士(QIMR)馈赠。二者均培养在DMEM培养基中。

所有培养液中均补加了10％FCS(胎牛血清CSL，澳大利亚)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和碳酸氢钠(1.2g/L)，37℃培养在5％CO₂的加湿气氛中。除另有说明之处，所有细胞系均购自ATCC(马里兰，美国)。

正常细胞系NFF(新生儿包皮成纤维细胞)由Peter Parsons博士(昆士兰医学研究院(Queensland Institute of Medical Research))馈赠。RK(家兔肾脏)细胞得自Miller Whalley(Macquarie University)。两种细胞系均培养在补加了10％FCS(CSL，澳大利亚)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和碳酸氢钠(1.2g/L)的RPMI中，37℃培养在5％CO₂的加湿气氛中。

2.2.增殖试验

测定各细胞系的IC50值。将细胞以生长动力学分析测定的合适细胞密度接种于96-孔板中，在有和没有测试化合物存在下培养5天。在37℃，根据生产商的使用说明加入20μL3-4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基溴化四唑(MTT，PBS配制为2.5mg/ml，Sigma)3-4小时后，评估细胞增殖。从y轴上的对照增殖％对x轴上的log剂量的半对数图计算IC50值。

2.3.DHE和HMC的药物动力学-口服

用1％CMC(m：v，水)将HMC和DHE制备为均匀悬浮液。采用管饲法将两种制剂以50mg/kg剂量口服递送至雌性BALB/c小鼠。各时间点(15分钟、30分钟、1小时、4小时和24小时)分配3只小鼠。在各时间点通过颈脱椎处死小鼠并收集血液。通过质谱分析游离的HMC。

2.4.HMC的药物动力学-静脉内和腹膜内

用20％羟丙基-β-环糊精(m：v，水)配制HMC溶液。将制剂以50mg/kg剂量通过管饲法口服递送或通过静脉内注释递送至雌性BALB/c小鼠。各时间点(15分钟、30分钟、1小时、4小时和24小时)均分配有3只动物。在各时间点通过颈脱椎处死小鼠并收集血液。也收集尿液并分析HMC。通过质谱分析游离的HMC。

2.5体内效力先驱研究-携带HPAC肿瘤的小鼠

胰蛋白酶消化烧瓶中亚汇合(80％)的HAPC细胞，用Hanks平衡盐溶液(Sigma)洗涤，以每毫升3.7×10⁷个细胞的密度重悬于dubellco极限必需培养基(Sigma)和等体积的matrigel^TM(Becton Dickson)中。在无胸腺nu/nu BALB/c小鼠沿背部表面中间的两侧皮下接种3.7×10⁶个HPAC细胞。对于HMC(n＝3/剂量方案)和对照组(n＝2)，在接种第5天以使肿瘤形成后开始治疗。

用20％HPBCD配制HMC，每日经腹膜内递送给药，15天。对照组接受相等(重量：重量)腹膜内剂量的20％HPBCD。在接种后第五天开始测量肿瘤(10×10mm²)，用卡尺测量两维尺寸，长度(a)和宽度(b)。通过公式W＝ab2/2计算肿瘤重量(W)，其中a是2个测量值中较长的(Odwyer等，1994)。分析最大肿瘤抑制(治疗的/对照，T/C)时的肿瘤增殖曲线。处死后，用福尔马林缓冲液固定肝脏、肾脏、股骨胃和结肠，石蜡包埋，切片并用H&E染色。然后将染色的切片递交至Rothwellconsulting进行组织病理学分析。对取自对照、载体对照和HMC治疗组的血液进行血清生物化学(分析)。通过兽医临床病理学(方法)(U.Syd)进行血清分析。

2.6协同作用的3-D模型分析

药物A和药物B之间细胞毒性相互作用的3-D模型分析能提供在三维(空间)预计联用两种药物的抑制性作用，从而揭示协同和拮抗的实际区域。3D协同作用图以Kanzawa等(Int.J.Cancer，71，311-319，(1997))概述的“理论加和作用”(TA)为基础。用下式计算单用药物A和药物B治疗时细胞毒性的计算理论加和作用，该公式假设这些药物是互相排斥的抑制剂：

${\mathrm{TA}}_{\left(1\right)}=\frac{{\left(f_a\right)}_A+{\left(f_a\right)}_B-2{\left(f_a\right)}_A{\left(f_a\right)}_B}{1-{\left(f_a\right)}_A{\left(f_a\right)}_B}$

其中：(f_a)_A＝受药物A影响的细胞组分

(f_a)_B＝受药物B影响的细胞组分

计算药物浓度各种组合的TA值并从观察到的各种组合的实验效果中扣除得到协同作用的测量值。正差异表明如果两种药物一起给予，受药物组合影响的细胞多于理论上预计的，因此是协同作用。负差异表明受药物组合影响的细胞少于理论上预计的，因此是拮抗作用。

3.0.结果

3.1.正常细胞毒性

脱氢牛尿酚(DHE)对NFF和家兔肾细胞的毒性较低，与HMC(分别是86和61μM)相比，其IC50值超过150μM(表1和图1)。在一项独立研究中，发现HHC对NFF和RK细胞均无毒性(也参见表1)。当与顺式铂氨(一种基准化疗药物)相比时，HMC和HHC所显示的毒性程度轻微。

表1.DHE、HMC、HHC和顺式铂氨对新生儿包皮成纤维细胞(NFF)和家兔肾细胞的相对毒性

3.2.对癌细胞的体外效力

当与DHE的IC50值相比时，HMC对多药抗性的p53mt卵巢癌细胞系(SKOV-3)，AR阴性的p53Mt前列腺癌细胞系(PC3)，ER阳性(p53wt)和阴性(p53mt)的乳腺癌细胞系(分别是MCF-7和MDA-MB-468)，p53Mt胶质瘤(HTB-138)，p53Mt前列腺癌(HPAC)和p53Mt大细胞肺癌显示了极为优秀的活性(约高5-10倍)(表2)。HMC显示对所测试的所有其它细胞系的抗癌症活性与DHE相当(表1)。注意到HMC对黑色素瘤细胞特别有效。(表2.1和图2)。相对于现有技术，这代表了实质性进步。

HMC对2种不同结肠细胞系的活性有差异，对HT-29细胞观察到有显著活性，而对HCT-15活性略低。注意HT-29和HCT-15分别是COX-2阳性和缺陷型。当用显微镜检查并与只用载体处理的细胞相比时，HMC处理的SKOV-3细胞显示的形态变化与经历凋亡的细胞一致(细胞胀大、胞质溶胶中出现颗粒和质膜起泡)。相反，与100μM脱氢牛尿酚接触18小时后，SKOV-3细胞保留相对正常的形态，与只用载体处理的细胞相当。

表2.1.比较脱氢牛尿酚和HMC对代表不同恶性肿瘤的细胞系的细胞毒性

其它研究测定了本文所述各种化合物对各种细胞系的细胞毒性。化合物14-烯是相应还原的苯并二氢吡喃，化合物14的3-烯苯并吡喃前体。观察到化合物1、2和11对几乎所有癌症细胞系显示最佳效力。与其相应的14-烯和化合物6相比，化合物14总体上显示稍好的效力(表2.2)。

表2.2.苯并二氢吡喃化合物1、2、6、11和14及色-3-烯化合物14-烯对代表不同恶性肿瘤的细胞系的细胞毒性

3.3.1.HMC的药物动力学-口服

与口服给予的DHE的药物动力学分布情况相比，经同一途径和剂量(50mg/kg)给予的HMC显示Cmax为141μM(1小时后达到)，而DHE是511μM(15分钟后达到)(表3和图3)。与DHE相似，HMC也与观察到的该分子游离形式的低血浆浓度相关(1.3μM，30分钟后)(表3和图3)。这低于采用相同剂量方案所能达到的游离脱氢牛尿酚最高浓度的一半(3.3μM，15分钟后)(图3)。与DHE相比，游离HMC：总HMC的比值较高(分别是0.92与0.64)。

表3.1.以50mg/kg给予HMC或DHE p.o.的小鼠获得的游离和总血浆浓度比较

3.3.2.HMC和HHC的药物动力学-口服

口服给予人患者200mg HMC或HHC。对于受攻击的各患者，在6小时期间采血，计算结果的平均值以特征鉴定血浆药物动力学。初步结果显示HMC的口服半衰期是3.99小时，HHC是3.26小时(表3.2)。

表3.2.给予200mg HMC或HHC后人血浆浓度半衰期的比较

 

化合物	Cmax(ng/mL)	Tmax(小时)	t1/2(小时)
				HMC(1)	513	2.17	3.99
HHC(11)	341	2.67	3.26

3.4.HMC的药物动力学-静脉内和腹膜内

当用HPBCD配制静脉内递送时，给药15分钟后，血液中观察到等于1mM药物的极高HMC水平(图4)。静脉内递送HMC的排泄动力学分两阶段，给药后第一个小时HMC以约1000uM/小时的速率从血液中快速排泄。推测是线性排泄，此速率在给药后1-4小时降至0.97uM/小时。当腹膜内给予同一制剂时，给药后1小时血浆中观察到HMC约低1个log(腹膜内给药是131μM，静脉内给药是1069μM)(图4)。然而，在此期间腹膜内给药的排泄动力学非常慢(112μM/小时)，从而导致给药1小时后血清浓度约高4.5倍(腹膜内给药是18.7，静脉内给药是3.98)。相反，给药后1-4小时，与静脉内给药相比，腹膜内给药后的排泄动力学较快(腹膜内给药为4.6μM/小时，静脉内给药为0.97μM/小时)。这些数据证实当通过静脉内或腹膜内途径给予时，游离状态的HMC是高度生物可利用的。与口服PK数据相关联，这些数据也提示HMC易于被GI解毒酶快速除去。在0.5、1和4小时收集的尿液中观察到高浓度的游离HMC(3.3mM、3.9mM和0.093mM)。

表4.以50mg/kg剂量静脉内和腹膜内给予20％羟丙基β环糊精配制的HMC后，血清中HMC的药物动力学分布情况比较。插页显示HMC的血清浓度。

3.5.体内效力的先驱研究-携带HPAC肿瘤的小鼠

与载体对照相比，在治疗期间每日腹膜内给予100mg/kg的HMC显著减缓了HPAC肿瘤增殖(图5)。在评估平均最终肿瘤质量时，也注意到最终肿瘤边界(％T/C＝62)显著降低(图6)。重要的是，如体重丧失测定的那样，每日以100mg/kg给予HMC15日的动物中未见毒性迹象。与对照相比，用HMC治疗的动物确实显示生长茁壮(图7)。收集器官(肝脏、肾脏、脾脏、股骨、胃和结肠)并递交至Rothwellconsulting进行组织病理学评估。也进行了限制性血清生物化学分析。这些数据证实HMC在体内显示对HPAC肿瘤的抗肿瘤生成活性。

3.5.1.HMC治疗组的组织病理学检查

对从两系列实验小鼠的福尔马林固定组织上切下的苏木精和曙红染色切片进行了组织病理学检查。检查肝脏、肾脏、胃和结肠的毒性破坏证据。检查脾脏和骨髓的骨髓抑制证据和肿瘤的坏死程度。按照存在的坏死程度给各肿瘤样品分配0-5的评分，0分表示无坏死，5分表示全部坏死。在两个分开的场合对切片作“盲法”评分，结果所示的最终评分是此两次种评分的平均值。

表5.HMC毒理学

3.5.1.1.结果小结

在从药物治疗的小鼠组织上切下的切片中未检测到毒性或骨髓抑制的证据。然而，所有药物治疗的小鼠都具有影响浆膜和相连的肠系膜的片状轻微/中等严重的慢性炎性变化，以及在所检查的一些组织中间皮细胞有反应性变化。这些变化与由于腹膜内注射了轻微刺激性物质相符。

在对照样品中，1/8和1/11未检测到肿瘤组织明显坏死。然而，药物治疗小鼠的肿瘤切片中有相当坏死。

3.5.1.2.与对照相比，HMC治疗小鼠的血清生物化学

评估了HMC治疗的与对照动物中的碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸转移酶(ALT)和肌酸(Cre)。ALP和Cre水平与对照类似，处于正常范围内(对于大鼠)，然而载体对照和HMC治疗组的ALT水平远低于不治疗对照组水平。

表6.与对照相比，HMC治疗小鼠的血清生物化学

*对于大鼠

ALP：性磷酸酶

ALT：丙氨酸转移酶

Cre：肌酸

3.6.HMC诱导黑色素瘤细胞和正常成纤维细胞凋亡

3.6.1.黑色素瘤

接触HMC24和48小时，最低2μM浓度的HMC能在所有TRAIL-敏感和耐受的黑色素瘤细胞中诱导凋亡(约7-10％凋亡)(表7和图8A)。以4μM的临床有意义药物浓度，TRAIL敏感(MEL-RM)和TRAIL阴性(IGR3)细胞系中与HMC接触24小时后凋亡细胞的发生率分别升至25％和39％(表7和图8A)。在其它细胞系中，接触4μM的HMC24小时后诱导凋亡的发生率是约9％。相比之下，接触4μM浓度DHE处理，24小时后细胞凋亡发生率是0-1％。在检查的所有细胞系中，接触同一浓度的HMC(4μM)在48小时后凋亡发生率升至21-42％(表7和图8B)。DHE是以4μM浓度接触48小时后唯一能诱导中等水平凋亡的其它药物，但只在ME4405(14％)和Mel-AT(15％)细胞系中有效(表7和图8B)。

表7.用DHE和HMC处理24和48小时黑色素瘤细胞的凋亡发生率小结

3.6.2.正常成纤维细胞

利用8μM的DHE或HMC接触24和48小时研究对正常成纤维细胞(MRC-5)和TRAIL-敏感黑色素瘤细胞(ME4405和MEL-RM)的作用(图9)。这些数据显示接触HMC24和48小时在两种黑色素瘤细胞系中均诱导了显著水平的凋亡，GHE(诱导凋亡的)程度较低。重要的是，尽管促进了恶性肿瘤细胞的程序性细胞死亡，但接触24和48小时正常成纤维细胞显示对8μM HMC和DHE药物诱导的凋亡(耐受)。这些数据证实HMC对于癌细胞有选择细胞毒性。

与DHE相比，本发明异黄酮化合物对所测试的所有癌症显示了优越的效力分布状态。虽然在NFF和RK细胞中，HMC比DHE的毒性略高，但是HMC的毒性明显低于顺式铂氨。与DHE相比，小鼠口服递送HMC的生物利用度较低，但游离HMC：总HMC的比值较高。HPBCD配制的游离形式HMC在静脉内和腹膜内递送时具有显著的生物利用度。腹膜内递送后游离的HMC的有意义血清浓度是口服递送的HMC的约18倍。已证明用20％HPBCD配制的经腹膜内递送的HMC在体内对HPAC肿瘤有中等抗肿瘤生成活性。当以100mg/kg递送至小鼠时，通过组织病理学(方法)测定HMC对大多数器官无毒性，然而，所有药物治疗的小鼠具有影响浆膜和相连的肠系膜的片状轻微/中等严重的慢性炎性变化，以及在所检查的一些组织中间皮细胞有反应性变化，这些变化与由于腹膜内注射了轻微刺激性物质相符。

接触HMC24和48小时后，HMC能在TRAIL-耐受和TRAIL-敏感的黑色素瘤细胞中诱导适中等强度水平的凋亡。正常成纤维细胞在接触DHE48小时后能耐受凋亡，DHE在TRAIL-耐受和TRAIL-敏感的黑色素瘤细胞中能诱导轻度中等水平的凋亡。正常成纤维细胞在接触48小时后能耐受凋亡。HMC和DHE都能诱导胱冬酶阴性细胞凋亡，提示操作性非固有程序性细胞死亡途径不是HMC和DHE介导凋亡所必需的。

3.7.体外，HMC与顺式铂氨、紫杉醇和吉西他滨、喜树碱、拓扑替康和阿霉素联用对癌细胞的协同毒性

3.7.1.HMC与顺式铂氨联用抗MM200黑色素瘤细胞系

评估了HMC与顺式铂氨联合接触5天或顺次接触(HMC→顺式铂氨)5天对MM200黑色素瘤细胞系的协同作用。由于(测定的)HMC毒性是单一疗法的，难于利用IC50变化作为协同作用的衡量来评估协同毒性(表8)。数据的3D分析显示采用5-天联合方案只有加和毒性明显(图11)。采用HMC→顺式铂氨序次(各化合物顺次接触24小时)方案进一步评估联用HMC-顺式铂氨对黑色素瘤细胞系MM200有协同作用的证据。利用IC50的变化来评估协同作用时，注意到2μM浓度的HMC明显使MM200细胞对顺式铂氨化疗敏感性提高1000倍以上(表8)。利用数据的3D分析证实HMC诱导了MM200细胞对顺式铂氨化疗敏感(图11B)。这些数据证明HMC能使癌细胞(以黑色素瘤为例)对顺式铂氨化疗敏感。

表8.HMC和顺式铂氨之间对Mel-RM黑色素瘤细胞系协同作用的比较性评

估。显示了作为单一疗法或联用时评估的各药物平均IC50数据

3.7.2HMC与吉西他滨联用抗Mel-RM黑色素瘤细胞

评估了HMC与吉西他滨联合接触5天或顺次接触(HMC→吉西他滨)5天对Mel-RM黑色素瘤细胞系的协同作用。由于(测定的)HMC毒性是单一疗法的，难于利用IC50变化作为协同作用的衡量来评估协同毒性(表9)。数据的3D分析显示采用5-天联合方案未引发对Mel-RM细胞系的协同毒性。采用HMC→吉西他滨顺次(各化合物顺次接触24小时)方案进一步评估联用HMC-吉西他滨对黑色素瘤细胞系Mel-RM有协同作用的证据。利用IC50的变化来评估协同作用时，注意到2和1μM浓度的HMC明显使Mel-RM细胞对吉西他滨化疗敏感性提高1000倍以上。利用数据的3D分析证实HMC诱导了Mel-RM细胞对吉西他滨化疗敏感。这些数据证明HMC能使癌细胞对吉西他滨化疗敏感。

表9.HMC和吉西他滨之间对Mel-RM黑色素瘤细胞系协同作用的比较性评估。显示了作为单一疗法或联用时评估的各药物平均IC50数据

3.7.3HMC与紫杉醇联用抗4405黑色素瘤细胞系

评估了HMC与紫杉醇联合接触5天或顺次接触(HMC→紫杉醇)5天对4405黑色素瘤细胞系的协同作用。由于(测定的)HMC毒性是单一疗法的，难于利用IC50变化作为协同作用的衡量来评估协同毒性(表10)。与紫杉醇单一疗法相比，注意到联用实验中IC50降低了30倍。然而，数据的3D分析显示采用5-天联合方案未引发对4405细胞系的协同毒性。采用HMC→紫杉醇顺次(各化合物顺次接触24小时)方案进一步评估联用HMC-紫杉醇对黑色素瘤细胞系4405有协同作用的证据。利用IC50的变化来评估协同作用时，注意到2μM浓度的HMC明显使4405细胞对紫杉醇化疗敏感性提高1000倍以上(表10)。利用数据的3D分析证实HMC诱导了MM200细胞对紫杉醇化疗敏感。这些数据证明HMC能使癌细胞对紫杉醇化疗敏感。

表10.HMC和紫杉醇之间抗4405黑色素瘤细胞系协同作用的比较性评估。显示了作为单一疗法或联用时评估的各药物平均IC50数据

3.7.4HMC与拓扑替康联用抗MM200黑色素瘤细胞系

评估了HMC与拓扑替康联合接触5天或顺次接触(HMC→拓扑替康)5天对MM200黑色素瘤细胞系的协同作用。由于(测定的)HMC毒性是单一疗法的，难于利用IC50变化作为协同作用的衡量来评估协同毒性(表8)。数据的3D分析证实5-天联合方案未引发对MM200细胞系的协同毒性。采用HMC→拓扑替康顺次(各化合物顺次接触24小时)方案进一步评估联用HMC-吉西他滨对黑色素瘤细胞系MM200有协同作用的证据。利用IC50的变化来评估协同作用时，注意到2μM浓度的HMC明显使MM200细胞对拓扑替康化疗敏感性提高1000倍以上(表11)。利用数据的3D分析证明HMC诱导了MM200细胞对拓扑替康化疗敏感。这些数据证明HMC能使癌细胞对拓扑替康化疗敏感。从3D分析可知2μM HMC和1-0.1μM之间的拓扑替康联用抗MM200黑色素瘤细胞系最佳。

表11.HMC和拓扑替康之间抗MM200黑色素瘤细胞系协同作用的比较性评估。显示了作为单一疗法或联用时评估的各药物平均IC50数据

3.7.5HMC与喜树碱联用抗Mel-RM黑色素瘤细胞系

评估了HMC与阿霉素联合接触5天或顺次接触(HMC→阿霉素)5天对Mel-RM黑色素瘤细胞系的协同作用。由于(测定的)HMC毒性是单一疗法的，难于利用IC50变化作为协同作用的衡量来评估协同毒性(表12)。数据的3D分析证明5-天联合方案未引发对Mel-RM细胞系的协同毒性，注意到确实有拮抗作用的证据。采用HMC→阿霉素顺次(各化合物顺次接触24小时)方案进一步评估联用HMC-阿霉素对黑色素瘤细胞系Mel-RM有协同作用的证据。利用IC50的变化来评估协同作用时，注意到2μM浓度的HMC明显使Mel-RM细胞对喜树碱化疗敏感性提高约12倍(表12)。然而，数据的3D分析显示HMC和阿霉素之间抗Mel-RM细胞协同作用的程度显著。这些数据证明HMC能使癌细胞对紫杉醇化疗敏感。从3D分析可知2μM HMC和1-0.1μM之间的阿霉素联用对MM200黑色素瘤细胞系最佳。

表12.HMC和阿霉素之间抗Me1-RM黑色素瘤细胞系协同作用的比较性评估。显示了作为单一疗法或联用时评估的各药物平均IC50数据

3.8利用化合物4、6和7抑制小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的TNFα

在补加了FCS、2mM谷氨酰胺和50U/ml青霉素/链霉素的DMEM中培养小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7。从培养瓶上轻柔地刮下亚汇合的细胞，以5×10⁵个细胞每孔接种于24-孔板，使之黏附1小时。用测试药物(0.025％DMSO配制)或只用载体处理细胞，1小时后加入50ng/ml LPS。培育16小时后，收集培养液并保存于-80℃用于酶免疫定量测定(Becton Dickinson)检测TNFα。

检验了本发明化合物6和7，结果见图12，这些结果表明所检验的化合物在所检验的浓度范围能以剂量依赖性方式抑制小鼠巨噬细胞的TNFα。

化合物6、7与另一种化合物4的原始数据见下表13。

表13.化合物4、6和7抑制小鼠巨噬细胞的TNFα

 

浓度(μM)	化合物6	化合物7	化合物4
				10	-48.7	-26.2	-6.1
1	-13.0	-25.4	-11.9
				0.1	-10.4	-1.4	-6.3

 

0.001	1.0	19.2	-14.3
				0.01	-	-	-11.3

3.9.HHC作为化疗敏化剂的评估

利用一组常规用于治疗癌症的细胞毒性药物来筛选HHC能否作为化学敏化剂来抵御代表各种癌症适应症的一组细胞系。发现HHC能使病理学不同的癌症细胞系(卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌以及胶质瘤)对吉西他滨化疗强烈敏感(表14)。发现用HHC：顺式铂氨对卵巢癌和前列腺癌有强烈协同作用，对结肠直肠癌细胞系有轻微协同作用，对胰腺癌和胶质瘤未见协同作用。发现用HHC：紫杉醇对卵巢癌和直肠结肠癌以及黑色素瘤细胞系有中等协同作用。发现联用HHC：紫杉醇对卵巢癌和胶质瘤细胞系有模糊协同作用，未见对前列腺癌和胰腺癌细胞系有协同作用的证据。数据显示HHC能使MM96L细胞系对顺式铂氨、脱羧铂氨和氨烯咪胺化疗强烈敏感(表7)。

表14.用一组癌细胞系和标准细胞毒性药物评估作为化疗敏化剂的HHC

关键词：SSSSS＝协同

MS＝中等协同

n.o.＝未观察到

-＝未测试

3.10.DHE、HMC和HHC抗所选择的黑色素瘤细胞系的效力

与DHE相比，HMC和HHC均显示了抵御各种黑色素瘤细胞系的优秀抗癌症活性。HHC是对目前测试到的所有黑色素瘤细胞系最有效的药物，其IC50值小于1μM(表15)。

表15.DHE、HMC和HHC抗黑色素瘤单一疗法的比较

4.0对LPS激活的小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的效力

在补加了胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和50U/ml青霉素/链霉素的DMEM中培养小鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7。从培养瓶上轻柔地刮下亚汇合的细胞，以5×10⁵个细胞每孔接种于24-孔板，使之黏附1小时。然后用10μM浓度的测试化合物(0.025％DMSO配制)或只用载体处理细胞，培育1小时。然后加入50ng/ml LPS(LPS-Sigma-Aldrich)。培育16小时后，收集培养液并保存于-80℃用于酶免疫定量测定检测内生性荷尔蒙(ecosanoid)(PGE2和TXB₂-Cayman Chemical)。

表16.与只用载体培育相比，用10μM测试化合物培育后类十二烷酸合成的变化百分比。正值表示合成增强；负值表示合成抑制，因此提示有抗炎性活性。

 

化合物	PGE2	TXB2
			1	-33.8	0
2	-12.6	16
			6	-37.7	-16.4
11	27.2	51.4

为使读者能实施本发明而无需过多实验，本文参考某些优选的实施方案描述了本发明。然而，本领域普通技术人员不难理解可在一定程度上可改变或修饰许多组分和参数而不脱离本发明的范围。此外，给予名称、标题等是为了便于读者理解本发明，不应理解为限制了本发明的范围。

本文引用的所有申请、专利和出版物(如果有的话)均全文纳入本文作为参考。

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本说明书中的参考文献不是，也不应理解为承认或以任何形式提示现有技术构成所从事领域的公知知识。

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Claims (16)

1.一种通式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：

式中

R₁是氢，

R₂和R₃独立为氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、卤素或OC(O)R₇，例外是R₂和R₃不都是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、氨基、C_1-4-烷基氨基或二(C_1-4-烷基)氨基、OC(O)R₇或OR₈，

R₇是氢、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、苯基、苄基或氨基，和

R₈是苯基或苄基，和

R₉是氢、羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-6环烷基或卤素。

2.一种式(I-a)所示化合物

式中

R₁是氢，

R₂和R₃独立为氢、羟基、C_1-6烷氧基、卤素或OC(O)R₇，例外是R₂和R₃不都是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、OC(O)R₇、氨基，和 

R₇是氢、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、苯基、苄基或氨基。

3.如权利要求2所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₁是氢，

R₂和R₃独立为氢、羟基、C_1-4-烷氧基、卤素或OC(O)R₇，条件是R₂和R₃不都是氢，

R₄、R₅和R₆独立为氢、羟基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基、C_3-6环烷基、OC(O)R₇，和

R₇是C_1-4-烷基、苯基或苄基。

4.如权利要求3所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₁是氢，

R₂和R₃独立为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、溴、氯、氟或乙酰氧基，例外是R₂和R₃不均是氢，

R₄是氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或乙酰氧基，和

R₅和R₆独立为氢、羟基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基或乙酰氧基。

5.如权利要求4所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，

R₁是氢，

R₂和R₃独立为氢、羟基、甲氧基、溴或乙酰氧基，除了R₂和R₃不都是氢，

R₄和R₆独立为氢、羟基、甲氧基或乙酰氧基，和

R₅是氢。

6.一种如权利要求1所述选自以下的化合物：

3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-苯基苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(3，4-二甲氧基苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(4-甲基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(2，6-二甲氧基-4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(2-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(3-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-溴苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；

3-(4-羟苯基)-4-(3-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇； 

3-(4-羟苯基)-4-(3-氨基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；和

3-(4-羟苯基)-4-(4-苯氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇。

7.一种如权利要求6所述选自以下的化合物：

3-(4-羟苯基)-4-(4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇；和

3-(4-羟苯基)-4-(4-羟苯基)苯并二氢吡喃-7-醇。

8.一种化合物，它是3-(4-羟苯基)-4-(3-酰基-2-羟基-4-甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-7-醇。

9.一种制备如权利要求2所述式(I-a)所示化合物的方法，包括使式(II)所示化合物的4-酮基与芳基化试剂W^-M⁺反应从而形成式(III)所示中间体叔醇或其盐，该中间体脱水形成式(IV)所示化合物，然后氢化并任选脱保护以形成式(I)所示化合物：

其中式(II)所示化合物为：

式(II)中

R₁是C_1-6烷基或Si(R₁₀)₃，

R₂和R₃独立为氢、C_1-6烷氧基、卤素或OSi(R₁₀)₃，例外是R₂和R₃不都是氢，

R₁₀独立为C_1-6烷基或苯基，

所述芳基化试剂中

W选自以下基团：

其中R₄、R₅和R₆如权利要求1中所定义， 

M⁺是一个或多个抗衡离子，

式(III)所示中间体叔醇为：

式(IV)所示化合物为：

10.如权利要求9所述的方法，其中，M⁺是[MgBr]⁺。

11.一种或多种权利要求1-8中任一项所述式(I)或(I-a)所示化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症或肿瘤块的药物中的应用。

12.如权利要求11所述的应用，所述癌症或肿瘤块是上皮来源，间充质来源或神经来源的。

13.如权利要求11所述的应用，所述癌症或肿瘤块选自前列腺、卵巢、子宫颈、乳腺、胆囊、胰腺、结肠直肠、肾脏和非小细胞肺癌。

14.如权利要求11所述的应用，所述癌症或肿瘤块选自黑色素瘤、间皮瘤和肉瘤癌。

15.如权利要求11所述的应用，所述癌症或肿瘤块是神经胶质瘤癌。

16.一种药物组合物，其包含与一种或多种药物载体、赋形剂、辅助剂和/或稀释剂联合的一种或多种权利要求1-8中任一项所述式(I)或(I-a)所示化合物或其药学上可接受的盐。 

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