CN101081863A - 脂多糖结合蛋白和其单克隆抗体、以及制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂多糖结合蛋白和其单克隆抗体、以及制备方法和用途。通过从人肝细胞中提取编码NH－LBP的cDNA片段，采用昆虫sf21细胞制备了NH－LBP蛋白，并通过pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌体抗体库，以NH－LBP为抗原进行了筛选，从而制备了抗NH－LBP人源单克隆抗体Fab抗体，以及dsFv抗体。该Fab抗体以及dsFv抗体能特异性地与人完整脂多糖结合蛋白的N端结合，竞争性地抑制了LBP与LPS的结合，使得机体对LPS的敏感性下降，降低LPS导致的过度炎症反应，并促进机体对LPS的降解，从而抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛细血管内凝血、多脏器衰竭的发生。

Description

脂多糖结合蛋白和其单克隆抗体、以及制备方法和用途

技术领域

本发明涉及发明涉及基因重组工程，特别是涉及脂多糖结合蛋白及其单克隆抗体、以及脂多糖结合蛋白及其单克隆抗体的制备方法和用途。

背景技术

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)，是主要由肝细胞(肾近曲小管上皮细胞、肺泡壁II型细胞也可少量合成)产生的一种介导内毒素与靶细胞受体结合的急性期应激反应蛋白，它能显著促进脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)与单核/巨噬细胞膜表面的CD14(mCD14)结合，形成LPS-LBP-CD14复合物，经单核/巨噬细胞膜上的Toll-Like Receptor 4(TLR4)-Myeloid Differentiation Protein 2(MD-2)-MYD88识别复合物转导，再经多显性转录核因子(nuclear factor kappa B，NF-kappa B)向胞核内传递信号，激活单核-巨噬细胞，促进炎性因子的分泌及炎症的发生、发展，导致肝、肺、肾等重要脏器发生严重损害。

人脂多糖结合蛋白(LBP)基因全长28.5Kb，位于人染色体20q11.23-q12上，含有14个外显子，编码与脂多糖结合部位的基因位于第3、4外显子(即成熟完整LBP的N端区)，基因5′端含有急性期反应蛋白所共有的启动子急性期反应元件/信号传导转录活化3(APRE/STAT-3)，启动子与外显子之间还含有促炎症转录因子活化蛋白1(AP-1)和C/EBP转录因子，3′端为富含AATAAA的非编码区，因此LBP基因能在急性期被激活、分泌表达。成熟完整脂多糖结合蛋白的相对分子量(Mr)60kDa，其家族包括人脂多糖结合蛋白、杀菌通透性增强蛋白(Bactericidal Permeability-Increasing protein，BPI)、血浆胆固醇脂转移蛋白(Plasma Cholesteryl Ester Transfer Protein，CETP)、磷脂转移蛋白(phospholipid transfer protein，PLTP)等。脂多糖结合蛋白的N端在空间上形成两个无极性的脂性结合位点，为人脂多糖结合蛋白与脂多糖的结合点，人脂多糖结合蛋白与CD14的结合部位则位于脂多糖结合蛋白的C-末端。

脂多糖结合蛋白能显著的促进脂多糖与mCD14结合，Nanbo等人发现人脂多糖结合蛋白可将机体对脂多糖识别的敏感度提高1000倍，在炎症急性反应早期，当血清脂多糖浓度相对较低时，就已有微量脂多糖结合蛋白参与，并且只有在脂多糖结合蛋白存在情况下机体才能对小剂量的脂多糖或细菌产生反应，从而增强机体抗感染作用，但在急性炎症反应中后期，当血清脂多糖结合蛋白含量升高时，脂多糖结合蛋白会导致单核/巨噬细胞过度活化，大量分泌白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子，这些因子又强烈地加速脂多糖结合蛋白基因的转录和脂多糖结合蛋白多肽的合成，进而导致机体严重损害，出现感染性休克、弥漫性毛细血管内凝血(DIC)、多脏器衰竭(MOF)(见Eur J Biochem 1999，260(1)：183-191)等，因此如何抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛细血管内凝血、多脏器衰竭的发生已成为当今临床工作中的一个重要研究方向。

现有技术认为患者血液中脂多糖结合蛋白浓度可作为判断损伤、预后的一个重要参考指标，如急性重度胰腺炎患者血液中脂多糖结合蛋白浓度会明显升高，并且脂多糖结合蛋白浓度越高，机体损伤越重、预后越差，Berner发现在新生儿发生败血症早期，脐血或外周血中脂多糖结合蛋白水平升高显著，并持续达24h以上，因此可将脂多糖结合蛋白水平作为指标监测新生儿感染是否加重(Clin-Diagn-Lab-Immunol，2002，9：440-445)。Uesugi等人进一步发现脂多糖结合蛋白能加重酒精对肝脏的损害(见J-Immunol，2002，168：2963-2969.)，这是因为酒精导致肝细胞中脂多糖结合蛋白、CD14的含量升高，从而对脂多糖的损伤更敏感。如何对应脂多糖结合蛋白在机体内变化规律，使得在一定浓度水平下不会导致过度炎症反应的损害，也成为当今临床工作中需要解决的一个重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种脂多糖结合蛋白氨基端片段；

本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体；

本发明所要解决的技术问题之三在于提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体；

本发明所要解决的技术问题之四在于提供一种脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法；

本发明所要解决的技术问题之五在于提供一种一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法；

本发明所要解决的技术问题之六在于提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的制备方法；

本发明所要解决的技术问题之七在于提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体和dsFv抗体的应用；

本发明所要解决的技术问题之八在于提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体和dsFv抗体的应用(与之七重复，应去除)。

为实现本发明目的而提供的一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，编码所述脂多糖结合蛋白氨基端片段的DNA序列为：

Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgc

caaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcccaggaggggctattagctctgcag

agtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatga

gttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtct

cagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctccttt

gatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggcccacagttact

gcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttc

cacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctcc

gatcatcagccttattctcaaactctg

其中，下划线区为编码信号肽序列；以基因数据库上脂多糖结合蛋白序列为标准，发生点突变的有：G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。

为实现本发明目的还提供一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，所述脂多糖结合蛋白氨基端片段的氨基酸序列为：

MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLAL

QSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLS

LSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVT

ASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVS

SDHQPYSQTL

其中，下划线区为信号肽的序列；以基因数据库上脂多糖结合蛋白氨基酸序列为标准，发生点突变的有：L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。

为实现本发明目的还提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，所述Fab抗体轻重链VL和VH的可变区基因序列及氨基酸序列如下：

轻链VL的基因序列为κ轻链：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC CTG ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

重链V_H的基因序列为VH3亚群：

GGA GGC TTA GTT CAA CCG GGG GGG TCA CTT ACA CTC TCC TGT GCA GCA TCT

GGA TTC CCA TTC AGT  ACG TAC TGG ATG CAC TGG GTC CGT CAA GGT CCA GGG

AAG CGG CCG GTG TGG GTC TCT  CGT GTC CAC AGT GAA GGG AGT GCC CGA AGT

TAC GCG GGC GCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGG GAC AAC GCC AGG

AAC ACC GTC TAT CTG CAG ATG AAT AGT CTG ACA GAC GAA GAC ACG GGT GTC

TAT TAT TGT GCG AGA

对应氨基酸序列为：

GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVSRVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDN

ARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR

其中，下划线为CDRS区。

为实现本发明目的还提供了一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体，所述dsFv抗体轻链rVL的可变区基因序列及氨基酸序列为：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC TGT ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

其中，下划线为CDRS区。

为实现本发明目的而提供的一种脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法，提取编码脂多糖结合蛋白氨基端片段的cDNA序列，通过病毒表达系统，采用细胞制备了脂多糖结合蛋白氨基端片段。

所述病毒表达系统为BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统；所述细胞为昆虫sf21细胞。

所述的脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法，具体包括下列步骤：

从感染休克死亡患者的肝细胞内提取信使RNA(mRNA)，逆转录为cDNA文库，以特异引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′扩增出编码人脂多糖结合蛋白氨基端片段的双链DNA序列，并与pMD19-T Simple Vector连接，转入感受态DH-5a菌中；

测试正确后以Sal I、HindIII行双酶切，目的序列回收、纯化，并与相同酶处理的载体pFASTBAC连接，构建质粒pFASTBAC-NH-LBP；

将pFASTBAC-NH-LBP转入DH10BAC菌中，通过基因转位，构建穿梭质粒pBacmid-NH-LBP，在测序正确后，将pBacmid-NH-LBP感染昆虫细胞sf21，则sf21细胞释放出编码脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白的病毒颗粒；

以病毒颗粒感染对数生长期的sf21细胞，在无血清培养基Sf900 II SFM表达脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白质，并脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白质以TALON柱芯进行梯度亲和纯化，得到脂多糖结合蛋白氨基端片段。

为实现本发明目的还提供了一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法，所述建立噬菌体抗体库，以脂多糖结合蛋白氨基端片段为抗原进行了筛选，制备抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体。

所述建立噬菌体抗体库，具体包括下列步骤：

从健康志愿者的外周血中分离获得单核细胞，从单核细胞中提取DNA序列，分别以7对引物扩增编码抗体重链IgVH的可变区序列、4对引物扩增编码抗体轻链IgVκ的可变区序列、5对引物扩增编码抗体轻链IgVλ的可变区序列，分别以Sac I+Xba I、Xho I+Spe I消化，以pComb3H噬菌粒为载体，于XL1-Blue杆菌内建立了人源噬菌体抗体文库Fab。

所述以脂多糖结合蛋白氨基端片段为抗原进行了筛选，具体包括下列步骤：

将脂多糖结合蛋白氨基端片段作为抗原包被酶联板，洗板后加入噬菌体抗体库，结合后洗板，然后洗下已结合的噬菌体，重新感染XL1-Blue菌并扩增抗体库，扩增的噬菌体抗体库进行下一轮的筛选。

所述制备抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，具体包括下列步骤：

通过聚合酶链式反应法，从阳性单克隆菌株的pComb3H中，将编码抗体轻重链的VH和VL分别扩增出，分别置于载体pET-30a(+)，构建表达质粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分别电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达，将表达的VH和VL多肽以TALON亲和纯化后，进行共同复性、折叠，形成Fab抗体。

为实现本发明目的还进一步提供一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的制备方法，在抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因密码子，构建基因序列rVL，然后将改变的rVL序列置于载体pET-30a(+)中，构建表达质粒pET-30a(+)-rVL，并电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达并纯化而制备。

所述在抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因密码子，是通过应用mega-primer PCR方法而实现的。

为实现本发明目的而提供的一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体在制备治疗炎症药物中的应用。

所述炎症为烧伤肠源性感染或者菌痢等G-杆菌所致的感染。

为实现本发明目的而提供的一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体在制备治疗炎症药物中的应用。

所述炎症为烧伤肠源性感染或者菌痢等G^-杆菌所致的感染。

为实现本发明目的而提供的一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体在制备检测体内脂多糖结合蛋白水平的药物中的应用。

为实现本发明目的还提供了一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体在制备检测体内脂多糖结合蛋白水平的药物中的应用。

为实现本发明目的而提供的一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，所述药物中包括如权利要求3中所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，并混合一种或一种以上医药上可接受的载体或添加剂。

为实现本发明目的还提供了一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，所述药物中包括如权利要求4中所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体，并混合一种或一种以上医药上可接受的载体或添加剂。

本发明的有益效果是：本发明通过从人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)入手，从人肝细胞中提取编码NH-LBP的cDNA片段，采用昆虫sf21细胞制备了NH-LBP蛋白，并通过pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌体抗体库，以NH-LBP为抗原进行了筛选，从而制备了抗NH-LBP人源单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)：Fab抗体，以及dsFv抗体。该Fab抗体，以及dsFv抗体能特异性地与人完整脂多糖结合蛋白的N端结合，从而竞争性地抑制了脂多糖结合蛋白与脂多糖的结合，使得机体对脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖导致的过度炎症反应，并促进机体对脂多糖的降解，从而抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛细血管内凝血、多脏器衰竭的发生。

附图说明

图1A是昆虫sf21细胞培养照片图；

图1B是昆虫sf21细胞分泌表达NH-LBP照片图；

图2是用TALON(针对6×His)柱芯对NH-LBP多肽的亲和纯化图；

图3是TALON亲和纯化NH-LBP蛋白质的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果图；

图4是人源噬菌体抗体库的构建及酶切鉴定结果图；

图5是人源噬菌体抗体库结构图；

图6是构建Fab抗体时所扩增的轻重链基因(VH和VL)图；

图7是用TALON(针对6×His)柱芯对轻链蛋白质片段VL的亲和纯化结果图；

图8是TALON亲和纯化轻重链蛋白质片段(VL和VH)的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果图；

图9是生理盐水对照组、dsFv抗体治疗组或Fab抗体治疗组、LPS注射损伤组体内活性检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明的脂多糖结合蛋白及其单克隆抗体、以及脂多糖结合蛋白及其单克隆抗体的制备方法和用途进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明涉及基因重组工程，特别是利用真核表达系统表达人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)、原核表达系统构建人源抗体库及抗NH-LBP单克隆抗体的的制备方法和用途。

针对如何抑制脂多糖(LPS)诱导的过度炎症反应，对信号传导途径，包括多显性转录核因子(nuclear factor kappa B，NF-kappa B)等信号的传递途径进行了分析，发现若抑制传递途径的多显性转录核因子，则将导致细胞的其它功能改变，因此不能对多显性转录核因子进行抑制。同时在分析中也发现人体内脂多糖的清除是不需要脂多糖结合蛋白参与的，并且脂多糖结合蛋白与脂多糖的结合并不会促进机体对脂多糖的降解，不会降低脂多糖导致的过度炎症反应的发生，因此机体内有无脂多糖结合蛋白发挥生物学功能，对脂多糖在体内的清除无明确影响。

所以本发明从人脂多糖结合蛋白氨基端片段(N-terminal fragment ofhuman lipopolysaccharide-binding protein，NH-LBP)入手，从人肝细胞中提取编码NH-LBP的cDNA片段，通过BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统(BAC-TO-BAC baculovirus expression system，NO 10359016，购自Invitrogen公司。它利用辅助质粒helper plasmid、转座载体pFastBac 1(HT)系列和含有杆状病毒AcNPV全基因组的穿梭载体Bacmid共同进行重组病毒的筛选)，采用昆虫sf21(NO 11497-013，购自GIBCO公司)细胞制备了NH-LBP蛋白，并通过pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌体抗体库，以NH-LBP为抗原进行了筛选，从而制备了抗NH-LBP人源单克隆抗体mAb。

抗NH-LBP人源单克隆抗体mAb能特异性地与人完整脂多糖结合蛋白的N端结合，从而竞争性地抑制了脂多糖结合蛋白的与脂多糖的结合，使得机体对脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖导致的过度炎症反应，并促进机体对脂多糖的降解。

(代理人理解，为了使本领域技术人员能够理解本发明的制备过程，对制备过程中使用的仪器设备，烦请发明人尽可能说明其制备仪器的名称和来源，特别是购自国外的专用仪器，应当予以说明，本方法中，所用仪器不多，但很多载体及菌株购自国外，现已列出)

实施例一：人脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备及鉴定：

(11)获得编码人NH-LBP的cDNA序列，并构建表达病毒：

从感染休克死亡患者的肝细胞内提取信使RNA(mRNA)，逆转录为cDNA文库，以特异引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′扩增出编码人NH-LBP的双链DNA序列，并与pMD19-T Simple Vector连接，转入感受态DH-5a菌中，测试正确后以Sal I、Hind III行双酶切，目的序列回收、纯化，并与相同酶处理的载体pFASTBAC连接，构建质粒pFASTBAC-NH-LBP。将pFASTBAC-NH-LBP转DH10BAC菌中，通过基因转位，构建穿梭质粒pBacmid-NH-LBP，测序正确后，将pBacmid-NH-LBP感染昆虫细胞sf21，则sf21细胞释放出编码目的蛋白的病毒颗粒，通过病毒空斑实验，测定病毒效价(滴度)。

具体方法过程如下：

111)从感染休克死亡患者的肝组织内分离肝细胞，按常规方法使用RNA提取试剂盒(TRIzol reagent)提取肝细胞内RNA序列，使用RT-PCR的随机引物(random 9 mers，RNA PCR kit，购自TaKaRa公司)逆转录为cDNA序列。合成引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′含Sal I酶切位点，5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′含HindIII酶切位点。

112)以如下条件进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)：

cDNA库5ng，引物各1μL(浓度20μmol/l)，Ex Taq酶0.3μL(浓度5mmol/L)，MgCl2 4μL，dNTP(各浓度2.5mmol/L)5μL，加水至总体积50μL。

113)按如下扩增条件进行扩增：

扩增条件：94℃预变性5min，此后94℃ 45s，54℃ 45s，72℃ 2min，30个循环，72℃延伸5min。PCR产物10g/L凝胶电泳，可见扩增出长约695bp的片段。

114)将聚合酶链式反应的产物切下，采用硝酸纤维吸附纯化及去离子水溶解，并与pMD19-T Simple Vector连接。连接条件为：PCR片段0.3pmol，PMD19-T Simple Vector 1μl，Ligation Mix 5μl，无菌去离子水补足体积10μl，在16℃连接3小时，加入100ul DH-5a感受态细胞，铺于含有0.04mg/mlX-gal、0.024mg/ml IPTG的LB平板上进行蓝白斑筛选。

115)挑取白色菌落，在LB(Lactose Broth)培养基(含Amp20ug/ml)中培养，抽提质粒，进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定。

116)如果序列正确，无移码突变的质粒，则进行Sal I、HindIII双酶切，并以相同方法酶切的pFASTBAC载体连接，构建质粒pFASTBAC-NH-LBP，质粒转入DH-5a感受态细胞内，铺于含有Amp40ug/ml的LB培养基平板上进行抗性筛选。

117)挑取菌落、扩增、提取质粒并进行基因序列测定。将2ng质粒pFASTBAC-NH-LBP与100μl DH10BAC感受态细胞混匀，进行热休克转然，铺于含有0.04mg/ml X-gal、0.024mg/ml IPTG、20ug/ml tet、20ug/ml Kan、20ug/ml gen的LB培养基平板上进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落，在LB培养基(含20ug/ml tet、20ug/ml Kan、20ug/ml gen)中培养，抽提质粒，然后再进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定，序列正确的即为穿梭质粒pBacmid-NH-LBP。

118)将10μl质粒pBacmid-NH-LBP与6μl CELLFECTIN(GIBCO)混匀，加入100μl Sf-900 II SFM(无血清培养基)，并加入对数生长期的昆虫细胞sf21中(3×106)，感染sf21细胞，培养72h后，其上清即含有重组病毒，将重组病毒重新感染sf21细胞，重新扩增2次，第3次扩增的病毒其空斑数为31×10^-6，感染复数为8，达到要求，并且基因序列测定正确。

119)病毒空斑实验的具体方法为：于6孔培养板内接种1×10¹⁶ sf21细胞，加入Grace培养基于28℃培养4-6hrs，此后每孔加入500uL不同稀释度的病毒，于28℃孵育1hrs后吸去病毒液，加入温度＜35℃的含Grace培养基的已融化1％低熔点琼脂糖凝胶，于28℃培养4-5days，每孔加入1mL0.03％中性红，28℃放置1-2hrs后吸出染色液，于28℃暗处放置2-3hrs，数出空斑数计算病毒滴度。

(12)进行NH-LBP制备表达、纯化：

以病毒颗粒感染对数生长期的sf21细胞，并于无血清培养基Sf900 II SFM表达目的蛋白质，目的蛋白质以TALON柱芯进行梯度亲和纯化，得到脂多糖结合蛋白氨基端片段。

如图1A，图1B所示，为昆虫sf21细胞培养及分泌表达NH-LBP照片图(其均为HE×100)；其中，图1A显示，昆虫细胞sf21在对数生长期，细胞大小均匀一致，胞浆透亮；而图1B显示，昆虫细胞sf21在感染病毒并表达NH-LBP 72h后，细胞大小不一，出现“巨细胞”，胞浆内见大量颗粒。

如图2所示为用TALON(针对6×His)柱芯对NH-LBP多肽的亲和纯化图；

其中，B峰、C峰、D峰为用10mmol/L、150mmol/L、300mmol/L的咪唑分别洗脱下的蛋白质吸收峰。

以第3次扩增病毒颗粒感染对数生长期的sf21细胞，在无血清培养基Sf900 II SFM中培养、表达目的蛋白质48～72h，此后将表达上清以TALON柱芯进行梯度亲和纯化，其条件为：平衡液1X PBS液(含100mmol/L NaCl、50mmol/L Na2HPO4.12H20及50mmol/L NaH2PO4.2H20，pH7.4)，洗脱A、B、C液分别为含10、150、300mmol/L Imidazole的1×PBS液。各个洗脱蛋白质峰分别回收、脱盐、冻干，得到脂多糖结合蛋白氨基端片段。

所获得编码NH-LBP的DNA序列为(其中下划线区为编码信号肽的序列)为：

Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgc

caaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcccaggaggggctattagctctgcag

agtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatga

gttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtct

cagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctccttt

gatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggcccacagttact

gcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttc

cacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctcc

gatcatcagccttattctcaaactctg

其中，以基因数据库(Genebank)上LBP序列为标准(NM_004139)，发生点突变的有：G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。

所获得的NH-LBP的氨基酸序列为(其中下划线区为信号肽的序列)：

MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLAL

QSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLS

LSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVT

ASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVS

SD LQPY LQTL

其中，以基因数据库(Genebank)上LBP氨基酸序列为标准(NM_004139)，发生点突变的有：L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。

(13)NH-LBP的鉴定：

利用Tricine-SDS-PAGE方法和毛细管电泳方法鉴定NH-LBP纯度。首先利用液相质谱测定NH-LBP分子量，利用流式细胞分选(FluorescenceActivated Cell Sorting，FACS)方法和生物传感器结合方法，鉴定NH-LBP与脂多糖(LPS)的结合力。

如图3所示为TALON亲和纯化NH-LBP蛋白质的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果图；

其中，1：蛋白质标记(97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KDa)；2：10mmol/L咪唑洗脱下的B峰；3：150mmol/L咪唑洗脱下的C峰；4：300mmol/L咪唑洗脱下的D峰；可见C峰内含有分子量约为27kDa的蛋白质带，经Westernblot鉴定，证明为NH-LBP蛋白质。

其具体过程如下：

131)将NH-LBP与完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混合，前后三次分别注入兔皮下，45天后取全血，制备血清。采用酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)方法，以NH-LBP为抗原，标96孔板，以不同稀释度的兔免疫血清为一抗，以HRP-鼠抗兔IgG抗体为二抗，以四甲基联苯胺(TMB)试剂为底物显色，测定血清抗体效佳，发现兔血清稀释到1∶6000和1∶10000时，仍能检测出抗原NH-LBP，初步证明NH-LBP具有较好的抗原性。

132)如图3所示，进行Tris-Tricine电泳及Western blot鉴定，从图中可以证明150mmol/L咪唑洗脱下的C峰中含有NH-LBP，其分子量为27KDa。然后以毛细管电泳鉴定NH-LBP纯度为97％，流式细胞分选方法实验和生物传感器结合实验证明NH-LBP与脂多糖的结合力，并且其结合力与人完整脂多糖结合蛋白相近。将NH-LBP注入兔皮下，测定血清抗体效价，然后用酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)方法，证明效价达1∶3000，初步证明NH-LBP具有抗原性。

实施例二：人源噬菌体抗体文库的制备

从健康志愿者的外周血中分离获得单核细胞，从单核细胞中提取DNA序列，分别以7对引物扩增编码抗体重链IgVH的可变区序列(Fd)、4对引物扩增编码抗体轻链IgVκ的可变区序列、5对引物扩增编码抗体轻链IgVλ的可变区序列，分别以Sac I+Xba I、Xho I+Spe I消化，以pComb3H噬菌粒为载体，于XL1-Blue杆菌内建立了人源噬菌体抗体文库Fab。

如图4所示为人源噬菌体抗体库的构建及酶切鉴定结果图，其中：

1：DNA标记(15000、10000、7500、5000、2500、1000、250bp)；

2：κbank containing pCOmb3H/SacI+XbaI(切下轻链基因序列)；

3：(κ+Fd)bank containing pCOmb3H/SacI+XbaI(切下轻链基因序列)；

4：(κ+Fd)bank containing pCOmb3H/XhoI+SpeI(切下重链基因序列)

所构建的抗体文库(含(κ+Fd)基因文库与(λ+Fd)基因文库)滴度为5.0×108菌落(colony forming units，CFU)。

在本实施例中，通过健康志愿者3名，各抽取外周全血约100mL，用淋巴单核细胞分离液离心(5000g)分离单个核细胞(Peripheral BloodMononuclear Cell，PBMC)，抽提单个核细胞的总RNA，再以随机引物逆转录为cDNA，最后以抗体轻重链引物分别进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到人源噬菌体抗体库，如图5所示。

具体方法过程如下：

(21)聚合酶链式反应所用引物，根据Kang等人(见Methods：CompanionMethods Enzymol，1991：2：111-120.)设计进行适当改动，即①扩增人IgVH基因5′的引物(含Xho I酶切位点)；②扩增人IgVH基因3′的引物(含SpeI酶切位点)；③扩增人Ig Vκ基因5′的引物(含Sac I酶切位点)；④扩增人Ig CKld基因3′的引物(含Xba I酶切位点)；⑤扩增人Ig Vλ基因5′的引物(含Sac I位点)；⑥扩增人Ig C L2基因3′的引物(含Xba I酶切位点)。补添的引物序列如下：

Human Heavy Chain Variable Domain 5’primer(含Xho I位点)

VH1a 5’-CAT CTG TAG  CTC GAG CAG TCT GGG-3’

VH1f 5’-CAT CTG TAG CTG  CTC GAG TCT GGG-3’

VH2f 5’-CAT CTG TAG CTA  CTC GAG TCG GG-3’

VH3a 5’-GAT CTG TAG  CTC GAG GAG TCT GGG-3’

VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG  CTC GAG TCT GGG-3’

VH4f 5’-CAT CTG TAG CTG  CTC GAG TCG GG-3’

VH6a 5’-CAT CTG TAG  CTC GAG CAG TCA GG-3’Human Heavy Chain Variable Domain 3’primer(含Spe I位点)

IgG15’-GTC AGT  ACT AGT TTT GTC ACA CGC TTT GGG-3’Human Kappa Chain(κ)Variable Domain 5’primer(含Sac I位点)

VK1a 5’-CGA ATC  GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’

VK1s 5’-CGA ATC  GAG CTC ACC CAG TCT CC-3’

VK2a 5’-CGA ATC  GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3’

VK3a 5’-CGA ATC  GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’

Human Kappa CK1d Constant Domain 3’primer(含Xba I位点)

5’-ACG GTG  TCT AGA ACT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA

CGG GCG AAC TCA G-3’

Human Lambda Chain(λ)Variable Domain 5’primer(含Sac I位点)

VL1 5’-AAT GTG  GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’

VL2 5’-TAT GCC  GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’

VL3 5’-GAT TTT  GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3’

VL4 5’-GAA TCT  GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3’

VL5 5’-GCA TCT  GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’

Human Lambda CL2 Constant Domain 3’primer(含Xba I位点)

5’-AGT CG T CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’

分别以上述7对引物扩增编码抗体重链IgVH的可变区序列(Fd)、4对引物扩增编码抗体轻链IgVκ的可变区序列、5对引物扩增编码抗体轻链IgVλ的可变区序列。

(22)抗体文库的构建：将载体pComb3H与聚合酶链式反应(PCR)扩增获得的κ链基因分别经Sac I+Xba I消化，利用琼脂糖凝胶进行电泳分离、纯化后，以T4 DNA连接酶进行连接，并通过电转化为感受态XL1-Blue菌。将所述转化的感受态XL1-Blue菌菌加入到3mL SOC培养基中于37℃振荡培养1h，再加入15mL SB培养基(Amp 50mg/L及Tet 20mg/L)于37℃培养，提取质粒，即获得κ链基因文库。将κ链基因文库质粒和聚合酶链式反应(PCR)扩增的重链基因片段(Fd)，分别以Xho I+Spe I进行消化、纯化及连接，并再次电转化为空XL1-Blue细菌。然后将再次电转化的空XL1-Blue细菌加入到3mL SOC培养基中振荡培养1h。此后加入15mL SB培养基(Amp 20mg/L及Tet 20mg/L)中培养1h，补足Amp至50mg/L，继续摇菌1h。加入100mL SB(Amp 50mg/L及Tet 20mg/L)和辅助噬菌体VCSM1350μL(1×1012PFU)，于37℃振荡培养2h，再加入Kan至70mg/L于37℃振荡培养过夜。此后将菌液离心，收集上清加入PEG8000和NaCl至终浓度分别为4％和3％，冰浴30min后离心(10000×g15min)。弃上清，以1.5mLPBS液(含1g/L BSA)溶解沉淀，再以24000×g离心4min。收集上清即为(Fd+κ)链抗体基因文库(Fab)。

以同样方法构建(Fd+λ)链抗体文库。

将(Fd+κ)链文库及(Fd+λ)链文库混合，即为完整人源噬菌体抗体库Fab。

如图4所示，将人源噬菌体抗体库进行酶切鉴定结果图，证明含有轻重链序列，完整的抗体库其滴度为4.6×10⁸菌落(CFU)。

实施例三：人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体和dsFv抗体的制备

(31)以NH-LBP为抗原对噬菌体抗体库Fab进行筛选和单菌株鉴定：

将NH-LBP作为抗原包被酶联板，洗板后加入噬菌体抗体库，结合2h后洗板，洗下已结合的噬菌体，重新感染XL1-Blue菌并扩增抗体库，扩增的噬菌体抗体库进行下-轮的筛选，共筛选5轮。

经5轮筛选后，携带抗NH-LBP抗体的噬菌体得到明显的富集，结合性提高了1.65×10⁴倍，证明筛选是成功的。

将每个单菌落扩增、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导、分泌表达Fab抗体，以NH-LBP标板，以Fab为一抗，HRP-鼠抗人Fab单克隆抗体为二抗，以四甲基联苯胺(TMB)为反应底物，通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法鉴定Fab与NH-LBP的结合力。共鉴定出6个单克隆菌株，其编码的Fab可与NH-LBP显著结合。

其具体过程如下：

将NH-LBP与碳酸缓冲液(pH9.6)混合后包被酶联板4℃过夜。以聚丁二酸丁二醇酯(PBS)洗涤及30g/L双三甲硅基乙酰胺(BSA)封闭1h后，再加入90μL/孔噬菌体抗体库结合2h，以PBS/Tween20液洗板1次(随筛选轮数，洗板次数递增致10次)，再以PBS洗板5次，加入100μL洗脱液(0.1mol/L HCI，1g/L BSA，pH2.2)静置10min，稍吹打后加入6μL Tris液(2mol/L)中和。最后，取10μL回收的噬菌体液作1∶100等比稀释测定其滴度。其余回收的噬菌体液加入2mL新鲜XL1-Blue菌液，扩增噬菌体(方法同建库)并进行下一轮的筛选，共筛选5轮。

经5轮筛选后，携带抗NH-LBP抗体的噬菌体得到明显的富集，结合性提高了1.65×10⁴倍，证明筛选是成功的。以第5轮筛选回收的噬菌体感染XL1-Blue菌并扩增，提取质粒切除gene III后，噬菌自身环化，并电转入XL1-Blue菌中，SOC培养基中培养，铺LB板(含Amp 50ug/mL、Tet10ug/mL)，37℃静置培养过夜。挑单菌落(50个)接种于3mL SB(含Amp 50ug/mL、Tet10ug/mL)中，于37℃振荡培养6h，直至OD600＝0.6～0.8，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃振荡培养6h或30℃振荡培养过夜(14h-16h左右)，过夜后菌液4℃离心10000rpm×5min，上清中则含有可溶性分泌抗体，此上清以0.05mol/l PBS液脱盐，脱盐后上清放入干燥机中浓缩，则含有Fab抗体。以NH-LBP标板，以Fab为一抗，HRP-鼠抗人Fab单克隆抗体为二抗，以四甲基联苯胺(TMB)为反应底物，通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法鉴定Fab与NH-LBP的结合力。

(32)抗NH-LBP的Fab抗体制备及鉴定：

通过聚合酶链式反应(PCR)法，从阳性单克隆菌株的pComb3H中，将编码抗体轻重链的VH和VL分别扩增出，分别置于载体pET-30a(+)，构建表达质粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分别电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达。

如图6所示为构建Fab抗体时所扩增的轻重链基因(VH和VL)图；其中，

1：DNA标记(2000、1000、750、500、250、100bp)；

2～4：扩增的轻链基因(VL)；

5～7：扩增的重链基因(VH)。

将表达的VH和VL多肽以TALON亲和纯化后，进行共同复性、折叠，形成Fab抗体。

如图7所示为用TALON(针对6×His)柱芯对轻链蛋白质片段VL的亲和纯化结果图，其中：

A峰、B峰：分别为含5mmol/L、150mmol/L Imidazole的1×PBS液所洗脱下的个蛋白质吸收峰。

如图8所示为TALON亲和纯化轻重链蛋白质片段(VL和VH)的Tricine-SDS-PAGE鉴定结果图，其中：

1：蛋白质标记(97.4、66.2、43、29、20.1、14.3KDa)；

2～3：VH表达蛋白用TALON柱芯纯化洗下的蛋白质峰“A，B”，其中B峰中含有VH蛋白；

4～5：VL表达蛋白用TALON柱芯纯化洗下的蛋白质峰“A，B”，其中B峰中含有VL蛋白。

具体过程如下：

①采用常规聚合酶链式反应(PCR)法，以pComb3H-Fab质粒为模板，分别以VL5和VL3，VH5和VH3为一对引物进行聚合酶链式反应。

具体过程如下：

采用质粒DNA 5ng，引物各1μL(浓度20μmol/l)，Ex Taq酶0.3μL(浓度5mmol/L)，MgCl2 4μL，dNTP(各浓度2.5mmol/L)5μL，加水至总体积50μL。

扩增条件为：94℃预变性5min，此后94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，30个循环，72℃ 5min。

利用18g/L凝胶进行电泳，得到聚合酶链式反应产物，对聚合酶链式反应产物采用硝酸纤维吸附纯化及去离子水溶解。

然后将VL和VH基因分别与pMD19-T Simple Vector连接，转入感受态DH-Sa菌中，于LB培养板(X-gal 0.04g/L、IPTG 0.024g/L、Amp 10mg/L)行蓝白斑筛选。

挑取白色菌落扩增、抽提质粒并进行基因测序鉴定，对序列正确的质粒进行Sac I、HindIII双酶切，并将目的片段与相同酶切的表达载体pET-30a(+)相连接，构建表达质粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，然后转入感受态DH-5a菌中，于LB培养板进行抗卡那霉素(kanamycin)筛选(浓度50mg/L)。

然后将单克隆细菌进行扩增，抽提质粒，再进行聚合酶链式反应(引物：T7 Promoter primer、T7 terminator primer)及Sac I、Hind III双酶切鉴定，对序列正确的质粒进行电转得到感受态BL21 star(DE3)菌，其中，电转条件为：2mm电击杯、2.5KV、电容50μF、平行电阻200Ω。

然后铺LB培养板(Kan 50mg/L)，挑选单菌落进行扩增，抽提质粒，利用8g/L凝胶进行电泳，并进行质粒基因序列测定(双向测定，引物：T7Promoter primer、T7 terminator primer)，如果目的序列正确、无碱基突变的单菌株，可利用其进行诱导表达。

②VL和VH蛋白质的表达和纯化：

将含有轻链可变区(VL)或抗体重链可变区(VH)的BL21 star(DE3)菌在A600nm为0.6～0.8时，以1mmol/L IPTG诱导于LB培养基中表达目的蛋白，表达时间为4h、6h、8h、10h和12h，寻找最佳表达时相点，并与含有空载体pET-30a(+)的BL21 star(DE3)菌进行比较。

将表达BL21 star菌进行反复冻融、溶菌酶处理及超声粉碎，提取其可溶性蛋白质及包涵体。

将可溶性蛋白质及溶解后的包涵体分别以亲合交换柱芯TALON进行梯度纯化，条件为：平衡液1X PBS液(含6mol/L盐酸胍、300mmol/LNaCl、50mmol/L Na2HPO4.12H20及50mmol/L NaH2PO4.2H20，pH7.4)，洗脱的A、B、C液分别为含5、150、300mmol/L Imidazole的1×PBS液。

如图6、7所示，各个洗脱蛋白质峰分别回收、脱盐、冻干并进行Westernblot鉴定后，得到VL和VH蛋白质的表达和纯化。

③VL、VH蛋白复性、折叠及纯化：

首先将VL和VH蛋白复性，具体过程如下：

将VL和VH蛋白溶于复性缓冲液(50mmol/L KH2PO4，1mmol/LEDTA，2mmol/L Reduced Glutathione，1mmol/L Oxidized Glutathione)，用KOH调pH10.7，冰上搅拌50min，再调pH为8.0，于4℃过夜。

将液体于4℃下离心11500g×15min，收集上清，装入透析袋脱盐并浓缩。

其次，将VL和VH蛋白折叠，具体过程如下：

将VL和VH蛋白共同溶于折叠缓冲液(100mmol/L Tris.HCl，500mmol/LArginine，2mmol/L EDTA，0.9mmol/L Oxidized Glutathione，pH8.5)，于10℃放置36h，再加入同量氧化谷胱甘肽，10℃放置12h，此后溶液置于透析袋中(截留Mr 8～10000u)脱掉盐及氧化谷胱甘肽并浓缩。

最后，纯化Fab蛋白：具体过程如下：

将SephadexTM G-25用5mmol/L的PB液(pH7.4)发胀、平衡48h后装柱、压紧，往纯化柱内加入折叠后的抗体溶液，再以5mmol/L PB洗脱(流速100cm/h)，收集最先洗脱出的蛋白质峰(含有Fab抗体)，以1mmol/L PB(pH7.3)脱盐、低温冻干，并进行蛋白质印迹(Western blot)等鉴定。

所获得Fab抗体轻重链VL和VH的可变区基因序列及氨基酸序列(其中，下划线为互补决定区域(Conplementarity Determining Regions，CDRS))：

①轻链VL(VL gene)的基因序列(为κ轻链)为：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC CTG ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

②重链V_H(V_H gene)的基因序列(为VH3亚群)为：

GGA GGC TTA GTT CAA CCG GGG GGG TCA CTT ACA CTC TCC TGT GCA GCA TCT

GGA TTC CCA TTC AGT  ACG TAC TGG ATG CAC TGG GTC CGT CAA GGT CCA GGG

AAG CGG CCG GTG TGG GTC TCT  CGT GTC CAC AGT GAA GGG AGT GCC CGA AGT

TAC GCG GGC GCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGG GAC AAC GCC AGG

AAC ACC GTC TAT CTG CAG ATG AAT AGT CTG ACA GAC GAA GAC ACG GGT GTC

TAT TAT TGT GCG AGA

对应氨基酸序列为：

GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVSRVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDN

ARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR

(33)抗NH-LBP的dsFv抗体制备及鉴定：

本发明实施例的抗NH-LBP的dsFv抗体制备，通过应用mega-primer PCR方法，在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因序列，改变点为第43位氨基酸，CTG(L43)→TGT(C43)，然后将改变的rVL序列置于载体pET-30a(+)，构建表达质粒pET-30a(+)-rVL，并电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达并纯化而制备。

因抗NH-LBP单克隆Fab抗体的重链基因骨架区FWR1中已含有Cys，因此，在制备抗NH-LBP单克隆Fab抗体的过程中，不需要再引入突变。

具体的过程如下：

331)dsFv VL突变基因的构建：

为将pComb3H-Fab质粒中κ轻链基因突变为dsFv rVL基因，设计如下引物：VL5：5′-CGGATCT GAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTGTCT-3′(位于1～24bp，划线处为Sac I酶切位点)；VLM：5′-GGA CGC ACCGTA GAT ACA GAG TTT AGG GGC TTT GCC TGG-3′(位于40～78bp，划线处为突变位点)；VL3：5′-ATC CGG AAG CTT ATT AAC ACT CTC CCCTGT TGA -3′(位于612～633bp，划线处为HindIII酶切位点)。

然后，应用mega-primer PCR方法，在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因序列，改变点为第43位氨基酸，CTG(L43)→TGT(C43)。

332)对dsFv VL表达质粒的构建以及dsFv VL表达及纯化：

将dsFv rVL基因与pMD19-T Simple Vector连接，电转入感受态DH-5a菌中，按常规行蓝白斑筛选。

挑取白色菌落扩增，并测定基因序列，对序列突变正确的质粒进行Sac I、HindIII双酶切，将目的片段与相同酶切的表达载体pET-30a(+)相连接，构建表达质粒pET-30a(+)-rVL，再电转入感受态DH-5a菌中，在LB培养板进行抗卡那霉素(kan)筛选(Kan 50μg/ml)。

其后，进行单克隆细菌扩增，抽提质粒并测序(引物：T7 Promoter primer、T7 terminator primer)，对序列正确的质粒电转入感受态BL21 star(DE3)菌。

其后将含有pET-30a(+)-rVL的BL21 star(DE3)菌在D(600)0.6～0.8时，以IPTG 1mmol/L诱导表达，寻找最佳表达时相点，并与空BL21 star(DE3)菌及含有空载体pET-30a(+)菌进行比较。

其后将表达BL21 star菌进行冻融、溶菌酶处理及超声粉碎，提取其可溶性蛋白质及包涵体。

再将可溶性蛋白质及溶解后的包涵体分别以亲合交换柱芯TALON进行梯度纯化，纯化条件为：平衡液1X PBS液(含盐酸胍6mol/l、NaCl 300mmol/l、Na2HPO4.12H20及NaH2PO4.2H20分别50mmol/l，PH7.4)，洗脱A、B、C液分别为含Imidazole 5、150及300mmol/L的1X PBS液。

然后，各个洗脱蛋白质峰分别回收、脱盐、冻干，并以抗6×His mAb为一抗行Western blotting等鉴定，得到dsFv VL表达质粒。

(333)rVL、VH蛋白复性、折叠及纯化：

首先，对rVL和VH蛋白复性，具体过程如下：

将VL和VH蛋白溶于复性缓冲液(50mmol/L KH2PO4，1mmol/LEDTA，2mmol/L Reduced Glutathione，1mmol/L Oxidized Glutathione)，用KOH调pH10.7，冰上搅拌50min，再调pH为8.0，于4℃过夜。

再将液体于4℃下离心11500g×15min，收集上清，装入透析袋脱盐并浓缩。

其次，对rVL和VH蛋白折叠，具体过程如下：

将rVL和VH蛋白共同溶于折叠缓冲液(100mmol/L Tris.HCl，500mmol/LArginine，2mmol/L EDTA，0.9mmol/L Oxidized Glutathione，pH8.5)，于10℃放置36h，再加入同量氧化谷胱甘肽，10℃放置12h，此后溶液置于透析袋中(截留Mr 8～10000u)脱掉盐及氧化谷胱甘肽并浓缩。

最后，纯化dsFv蛋白，具体过程如下：

将SephadexTM G-25用5mmol/L的PB液(pH7.4)发胀、平衡48h后装柱、压紧，往纯化柱内加入折叠后的抗体溶液，再以5mmol/L PB洗脱(流速100cm/h)，收集最先洗脱出的蛋白质峰(含有Fab抗体)，以1mmol/L PB(pH7.3)脱盐、低温冻干，并进行Western blot等鉴定。

将表达的VH和rVL多肽进行共同复性、折叠，通过二硫键的形成来形成dsFv抗体。

所获得dsFv抗体轻链rVL的可变区基因序列及氨基酸序列(其中，下划线为CDRS区)为：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC TGT ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

实施例四：Fab抗体及dsFv抗体的体外活性检测

将Fab抗体或dsFv抗体与NH-LBP按摩尔比1∶1比例混合后37℃水浴1min，进行普通聚丙烯酰胺凝胶电泳，观察抗体是否能与NH-LBP结合；以2mg/L LBP为抗原标96孔板，以Fab抗体或dsFv抗体为第一抗体，以HRP-鼠抗人kappa链为第二抗体，并以人血白蛋白为阴性对照，通过酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)法，检测Fab抗体或dsFv抗体与NH-LBP的结合能力(当A450nm值为阴性对照的两倍以上时则为阳性)。Fab抗体及dsFv抗体均能与人全长(天然)LBP显著结合，Fab抗体稀释到0.1mg/L，dsFv抗体稀释到0.2mg/L，均仍可与LBP有效结合，具体数据见表1和表2。

表1  复性后Fab与LBP结合活性

Antigen	Different dilution of Fab
						10mg/L	1mg/L	0.1mg/L	0.01mg/L	0.001mg/L
	LBPHuman Albumin	0.32±0.090.03±0.02	0.19±0.050.02±0.02	0.11±0.040.04±0.02	0.05±0.030.03±0.01						0.04±0.020.04±0.01

表2  复性后dsFv与LBP结合活性

Antigen	Different dilution of dsFv
						1mg/L	0.5mg/L	0.2mg/L	0.1mg/L	0.05mg/L

LBPHuman Albumin

0.20±0.060.02±0.01

0.17±0.050.03±0.01

0.08±0.030.03±0.02

0.04±0.030.03±0.01

0.04±0.040.04±0.02

实施例五：Fab抗体及dsFv抗体的体内活性检测：

将Bab-C小鼠按雌雄各半分为三组，每组10只；分别为生理盐水对照组、dsFv抗体治疗组或Fab抗体治疗组、LPS注射损伤组，分别腹腔注射生理盐水、LPS、LPS+dsFv或LPS+Fab；注射72h后断头处死，立即取血、分离血清，用TNF-a放射免疫试剂盒检测血中TNF-a含量，并测量其肝功能三项指标(ALT\AST\ALB)；用SPSS软件进行统计学分析，并将所获得的脑、心、肺、肝、肾等器官固定、制作苏木精-伊红(haemat0xylin-eosin，HE)切片，光镜下观察其形态学改变。研究发现脂多糖(LPS)对肝和肺的损伤最为明显；其次是肾与脑；而心和脾改变不大；对照组与治疗对照组比较，各主要器官损伤均较轻，说明Fab抗体及dsFv抗体确实能在一定程度上减轻机体主要器官的损伤，具体数据见表3。

表3：dsFv治疗前后72h小鼠体内肝功能的变化

	例数	ALT	AST	ALB	TNF-a
						盐水对照组	20	58±46.74※▲	64.3±21.52※▲	38.19±16.42※△	9.53±29.37※▲
LPS注射组	20	112±36.40※★	161±17.20※☆	30.1±6.34※☆	26.36±7.56※★
						dsFv治疗组	20	85.1±49.95※★	115±31.57※☆	36.18±22.01*☆	14.13±12.33※★

其中：^*表示生理盐水组与LPS注射组比较P＜0.05；※表示生理盐水组与LPS注射组比较P＜0.01；△表示生理盐水组与dsFv治疗组比较P＜0.05；▲表示生理盐水组与dsFv治疗组比较P＜0.01；☆表示LPS注射组与dsFv治疗组比较P＜0.005；★表示LPS注射组与dsFv治疗组比较P＜0.01。

三组关系如图9所示，其中，1.00：生理盐水对照组；2.00：LPS注射组；3.00：dsFv治疗组。

实施例六：人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体和dsFv抗体的应用

(1)Fab抗体、dsFv抗体可与人全长LBP的N端结合，竞争性地抑制LPS与LBP的结合，从而使得LBP无法促进LPS与mCD14的结合，从而显著抑制LPS导致的过度炎症反应。该类抗体可用于感染患者，特别是重征感染的患者，如临床烧伤肠源性感染患者、菌痢患者等，可防止过度炎症反应的发生。

(2)Fab抗体、dsFv抗体为人源抗体，对人体无种属排斥性，可应用于人体，不会导致肾等重要脏器的损害。该类人源抗体在BABC小鼠(6-8周龄，体重18-22g)体内未导致溶血反应，也未导致明确的肝肾肺等脏器损害。

Fab抗体、dsFv抗体作用于小鼠体内，72小时后断头，取血并对重要脏器制片。病理切片观察，发现Fab抗体、dsFv抗体对肝、肺、肾、脑等重要脏器无明确的病理损害。其中肝功等指标测定，测定数据见表4，测定值无明显差异，证明Fab抗体、dsFv抗体对小鼠肝无明确损害。

表4  dsFv抗体和Fab抗体在小鼠体内的毒性作用dsFv抗体和Fab抗体作用72h肝功能的变化

	ALT	AST	ALB	TNF-a
					盐水对照组	51.4±3.7	62±3.42	37.12±14.75	10.5±0.85
Fab抗体作用组	52.9±2.17	63±2.71	41.48±0.80	13.42±3.01
					dsFv抗体作用组	49.3±5.20	59.1±8.5	38.37±6.15	11.7±5.7

其中：P＞0.05

(3)Fab抗体、dsFv抗体可用于检测患者体内脂多糖结合蛋白(LBP)水平，提前预报败血症的发生。

临床利用Fab抗体、dsFv抗体检测，得到慢性重型乙肝患者血清脂多糖结合蛋白(LBP)的浓度约为(2314.06±942.25)nmol/L，急性细菌性痢疾患者血清脂多糖结合蛋白(LBP)的浓度约为(1452.37±463.49)nmol/L，正常人血清脂多糖结合蛋白(LBP)的浓度为(137.46±93.43)nmol/L。

(4)应用途径包括：静脉注射。

本发明通过从人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)入手，从人肝细胞中提取编码NH-LBP的cDNA片段，采用昆虫sf21细胞制备了NH-LBP蛋白，并通过pComb3H噬菌粒建立了人源噬菌体抗体库，以NH-LBP为抗原进行了筛选，从而制备了抗NH-LBP人源单克隆抗体(mAb)：Fab抗体，以及dsFv抗体。Fab抗体，以及dsFv抗体能特异性地与人完整脂多糖结合蛋白的N端结合，从而竞争性地抑制了脂多糖结合蛋白的与脂多糖的结合，使得机体对脂多糖的敏感性下降，降低脂多糖导致的过度炎症反应，并促进机体对脂多糖的降解，从而抑制过度的炎症反应和防止弥漫性毛细血管内凝血、多脏器衰竭的发生。

本实施例是为了更好地理解本发明进行的详细的描述，并不是对本发明所保护的范围的限定，因此，本领域普通技术人员不脱离本发明的主旨未经创造性劳动而对本明所做的改变在本发明的保护范围内。

                             序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学西南医院病理学研究所

<120>脂多糖结合蛋白和其单克隆抗体、以及制备方法和用途

<160>4

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>648

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(75)

<223>编码人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide-binding protein，HLBP)信号肽序列

<220>

<221>CDS

<222>(76)..(648)

<223>编码人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)序列

<220>

<221>mutation

<222>(144)..(144)

<223>G to A

<220>

<221>mutation

<222>(626)..(626)

<223>T to A

<220>

<221>mutation

<222>(627)..(627)

<223>A to T

<220>

<221>mutation

<222>(637)..(637)

<223>C to T

<220>

<221>mutation

<222>(638)..(638)

<223>T to C

<220>

<221>mutation

<222>(639)..(639)

<223>C to T

<400>1

atg ggg gcc ttg gcc aga gcc ctg ccg tcc ata ctg ctg gca ttg ctg     48

Met Gly Ala Leu Ala Arg Ala Leu Pro Ser Ile Leu Leu Ala Leu Leu

1               5                   10                  15

ctt acg tcc acc cca gag gct ctg ggt gcc aac ccc ggc ttg gtc gcc     96

Leu Thr Ser Thr Pro Glu Ala Leu Gly Ala Asn Pro Gly Leu Val Ala

            20                  25                  30

agg atc acc gac aag gga ctg cag tat gcg gcc cag gag ggg cta tta    144

Arg Ile Thr Asp Lys Gly Leu Gln Tyr Ala Ala Gln Glu Gly Leu Leu

         35                  40                    45

gct ctg cag agt gag ctg ctc agg atc acg ctg cct gac ttc acc ggg    192

Ala Leu Gln Ser Glu Leu Leu Arg Ile Thr Leu Pro Asp Phe Thr Gly

    50                  55                  60

gac ttg agg atc ccc cac gtc ggc cgt ggg cgc tat gag ttc cac agc    240

Asp Leu Arg Ile Pro His Val Gly Arg Gly Arg Tyr Glu Phe His Ser

65                  70                  75                  80

ctg aac atc cac agc tgt gag ctg ctt cac tct gcg ctg agg cct gtc    288

Leu Asn Ile His Ser Cys Glu Leu Leu His Ser Ala Leu Arg Pro Val

                85                  90                  95

cct ggc cag ggc ctg agt ctc agc atc tcc gac tcc tcc atc cgg gtc    336

Pro Gly Gln Gly Leu Ser Leu Ser Ile Ser Asp Ser Ser Ile Arg Val

            100                 105                 110

cag ggc agg tgg aag gtg cgc aag tca ttc ttc aaa cta cag ggc tcc    384

Gln Gly Arg Trp Lys Val Arg Lys Ser Phe Phe Lys Leu Gln Gly Ser

        115                 120                 125

ttt gat gtc agt gtc aag ggc atc agc att tcg gtc aac ctc ctg ttg    432

Phe Asp Val Ser Val Lys Gly Ile Ser Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu

    130                 135                 140

ggc agc gag tcc tcc ggg agg ccc aca gtt act gcc tcc agc tgc agc    480

Gly Ser Glu Ser Ser Gly Arg Pro Thr Val Thr Ala Ser Ser Cys Ser

145                 150                 155                 160

agt gac atc gct gac gtg gag gtg gac atg tcg gga gac ttg ggg tgg    528

Ser Asp Ile Ala Asp Val Glu Val Asp Met Ser Gly Asp Leu Gly Trp

                165                 170                 175

ctg ttg aac ctc ttc cac aac cag att gag tcc aag ttc cag aaa gta    576

Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Lys Phe Gln Lys Val

            180                 185                 190

ctg gag agc agg att tgc gaa atg atc cag aaa tcg gtg tcc tcc gat    624

Leu Glu Ser Arg Ile Cys Glu Met Ile Gln Lys Ser Val Ser Ser Asp

        195                 200                 205

cat      cag      cct      tat      tct      caa      act      ctg

648

His Gln Pro Tyr Ser Gln Thr Leu

    210                 215

<210>2

<211>249

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(58)..(90)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体中κ轻链基因的CDRS区

<220>

<221>CDS

<222>(136)..(156)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体中κ轻链基因的CDRS区

<400>2

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC     48

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

1               5                   10                  15

ACC ACT ACG CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT     96

Thr Thr Thr Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr

            20                  25                  30

CAG CAA AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC CTG ATC TAC GGT GCG TCC    144

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser

        35                  40                  45

ACT TAC AAA TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA    192

Thr Tyr Lys Leu Gly Ser Leu Tyr Gly Ser Ala Ala Val Gly Leu Gly

    50                  55                  60

CCG ATT TCA CTC TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA    240

Pro Ile Ser Leu Ser Pro Leu Thr Ser Arg Ser Leu Lys Ile Leu Gln

65                  70                  75                  80

CTT                              ATT                               ACT

249

Leu Ile Thr

<210>3

<211>270

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(67)..(81)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体中重链V_H基因的CDRS区

<220>

<221>CDS

<222>(124)..(174)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆Fab抗体中重链V_H基因的CDRS区

<400>3

GGA GGC TTA GTT CCG CCG GGG GGG TCA CTT ACA CTC TCC TGT GCA GCA     48

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala

1               5                   10                  15

TCT GGA TTC CCA TTC AGT ACG TAC TGG ATG CAC TGG GTC CGT CAA GGT     96

Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Gly

            20                  25                  30

CCA GGG CGG CGG CCG GTG TGG GTC TCT CGT GTC CAC AGT GAA GGG AGT    144

Pro Gly Lys Arg Pro Val Trp Val Ser Arg Val His Ser Glu Gly Ser

        35                  40                  45

GCC CGA AGT TAC GCG GGC GCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGG    192

Ala Arg Ser Tyr Ala Gly Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

    50                    55                  60

GAC AAC GCC AGG AAC ACC GTC TAT CTG CAG ATG AAT AGT CTG ACA GAC    240

Asp Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Asp

65                  70                  75                  80

GAA GAC ACG GGT GTC TAT TAT TGT GCG AGA                            270

Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

                85                  90

<210>4

<211>249

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(58)..(90)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆dsFv抗体中轻链rVL基因的CDRS区

<220>

<221>CDS

<222>(136)..(156)

<223>编码人源抗NH-LBP单克隆dsFv抗体中轻链rVL基因的CDRS区

<400>4

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC     48

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

1               5                   10                  15

ACC ACT ACG CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT     96

Thr Thr Thr Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser Leu Ala Trp Tyr

            20                  25                  30

CAG CAA AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC TGT ATC TAC GGT GCG TCC    144

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Cys Ile Tyr Gly Ala Ser

        35                  40                  45

ACT TAC AAA TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA    192

Thr Tyr Lys Leu Gly Ser Leu Tyr Gly Ser Ala Ala Val Gly Leu Gly

    50                  55                  60

CCG ATT TCA CTC TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA    240

Pro Ile Ser Leu Ser Pro Leu Thr Ser Arg Ser Leu Lys Ile Leu Gln

65                  70                  75                  80

CTT                            ATT                                 ACT

249

Leu Tle Thr

Claims (21)

1.一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，其特征在于，编码所述脂多糖结合蛋白氨基端片段的DNA序列为：

Atgggggccttggccagagccctgccgtccatactgctggcattgctgcttacgtccaccccagaggctctgggtgc

caaccccggcttggtcgccaggatcaccgacaagggactgcagtatgcggcecaggaggggctattagctctgcag

agtgagctgctcaggatcacgctgcctgacttcaccggggacttgaggatcccccacgtcggccgtgggcgctatga

gttccacagcctgaacatccacagctgtgagctgcttcactctgcgctgaggcctgtccctggccagggcctgagtct

cagcatctccgactcctccatccgggtccagggcaggtggaaggtgcgcaagtcattcttcaaactacagggctccttt

gatgtcagtgtcaagggcatcagcatttcggtcaacctcctgttgggcagcgagtcctccgggaggeccacagttact

gcctccagctgcagcagtgacatcgctgacgtggaggtggacatgtcgggagacttggggtggctgttgaacctcttc

cacaaccagattgagtccaagttccagaaagtactggagagcaggatttgcgaaatgatccagaaatcggtgtcctcc

gatcatcagccttattctcaaactctg

其中，下划线区为编码信号肽序列；以基因数据库上脂多糖结合蛋白序列为标准，发生点突变的有：G(144)→A(144)；T(626)→A(626)；A(627)→T(627)；C(637)→T(637)；T(638)→C(638)；C(639)→T(639)。

2、一种脂多糖结合蛋白氨基端片段，其特征在于，所述脂多糖结合蛋白氨基端片段的氨基酸序列为：

MGALARALPSILLALLLTSTPEALGANPGLVARITDKGLQYAAQEGLLAL

QSELLRITLPDFTGDLRIPHVGRGRYEFHSLNIHSCELLHSALRPVPGQGLS

LSISDSSIRVQGRWKVRKSFFKLQGSFDVSVKGISISVNLLLGSESSGRPTVT

ASSCSSDIADVEVDMSGDLGWLLNLFHNQIESKFQKVLESRICEMIQKSVS

SDHQPYSQTL

其中，下划线区为信号肽的序列；以基因数据库上脂多糖结合蛋白氨基酸序列为标准，发生点突变的有：L(209)→H(209)；L(213)→S(213)。

3、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，其特征在于，所述Fab抗体轻重链VL和VH的可变区基因序列及氨基酸序列如下：：

轻链VL的基因序列为κ轻链：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC CTG ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

重链V_H的基因序列为VH3亚群：

GGA GGC TTA GTT CAA CCG GGG GGG TCA CTT ACA CTC TCC TGT GCA GCA TCT

GGA TTC CCA TTC AGT  ACG TAC TGG ATG CAC TGG GTC CGT CAA GGT CCA GGG

AAG CGG CCG GTG TGG GTC TCT  CGT GTC CAC AGT GAA GGG AGT GCC CGA AGT

TAC GCG GGC GCC GTG AAG GGC CGA TTC ACC ATC TCC AGG GAC AAC GCC AGG

AAC ACC GTC TAT CTG CAG ATG AAT AGT CTG ACA GAC GAA GAC ACG GGT GTC

TAT TAT TGT GCG AGA

对应氨基酸序列为：

GGLVQPGGSLTLSCAASGFPFSTYWMHWVRQGPGKRPVWVS RVHSEGSARSYAGAVKGRFTISRDN

ARNTVYLQMNSLTDEDTGVYYCAR

其中，下划线为CDRS区。

4、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体，其特征在于，所述dsFv抗体轻链rVL的可变区基因序列及氨基酸序列为：

ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTT TCT GCA TCT GTC GGA GAC AGA GTC ACC ACC

ACT ACG  CGG GCA AGT CAG GTA ATT AGC AGT TCT TTA GCC TGG TAT CAG CAA

AAA CCA GGC AAA GCC CCT AAA CTC TGT ATC TAC  GGT GCG TCC ACT TAC AAA

TTG GGG TCC CTT TAC GGT TCA GCG GCA GTG GGT CTG GGA CCG ATT TCA CTC

TCA CCA TTG ACG TCC CGC AGC CTG AAG ATT CTG CAA CTT ATT ACT

对应氨基酸序列为：

TQSPSSLSASVGDRVTTTTRASQVISSSLAWYQQKPGKAPKLCIYGASTYKLGSLYGSAAVGLGPI

SLSPLTSRSLKILQLIT

其中，下划线为CDRS区。

5、一种脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法，其特征在于，提取编码脂多糖结合蛋白氨基端片段的cDNA序列，通过病毒表达系统，采用细胞制备了脂多糖结合蛋白氨基端片段。

6、根据权利要求5所述的脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法，其特征在于，所述病毒表达系统为BAC-TO-BAC杆状病毒表达系统；所述细胞为昆虫sf21细胞。

7、根据权利要求5或6所述的脂多糖结合蛋白氨基端片段的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括下列步骤：

从感染休克死亡患者的肝细胞内提取信使RNA，逆转录为cDNA文库，以特异引物5′-GTCGACTGGAGTGGGAATCTAGGA-3′；5′-AAGCTTATTCTGTGTTGTAACTGG-3′扩增出编码人脂多糖结合蛋白氨基端片段的双链DNA序列，并与pMD19-T Simple Vector连接，转入感受态DH-5a菌中；

测试正确后以Sal I、HindIII行双酶切，目的序列回收、纯化，并与相同酶处理的载体pFASTBAC连接，构建质粒pFASTBAC-NH-LBP；

将pFASTBAC-NH-LBP转入DH10BAC菌中，通过基因转位，构建穿梭质粒pBacmid-NH-LBP，在测序正确后，将pBacmid-NH-LBP感染昆虫细胞sf21，则sf21细胞释放出编码脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白的病毒颗粒；

以病毒颗粒感染对数生长期的sf21细胞，在无血清培养基Sf900 II SFM表达脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白质，并脂多糖结合蛋白氨基端片段蛋白质以TALON柱芯进行梯度亲和纯化，得到脂多糖结合蛋白氨基端片段。

8、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法，其特征在于，所述建立噬菌体抗体库，以脂多糖结合蛋白氨基端片段为抗原进行了筛选，制备抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体。

9、根据权利要求8所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法，其特征在于，所述建立噬菌体抗体库，具体包括下列步骤：

从健康志愿者的外周血中分离获得单核细胞，从单核细胞中提取DNA序列，分别以7对引物扩增编码抗体重链IgVH的可变区序列、4对引物扩增编码抗体轻链IgVκ的可变区序列、5对引物扩增编码抗体轻链IgVλ的可变区序列，分别以Sac I+Xba I、Xho I+Spe I消化，以pComb3H噬菌粒为载体，于XL1-Blue杆菌内建立了人源噬菌体抗体文库Fab。

10、根据权利要求8所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法，其特征在于，所述以脂多糖结合蛋白氨基端片段为抗原进行了筛选，具体包括下列步骤：

将脂多糖结合蛋白氨基端片段作为抗原包被酶联板，洗板后加入噬菌体抗体库，结合后洗板，然后洗下已结合的噬菌体，重新感染XL1-Blue菌并扩增抗体库，扩增的噬菌体抗体库进行下一轮的筛选。

11、根据权利要求8至10任一项所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的制备方法，其特征在于，所述制备抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，具体包括下列步骤：

通过聚合酶链式反应法，从阳性单克隆菌株的pComb3H中，将编码抗体轻重链的VH和VL分别扩增出，分别置于载体pET-30a(+)，构建表达质粒pET-30a(+)-VH和pET-30a(+)-VL，分别电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达，将表达的VH和VL多肽以TALON亲和纯化后，进行共同复性、折叠，形成Fab抗体。

12、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的制备方法，其特征在于，在抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因序列rVL，然后将改变的rVL序列置于载体pET-30a(+)中，构建表达质粒pET-30a(+)-rVL，并电转入BL21 star(DE3)菌中，以IPTG诱导表达并纯化而制备。

13，根据权利要求12所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的制备方法，其特征在于，所述在抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区FWR2中引入编码Cys的基因序列rVL，是通过应用mega-primer PCR方法而实现的。

14、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，其特征在于，所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体在制备治疗炎症药物中的应用。

15、根据权利要求14所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，其特征在于，所述炎症为烧伤肠源性感染或者菌痢等G^-杆菌所致的感染。

16、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，其特征在于，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体在制备治疗炎症药物中的应用。

17、根据权利要求16所述的抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，其特征在于，所述炎症为烧伤肠源性感染或者菌痢等G^-杆菌所致的感染。

18、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，其特征在于，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体在制备检测体内脂多糖结合蛋白水平的药物中的应用。

19、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，其特征在于，所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体在制备检测体内脂多糖结合蛋白水平的药物中的应用。

20、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体的应用，其特征在于，所述药物中包括如权利要求3中所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段单克隆Fab抗体，并混合一种或一种以上医药上可接受的载体或添加剂。

21、一种抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体的应用，其特征在于，所述药物中包括如权利要求4中所述抗脂多糖结合蛋白氨基端片段的dsFv抗体，并混合一种或一种以上医药上可接受的载体或添加剂。

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