CN101065497B - 用于亲和分离的微泡 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于亲和分离、亲和纯化和亲和分析的基于亲和分子包衣微泡的方法、组合物及试剂盒。具体而言，本发明提供了亲和分子包衣的蛋白质微泡。此外，本发明还提供了亲和分子包衣的玻璃微泡。本发明特别提供了应用本发明微泡对分析物和细胞进行分离的方法。

Description

用于亲和分离的微泡
技术领域
本发明涉及用于亲和分离、亲和纯化和亲和分析的基于亲和分子包衣微泡的方法、组合物及试剂盒。
背景技术
细胞、病毒、细菌和水溶性分子的分离领域已使用了各种微粒作为固相来吸附或结合所关注的目标物质。例如，配体(如抗体)包衣的磁性微粒可以结合到靶细胞或水溶性蛋白质上。目标物质通过结合到磁性微粒上，实现了其与他类细胞或蛋白质的分离。目前对该原创性工作已有各种改进，且多年前就出现有商业化产品。
其他研究者曾经使用过橡胶颗粒、脂质体、乳脂球和塑料颗粒(如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龙等)。作为捕获载体，这些物质都具有其各自的特性和问题。对非目标细胞或蛋白质的非特异性吸附是这些方法中最常见的问题，从而导致分离不良。此外，大多数方法在结合步骤以后都需要至少一个附加步骤以实现未结合样品和微粒结合物之间的分离，如磁性微粒需要施加磁场；有时需要通过离心或过滤将微粒从溶液中分离。
微粒结合目标细胞或蛋白质所需的时间通常与其表面积和单位体积溶液中的微粒数相关。颗粒越小，表面积越大，从而结合越快。然而，大的表面积通常会增加非特异性结合。
分离方法可能会根据其本身的性质或原理共同分离不同的微粒。这在基于重力离心法(gravity centrifugation)的分离中尤为明显，在此过程中微粒、细胞或其它物质可能会共同形成丸状(co-pellet)。此外，某些细胞类型如巨噬细胞和单核细胞，它们本身可以非特异性吞噬这些微粒，从而和目标细胞一起被分离。尽管通过一定的步骤或预防措施可以将以往技术中的个别问题最小化或避免，但某些局限性是内在的且是不可能彻底克服的。目前不同的方法获得了不同程度的成功，这表明需要寻找一个更好的解决该问题的办法。
最理想的分离制剂应该具有无穷大的表面积而完全没有非特异性相互作用，从而保证结合过程可以快速进行，并将其与非目标细胞或水溶性分子的结合降至最低。理想的分离剂应当在不捕获非目标细胞或分子的前提下达到其和细胞悬液或可溶性分子溶液间的分离。
发明概述
本发明提供了用于亲和分离或亲和分析的组合物，其包括亲和分子共价包衣的微泡。本发明的一个实施方式中，所述微泡为蛋白质微泡，如白蛋白微泡。通过向蛋白质溶液中引入气体，如采用超声处理，可以制得蛋白质微泡。作为本发明的一个方面，通过包括加热蛋白质溶液的方法可以向其中引入气体。在另一实施方式中，通过蛋白质变性或以Cr+++处理，可以稳定蛋白质微泡。
本发明的另一实施方式中，所述微泡为玻璃微泡。作为本发明的一个方面，所述玻璃微泡的密度约为0.6g/cc，平均直径为30μm左右。
本发明中的亲和分子可以是受体、配体或抗体。或者，该亲和分子也可以是生物素、抗生物素蛋白或链亲和素。
可通过例如使用异双功能试剂，如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯，将亲和分子直接连接到微泡上。在本发明另一实施方式中，亲和分子通过例如和至少另一个分子相互作用，间接连接到微泡上。作为本发明的一方面，微泡直接连接到链亲和素上，而亲和分子是生物素化的，通过链亲和素和生物素的相互作用将亲和分子连接到微泡上。
在本发明的一个实施方式中，亲和分子可以通过微泡上的环氧包衣连接到微泡上。在另一实施方式中，亲和分子通过微泡上的胺基官能团连接到微泡上。
作为本发明的一方面，玻璃微泡经处理产生具有反应活性的表面残基，该残基和3-氨丙基三乙氧基硅烷反应，产生胺。另一方面，玻璃微泡具有顺式-二醇包衣，通过该顺式-二醇(cis-diol)包衣，亲和分子可以直接连接到玻璃上。可例如如下产生顺式-二醇包衣：处理玻璃微泡以产生具有反应活性的表面羟基残基，使该残基与3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷反应产生环氧官能团，用酸处理该环氧官能团，使该环氧官能团转化为顺式-二醇官能团。
本发明也提供了一种产生用于亲和分离或亲和分析的蛋白质微泡的方法。一方面，该方法包括加热蛋白质溶液。在该方法的另一方面，通过超声处理蛋白质溶液，向其中引入气体，从而制得蛋白质微泡。在该方法的另一方面，在一种气体或混合气体的存在下对蛋白质溶液进行机械处理。
作为本发明的另一个方面，所述气体为空气，所述蛋白质为白蛋白。通过例如Cr+++处理可以稳定蛋白质微泡。
本发明还提供了一种产生用于亲和分离或亲和分析的微泡的方法，所述方法包括提供微泡；和对微泡进行亲和分子包衣。
在本发明的另一实施方式中，提供了特定样品(species)的亲和分离或亲和分析的方法。根据这些实施方式，该方法包括以下步骤：提供亲和分子包衣的微泡的溶液，样品与亲和分子在溶液中的相互作用使微泡与在溶液中与亲和分子相互作用的样品接触，从而产生样品包衣的微泡；通过使微泡漂浮到溶液表面而达到样品与溶液分离的目的。
作为该实施方式的一方面，样品可以是受体、配体或抗原。在一个实施方式中，样品为分析物。而在其它实施方式中，样品为病毒或细胞。
作为本发明的另一方面，蛋白质微泡，尤其是白蛋白微泡，可以在去垢剂、压力或真空的作用下释放样品。
发明的详细描述
应理解前述的总体描述和随后的详细描述仅用作范例和阐述，而并不用于限定本发明。如本文所用，如非特别指出，单数形式包含了复数形式。如本文所用，如非特别指出，“或”表示“和/或”的意思。此外，术语“包括(including)”及其其它形式，如“包括(includes)”或“包括(included)”的使用，是非限制性的。如本文所用，如非特别指出，“可以”表示“可能”。
每部分的标题仅用于全文的结构布局，而并不影响主题的描述。本申请引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于：专利、专利申请、文献、书籍、手册或论文，为了任何目的以其全文作为参考纳入本文。
定义
在进一步描述本发明的具体实施方式以前，将对一系列术语进行详尽的定义和阐述。
除非提供特定的定义，本发明中使用的术语，试验过程、技术和方法均是其所属技术领域中已知。标准化学符号与缩写可互换使用，该化学符号可以代表其全名。因此，例如，“碳”和“C”被认为具有相同的含义。化学合成、化学修饰、化学分析、药物的配制、制剂、递送和患者的治疗可依据标准技术进行。重组DNA方法、寡聚核苷酸合成、组织培养等可依据标准技术进行。反应和纯化技术可如本领域普遍所接受地进行操作或根据本文描述进行操作例如根据厂商的说明书使用试剂盒。前述的技术和步骤基本可以依据各种概括性或详细的参考文献所报道的常规方法进行，这些方法在本文通篇中有引用和讨论。例如，参见Sambrook等，Molecular Cloning：A laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))(分子克隆：实验手册(第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989))；Harlow&Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(1988))(抗体：实验手册(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1988))，为了任何目的以其全文作为参考纳入本文。
如本文所用，所述的“气泡”，是指一种小的、空心的、轻质小球，尤指包裹在薄膜中的具有小球体积的气体。气泡内部可以含有任何气体，包括但不限于：氧气、氮气、二氧化碳、氦气、碳氟化合物气体和它们的各种混合气体，如空气。薄膜可以是任何能够包裹少量体积气体的物质，如：不溶的蛋白质或脂质；聚合物或非聚合物材料；固体，如金属；固体玻璃、陶瓷或类似材料；或者是塑料，如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龙等。作为优选的实施方式，该薄膜为白蛋白。作为另一优选的实施方式，所述薄膜为硼硅酸盐玻璃。在某一实施方式中，薄膜对其所处的环境和溶液稳定。在另一实施方式中，薄膜可以选择性的爆裂、压碎或溶解。“微泡”是小的气泡，其直径通常在0.1μm到100μm的范围内，典型地在1μm到50μm的范围内，常常为2μm到20μm或2μm到30μm的范围内。
如本文所用，术语“分析物”是指分析中的待检测且可能存在于样品中的任何物质。分析物可以是任何物质，对此并无限制。在本发明的优选实施方式中，分析物包括具有天然抗体的物质或可制备得到抗体的物质。分析物可以是例如：蛋白质、多肽、半抗原、碳水化合物、脂质、药物、细胞、细胞亚组分或细胞器(如溶酶体、线粒体)，或任意一种其它生物或非生物分子、复合物或它们的组合。在另一实施方式中，分析物为一种抗体。而在另一实施方式中，分析物为核酸(DNA、RNA、PNA、以及它们的混合物或包括核苷衍生物或类似物的核酸)。
可利用本发明中的组合物、方法或试剂盒检测的多价配体分析物通常为聚氨基酸，即多肽、蛋白质、多糖、核酸以及它们的组合。这种组合包括细胞组分、组织、细菌、病毒、细胞壁、细胞膜、细胞器、染色体、基因、线粒体、细胞核等等。根据本发明的一方面，特定的分析物不包含核酸。
利用本发明中的方法可以有利地检测各种蛋白质分析物。这些蛋白质可以根据其家族(每个家族中的蛋白质具有相似的结构特性)、生物学功能、以及与特定微生物的关系(尤其是致病微生物)等等进行分类。本发明尤为关注的蛋白质家族包括例如：免疫球蛋白、细胞因子、酶、激素、癌抗原、营养标记物(nutritional marker)、组织特异性抗原以及生物战剂。这些蛋白质分析物可能存在于血液、血清、血浆、脊髓液、滑液、唾液、尿液、精液、修复液(prostheticfluid)、细胞或组织中。
以下列出了用本发明的组合物、方法及试剂盒可以检测的在结构上相关的蛋白质分析物种类的例子：
鱼精蛋白(protamines)
组蛋白(histones)
白蛋白(albumins)
球蛋白(globulins)
硬蛋白(scleroproteins)
磷蛋白(phosphoproteins)
粘蛋白(mucoproteins)
以下列出的存在于人血浆中的，具有重要临床意义的蛋白质的例子，可以用本发明中的组合物、方法及试剂盒对其进行检测：
α1-脂蛋白(α1-Lipoprotein)
α1-抗胰蛋白酶(α1-Antitrypsin)
皮质激素传递蛋白(Transcortin)
4.6S-后白蛋白(4.6S-Postalbumin)
色氨酸缺陷蛋白(Tryptophan-poor)
α1-糖蛋白(α1-Glycoprotein)
α1x-糖蛋白(α1x-Glycoprotein)
甲状腺素结合球蛋白(Thyroxin-binding globulin)
α-间胰蛋白酶抑制剂(Inter-α-trypsin-inhibitor)
Gc-球蛋白(Gc-globulin)
(Gc1-1)
(Gc2-1)
(Gc2-2)
结合珠蛋白(Haptoglobin)
(Hp1-1)
(Hp2-1)
(Hp2-2)
血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)
乙酰胆碱酯酶(Cholinesterase)
α2-脂蛋白(α2-Lipoprotein(s))
肌红蛋白(Myoglobin)
C-反应蛋白(C-Reactive Protein)
α2-巨球蛋白(α2-Macroglobulin)
α2-HS-糖蛋白(α2-HS-glycoprotein)
Zn-α2-糖蛋白(Zn-α2-glycoprotein)
α2-神经胺酸糖蛋白(α2-Neuramino-glycoprotein)
促红细胞生成素(Erythropoietin)
β-脂蛋白(β-lipoprotein)
转铁蛋白(Transferrin)
血液结合素(Hemopexin)
纤维蛋白原(Fibrinogen)
血纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)
β2-糖蛋白I(β2-glycoprotein I)
β2-糖蛋白II(β2-glycoprotein II)
免疫球蛋白G(Immunoglobulin G)
(IgG)或γG-球蛋白(IgG or γG-globulin)
分子式：γ2k2或γ2λ2
免疫球蛋白A(IgA)或γA球蛋白(IgA or γA-globulin)
分子式：(α2κ2)n或(α2κ2)n
免疫球蛋白M(IgM)或γM球蛋白(IgM or γM-globulin)
分子式：(μ2κ2)5或(μ2λ2)5
免疫球蛋白D(IgD)或γD球蛋白(γD)(IgD or γD-globulin)
分子式：(..2κ2)或(.δ.2λ2)
免疫球蛋白E(IgE)或γE球蛋白(γE)(IgE or γE-globulin)
分子式：(ε2κ2)或(ε2λ2)
游离的κ和λ轻链(Free κ and λ light chains)
补体因子：(Complement factors)
C′1
C′1q
C′1r
C′1s
C′2
C′3
β1A
α2D
C′4
C′5
C′6
C′7
C′8
C′9
用本发明的组合物、方法及试剂盒可以检测的重要凝血因子包括下表中列出的例子：
Figure S05838082820070511D000071
Figure S05838082820070511D000081
利用本发明中的组合物、方法及试剂盒可以检测的重要的蛋白质激素包括：
肽和蛋白质激素(Peptide and Protein Hormones)
甲状旁腺激素(Parathyroid hormone(parathromone))
降钙素(Thyrocalcitonin)
胰岛素(Insulin)
胰高血糖素(Glucagon)
耻骨松弛激素(Relaxin)
促红细胞生成素(Erythropoietin)
促黑素细胞激素(黑素细胞刺激激素；中叶素)(Melanotropin(melanocyte-stimulating hormone；intermedin)
生长激素(Somatotropin(growth hormone))
促肾上腺皮质激素(Corticotropin(adrenocorticotropic hormone))
促甲状腺素(Thyrotropin)
卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone)
黄体生成素(促间质细胞激素)(Luteinizing hormone(interstitialcell-stimulating hormone))
催乳激素(Luteomammotropic hormone(luteotropin，prolactin))
促性腺激素(绒毛膜促性腺激素)(Gonadotropin(chorionic gonadotropin))
组织激素(Tissue Hormones)
分泌素(Secretin)
胃泌素(Gastrin)
血管紧张素I和II(Angiotensin I and II)
舒缓激肽(Bradykinin)
人胎盘催乳激素(Human placental lactogen)
细胞因子(Cytokines)
IL 1
IL 2
IL 4
IL 6
I1 8
I1 10
EGF
TNF
NGF
癌抗原(Cancer Antigens)
PSA
CEA
α-胎蛋白(α-fetoprotein)
酸性磷酸酶(Acid phosphatase)
CA19.9
CA125
组织特异性抗原(Tissue Specific Antigens)
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
肌红蛋白(myoglobin)
CPK-MB
肌钙蛋白(Troponin)
BNP
原BNP
降钙素(Calcitonin)
髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein)
神经垂体来源的肽类激素(Peptide Hormones from the Neurohypophysis)
催产素(Oxytocin)
抗利尿激素(Vasopressin)
释放因子(RF，Releasing factors)CRF，LRF，TRF，生长激素释放因子(Somatotropin-RF)，GRF，FSH-RF，PIF，MIF
蓖麻蛋白(Ricin)
白喉毒素(Diptheria toxin)
肉毒杆菌毒素(Botulism toxin)
葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcus enterotoxin B)
细菌和病毒也可以作为分析物，用本发明中的组合物、方法及试剂盒进行检测。包括以下生物分析物：
棒状杆菌(Corynebacteria)
白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)
肺炎球菌(Pneumococci)
肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)
链球菌((Streptococci)
化脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)
唾液链球菌(Streptococcus salivarus)
葡萄球菌(Staphylococci)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)
奈瑟氏菌(Neisseria)
脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitides)
淋球菌(Neisseria gonorrhea)
肠细菌(Enterobacteriaciae)
大肠杆菌(Caliform)
大肠埃希杆菌(Escherichia coli)
产气肠杆菌(Aerobacter aerogenes)
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)
沙门氏菌(Salmonellae)
伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhosa)
猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)
志贺氏菌(Shigellae)
痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteria)
施米茨氏志贺氏菌(Shigella schmitzii)
胶醇志贺氏菌(Shigella arabinotard)
弗莱克斯纳氏志贺氏菌(Shigella flexneri)
鲍伊德氏志贺氏菌(Shigella boydii)
宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)
其它肠道杆菌(Other enteric bacilli)
普通变形杆菌(proteus vulgaris)
奇异变形杆菌(proteus mirabilis)
不动杆菌属(Proteus species)
摩根氏变形杆菌(Proteus morgani)
绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
嗜血-伯德特氏群(Hemophilus-Bordetella Group)
流感嗜血杆菌(Hemophilus influenza)
杜克雷嗜血杆菌(Hemophilus ducryi)
嗜血杆菌(Hemophilus hemophilus)
埃及嗜血杆菌(Hemophilus aegypticus)
副流感嗜血菌(Hemophilus parainfluenza)
百日咳伯德特氏菌(Bordetalla pertussis)
巴斯德氏菌(Pasteurellae)
鼠疫巴斯德氏杆菌(Pasteurella pestis)
土拉巴斯德氏杆菌(Pasteurella tulareusis)
布鲁氏菌(Brucellae)
羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)
流产布氏杆菌(Brucellaa bortus)
猪布鲁氏菌(Brucella suis)
需氧芽孢杆菌(Aerobic Spore-forming Bacilli)
炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
厌氧芽孢杆菌(Anaerobic Spore-forming Bacilli)
肉毒梭菌(Clostridium botulium)
破伤风梭菌(Clostridium tetani)
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)
诺维氏梭菌(Clostridium novyi)
腐败梭菌(Clostridium septicum)
溶组织梭菌(Clostridium histolyticum)
第三梭菌(Clostridium tertium)
双酶梭菌(Clostridium bifermentans)
产孢梭菌(Clostridium sporogenes)
分支杆菌(Mycobacteria)
人结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis hominis)
牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)
鸟分支杆菌(Mycobacterium avium)
麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)
副结核分支杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)
放线菌(类真菌样细菌)(Actinomycetes(fungus-like bacteria)
伊斯雷尔氏放线菌(Actinomyces Isaeli)
牛放线菌(Actinomyces bovis)
奈斯隆迪氏放线菌(Actinomyces naeslundii)
星状诺卡氏菌(Nocardia asteroids)
巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)
螺旋体(The Spirochetes)
梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)
细弱密螺旋体(Treponema pertenue)
品它病密螺旋体(Treponema carateum)
回归热螺旋体(Borrelia recurrentis)
黄疸出血钩端螺旋体(Leptospira icterohemorrhagiae)
犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)
锥虫体(Trypanasomes)
支原体(Mycoplasmas)
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
其它病原体(Other pathogens)
立克次氏体(类细菌样诸虫)(Rickettsiae(bacteria-like parasites))
普瓦基克氏立克次氏体(Rickettsia prowazekki)
莫赛尔氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)
立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)
康诺尔氏立克次氏体(Rickettsia conori)
澳大利亚立克次氏体(Rickettsia australis)
西伯利亚立克次氏体(Rickettsia sibiricus)
小蛛立克次氏体(Rickettsia akari)
恙虫热立克次氏体(Rickettsia tsutsugamushi)
衣原体(不可归类的寄生细菌或病毒)(Chlamydia(unclassifiableparasitesbacterial/viral))
衣原体因子(不确定命名)(Chlamydia agents(naming uncertain))
真菌(Fungi)
新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)
皮炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)
荚膜组织胞浆菌(Hisoplasma capsulatum)
粗球孢子菌(Coccidioides immitis)
巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)
白色念珠菌(Candida albicans)
烟曲霉菌((Aspergilus fumigatus)
伞状毛霉菌(伞枝犁头霉)(Mucor corymbifer(Absidia corymbifera))
米根霉(Rhizopus oryzae)
无根根霉菌(Rhizopus arrhizua)
藻菌(Phycomycetes)
黑色根霉菌(Rhizopus nigricans)
申克氏孢子丝菌(Sporotrichum schenkii)
裴氏着色霉(Flonsecaea pedrosoi)
紧密着色芽生菌(Fonsecacea compact)
皮炎着色芽生菌(Fonsecacea dermatidis)
卡氏枝孢霉(Cladosporium carrionii)
疣状瓶霉(Phialophora verrucosa)
构巢曲霉菌(Aspergillus nidulans)
足马杜拉分支菌(Madurella mycetomi)
灰马杜拉分支菌(Madurella grisea)
波伊德霉样真菌(Allescheria boydii)
琼塞尔梅氏瓶霉菌((Phialophora jeanselmei)
石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)
须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)
埃吉罗氏角质线菌(Keratinomyces ajelloi)
犬小孢子菌(Microsporum canis)
奥杜盎氏小孢子菌(Microsporum adouini)
红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)
病毒(Viruses)
腺病毒(Adenoviruses)
疱疹病毒(Herpes Viruses)
单纯疱疹(Herpes simplex)
水痘(禽痘)(Varicella(Chicken pox))
带状疱疹(Herpes Zoster(Shingles)
病毒B(Virus B)
细胞巨化病毒(Cytomegalovirus)
痘病毒(Pox Virus)
天花(Variola(smallpox))
牛痘(Vaccinia)
牛痘病毒(Poxvirus bovis)
副牛痘(Paravaccinia)
传染性软疣(Malluscum contagiosum)
微小核糖核酸病毒(Picornaviruses)
脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)
柯萨奇病毒(Coxsachievirus)
艾柯病毒(Echoviruses)
鼻病毒(Rhinoviruses)
黏病毒(Myxoviruses)
副流感病毒(1-4)(Parainfluenza(1-4))
腮腺炎病毒(Mumps Virus)
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)
麻疹病毒(Measles Virus)
牛瘟病毒(Rinderpest Virus)
犬瘟病毒(Canine Distemper Virus)
呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus)
风疹病毒(Rubella Virus)
虫媒病毒(Arboviruses)
东部马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)
西部马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus)
辛德毕斯病毒(Sindbis Virus)
奇孔冈雅病毒(Chikugunya Virus)
塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)
梅阿罗病毒(Mayora Virus)
圣路易脑炎病毒(St.Louis Encephalitis Virus)
普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)
加利福利亚脑炎病毒(California Encephalitis Virus)
科罗拉多蜱传热病毒(Colorado Tick Fever Virus)
黄热病病毒(Yellow Fever Virus)
登革病毒(Dengue Virus)
呼吸道肠道病毒(Reoviruses)
呼吸道肠道病毒1-3型(Reovirus Types1-3)
逆转录酶病毒(Retroviruses)
人类免疫缺陷病毒I和II型(HIV)(Human Immunodeficiency VirusesIandII(HIV))
人嗜T淋巴细胞病毒I和II型(HTLV)(Human T-cell Lymphotrophic
Virus I & II(HTLV))
肝炎(Hepatitis)
甲型肝炎病毒(Hepatitis A Virus)
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus)
丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus)
癌病毒(Cancer Viruses)
劳舍尔氏白血病病毒(Rauscher Leukemia Virus)
格劳斯氏病毒(Gross Virus)
马龙尼氏白血病病毒(Maloney Leukemia Virus)
人乳突瘤病毒(Human Papilloma Virus)
此外，需要检测患者的正常或患病的组织或细胞。例如，特定循环癌细胞或其它细胞的存在或缺失，对于疾病可能具有诊断价值。因此，病人的内源性细胞可作为分析物，通过本发明中的组合物、方法及试剂盒可以方便的对其进行检测。
本文所述的“亲和分子”指的是可以特异性结合另一分子的任意分子。在本发明的某一实施方式中，所述亲和分子为抗体。在本发明的另一实施方式中，所述亲和分子为抗原。在其它实施方式中，亲和分子包括但不限于：核酸(DNA、RNA、PNA、以及它们的混合物，或包含核苷酸衍生物或类似物的核酸)；生物受体分子(如胰岛素受体)；受体的对应配体(如对应于胰岛素受体的胰岛素)；对另一分子具有亲和力的生物分子、化学分子及其它分子，如生物素和抗生物素蛋白。本发明中的亲和分子不一定包含完整的天然分子，而可以仅由天然分子或非天然分子的一个部份、一个片段或一个亚单元组成，如抗体的Fab片段。此外，所述亲和分子也包含可检测的标记。
亲和分子可以通过本领域中任何已知的方法产生。例如，抗体可存在于抗血清中，可以从杂种瘤组织培养液上清中或腹水液中制备得到，或可通过本领域中熟知的重组表达系统制得。通过化学反应、酶促反应或其它反应可以制得抗体、受体或其它组分的片段、部分或亚单位，如众所周知的分子(如Fab，Fab′)或新的分子。本发明中的亲和分子还包括重组分子、嵌合分子和杂交分子，如人源化抗体、灵长源化抗体以及其它非天然抗体形式分子。本领域的技术人员可以发现，上述的关于各种抗体形式的非限制性例子还可以拓展到适用于本发明方法的其它亲和分子，包括：重组分子、嵌合分子、杂交分子、截断分子等形式的非抗体分子。
如本文所用，术语“特异性地结合”和“特异性结合”指的是抗体或其它分子，尤其是本发明中的亲和分子，其在本发明中的特定条件下，对目标分子(如抗原、配体和其它分析物)的亲和力高于对其它分子的亲和力。本领域中已知的抗体或抗体片段，为具有可结合其它分子(如抗原)的区域的多肽分子。在本发明的各个实施方式中，“特异性结合”指的是抗体或其它亲和分子结合目标分析物分子的能力至少是其结合与目标分子不相关的其它分子的能力的106倍，优选的倍数至少约为107，更优选的倍数至少约为108，最优选的倍数至少约为109。通常，特异性结合指的是亲和力比非特异性结合高约106—109倍多。在某些实施方式中，特异性结合的特征为其亲和力是非特异性结合的109倍多。本文所述的任意范围，如“1-10或一到十”，表示的是该给定范围内的任意整数或非整数单位，没有任何限制。因此，“1-10”表示的是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以及其间的任意亚单位。
“多克隆抗体”或“PAb”，为抗体分子的异质性群体，其来源于接受抗原或抗原功能性衍生物免疫的动物血清。通过注射抗原或半抗原-载体结合物，并任选地添加佐剂，以免疫宿主动物(如兔、小鼠或羊)，从而生产多克隆抗体。多克隆抗体可以是未纯化、纯化或部分纯化，从而除去抗血清中的其它组分。多克隆抗体的制备和纯化技术为本领域中熟知的方法，并在各类概述性的或详尽的参考文献中均有描述，包括但不限于：Kabat & Mayer，ExperimentalImmunochemistry，2d ed.，(Thomas，Springfield，IL(1961)(《实验免疫化学》，第二版)；Harlow & Lane，Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988))(《抗体：实验手册》(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1988)；Weir，Handbook of ExperimentalImmunology，5th ed.(Blackwell Science，Cambridge，MA(1996))(《实验免疫学手册》，第五版).
“单克隆抗体”或“Mab”为针对某一特定抗原的抗体分子的同质性群体，其可以通过制备抗体分子的任意技术制得，如通过细胞株的连续培养。这些技术包括但不限于：杂交瘤技术(Kohler & Milstein，Nature，256：495-7(1975)；美国专利美国专利4,376,110))，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，Immunology Today，4：72(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：2026-30(1983))，EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(《单克隆抗体与癌症治疗》)，Alan R.Liss，Inc.，New York，第77-96页(1985))。这些抗体可属于任何免疫球蛋白类，包括：IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其亚类。本发明中用于产生MAb的杂交瘤可以在体内或体外培养。鉴于体内所得的MAb的高滴定度，该方法为目前优选的生产MAb的方法。
此外，本发明也可以使用用于产生“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.，81：6851-6855(1984)；Takeda等，Nature，314：452-54(1985))，该方法通过将具有适宜抗原特异性的鼠源抗体分子基因和具有特定生物活性的人源抗体基因进行剪接，制得“嵌合抗体”。“嵌合抗体”分子中的不同部分来源于不同的动物种类，如同时含有来源于鼠MAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体分子。
或者，单链抗体制备技术(美国专利4,946,778；Bird，Science242：423-26(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-83(1988)；Ward等，Nature，334：544-46(1989))也适用于制备本发明的基因-单链抗体。单链抗体通常是通过将Fv区的重链和轻链以氨基酸键连接从而产生单链多肽来形成的。
识别特定抗原表位的抗体片段可以通过现有技术制得。例如，这些片段包括但不限于：通过用胃蛋白酶消化抗体分子所得的F(ab′)2片段，通过还原F(ab′)2片段间的二硫键所得的Fab片段。此外，可以构建Fab表达文库(Huse等，Science，246：1275-81(1989))，以保证以所需的特异性对单克隆Fab片段进行快速、简便的识别。
本文所述“半抗原”是指可以被抗体识别的小的蛋白质(proteinaceous)或非蛋白质抗原决定簇。通常，半抗原在动物体内不引起抗体形成，除非较大的部分种类。例如，小肽半抗原通常和载体蛋白如钥孔
Figure S05838082820070511D00018171829QIETU
血蓝蛋白相结合，以产生抗半抗原抗体应答。“抗原”为在动物体内可以引起抗体应答的大分子，其可以被所得抗体识别。抗原和半抗原至少包含一个抗原决定簇或“抗原表位”，作为抗原或半抗原结合抗体的部位。通常，半抗原上的抗原表位为整个分子。
“受体”或“生物受体”常特指细胞内部或表面的一种分子结构，其可选择性的结合特定的物质(如配体)并伴随结合产生特定的生理效应。受体的例子包括：细胞表面的肽类激素受体、神经递质受体、抗原受体、补体片段受体和免疫球蛋白受体、以及胞质中的甾体类激素受体。本发明所述的受体通常是指可以被分离纯化的，而无需影响或能够影响生理或其它生物效应的受体。本发明的方法利用了受体对特异性物质的选择性结合。
术语“配体”广义上为可以结合受体的分子。更具体的说，配体为可溶性的小分子，如激素或神经递质。
“固体支持物”指任何可以用于固定诸如分析物、抗体或复合物的固相。本领域中常见的合适的固体支持物有反应槽(如微量滴定板)的槽壁、试管壁、聚苯乙烯珠粒、顺磁性或无磁性珠粒、硝化纤维素膜、尼龙膜、微粒(如橡胶微粒)、以及羊(或其它动物)的红细胞。固体支持物的代表性材料包括但不限于：聚氯乙烯(PVC)、聚苯乙烯、纤维素、尼龙、橡胶以及其衍生物。此外，可以对固体支持物进行包衣、衍生化或修饰，以促进期望分子(如分析物)的附着和/或防止非特异性结合或其它非期望的相互作用。对特定“固体支持物”的选择并不严格，可以由本领域的技术人员根据所用分析方法进行选择。因此，橡胶颗粒、微粒、顺磁性或无磁性珠粒、膜、塑料试管、微量滴定板壁、玻璃或硅芯片、以及红细胞都可用作合适的固体支持物。考虑到使用的便利，可以根据不同的检测方法来选择固体支持物。例如，选用96孔板或384孔板用于自动分析，如自动化工作站，和/或通过例如读板器进行测定的分析方法。当本发明的方法涉及到采用基于薄膜显影的放射自显影或化学发光检测步骤时，可以选用薄膜作为固体支持物，如硝化纤维素膜或尼龙膜。本发明的某一实施方式中，通常选择反应槽孔的槽壁用于双抗体夹心免疫分析。而在本发明的其它实施方式中，可以选用顺磁性珠粒作为固体支持物。将分子固定于固体相上的方法包括：离子作用、疏水作用、共价作用等，以及它们的组合作用。然而，固定的方法并非特别重要，其中可能涉及到一些不明的吸附机理。本文中所述的“固体支持物”，可以指任何不溶性物质，或是可以通过后续反应转变为不溶性的物质。可以根据固体支持物吸附和固定捕获剂的固有能力，对其进行选择。或者，固体相上可以保留一个附加的受体，该受体具有吸附和固定捕获剂的能力。该附加的受体可含有和捕获剂本身或接合在捕获剂上的带电体带相反电荷的物质。在本发明的另一实施方式中，该附加受体分子可以是任意一个特异性结合成分，其固定(或连接)在固体相上，并能通过特异性结合反应将捕获剂固定化。该附加的受体分子在分析前或分析过程中，可以间接地将捕获剂固定在固体相上。因此固体相可以是塑料、塑料衍生物、顺磁性或非磁性金属、试管的玻璃或硅表面、微量滴定板、薄片、珠粒、微粒、芯片、或其它本领域普通技术人员已知的元件。
“肽”广义上指通过肽键连接的短链氨基酸。典型的肽链含有约2-100个氨基酸，更典型的含有4-50个氨基酸，最常见的为6-20个氨基酸。“多肽”通常指长度长于肽，的单个直链或带侧链的氨基酸序列。“多肽”的长度通常为至少具有约100-1000个氨基酸，更典型的至少具有约150到600个氨基酸，而常常至少具有约200-500个氨基酸。“蛋白质”包括单个多肽和多个多肽链的复合物，其中每个多肽链可能相同或不同。蛋白质中的多个多肽链，可以根据其一级结构中的氨基酸序列、二级结构、三级结构和四级结构进行辨别；它们可通过某种方式如二硫键相结合；它们也可包括了合成后修饰，如糖基化、磷酸化、截短或其它方法等，但不仅限于上述修饰。抗体，如IgG蛋白，典型地具有四条通过二硫键相互结合的多肽链(即两条轻链，两条重链)。此外，蛋白质可以包含附加成分，如结合的金属(如铁、铜和硫)和其它部分。本文关于肽、多肽和蛋白质的定义，包括但不限于：其生物活性形式和无活性形式；天然形式和变性形式；以及它们的变异、修饰、截短、杂交和嵌合形式。本发明中的肽、多肽和蛋白质可以为任何来源或可通过任何方式获得，包括但不限于：从天然组织或其它物质中提取；在宿主生物体(如细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞)中重组生产；以及运用本领域中技术人员所熟知的方法进行化学合成。
本文所述的“接合物”指通过共价结合或其它方式连接在一起的两个分子。在某一实施方式中，通过将核酸共价结合到蛋白质、多肽或其它亲和分子上，制备了核酸结合物。在本发明的优选实施方式中，蛋白质、多肽或其它亲和分子通过连接基团共价结合到核酸上，以形成结合物。
本文所述用于检测样品中分析物的存在的“试剂盒”可例如至少包括一个容器，其内装有可以特异性地结合待测分析物的结合对。该试剂盒还可包括其它容器，其内装有以下物质：样品检测必需的缓冲液、溶液或其它试剂和物质；有助于扩增结合对中核酸探针的试剂；扩增后用于检测核酸成分的存在的试剂。优选的试剂盒还应包括使用说明。如果用于疾病诊断，试剂盒还应包括FDA的使用批准文件及其使用说明。
具体而言，间隔试剂盒包括任何试剂盒，其中试剂分别装在独立的容器中。这些容器包括：小玻璃容器、塑料容器、塑料条或纸条。这样的容器布局保证使用时试剂可以有效地从一个隔间(compartment)转移到另一隔间，从而使得样品与试剂不会交叉污染，同时每个单独容器中的试剂或溶液可以定量的从一个隔间加入到另一隔间。这样的容器包括可以容纳待测样品的容器、装有分析所需的探针或底物的容器；装有缓冲液或试剂(如磷酸缓冲盐溶液、Tris缓冲液等)的容器；装有用于检测核酸标记、扩增后样品的试剂的容器，等等。本领域中的技术人员可以轻易地发现，本发明中制备结合对所必需的结合对/物质、原料或试剂可以轻易地加入本领域中熟知的试剂盒形式中。
根据本发明的方法，用于使DNA连接至抗体上或其它亲和分子上的试剂盒可至少包括一个装有冻干的、活化的DNA的容器。该试剂盒也可以包括其它容器，其中装有以下物质中的一种或多种：试剂、缓冲液、反应后用于检测核酸存在的试剂。优选的试剂盒还应包括使用说明书。用于制备或利用本发明的新组合物的试剂盒和对分析物进行分离分析所用的方法可包括已制备的微泡或用于产生微泡的薄膜。同样，试剂盒中的微泡可以是连接了亲和分子的或未连接亲和分子的。所述试剂盒中还可以包括装有一种或多种以下物质的其它容器：试剂、缓冲液、用于产生微泡的试剂或将微泡用于亲和分离、纯化、浓缩的试剂等。优选的试剂盒还应包括使用说明书。本领域中的技术人员可以很容易地发现，本发明中的组合物和方法可以简便的适用于本领域中已确定的试剂盒形式。
本发明提供了新型的组合物和方法，其可用于分析物也包括细胞、病毒、细胞亚组分和溶液中可溶性分子等的分离和分析。本发明基于包衣微泡，其可以特异性结合到目标分析物(细胞、病毒、细胞亚组分或可溶性分子)上。本发明中的微泡为亲和分子包衣，或将亲和分子展示于其外表面。本发明新颖的组合物和方法也可用于浓缩分析物，包括但不限于：抗体、抗原、蛋白质和核酸。
在某一实施方式中，亲和分子包衣的微泡还含有可检测的标记。在另一实施方式中，亲和分子本身为可检测的标记。在这些实施方式中，通过该标记可以检测分析物、样品或微泡的数量或存在与否，或对其进行定量。在某一实施方式中，微泡上的所述标记为核酸，其可以为被扩增并检测。检测技术包括而不仅局限于：PCR、核苷酸测序、PCR测序、分子信标技术(molecular beacon)、杂交、PCR后的杂交、荧光、放射性同位素标记、磷光和吸光。用于检测的试剂的例子包括而不仅局限于：放射性同位素、酶标记(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)、荧光素、磷光、生物发光、化学发光素、亲和标记(如生物素、抗生物素蛋白、链亲和素)以及其它本领域技术人员熟知的试剂。上述实施方式为非限制性的，可以预见其它适用于本发明的实施方式。
在本发明的某一实施方式中，微泡为蛋白质微泡，其可以由任意肽、多肽、蛋白质或其混合物组成。人工合成的或天然的肽、多肽、蛋白质或它们的组合均符合本发明。在某一实施方式中，可以采用通入气体来轻易制得蛋白质微泡。在某一实施方式中，所述蛋白质为白蛋白。
本发明中通常通过向蛋白质溶液中引入气体(如超声)，可以制得蛋白质微泡。微泡内可以含有任何气体，包括但不限于：氧气、氮气、二氧化碳、氦气、碳氟化合物及其各种组合，如空气。作为本发明的一个方面，可以通过包括加热蛋白质溶液步骤的方法向其中引入气体。通过加热使蛋白质变性，可以稳定蛋白质微泡，但并不仅局限于该理论。在另一实施方式中，可例如通过蛋白质变性、蛋白质固定、蛋白质交联或以Cr+++处理，可以稳定蛋白质微泡。作为本发明的另一方面，用醛类化合物，如戊二醛或甲醛进行交联，可以稳定微泡。
蛋白质微泡的直径一般在0.1μm到100μm的范围内，通常是在1μm到50μm的范围内，常见是在2μm到20μm或2μm到30μm的范围内。
本发明中的亲和分子可以是受体、配体或抗体。或者，亲和分子还可以是生物素、抗生物素蛋白或链亲和素。在本发明的某一实施方式中，以链亲和素对生物素化的微泡进行包衣，从而制得一种可以轻易被生物素化配体(如抗体)包衣的微泡。在另一实施方式中，微泡为配体包衣的微泡。
微泡的亲和分子包衣过程可以选用本领域中的任何已知方法。有利的是，蛋白质含有氨基官能团，其可以作为很多修饰反应或连接反应的基础，如和醛类化合物反应。而且，技术人员可以发现，可对组成微泡的物质，如蛋白质、玻璃等，进行化学衍生化或功能化，从而使其可以和各种亲和分子相互作用。技术人员熟知多种用于将蛋白质或其它分子连接到微泡上的市售试剂、产品和试剂盒。亲和分子可以直接连接到蛋白质上，例如通过使用异双功能试剂，如4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯。
在本发明的另一实施方式中，亲和分子通过和至少一个其它分子相互作用，间接连接到蛋白质上。作为本发明的一个方面，微泡直接连接到链亲和素上，而亲和分子是生物素化的，从而通过链亲和素和生物素的相互作用将亲和分子连接到蛋白质上。生物素和抗生物素蛋白/链亲和素的相互作用，以及将上述分子连接到其它样品上的技术为本领域所熟知。也可参考概括性的或具体的教科书或实验室手册，其中描述了生物素、抗生物素蛋白和链亲和素的化学、生物学性质及其相互作用，和/或将生物素和抗生物素蛋白/链亲和素连接到其它分子上的方法。参见例如Avidin-Biotin Chemistry：A Handbook(Savage等编PierceChemical Co.，Rockford，IL，1992)(《抗生物素蛋白-生物素化学手册》)。
作为本发明的另一方面，包衣微泡是用玻璃微泡(如由3MTM提供的微泡)制备的。硼硅酸盐玻璃泡经氢氧化钠处理后，暴露出其硅表面，随后和硅烷化剂(silanating agent)如3-氨基-丙基-三乙氧基硅烷反应，得到伯胺包衣的表面。微泡可以和NHS-生物素反应制得生物素化的玻璃微泡，根据需要可以对其进行链亲和素包衣。然后可很容易地使该链亲和素微泡与生物素化的配体(如生物素化抗体)反应；或者，可使环氧化物包衣的玻璃微泡直接与配体反应，或根据本领域技术人员熟知的方法对其进行直接或间接的包衣。
本发明的另一实施方式提供了样品的亲和分离或亲和分析的方法。这些实施方式的方法包括下列步骤：提供用亲和分子包衣的微泡溶液；将样品与该微泡接触，所述样品能与该亲和分子在溶液中相互作用，从而制得样品包衣的微泡；使样品包衣的微泡和溶液分离。优选的实施方式为使样品包衣的微泡浮到溶液上部，从而从溶液中分离该样品。根据这个方法，可以对所有类型的样品进行亲和分离和分析，包括：蛋白质(抗原、抗体、配体、受体、激素)、核酸、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖类、碳水化合物、病毒、细胞、细胞组分、亚细胞器、亚细胞器中的组分、及其合成物。
本发明的另一实施方式提供了对样品进行亲和浓缩的方法。这些实施方式的方法包括下列步骤：提供亲和分子包衣的微泡溶液；将样品与该微泡接触，所述样品能与该亲和分子在溶液中相互作用，从而制得样品包衣的微泡；使样品包衣的微泡和溶液分离。优选的实施方式为使样品包衣的微泡浮到溶液上方，从而使该样品与溶液分离。根据这个方法，可以浓缩各种类型的样品，包括：蛋白质(抗原、抗体、配体、受体、激素)、核酸、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖类、碳水化合物、病毒、细胞、细胞组分、亚细胞器、亚细胞器中的组分、及其合成物。
可被分离、分析、纯化和浓缩的样品可以是任何类型的物质，包括：蛋白质(抗原、抗体、配体、受体、激素)、核酸(RNA、DNA、核酸类似物及其混合物等)、脂蛋白、脂肪、甘油三酯、糖类、碳水化合物、病毒、细胞、细胞组分(溶酶体、内质网等)、亚细胞器(线粒体等)、亚细胞器中的组分、及其合成物。作为该实施方式的一方面，样品为受体、配体或抗原。在某一实施方式中，样品为分析物。在其它实施方式中，样品为病毒或细胞。
本发明的包衣微泡结合到包括细胞、病毒、分析物或其它分子在内的目标样品上，随后漂浮到溶液表面，从而达到与接触溶液和非目标样品分离的效果。在分离时间为重要参数的实施方式中，通过离心含有微泡的溶液或使用气泡捕获物，可以进一步缩短分离时间。
本发明中的白蛋白微泡具有如下有用的特性：当压力或真空作用于溶液上，或加入少量去污剂或表面活性剂时，该微泡可轻易被破坏并从视野中消失。本发明的该方面在需要分离不含捕获性微泡的目标样品时尤为有用。例如，可能需要研究亲和分离细胞的表型，或需要将分离后的细胞释放出来用于后续分析或增殖。在本发明的某些实施方式中提供了一种简单的方法，其可以在避免使用潜在的破坏性试剂(如酶、烈性化学试剂以及极端的pH条件)的条件下，将样品从捕获性微泡中释放出来。而在其它实施方式中，分析物或样品则通过酶解作用或化学手段从微泡中释放出来。
玻璃微泡的优势在于可以用硼硅酸盐玻璃制得，因而很大程度上不含污染物。在常规操作中，该物质也可抗破损或毁坏。
本发明中的微泡在亲和应用方面相比固体颗粒具有额外的优势，即微泡的重力法向力和浮力具有不同的方向，从而显著减少了分离过程中对那些通常向反应容器底部沉降的样品的非特异性结合与包裹。在不会对微泡造成不良影响的条件下，通过低离心力场和适当的离心速率，有助于迫开未结合的细胞，以提高分离效果。
根据后面实施例部分中的描述，将抗细菌抗体包衣的白蛋白微泡和细菌悬液混合后，所有细菌都和微泡一起被分离，使得悬液被灭菌。类似的，在对照实验中，不含特异性抗体的微泡对细菌只有少量非特异性吸附，从而在分离后，微泡与细菌的协同纯化作用低不可测。
本发明还提供了用于亲和分离或亲和分析的微泡的制备方法，所述方法包括步骤：提供微泡；和对微泡进行亲和分子包衣。
值得注意的是，根据本文的介绍，本领域中具有基本常识的技术人员有能力将本发明应用于特定的问题和情况。下面的非限制性实施例进一步说明了本发明。下面的实施例，包括实验方法和结果，仅用于说明本发明，本发明并不限于这些实施例中。
实施例
白蛋白微泡
实施例1白蛋白微泡的制备
室温下用空气饱和的生理盐水将5％的人白蛋白溶液(USP，BayerCorporation，Elkhart，IN)稀释到1％。取20毫升稀释后溶液，加入到50毫升的玻璃烧杯中，使烧杯25毫升刻度以下浸没在85℃的水浴中。利用数字温度计监测白蛋白溶液的温度，并轻轻搅拌溶液。在73℃的处理温度下将BransonDigital 
Figure S05838082820070511D000251
450型探针(Branson Ultrasonics Corp.，Danbury，CT)加到白蛋白溶液表面，立即在80％振幅条件下超声10秒。从水浴中取出烧杯，置于碎冰中，轻轻搅拌至溶液冷却到40℃。室温下将白蛋白微泡悬液转移至150毫升的软质酸瓶(flexible carboy)中( Bag，Stedim，Cncord，CA)。用新鲜的溶液重复上述步骤多次，直至酸瓶装满。调节微泡悬液至叠氮钠浓度为0.05％，将该酸瓶垂直置于冰箱中，放置至少24小时。超声过程约可以将5％的可溶性白蛋白转化为不可溶的、充满空气的白蛋白微泡。
实施例2铬稳定白蛋白微泡的制备
在一些实验中，用Cr+++处理，以稳定白蛋白微泡。使白蛋白微泡浮起，并除去液相，代之以5mM硫酸铬钾溶液。轻微震摇，使微泡保持悬液状态，在60℃水浴中孵育30分钟。孵育后，同下法洗掉铬溶液，代之以1％人血清白蛋白的生理盐水溶液。对铬处理过的白蛋白微泡的处理方式与未用铬处理过的白蛋白微泡相同。
实施例3生物素包衣的白蛋白微泡的制备
吸弃微泡漂浮层下方的未转化的白蛋白溶液，代之以预冷的、空气饱和的含0.2％的聚乙烯醇(分子量30,000到70,000)的PBS(磷酸缓冲液，pH7.4)溶液(PVA/PBS)。轻微震摇重新悬浮微泡，并转移至底部具塞的一次性塑料注射器中。4℃，200xg反复离心，每次5分钟，吸弃下层液体，用新鲜的、预冷的、空气饱和的PVA/PBS重悬浮，以洗去残余的可溶性白蛋白。洗涤后的白蛋白微泡以PVA/PBS悬浮，浓度约为25％，室温下与浓度为0.01到1.0mg/ml的磺基琥珀酰亚胺-6-生物素酰胺己酸酯(磺基-NHS-LC-生物素；EZ-LinkTMsulfo-NHS-LC-biotin，Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL)反应至少1小时，其间轻微震摇。4℃多次离心，以预冷的、空气饱和的PVA/PBS洗去未反应的生物素。以含0.1％Triton-X100的PVA/PBS溶解等分的悬浮后的微泡，通过测定其蛋白质浓度(BCA Protein Assay，Pierce)和生物素(2-(4′-羟基偶氮苯)-苯甲酸分析法)浓度，评估生物素标记程度。白蛋白微泡的生物素化反应的通常得率范围为生物素/白蛋白(摩尔比)在40％到500％间。通过观察生物素微泡和BioMag无核酶链亲和素顺磁微粒(Polysciences，Inc.，Warrington，PA)在悬液中的自发结合确定白蛋白微泡表面生物素的利用度。将生物素包衣的白蛋白微泡冷藏在含0.05％叠氮钠的PVA/PBS溶液中。
实施例4链亲和素包衣的白蛋白微泡的制备
将生物素微泡和过量的链亲和素(Prozyme，San Leandro，CA)接触，间接制备充满空气的链亲和素包衣的白蛋白微泡。在此条件下，避免了微泡的交联。也可通过双功能团蛋白质交联剂，直接将链亲和素包衣到白蛋白微泡上。
对以PVA/PBS悬浮生物素包衣的白蛋白微泡进行完全的处理，并迅速加入10mg/ml链亲和素溶液，其间不断的旋涡混合，使之终浓度为1mg/ml，进行间接包衣。反复离心洗涤，方法同上，以洗去未反应的链亲和素。链亲和素为四价的，从而保证了生物素结合位点的有效性。
或者，使用4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(s-SMCC)对白蛋白微泡进行直接的链亲和素包衣。用5倍-10倍(摩尔比)的过量S-乙酸硫代乙酸正琥珀酰亚胺酯(SATA)在室温下处理10mg/ml链亲和素的PBS溶液(pH7.4)至少一小时。采用以PBS平衡的Sephadex G-25树脂通过FPLC将从链亲和素中去除未反应的SATA，冷冻储藏纯化的蛋白质。修饰的链亲和素在使用前用PBS(含50mM羟胺和2.5mM EDTA，pH7.5)在室温下处理2小时，以除去其上的保护性乙酰基基团。同时，用0.01-1mg/ml的s-SMCC溶液在室温下处理白蛋白微泡的PVA/PBS悬液30分钟，其间不断轻微震摇。通过4次离心洗涤立刻除去过量的s-SMCC试剂，并使s-SMCC微泡与巯基修饰的链亲和素相结合。通过马来酰亚胺官能团和新暴露出的链亲和素上巯基基团间的反应，将链亲和素共价结合到白蛋白微泡的表面。通过反复的离心洗涤除去微泡中过量的链亲和素，以预冷的、空气饱和的PBS(含0.05％叠氮钠)悬浮后，置于冰箱保存。
实施例5抗体包衣的白蛋白微泡
大肠杆菌(E.coli)0157：H7亲和纯化抗体，购自KPL公司(Gaithersburg，MD)，并按下述步骤进行生物素化。以PBS(pH7.4)溶解抗体，加热至37℃，30min。室温下用过量的8-12倍摩尔量的6-生物素酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯(EZ-LinkTM sulfo-NHS-LC-biotin)处理两小时。采用G-25Sephadex凝胶过滤层析，以PBS洗脱，除去过量的生物素。采用
Figure S05838082820070511D000271
 YM-30过滤设备(Millipore，Bedford，MA)对生物素化的抗体进行超滤浓缩，浓缩后样品置冰箱保存，加入叠氮钠为保护剂。轻微震摇重悬抗生物素蛋白包衣的白蛋白微泡，加入1摩尔过量的生物素标记的抗体溶液(溶于PBS)。同上法，通过反复离心和重悬，除去不溶性微泡中的过量物质。将抗体包衣的白蛋白微泡在4℃条件下保存于含叠氮钠的PVA/PBS溶液中。
实施例6以抗体包衣的微泡捕获细菌细胞
大肠杆菌(E.coli0157：H7)购自美国典型微生物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)，37℃条件下以LB液体培养基和琼脂培养基进行培养。将培养于液体培养基中的菌液以预冷无菌PVA/PBS溶液或含0.2％牛血清白蛋白的PBS溶液(BSA/PBS)梯度稀释至菌密度约为5,000个细胞/毫升。向细胞悬液中加入1/10体积的微泡悬液，室温下轻微震荡数分钟。10分钟内微泡在固有浮力的作用下漂浮至混合液表面。以微量移液枪吸取10微升的不含漂浮微泡的下层液体，划线接种到LB琼脂平板上，37℃培养过夜。以细菌悬液为阳性对照，可产生约50个菌落/平板。而经抗体包衣的微泡处理过的细菌悬液中不存在可产生菌落的细胞。可通过轻摇微泡悬液，取10μl接种到LB平板上，从微泡中回收细菌细胞，而经培养过夜，在所得平板上可观察到有菌落形成则证实了该回收。上述结果表明细菌细胞为抗体包衣的白蛋白微泡所捕获。以未包衣的白蛋白微泡或链亲和素包衣的白蛋白微泡处理细菌悬液，不能除去其中的细菌细胞。
实施例7通过先修饰白蛋白后超声的方法制备微泡
通过先对血清白蛋白进行生物素标记，后形成微泡，从生物素化的血清白蛋白制得白蛋白微泡，该微泡可以结合抗生物素蛋白或链亲和素。以生理盐水(含4mM辛酸钠，4mM色氨酸钠)配制50mg/ml的牛血清白蛋白(BSA；Bovuminar Cohn Fraction V，Intergen，Purchase，NY)溶液，过滤灭菌后保存于干净的玻璃容器中，室温下以荧光照射两周。该处理过程可以光氧化游离的巯基，该巯基的存在会妨碍微泡的形成。取出20毫升的上述BSA溶液，以1M NaOH调节pH至8.5。加入25毫克s-NHS-LC-生物素并混匀，室温下反应一小时，其间保持pH为8.5。用生理盐水稀释反应液至白蛋白浓度为1％，根据上述制备未修饰的白蛋白微泡的方法，进行超声。所得白蛋白微泡以1％BSA的生理盐水溶液洗涤数次，以除去未结合的生物素。用生物素化白蛋白制备所得的微泡可以同抗生物素蛋白或链亲和素反应，也可根据上述方法对其进行抗生物素蛋白包衣或链亲和素包衣。
玻璃微泡
实施例8胺包衣的玻璃微泡的制备
使密度约为0.6g/cc，平均直径约为30μm的3MTM ScotchLiteTM玻璃微泡S60HS(St Paul，MN)在水中悬浮，使其漂浮到悬液表面。从底部去除液体层，以除去细粒和碎片。该步骤可以在60毫升的顶部具塞的一次性注射器中方便地进行。反复多次冲洗。60℃下，以0.25M的NaOH悬浮经洗涤的微泡24小时，得到具有反应活性的表面羟基，然后用水洗涤除去过量的碱。随后，室温下用0.05M HCl处理微泡1小时。以水和无水丙酮依次洗涤，除去酸；将终产物置于60℃烘箱内干燥。室温下以3％的3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-APS，Sigma)的无水丙酮或甲苯溶液悬浮处理过的干燥玻璃微泡30分钟，使羟基官能团转化为氨基。以丙酮洗涤数次除去过量的硅烷，将衍生的微泡置于60℃烘箱内干燥。
在某些试验中，以70％的硫酸和9％的过氧化氢在室温下悬浮玻璃微泡16小时后，以水反复洗涤。以现配的3-APS：水：乙醇混合溶液(体积比为3:4:92)重悬上述酸处理过的微泡。室温下反应30分钟。用乙醇洗涤除去过量的反应试剂，所得玻璃微泡在115℃烘烤1小时。再次用乙醇洗涤该微泡，并置60℃烘箱内干燥。
将所得胺包衣的玻璃微泡室温下干燥保存。采用4-氧-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)丁酸s-琥珀酰酯(Pierce)分析方法，确定了微泡功能性表面胺基基团为2.5-3.0/nm2。
实施例9抗体包衣的胺玻璃微泡
以50mM的碳酸氢钠和0.1％吐温TM20的混合溶液(pH8.5)悬浮胺包衣的玻璃微泡，室温下与磺基-NHS-LC-生物素反应2小时。生物素试剂的用量为有效微泡表面胺的0.1-7倍。以含0.1％吐温TM20的PBS溶液(PBS/Tween)TM洗涤并保存该玻璃微泡。加入过量的(摩尔数)5mg/ml抗生物素蛋白溶液以饱和有效生物素位点。以PBS/TweenTM洗去残余的抗生物素蛋白，将该微泡保存于含0.2％牛血清白蛋白和0.05％叠氮钠的PBS溶液(BSA/PBS)中，置冰箱中贮存。
还可使用s-SMCC交联剂，以巯基化抗生物素蛋白对胺玻璃微泡进行包衣。以50mM磷酸钠溶液(含10％二甲替甲酰胺和2mg/ml s-SMCC，pH7.5)配制浓度为1:10(w/v)的胺玻璃微泡悬液，室温放置1小时。以100％无水乙醇洗涤马来酰亚胺包衣的玻璃微泡，排干(drain)，置于玻璃瓶中真空干燥，氮气环境中-20℃保存。经SATA修饰的抗生物素蛋白含有游离的巯基基团(见实施例4)；以羟胺处理过量的该抗生物素蛋白使其脱乙酰化，随后直接加到干燥的马来酰亚胺玻璃微泡中，可以得到抗生物素蛋白包衣的微泡。培养过夜后，用PBS/TweenTM洗去过量的抗生物素蛋白。
以1.0毫升PBS/BSA悬浮20毫克抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡，加入10μg经修饰后含2-6个生物素基团的大肠杆菌0157：H7抗体(见实施例5)。冰浴两小时，该抗体可以容易地连接到抗生物素蛋白表面包衣上，从而制得抗体包衣的玻璃微泡。所得微泡洗涤后以悬液形式置4℃保存，配制悬液所用的缓冲液有助于保持抗体的稳定性。加入牛血清白蛋白和叠氮钠作为稳定剂。
实施例10将大肠杆菌0157捕获到抗体包衣的玻璃微泡上
以预冷无菌PBS对大肠杆菌菌液进行梯度稀释至密度为5,000个细胞/毫升，所用PBS中含牛血清白蛋白和叠氮钠。以1％(v/w)抗体包衣的微泡处理细菌悬液，室温下振摇数分钟。待微泡漂浮至液面后，取10μl下层液体(不含漂浮的微泡)接种到琼脂平板上，以未经处理的菌液为对照进行平行比较。以未包衣的微泡处理过的菌液经37℃琼脂平板培养过夜后，形成的菌落单元相比未经微泡处理过的菌液无明显减少。而经抗体包衣玻璃微泡处理过的细菌悬液所形成的菌落数减少了50％-100％，经重悬浮和平板培养回收这些菌落形成单元。上述结果表明细菌细胞被特异性抗体包衣的玻璃微泡所捕获。
实施例11抗体包衣的环氧化物玻璃微泡
以0.1M硼酸钠和0.15M氯化钠的混合溶液(pH9.0)洗涤并悬浮3MTMScotchLiteTM玻璃泡H2O/1000。加入5mg/ml抗生物素蛋白，4℃培养该悬液48小时。以含0.05％叠氮钠的BSA/PBS洗涤该抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡，以除去未结合的抗生物素蛋白，并以相同溶液保存该玻璃微泡。所得抗生物素微泡具有生物素标记的抗大肠杆菌0157：H7抗体包衣，根据上法可以除去菌液中的细菌。
实施例12顺式-二醇包衣的玻璃微泡的制备
根据实施例6的方法，制得带有活性羟基基团的玻璃微泡。室温下，以含6％3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(v/v)的无水丙酮处理干燥的玻璃微泡3小时，使其硅烷化。以丙酮洗去过量的硅烷化试剂后，以0.05M HCl悬浮微泡，60℃，2小时，将环氧官能团转换为顺式-二醇官能团。以丙酮洗去酸，37℃干燥微泡过夜。所得顺式-二醇玻璃微泡室温干燥保存。
室温下，在密闭容器中以0.3M羰基二咪唑(CDI)的无水丙酮溶液活化25％的顺式-二醇包衣的玻璃微泡悬液1小时，每隔10分钟排气一次。以无水丙酮洗去过量的试剂后，室温真空干燥该玻璃微泡。活化的微泡在氮气环境中-4℃干燥保存。
CDI活化的玻璃微泡与4mg/ml抗生物素蛋白溶液(溶剂为0.1M碳酸钠，pH9.5)室温下培养过夜，对其进行抗生物素蛋白包衣。加入0.2M磷酸二氢钠，下调pH至6.5。以含叠氮钠的BSA/PBS洗涤并保存所得的抗生物素蛋白包衣的玻璃微泡。
采用了含生物素标记的抗大肠杆菌0157：H7抗体的微泡，按上述方法从悬液中除去细菌。和对照样品相比，本实验所形成的菌落数减少，证明菌液中细菌减少了50-100％。
在某些实验中，室温下用0.2M高碘酸钠溶液活化顺式-二醇包衣的玻璃微泡90分钟。以水和乙醇依次洗涤产物后室温干燥。该化学反应使得玻璃微泡表面包有氨基反应性醛基官能团。后续的抗生物素蛋白包衣，生物素化抗体包衣以及相关测试，步骤同上，结果相似。

Claims (9)

1.一种亲和分离或亲和分析样品的非诊断用途的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)提供亲和分子包衣的白蛋白微泡的溶液，所述亲和分子特异性地结合样品；
(b)在溶液中使所述微泡与所述样品接触，所述样品与包覆在微泡上的所述亲和分子相互作用，从而产生样品包衣的微泡；
(c)使所述样品包衣的微泡漂浮至液面上；
(d)将所述样品包衣的微泡与游离的样品和溶液分开；和
(e)通过用去污剂或表面活性剂处理所述样品包衣的微泡来破坏所述微泡。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和分子选自：受体、配体、或抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和分子为生物素。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和分子为抗生物素蛋白或链亲和素。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为受体、配体或抗原。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为分析物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品为病毒、细胞或它们的亚组分。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品以生物素、抗生物素蛋白或链亲和素修饰。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括离心所述微泡和溶液，其中所述样品在重力作用下形成丸状，从而有助于所述样品包衣的微泡与游离样品和溶液的分离。
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