CN101061223A - 基因多态性检测方法、诊断方法以及用于其的装置及检验试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以从样品制备阶段开始自动进行多SNP位点的分型(typing)的基因多态性检测方法。其特征在于，按照规定的温度循环，使样品(2)与PCR反应液(4)的混合液进行PCR反应。在PCR反应结束后，添加侵入试剂(6)。随后，已添加侵入试剂(6)的反应液被添加到分型反应部的探针固定部(8)，使其反应。分别对应多SNP位点的各位点、发出荧光的侵入探针，被个别保持在探针固定部(8)的各位点，反应液与侵入探针反应，只要与该侵入探针对应的SNP存在，就可以发出荧光。

Description

基因多态性检测方法、诊断方法以及用于其的装置及检验试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测以人为代表的动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是SNP(单碱基多态性)的方法、装置、试剂，以及使用该结果进行疾病发病率的诊断或进行所给予的药剂的种类与效果以及副作用之间的关系等的诊断的方法及其装置。
该基因多态性检测方法或装置可以用于基因分析的研究或临床领域。
背景技术
作为利用基因多态性来预测疾病的患病容易程度等的方法或装置，提出了如下所述的方法或装置。
为了决定患者是否容易患上败血病及/或败血病是否快速进展，从患者身上采集核酸样品，检测该样品中的型式2(pattern 2)等位基因或与型式2等位基因连锁不平衡的标记基因，如果检测出型式2等位基因或与型式2等位基因连锁不平衡的标记基因，则判断为该患者容易患败血病(参照专利文献1。)。
为了诊断人的flt-1基因中的1或其以上的单核苷酸多态性，通过决定人核酸的1或其以上的位置：1953、3453、3888(分别按照EMBL受理编号X51602中的位置)、519、786、1422、1429(分别按照EMBL受理编号D64016中的位置)、454(按照序列编号3)及696(按照序列编号5)的序列，参照flt-1基因中的多态性，决定此人的体质(特开2001-299366号公报。)。
有与鉴别SNP位点的碱基即分型有关的很多手法的报道。下述手法是其中具有代表性的手法。
为了使用较少量的基因组DNA，对涉及到数十万处的SNP位点进行分型，使用基因组DNA及多对引物同时扩增至少包括一个单碱基多态性位点的多个碱基序列，使用扩增后的多个碱基序列，利用分型工序辨别该碱基序列中含有的单碱基多态性位点的碱基。作为该分型工序，使用侵入(invade)法或Taqman PCR法(参照专利文献3。)。
但是，在SNP的分型中，在进入扩增工序的阶段必须配制基因组DNA，其中需要花费时间、人力和成本。
另一方面，如果只着眼于扩增DNA的PCR法，还提出了不用进行前处理而从血液等样品直接进行PCR反应的方法。于是，在扩增含有基因的样品中的目的基因的核酸合成法中，向基因扩增反应液中添加含有基因的样品中的基因包含体或含有基因的样品本身，在添加后的该反应液的pH为8.5～9.5(25℃)下，扩增含有基因的样品中的目的基因(参照专利文献4。)。
专利文献1：特表2002-533096号公报
专利文献2：特开2001-299366号公报
专利文献3：特开2002-300894号公报
专利文献4：专利第3452717号公报
专利文献5：专利第3494509号公报
非专利文献1：Hsu T.M.，Law S.M.Duan S，Neri B.P.，Kwok P.Y.，“利用双色荧光偏振技术的侵入检测，对单核苷酸多态性进行的基因分型(Genotyping single-nucleotide polymorphisms by the invader assay withdual-color fluorescence polarization detection)”，Clin.Chem.，2001Aug；47(8)：1373-7
发明内容
就已经构建的分型系统而言，为了用PCR法扩增需要进行分型的多个SNP区域，虽然最初采集的DNA量很少即可，但在用PCR法扩增之前，必需进行预先从生物体样品中提取DNA的前处理。为此该前处理需要花费时间和人力。
另一方面，已经确立了在不从血液等生物体样品中提取核酸的状态下，直接利用PCR法进行扩增的方法，但在将该直接PCR法与分型方法结合起来时，对需要进行分型的多个SNP位点同时进行扩增的自动化系统尚未构建起来。
于是，本发明的目的在于，可以从样品的配制阶段开始自动地进行用于多个目的SNP位点的分型。
本发明的基因多态性检测方法包括：使未实施核酸提取操作的生物体样品，直接作用于含有将各多个多态性位点分别夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液，使基因组DNA扩增的扩增工序；和使对应所述多个多态性位点配制而成的分型试剂作用于在所述扩增工序中扩增的基因组DNA，辨别所述多个多态性位点的碱基的分型工序。
在此，如果表示多态性位点与引物的关系，则为了扩增1个多态性位点而需要将该多态性位点夹在中间并结合的一对引物。由于在成为对象的生物体样品中存在多种多态性位点，所以这些多态性位点位于彼此分离的位置时，需要多态性位点的种类数的2倍种类的引物。但是，在2个多态性位点接近的情况下，可以分别将这些多态性位点夹在中间并使引物结合、扩增，另外也可以不在这些中的2个多态性位点之间结合引物，而只在2个多态性位点的序列的两侧结合引物，进行扩增。因而，必需的引物种类未必是多态性位点的种类数的2倍。本发明中的“分别将多个多态性位点夹在中间并结合的多个引物”不仅指一对引物将1个多态性位点夹在中间并结合的情况，还包括将2个或其以上的多态性位点夹在中间并结合的情况，使用的是扩增多个多态性位点所必需的种类的引物。
多态性包括变异、缺失、重复、转移等。具有代表性的多态性是SNP。
在此，核酸提取操作是指分解核酸包含体(细胞、细菌、真菌、病毒等内部含有核酸的膜结构体)，从已分解的核酸包含体中提取核酸的一系列操作。核酸包含体的分解例如使用酶、表面活性剂、离液剂等进行。从已分解的核酸包含体提取核酸例如使用苯酚或苯酚/氯仿等进行。
因而，未实施核酸提取操作的生物体样品是指未实施这一系列操作的样品，包括含有核酸包含体的生物体样品本身、进行了加热处理或冻结处理等核酸包含体已分解的状态的生物体样品、从生物体样品回收的核酸包含体。从生物体样品回收核酸包含体的回收方法，例如可以举出使用离心/超速离心、聚乙二醇等共沉淀剂、吸附载体等的方法。
在此，生物体样品是指动植物组织、体液、排泄物等，体液包括血液或唾液。
基因组DNA包括以人为代表的动植物DNA、细菌及病毒等的DNA、进而还包括以RNA为模板合成的cDNA。
上述扩增工序可以使用PCR法等。在这种情况下，优选在25℃、pH为8.5～9.5的条件下进行PCR法。
从上述未实施核酸提取操作的生物体样品的基因组DNA的扩增工序，详细记载于专利文献4、5中。
上述分型工序可以使用侵入法或Taqman PCR法。
在本发明的诊断方法中，准备针对特定的多态性或多个多态性的组合的诊断值作为数据库，基于利用本发明的基因多态性检测方法检测出的多态性的结果，从所述数据库读取诊断值。在此，作为诊断值，可以包括疾病发病率、给予药剂的种类与效果及副作用之间的关系等。
本发明的基因多态性检测装置的一个方式，具备如下所述的结构来自动地检测基因多态性：设置未实施核酸提取操作的生物体样品的样品设置部；对含有将多个多态性位点分别夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液进行保持的扩增试剂保持部；保持对应上述多个多态性位点配制而成的分型试剂的分型试剂保持部；为了在将所述生物体样品添加到所述基因扩增反应液中而成的反应液内使基因组DNA扩增，而控制该反应液的温度的扩增部；具有保持分别对应所述多个多态性位点并发出荧光的探针的探针固定部，为了使在所述扩增部扩增的基因组DNA和所述分型试剂的反应液与各探针发生反应而控制该反应液的温度的分型反应部；可以移动到所述样品设置部、所述扩增试剂保持部、所述分型试剂保持部、所述扩增部及所述分型反应部的位置，将样品、扩增试剂、分型试剂及样品与这些试剂的反应液分注到规定位置的分注装置；向所述分型反应部的各探针固定部照射激发光，来检测荧光的荧光检测装置；对所述扩增部及分型反应部的温度控制、所述分注装置的分注动作以及所述荧光检测装置的检测动作进行控制的控制部。
在此，各探针固定部不仅可以保持1种探针，还可以保持2种以上的探针。当在1个探针固定部保持2种以上的探针时，彼此分离配置，以能够区别检测从各探针发出的荧光。
作为上述分型反应部的例子，上述分型反应部在每个所述探针固定部具备上部开口并供给反应液的凹部。在这种情况下，优选进一步具有对防止反应液的蒸发的油进行保持的油保持部，所述分注装置在向所述凹部分配反应液之前或之后，可以向所述凹部分配所述油。
作为上述分型反应部的另一个例子，上述分型反应部在每个所述探针固定部具备供给反应液的流道。该流道可以在每个上述探针固定部具备反应液的供给用入口和排出用出口，也可以与反应液的供给用共用入口和排出用共用出口连接。在这种情况下，上述探针固定部可以在上述流道内形成为凹部。
作为上述分型反应部的进而另一个例子，上述分型反应部具备在内部形成多个所述探针固定部的流道。
所述样品设置部与所述扩增部共用温度调节部。
在本发明的检验试剂盒中，将如下所述的结构形成为一体，这些结构包括：收容含有将多个多态性位点分别夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液的扩增试剂收容部；收容对应所述多个多态性位点配制而成的分型试剂的分型试剂收容部；以及个别保持对应所述多个多态性位点的各位点并发出荧光的探针的多个探针固定部。
检验试剂盒也可以进一步将收容对样品进行稀释的稀释液的稀释液收容部形成为一体。
本发明的基因多态性检测装置的其他一个方式，使用本发明的检验试剂盒，具备：安装该检验试剂盒的检验试剂盒安装部；为了在所述扩增试剂收容部内、在所述基因扩增反应液与体液样品的反应液内，使基因组DNA扩增，而控制该反应液的温度的扩增部；为了使在所述扩增部扩增的基因组DNA和所述分型试剂的反应液与所述探针固定部的探针发生反应而控制该反应液的温度的分型反应部；从所述扩增试剂收容部向所述分型试剂收容部移送液体以及从所述分型试剂收容部向所述各探针固定部移送液体的送液装置；向所述各探针固定部照射激发光来检测荧光的荧光检测装置；对所述扩增部及分型反应部的温度控制、所述送液装置的送液动作以及所述荧光检测装置的检测动作进行控制的控制部。
作为送液装置的一例，是被设置成具备分注喷嘴并可以向必要的场所移动的分注装置。
本发明的基因多态性检测装置的其他一个方式，使用本发明的检验试剂盒，而作为该检验试剂盒，使用各收容部由软质材料形成的检验试剂盒，所述送液装置是通过挤压所述各收容部并使其变形来送液的挤压装置。
本发明的诊断装置具备：本发明的基因多态性检测装置；存储关于特定的SNP或多个SNP的组合的疾病发病率或给予药剂的种类和效果及副作用等的诊断值的数据库；基于利用所述基因多态性检测装置检测出的SNP结果，从所述数据库读取诊断值并进行显示的显示装置。
图1是概要地表示本发明的检测方法的图。在此，对扩增工序使用PCR法、分型工序使用侵入法进行说明。
在PCR工序中，向血液等生物体样品2中添加PCR反应液4，或相反，向PCR反应液4中添加生物体样品2。例如采取1μL样品2，向其中添加10μL左右的PCR反应液4。PCR反应液4被预先配制，含有用于需要测定的SNP位点的多个引物，向其中添加用于调节pH的缓冲液、4种脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)、其他必需的试剂，在与样品2混合时，将pH调节成8.5～9.5。
使样品2与PCR反应液4的混合液，按照规定的温度循环进行PCR反应。PCR温度循环包括变性、引物附着(退火)及引物延伸的3个工序，通过重复进行该循环，使DNA扩增。作为各工序的一例，变性工序为94℃下1分钟，引物附着工序为55℃下1分钟，引物延伸为72℃下1分钟。样品没有实施基因组提取操作，但在PCR温度循环的高温下，DNA从血细胞或细胞游离出来，PCR反应所必需的试剂与DNA接触，反应进行。
在PCR反应结束后，添加侵入试剂6。侵入试剂6中含有发出荧光的FRET探针及裂解酶(cleavase：结构特异的DNA分解酶)。FRET探针是具有与基因组DNA完全没有关系的序列的荧光标记寡核苷酸，与SNP的种类无关，是共用的序列。
接着，向分型反应部的探针固定部8中添加已添加侵入试剂6的反应液，使其反应。在探针固定部8的各部位，分别对应多个SNP位点个别保持侵入探针和报道(reporter)探针，反应液与侵入探针发生反应，只要存在对应该报道探针的SNP，就可以发出荧光。
在专利文献3的段落[0032]～[0034]中有关于侵入法的详细记载。
各报道探针根据与其对应的SNP碱基准备2种探针，可以辨别出该SNP是纯合子还是杂合子。
在本发明中使用的扩增工序的PCR法同时扩增多个目的SNP位点，而且从没有实施核酸提取操作的生物体样品，直接利用PCR法，使含有这些SNP位点的多个基因组DNA扩增。所以，使含有用于这些SNP位点的多个引物的基因扩增反应液直接作用于生物体样品，使其在25℃、pH8.5～9.5的条件下，发生PCR反应。
PCR反应液包括pH缓冲液，MgCl2、KCl等盐类，引物，脱氧核苷酸类及热稳定性合成酶。此外，也可以根据需要添加表面活性剂或蛋白等物质。
pH缓冲液除了三(羟甲基)氨基甲烷与盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的组合以外，还可以使用各种pH缓冲液。在PCR反应液中，优选以10mM～100mM之间的浓度使用已调节pH的缓冲液。
引物是指作为利用PCR反应合成DNA的开始点发挥作用的寡核苷酸。引物可以合成，也可以从生物界中分离。
合成酶是通过附加引物来合成DNA用的酶，也包括化学合成系。作为适当的合成酶，包括大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase)I、大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶的克列诺(Klenow)片段、T4DNA聚合物、TaqDNA聚合酶、T.litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KOD DNA聚合酶、EX TaqDNA聚合酶、逆转录酶等，但不被这些所限定。“热稳定性”是指即使在高温下、优选在65～95℃下也可以保持其活性的化合物的性质。
在分型工序中使用的侵入法是通过使等位基因特异寡核苷酸与含有分型对象的SNP的DNA发生杂交(hybridyzation)，来对SNP位点进行分型的方法，是使用如下所述物质的方法，即：含有分型对象的SNP的DNA，对分型对象的SNP的各等位基因具有特异性的2种报道探针及1种侵入探针，和识别DNA结构并切断的具有特殊内切酶活性的酶(参照专利文献3。)。
在本发明的基因多态性检测方法中，从没有实施核酸提取操作的生物体样品中同时扩增目的多个多态性位点，并同时对这些多态性位点进行分型，所以可以以简单的工序、在短时间内进行多态性的分型。
本发明的诊断方法是基于得到的多态性的分型，从数据库读取诊断值，所以可以在医疗现场使用。
在本发明的第一方式的基因多态性检测装置中，只将没有实施核酸提取操作的生物体样品设置于样品设置部开始检测，就可以自动地实行目的多个多态性的分型。
在本发明的第2、3方式的基因多态性检测装置中，由于使用的检验试剂盒是预先收容基因扩增反应液及分型试剂或进而还预先收容稀释液，探针固定部作为一体形成，所以可以用简单的测定装置自动地实行目的多个多态性分型。
在本发明的诊断装置中，可以从多态性的分型自动地实行至基于该分型的诊断值的显示。
附图说明
图1是概要地表示本发明的检测方法的流程图。
图2(A)是概要地表示一个实施例的基因多态性检测装置的主要部分立体图，(B)是其中使用的分型反应容器的部分截面图。
图3是表示同一实施例的台子和分注探针的布局。
图4是表示基因多态性检测装置的其他实施例中的台子和分注探针等的布局的平面图。
图5是概要地表示基因多态性检测装置的另一个实施例的主要部分立体图。
图6是表示在侵入反应区配置的分型反应容器的其他例子的图，(A)为平面图，(B)为(A)在X-X线位置的截面图。
图7是表示在侵入反应区配置的分型反应容器的另一个例子的平面图。
图8是表示在侵入反应区配置的分型反应容器的另一个例子的图，(A)为平面图，(B)为沿着1个流道的截面图。
图9是表示在侵入反应区配置的分型反应容器的另一个例子的图，(A)为平面图，(B)为在(A)的Y-Y线位置的截面图。
图10是表示条状的检验试剂盒的一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图11是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图12是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图13是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图14是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图15是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图16是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图17是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图18是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图19是表示条状的检验试剂盒的另一个实施例的图，(A)为立体图，(B)为将其正视图与荧光检测装置的物镜一起显示的图。
图20是概要地显示简易型自动基因多态性检测装置的一个实施例的主要部分立体图。
图中：2-样品，4-PCR反应液，6-侵入试剂，8-探针固定部，10-样品台，12-采血管，14-PCR反应液容器，15-侵入反应试剂容器，17-矿物油容器，20-反应台，22-PCR区，22a-预热区，24-扩增反应容器，28-侵入反应区，30、30a、30b、30c、30d-分型反应容器，34-喷嘴，40-清洗水，42-孔，44-侵入探针，45-矿物油，50-荧光检测装置，70-PCR反应容器设置部，71-分型反应容器设置部，72-容器搬运臂，74、78-流道，82-室，88-稀释液收容部，90-PCR反应液收容部，92-侵入反应试剂收容部，94、94a、94b、94c、96b、98-侵入探针固定部，122-检验试剂盒，120-基因多态性检测装置，124-喷嘴124，126-测光部，128-显示器。
具体实施方式
图2(A)是概要地表示一个实施例的自动基因多态性检测装置的图。
10是兼具样品设置部与试剂保持部的取样(sample)台。样品设置部中配置有采血管12作为样品容器。作为采血管12，装有可以搭载各种尺寸如直径13mm的、直径16mm的容器等、进而也可以搭载取样量杯(sample cup)的通用接合器(universal adapter)，可以对应各种样品容器。用采血管12采取血液，作为没有实施基因组提取操作的体液样品，搭载于取样台10上。
在取样台10的试剂保持部搭载作为扩增试剂的PCR反应液14和作为分型试剂的侵入反应试剂15。
以下显示各反应液的组成，详细地说明本发明，但本发明的技术范围不被这些实施例所限定。
相对于人新鲜血液1μl，使用PCR反应液24μl，进行PCR。
在该PCR反应液中，混入各50mmol的40种引物(20对)、EX-TaqDNA聚合酶(宝酒造公司制)10个单位、TaqStart(CLONTECH Laboratories公司制)0.55μg、AmpDirect(岛津制作所制)。引物例如可以使用专利文献3的表1中记载的SNP ID1～20、序列编号1～40等。
侵入试剂使用侵入检测试剂盒(Invader Assay Kit)(Third WaveTechnology公司制)。即，试剂盒中含有的缓冲液∶FRET探针∶裂解酶∶蒸馏水，混合配制成3∶3∶3∶50。
20是反应台，反应台20的内侧为PCR区22，配置有扩增反应容器24。PCR区22设有温度调节部，使反应液的温度成为为了进行PCR扩增反应而设定的温度。扩增反应容器24是可以一次性使用的树脂制，为了使热交换性变得更好而形成为薄壁。PCR区22的温度设定为，在例如94℃、63℃、72℃的3个阶段变化，重复进行该循环。
在反应台20，在PCR区22的外周侧配置有与PCR区22为同心圆状的分型反应用侵入反应区28。在侵入反应区28配置有分型反应容器30，在分型反应容器30形成与需要检测的SNP数目对应的数目或它们的数倍数的微小孔42。孔42的容量为例如数10nL～数μL。就侵入反应区28而言，为了成为与PCR区22不同的温度，具备与PCR区22独立的温度调节部。侵入反应区28的温度例如被设定为63℃。
分型反应容器30的截面图如图2(B)所示，在各孔42中预先固定有与SNP对应的侵入探针和报道探针44。向各孔42中分注含有利用PCR反应扩增的DNA的反应液和侵入反应试剂，与侵入探针44发生反应。只要在被分注的反应液中存在与该侵入探针44对应的SNP，FRET探针就会引起发出荧光。
作为报道探针和侵入探针的具体例，例如可以使用非专利文献1的表1中记载的Primary probe 1、2和Invader probe。
侵入探针和报道探针以风干的状态固定于孔内。
为了从孔42的底面侧测定来自分型反应容器30的荧光，分型反应容器30由低自发荧光性(很少从其自身产生荧光的性质)而且光透过性的树脂例如聚碳酸酯等材料形成。
回到图2(A)进行说明，为了测定来自分型反应容器30的荧光，而配置荧光检测装置50。荧光检测装置50具备发出473nm的激光光的激光二极管(laser diode)(LD)或发光二极管(LED)52作为激发光源，具备使该激光光在容器30的孔42的底面聚光并照射的一对透镜54、56。透镜54使来自激光二极管52的激光光聚光成为平行光，透镜56是使变为平行的激光光会聚、照射于孔42的底面的物镜。物镜56还起到使从孔42产生的荧光聚光的透镜的作用。在一对透镜54、56之间设有分色镜(dichroic mirror)58，分色镜58的波长特性被设定为使激发光透过、使荧光反射。在分色镜58的反射光(荧光)的光程上进一步设置分色镜60。分色镜60的波长特性被设定为反射525nm的光、透过605nm的光。在利用分色镜60的反射光的光程上配置有检测525nm的荧光的透镜62和光检测器64，在利用分色镜60的透过光的光程上配置有检测605nm的荧光的透镜66和光检测器68。通过利用此两个检测器64、68检测2种荧光，检验出有无与固定于各孔的侵入探针对应的SNP，和该SNP是纯合子还是杂合子。作为标记荧光体，可以使用例如FAM、ROX、VIC、TAMRA等。
在取样台10与反应台20之间配置有具有喷嘴34的分注探针32。该喷嘴34在取样台10与反应台20之间移动，进行如下动作，即：从配置于取样台10的采血管12吸引样品，向位于反应台20的PCR区的扩增反应容器24分注的动作；将配置于取样台10的PCR反应液14分注于扩增反应容器24的动作；将配置于取样台10的侵入反应试剂15分注于扩增反应容器24的动作；进而将扩增反应容器24的反应液分注于分型反应容器30的孔42的动作。为了进行利用喷嘴34的分注动作的操作，注射器泵(syringe pump)38与清洗水40借助切换阀36与喷嘴34连接。清洗水40用于液体的分注和喷嘴34的清洗。
为了防止在扩增反应容器24或孔42中在测定荧光时反应液干燥，在取样台10中还进一步配置有矿物油的容器17，喷嘴34向孔42分注该矿物油，用符号45表示该矿物油，其可以覆盖反应液的表面，抑制蒸发。
图3是表示该实施例的各台10、20和分注探针32的布局的平面图，探针32以轴32a为中心，在水平面内旋转，同时也向垂直方向变位，进行分注动作。
说明该实施例的动作。
分注探针32向PCR区的扩增反应容器24分注采血管12的样品例如1～数μL，接着，分注探针32向已分注该样品的扩增反应容器24内分注PCR反应液14例如5～10μL。另外，相反，也可以先分注该PCR反应液14，然后再分注样品。在已分注样品和PCR反应液的扩增反应容器中，例如重复进行1～1.5小时的规定温度循环，进行PCR反应。也向PCR区的其他扩增反应容器24中依次分注样品和反应液，重复进行PCR反应。
利用分注探针32，向结束PCR反应的扩增反应容器24中添加侵入反应试剂15并混合。该混合液利用分注探针32向侵入反应区28的分型反应容器30的多个孔42中分注，进行数分钟～数小时的侵入反应。在该反应过程中或反应结束后，利用荧光检测装置50检测荧光。在向分型反应容器30中分注反应液之后，为了防止反应液的蒸发，也可以在孔42的反应液上分注矿物油。
图4是表示其他实施例的基因多态性检测装置中的台等的布局的图。在此，在PCR区的更内侧设有预热区22a。预热区22a具备维持在94℃的温度调节部，可以使在此处配置的扩增反应容器始终保温在94℃。另外，为了可以交换PCR反应容器24和分型反应容器30，设有PCR反应容器设置部70和分型反应容器设置部71，为了交换这些PCR反应容器24和分型反应容器30而设有容器搬运臂72。
在该实施例的基因多态性检测装置中，利用容器搬运臂72，将扩增反应容器24和分型反应容器30分别搬运至规定的位置。扩增反应容器24被搬运至PCR反应区22和预热区22a两者并进行保持。采血管12的样品首先被分注至预热区22a的扩增反应容器24中，被预热至94℃。预热区22a的扩增反应容器在PCR反应开始时，由容器搬运臂72搬运至PCR区22。
然后，在图2、3的实施例中说明的动作相同，向PCR区22的扩增反应容器24的样品上分注PCR反应液，进行PCR反应。在PCR反应结束后，分注侵入反应试剂，然后扩增反应容器24的反应液被分注至分型反应容器30的多个孔，进行侵入反应，利用荧光检测装置检测荧光。
在该实施例中，反应结束后的扩增反应容器24和分型反应容器30由容器搬运臂72搬运至废弃部，被废弃，新的扩增反应容器24和分型反应容器30被保持在反应台的规定位置。
图5是表示基因多态性检测装置的另一个实施例的图，在该实施例中，省略了取样台，样品设置部和PCR区被设于同一区域，温度调节部也共用，扩增反应容器24兼具样品容器的功能。PCR反应液容器14、侵入反应试剂容器15及矿物油容器17，配置于在反应台20的附近且可被分注探针32进行分注的位置。其他结构与图2的实施例相同。
对该实施例的动作进行说明。
采血管的样品采取例如1～数μL，分注至扩增反应容器24，设置于PCR区。在PCR反应开始时，分注探针32向已分注有样品的扩增反应容器24中分注PCR反应液14例如5～10μL。另外，相反，也可以先分注PCR反应液14，然后再分注样品。在已分注样品和PCR反应液的扩增反应容器中，例如重复进行1～1.5小时的规定温度循环，进行PCR反应。也向位于PCR区的已分注样品的其他扩增反应容器24中依次分注PCR反应液，重复进行PCR反应。
利用分注探针32，向已结束PCR反应的扩增反应容器24中添加侵入反应试剂15并混合。该混合液利用分注探针32向侵入反应区28的分型反应容器30的多个孔42中分注，进行数分钟～数小时的侵入反应。在该反应过程中或反应结束后，利用荧光检测装置50检测荧光。
图6～9是分别表示配置于侵入反应区的分型反应容器的其他例子的图。
图6的分型反应容器30a在基体上形成多个流道74，在流道74固定有1种或多种侵入探针。当在1个流道74固定多种探针时，为了可以区别、检测互相的荧光，在彼此分离的场所固定。为了从流道74的底面侧测定荧光，基体是由低自发荧光性、光透过性的树脂等材料形成。
形成流道74的基体，由2张基板76a、76b接合构成。为了使流道74在基板的内侧，在一张基板76a的表面形成流道74用的槽，在该流道形成面接合有另一张基板76b。在流道74的两端设有反应液用的入口78a和出口78b，它们分别贯通基板76b，在基体表面形成开口。
图7的分型反应容器30b与图6的分型反应容器30a一样在基体内部具有流道74，但该分型反应容器30b的流道74在其中途形成有面积变大的部分74a。该部分74a的深度可以变得比其他流道部分深。在该部分74a固定有侵入探针。
在图6、图7的分型反应容器30a、30b中，如果向各入口78a分注反应液，则反应液进入各自的流道74，与固定于内部的侵入探针发生反应，如果存在与该侵入探针对应的SNP，则发出荧光。
图8所示的分型反应容器30c，利用2张基板在基体内部形成有流道78，这一点虽然与图6、7的分型反应容器相同，但固定有侵入探针的全部流道与共用的反应液入口80a和共用的反应液出口80b连接，这一点则是不同的。
在图8的分型反应容器30c中，如果向共用的入口80a分注反应液，则反应液进入所有的流道78，与固定于各流道78的内部的侵入探针发生反应，如果存在与这些侵入探针对应的SNP，则发出荧光。
图9所示的反应容器30d，在基体内部形成流道82的宽度很宽的室，在其两端设有向基体表面开口的入口84a和出口84b。在室82内，多种侵入探针44被固定于彼此分离的位置。
在图9的分型反应容器30d中，如果向共用的入口84a分注反应液，则反应液进入流道的室82，与各侵入探针44发生反应，如果存在与这些侵入探针44对应的SNP，则发出荧光。
图10～图19是表示在本发明的其他方式的检测装置中使用的条状的检验试剂盒的图。在各图中，(A)为立体图，(B)为其正视图。
在各检验试剂盒中，具备向基板面的一个方向膨出的、稀释液收容部88、PCR反应液收容部90及侵入反应试剂收容部92的3个收容部，和配置于基板面内的多个侵入探针固定部94。
在各收容部88、90、92中分别收容有稀释液、反应液或反应试剂，为了在使用前的状态下不发生液体泄漏，利用可以装卸的薄膜或板密封各收容部88、90、92的开口。剥离稀释液收容部88的开口的薄膜或板，利用喷嘴95，将样品血液分注至稀释液收容部88。样品分注后，稀释液收容部88的开口再次被薄膜或板关闭，检验试剂盒被安装在检测装置。
侵入探针固定部94固定彼此不同的侵入探针，为了可以从基板的背面侧检测出产生的荧光，至少设置有侵入探针固定部94的部分的基板的材料是由低自发荧光性且光透过性的树脂等形成。
在图10的检验试剂盒中，侵入探针固定部94彼此分离配置，在基板表面露出。
从该检验试剂盒中的收容部88、90、92的液体的移送，使用分注喷嘴进行。所以，密封收容部88、90、92的开口的薄膜或板，优选为可以容易地被分注喷嘴穿过的材料。
该试剂盒，在使用时利用分注喷嘴将血液等样品分注至稀释液收容部88之后，安装于后述的基因多态性检测装置(图20)。在该基因多态性检测装置内，该试剂盒的稀释液收容部88内的样品由分注喷嘴移送至PCR反应液收容部90，在基因多态性检测装置内，利用规定的温度循环进行PCR反应。在PCR反应结束后，PCR反应液收容部90内的反应液由分注喷嘴移送至侵入反应试剂收容部92中，与侵入反应试剂混合。然后，侵入反应试剂收容部92的反应液由分注喷嘴分注至各侵入探针固定部94上。在各侵入探针固定部94中，如果样品中存在分别与其对应的SNP，则侵入反应会产生荧光，用基因多态性检测装置内的荧光检测装置进行检测。
图11的检验试剂盒，除了侵入探针固定部94a的结构以外，与图10的相同。侵入探针固定部94a的结构与图6的分型反应容器30a相同。
图12的检验试剂盒，也是除了侵入探针固定部的结构以外，与图10的相同。在该检验试剂盒中，侵入探针固定部94b成为流道形状，在该流道内固定有侵入探针。固定有多个侵入探针的多个流道与共用的入口96a和出口96b连接。只有入口96a和出口96b具有开口，在基板内形成有流道。
在该检验试剂盒中，反应液向侵入探针固定部94b的分注，只需要向入口96a进行1次分注即可。向入口96a分注的反应液进入流道内，与固定于流道内的侵入探针发生反应，如果样品中存在分别与其相对应的SNP，则侵入反应会产生荧光，用基因多态性检测装置内的荧光检测装置进行检测。
在图13的检验试剂盒中，多个侵入探针彼此分离固定在用符号94c表示的室上的宽流道上。室94c形成在基板内部，入口96a和出口96b具有开口。在这种情况下，反应液向侵入探针固定部94c的分注，也只需要向入口96a进行1次分注即可。向入口96a分注的反应液进入室94c内，与固定于室94c内的侵入探针发生反应，如果样品中存在分别与其对应的SNP，则侵入反应会产生荧光，用基因多态性检测装置内的荧光检测装置进行检测。
在图14的检验试剂盒中，侵入探针固定部98，在滤纸等低自发荧光性(spontaneous-fluorescent)的材料的多个位置固定不同的侵入探针，安装于基板。侵入探针固定部98在基板表面露出。
在该检验试剂盒中，反应液可以利用喷嘴只向侵入探针固定部98的一端分注，反应液通过在侵入探针固定部98的材料中扩散，来与固定于各位置的探针发生反应。
图15的检验试剂盒也与图14的检验试剂盒相同，具备在滤纸等低自发荧光性的材料的多个位置固定有不同侵入探针的侵入探针固定部96b。但是，在检验试剂盒中，侵入探针固定部96b由透明薄膜或透明板夹持并保持，为了向侵入探针固定部98分注反应液，与侵入探针固定部96b相通的入口100具有开口。向该入口100分注的反应液，通过流入到侵入探针固定部96b中并扩散，与在侵入探针固定部96b的各位置固定的探针发生反应。
在图16～图19所示的检验试剂盒中，收容部88、90、92由柔软的材料形成，利用基板表面的槽108、110连接收容部88、90、92之间。在使用前的状态下，收容部88、90、92由薄片或板密封，以使收容部88、90、92彼此独立。另外，在设于基板表面的侵入探针固定部94b、94c、96b、98与侵入反应试剂收容部92之间的基板表面，还形成有槽104。
使用时剥离薄片或板，向稀释液收容部88分注样品。此后，如果将该检验试剂盒安装于基因多态性检测装置，则液体可以利用槽108、110在收容部88、90、92之间流动，液体可以通过槽104，从侵入反应试剂收容部92向侵入探针固定部94b、94c、96b、98流动。
在基因多态性检测装置内的收容部88、90、92之间的送液、以及从侵入反应试剂收容部92向侵入探针固定部94b、94c、96b、98的送液，通过依次机械地挤压、挤破收容部88、90、92来进行。即，如果挤破稀释液收容部88，则稀释液收容部88的液体通过槽108，向PCR反应液收容部90移动。接着，如果挤破PCR反应液收容部90，则PCR反应液收容部90的液体通过槽110，向侵入反应试剂收容部92移动。进而，如果挤破侵入反应试剂收容部92，则侵入反应试剂收容部92的液体通过槽104，向侵入探针固定部94b、94c、96b、98移动，发生侵入反应。
图16的检验试剂盒具备与图12相同的流道形状的侵入探针固定部94b。在侵入探针固定部94b的顶端即收容部88、90、92的相反侧的一端设有出口106，使用时通过剥离密封用的薄片或板，该出口露出开口，从侵入反应试剂收容部92送液，通过了侵入探针固定部94b的多余的液体从该出口106排出。
图17的检验试剂盒具备与图13相同的室型的侵入探针固定部94c。该检验试剂盒也在侵入探针固定部94c的顶端即收容部88、90、92的相反侧的一端设有出口106，在使用时通过剥离密封用的薄片或板，该出口露出开口，从侵入反应试剂收容部92送液，通过了侵入探针固定部94c的多余的液体从该出口106排出。
图18的检验试剂盒具备与图14同样的在滤纸等低自发荧光性的材料的多个位置固定有不同侵入探针的侵入探针固定部98。侵入探针固定部98在基板表面露出。
图19的检验试剂盒具备与图15同样的在滤纸等低自发荧光性的材料的多个位置固定有不同侵入探针的侵入探针固定部98。该侵入探针固定部98由透明薄膜或透明板夹持并保持。
在图18、19的检验试剂盒中的侵入探针固定部98，由于具备吸湿力大的纸等材料，所以可以由该材料吸收从侵入反应试剂收容部92送液的液体。
图20是概要地表示简易型自动基因多态性检测装置的实施例的图，该基因多态性检测装置，使用图10～图19所示的检验试剂盒122，检测SNP。
该基因多态性检测装置120具备安装有多个检验试剂盒122的安装部，检验试剂盒122在样品被分注至稀释液收容部的状态下被安装。设置有可以移动的喷嘴124，该喷嘴124向安装于安装部的检验试剂盒122进行送液。
虽在图中未图示，但为了在检验试剂盒122的PCR反应液收容部90内，在PCR反应液与生物体样品的反应液内扩增基因组DNA，而具备控制该反应液的温度的扩增部；为了使在该扩增部扩增的基因组DNA和分型试剂的反应液与探针固定部94、94a、94b、94c、96b、98的探针发生反应，而具备控制该反应液的温度的分型反应部。
126是作为荧光检测装置的测光部，为了检测出从检验试剂盒122的侵入探针固定部产生的荧光，可以设置成能在多个检验试剂盒122之间移动的同时进行荧光检测且可以移动。根据检测的荧光判断的分型结果显示在显示器128。
以上的实施例是基因多态性检测装置，但还可以作为疾病发病率或给予药剂的种类与效果及副作用等的诊断装置。在这种情况下，在这些基因多态性检测装置中设置有针对特定的SNP或多个SNP的组合而存储疾病发病率或给予药剂的种类与效果及副作用等的诊断值的数据库，或者连接外部的此类数据库。在连接外部的数据库的情况下，可以用专用的线路连接，或者也可以借助通用的通信线路连接。在作为诊断装置的情况下，基于利用本发明的基因多态性检测装置检测的SNP结果，从数据库读取诊断值，在显示装置显示。
产业上的可利用性
本发明在基因分析的研究或临床领域，可以检测以人为代表的动物或植物的基因组DNA的多态性特别是SNP(单碱基多态性)，进而除了可以用于使用该结果进行疾病发病率的诊断、或给予药剂的种类与效果及副作用之间的关系等的诊断以外，还可以用于动物或植物的品种判断、感染病诊断(感染菌的型判断)等。

Claims (21)

1.一种基因多态性检测方法，其中，包括：
使未实施核酸提取操作的生物体样品，直接作用于含有将多个多态性位点分别夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液，使基因组DNA扩增的扩增工序；和
使对应所述多个多态性位点配制而成的侵入试剂作用于在所述扩增工序中扩增的基因组DNA，辨别所述多个多态性位点的碱基的分型工序。
2.根据权利要求1所述的基因多态性检测方法，其中，
成为检测对象的多态性，是单碱基多态性。
3.根据权利要求1或2所述的基因多态性检测方法，其中，
所述扩增工序使用PCR法。
4.根据权利要求1或2所述的基因多态性检测方法，其中，
所述分型工序使用侵入法或Taqman PCR法。
5.一种诊断方法，其中，
准备针对特定的多态性或多个多态性的组合的诊断值，作为数据库，
基于利用权利要求1所述的方法检测出的多态性的结果，从所述数据库读取诊断值。
6.一种基因多态性检测装置，其中，具备：
设置未实施核酸提取操作的生物体样品的样品设置部；
保持含有将多个多态性位点分别夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液的扩增试剂保持部；
保持对应所述多个多态性位点配制而成的分型试剂的分型试剂保持部；
为了使添加到所述基因扩增反应液中的所述生物体样品在反应液内扩增基因组DNA而控制该反应液的温度的扩增部；
具有对分别对应所述多个多态性位点而发出荧光的探针进行保持的探针固定部，为了使在所述扩增部扩增的基因组DNA和所述分型试剂的反应液与各探针发生反应而控制反应液的温度的分型反应部；
可以移动到所述样品设置部、所述扩增试剂保持部、所述分型试剂保持部、所述扩增部及所述分型反应部的位置，将样品、扩增试剂、分型试剂及样品与这些试剂的反应液分注到规定位置的分注装置；
向所述分型反应部的各探针固定部照射激发光来检测荧光的荧光检测装置；和
对所述扩增部及分型反应部的温度控制、所述分注装置的分注动作以及所述荧光检测装置的检测动作进行控制的控制部。
7.根据权利要求6所述的基因多态性检测装置，其中，
所述分型反应部在每个所述探针固定部具备上部开口并供给反应液的凹部。
8.根据权利要求7所述的基因多态性检测装置，其中，
进一步具有保持防止反应液蒸发的油的油保持部，
所述分注装置在向所述凹部分注反应液之前或之后，可以向所述凹部分注所述油。
9.根据权利要求6所述的基因多态性检测装置，其中，
所述分型反应部在每个所述探针固定部具备供给反应液的流道。
10.根据权利要求9所述的基因多态性检测装置，其中，
所述流道在每个所述探针固定部具备反应液的供给用入口和排出用出口。
11.根据权利要求9所述的基因多态性检测装置，其中，
所述流道与反应液的供给用共用入口和排出用共用出口连接。
12.根据权利要求9～11中任意一项所述的基因多态性检测装置，其中，
所述探针固定部为在所述流道内一部分变宽的部分。
13.根据权利要求6所述的基因多态性检测装置，其中，
所述分型反应部具备在内部形成有多个所述探针固定部的流道。
14.根据权利要求6～13中任意一项所述的基因多态性检测装置，其中，
所述样品设置部与所述扩增部共用温度调节部。
15.一种检验试剂盒，其中，其是如下所述的结构形成为一体的试剂盒，这些结构包括：
收容含有分别将多个多态性位点夹在中间并结合的多个引物的基因扩增反应液的扩增试剂收容部；收容有对应所述多个多态性位点配制而成的分型试剂的分型试剂收容部；以及将分别对应所述多个多态性位点并发出荧光的探针个别保持的多个探针固定部。
16.根据权利要求15所述的检验试剂盒，其中，
进一步将收容稀释样品的稀释液的稀释液收容部形成为一体
17.根据权利要求15或16所述的检验试剂盒，其中，
所述各收容部由软质材料形成。
18.一种基因多态性检测装置，其中，具备：
安装权利要求15～17中任意一项所述的检验试剂盒的检验试剂盒安装部；
为了在所述扩增试剂收容部内、在所述基因扩增反应液与生物体样品的反应液内使基因组DNA扩增，而控制该反应液的温度的扩增部；
为了使在所述扩增部扩增的基因组DNA和所述分型试剂的反应液与所述探针固定部的探针发生反应而控制该反应液的温度的分型反应部；
从所述扩增试剂收容部向所述分型试剂收容部移送液体及从所述分型试剂收容部向所述各探针固定部移送液体的送液装置；
向所述各探针固定部照射激发光来检测荧光的荧光检测装置；和
对所述扩增部及分型反应部的温度控制、所述送液装置的送液动作以及所述荧光检测装置的检测动作进行控制的控制部。
19.根据权利要求18所述的基因多态性检测装置，其中，
所述送液装置是被设置成具备分注喷嘴并可以向必要的场所移动的分注装置。
20.根据权利要求18所述的基因多态性检测装置，其中，
作为所述检验试剂盒，使用权利要求17所述的检验试剂盒，
所述送液装置是通过挤压所述各收容部并使其变形来送液的挤压装置。
21.一种诊断装置，其中，具备：
权利要求6～14及18～20中任意一项所述的基因多态性检测装置；
存储关于特定的多态性或多个多态性的组合的诊断值的数据库；
基于利用所述基因多态性检测装置检测出的多态性结果，从所述数据库读取诊断值并进行显示的显示装置。
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