CN101050170A

CN101050170A - 一种新型天然抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101050170A
Application number: CN 200710027454
Authority: CN
Inventors: 王定勇; 臧林泉; 谢启宇; 刘恩桂; 潘雪刁; 陈健
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Shenzhen Guoshengyuan Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2007-04-06
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2007-10-10
Anticipated expiration: 2027-04-06
Also published as: CN101050170B

Abstract

本发明公开了一种新型天然抗肿瘤活性化合物，是一种具有全新分子骨架的化合物，结构新颖、抗肿瘤活性强，可来源于杨梅植物资源，安全性高；同时公开了其制备方法，浸提杨梅植株粗粉，减压浓缩，用水分散后，用适宜的有机溶剂萃取，分离提纯得到所述的化合物，所述化合物在制备抗肿瘤药物领域应用前景广阔，为医学上开发攻克肿瘤的天然药物打下了基础。

Description

一种新型天然抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种新型天然抗肿瘤活性化合物及其制备方法与应用。

背景技术

杨梅(Myrica ruba Lour，Sieb.Et Zucc.)系杨梅科(Myricae)杨梅属(Myrica)植物。杨梅的果实、树皮、根或核仁均可供药用。其果实甘酸、温，具有生津解渴、和胃消食之功效，可治烦渴、吐泻、痢疾、腹痛；其树皮性温、味苦辛涩，可治痢疾、跌打损伤、牙痛、汤火伤；其根辛、温，具有理气、止血、化瘀之功效，可治胃痛、膈食呕吐、吐血等症；其种仁可治脚气。杨梅植物主要含间环二芳基庚烷、黄酮和三萜等类型天然化合物，但其有效成分并不明确，是否具有抑制肿瘤的作用也未得到进一步研究。

癌症是危害人民生命和健康的重要疾病之一，抗肿瘤活性化合物或先导物的发现是抗癌药物研究的重要方面，而寻找天然的抗肿瘤活性化合物更是迫在眉睫。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新型天然抗肿瘤活性化合物，从天然植物杨梅获得。

另一个目的是提供所述新型天然抗肿瘤活性化合物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述新型天然抗肿瘤活性化合物的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：提供了一种新型天然抗肿瘤活性化合物，具有如下的化学结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁，R₁₂选自：氢原子(H)，烃基(alkyl)，芳基(aryl)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羟基(hydroxyl)，卤素(halogen)，氨基(amino)，烃氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，酰氨基(acylamino)，且不全为氢原子(H)；C₇，C₈，C₉，C₁₀，C_n，C₁₂，C₁₃位之间的连接形式为双键或叁键或环氧连接。

所述的新型天然抗肿瘤活性化合物，优选例是当R₃，R₄，R₅，R₆，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁为氢原子(H)，R₁，R₂为甲氧基(OCH₃)，该化合物为(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷。

本发明提供了上述新型天然抗肿瘤活性化合物的制备方法，是用合适的溶剂浸提杨梅植株粗粉，减压浓缩得到总浸膏，总浸膏用水分散后，用适宜的有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经分离得到所述化合物。

浸提可采用60％-98％乙醇或甲醇，萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一种。

还可以通过化学合成的方法得到(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷类似物。

本发明提供了所述新型天然抗肿瘤活性化合物的应用，主要是在制备作为增强机体免疫、消炎或抑制肿瘤细胞药物方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的新型天然抗肿瘤活性化合物为一全新分子骨架的环状二芳基庚烷醌类化合物，结构新颖、抗肿瘤活性强，可来源于杨梅植物资源，安全性高。

2、对所述化合物的进一步研究有望发现选择性高、活性强、毒副作用小、抗瘤谱广、抗多药耐药性好的新型抗癌药物，具有重要的潜在产业化开发价值以及对人类研究抗癌药物的重大贡献。

3、本发明所述化合物的制备方法简单安全易行。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明：

实施例1：

杨梅全植株30Kg(干重)，粉碎后用95％乙醇浸提(50L×3次)，减压浓缩得总浸膏1680g。总浸膏溶解在3.0L约40-60℃的温热水，冷却后用氯仿萃取(1.0L×10次)，减压浓缩得氯仿部分浸膏250g。氯仿部分浸膏经硅胶柱层析，石油醚(60～90℃)-丙酮(石油醚，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，2∶1，丙酮)梯度洗脱，分成9个部分(TLC作检测，相同部分合并到一起)；Fr.4经硅胶制备薄层，展开剂为石油醚：乙酸乙酯(4∶1，V/V)，分离提纯得到化合物1 250mg。

化合物1为桔红色油状物，在TLC硅胶薄层板上与10％硫酸乙醇反应显浅蓝色，该化合物的HRMS给出准分子离子峰m/z 395.1467[M+Na]⁺，示其分子式为C₂₁H₂₄O₆；IR吸收峰ν_max 3435cm^-1，1651cm^-1，1602cm^-1，1507cm^-1表明1中含在羟基、共轭羰基和苯环；¹HNMR信号δ7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz)显示分子中存在一个1，2，4-三取代苯环。¹H-¹HCOSY相关信号说明分子中存在-(CH₂)₂CH(OH)(CH₂)₄-结构单元；¹³CNMR显示21个碳信号，其中61.3(q)，61.2(q)为两个甲氧基信号，分子骨架共19个碳信号，¹³CNMRδ184.1，184.2显示含有苯醌结构片断。综合上述信息，化合物1应为含有醌式结构片断的二芳基庚烷类化合物。根据此化合物的¹H-¹H COSY，HMQC，HMBC和NOESY(见附图)，确定1为(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷。具有如下式1所示化学结构：

化合物1的特征在于：

颜色和状态：桔红色油状物；

分子式：C₂₁H₂₄O₆；

比旋光[α]_D ²⁰：+0.027°(c 0.625mg/ml，丙酮)

紫外光谱[λmax(MeOH)logε]：194nm(0.31)，203nm(0.72)，279nm(0.32)；

红外光谱：主要特征谱带位于3435，2937，1651，1614，1602，1507，1453，1288，1202，1144，1006，822，759cm^-1；

质谱：ESI(-)：371.2(M-H)^-；

HRESI(+)：395.1467(M+Na)⁺；

核磁共振氢谱(600Hz，CDCl₃，δin ppm and TMS as internalstandard)：2.40(1H，m，H_a-7)，1.68(1H，m，H_b-7)，1.87(1H，m，H_a-8)，1.30(1H，m，H_b-8)，1.60(1H，m，H_a-9)，1.15(1H，t，J＝13.8Hz，H_b-9)，0.98(1H，m，H_a-10)，0.73(1H，t，J＝12.7Hz，H_b-10)，3.72(1H，t，J＝8.3Hz，H-11)，1.94(1H，dt，J＝13.3，4.1Hz，H_a-12)，1.65(1H，m，H_b-12)，2.66(1H，td，J＝13.4，3.2Hz，H_a-13)，2.82(1H，dt，J＝13.8，3.5Hz，H_b-13)，7.03(1H，dd，J＝8.3，1.6Hz，H-15)，6.84(1H，d，J＝8.3Hz，H-16)，6.78(1H，d，J＝1.6Hz，H-18)，5.93(1H，brs，17-OH)，4.01(3H，s，OCH₃)，4.05(3H，s，OCH₃)；

核磁共振碳谱(125Hz，CDCl₃，δin ppm and TMS as internalstandard)：120.7(s，C-1)，141.0(s，C-2)，144.9(s，C-3)，184.1(s，C-4)，144.4(s，C-5)，146.5(s，C-6)，34.7(t，C-7)，24.1(t，C-8)，26.4(t，C-9)，26.9(t，C-10)，72.1(d，C-11)，33.6(t，C-12)，39.8(t，C-13)，133.7(s，C-14)，130.5(d，C-15)，117.5(d，C-16)，150.9(s，C-17)，131.1(d，C-18)，184.2(s，C-19)，61.3(q，OMe)，61.2(q，OMe)。

实施例2：本发明的消炎作用

按药剂学方法，可以将本发明提取物用于制备作为增强机体免疫或消炎的药物。

下述的药理实验表明本发明提取物具有增强机体免疫以及消炎等药理活性：将小鼠40只，雌雄各半，体重80～150g，经由背部皮下注射0.5％的2，4一ONFB乙醇溶液100pl作为抗原使之增敏，注射2，4一DNFB 4天后增敏成立，第6天在小鼠右耳上涂1％2，4一DNFB一橄榄油溶液作为抗原攻击，使小鼠产生耳缘接触性皮肤炎。随机等分为4组，杨梅提取物于增敏前一天到2，4一DNFB攻击当天连续7天经口给药。第1组为蒸馏水对照组，喂以同体积蒸馏水，第2、3、4组分别灌喂0.02％、0.2％、0.5％本发明乙醇提取物溶液0.5ml。取下小鼠左右两耳，测定左右耳缘18mm重量差及比较浮肿程度。杨梅提取物连续7天经口给药，对小鼠耳缘浮肿显示出一定的抑制效果，与蒸馏水对照组相比，小鼠左右耳缘18mm重量差分别小15％、25％、30％左右。

实施例3：本发明的抗肿瘤作用

通过SRB法检测细胞的存活率，Hoechst33258核染色法、琼脂糖凝胶电泳法和流式细胞术来检测细胞的凋亡情况，来评价化合物1的抗肿瘤活性。

1、试剂DMEM、小牛血清购于GIBCO BRL公司、溴化乙啶(EB)购于上海生工公司、Hoechst33258购于Sigma公司、蛋白酶K(Proteinase K)，100bp DNA ladder购于NEB公司、RNA酶A(RNaseA)购于PROMEGA公司、碘化吡啶(PI)购于Merck公司、琼脂糖(Argarose)购于西班牙BioWest公司、其余试剂为国产分析纯。

2、仪器CO₂培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、高速冷冻离心机、水平电泳装置、凝胶扫描分析系统、酶标仪、流式细胞仪。

3、方法细胞培养及化合物1处理：肿瘤细胞在含10％小牛血清、100U/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养基中，于5％CO₂、37℃的细胞培养箱内常规培养。取对数生长期的细胞，0.25％胰酶消化，用培养基调成1×10⁵/ml的细胞悬液进行实验。

设对照组和实验组。化合物1处理时，实验组细胞加入不同浓度的化合物1培养48h。对照组不加药物。

细胞活性测定(SRB法)：取培养于96孔板经化合物1处理过的细胞，每孔加入50％(质量体积)的三氯乙酸(TCA)50固定细胞，TCA的终浓度为10％，轻柔地加在每孔液面上；然后在4℃冰箱中放置1h；培养板各孔用去离子水洗涤5遍，以去除TCA；培养板空气中干燥；每孔加100μL0.4％(wt/Vol)SRB(溶解于1％醋酸中)，室温下放置30min；弃去各孔内液体后用洗涤5遍，去除未结合的染料，剩余的1％乙酸冲洗液在水池边轻轻敲打，保证完全清除冲洗液；接着培养板在空气中干燥直到没有可见的液体；用pH为10.5，10mmol/l unbu-ffered Trisbase(三羟甲基胺基甲烷)溶解，在平板振荡器上振荡5min；在酶联免疫检测仪测定OD值，用空白对照(没有接种细胞的生长培养基)调零，所用波长为490～530nm。按下列公式计算杀伤率∶杀伤率(％)＝(1-实验组OD值/对照组OD值)×100％。

Hoechst33258核染色样本制备：收集细胞(1×10⁶个)，1000r/min，离心5min，将培养基移去，用PBS洗两次，迅即加入40g/L的多聚甲醛液固定10min。离心后吸去固定液，以蒸馏水清洗一次，用Hoechst33258(5mg/L)染色10min。用蒸馏水清洗2次后取细胞悬液，滴于载玻片，自然干燥，在荧光显微镜下以340nm激发光观察并随机拍照。Hoechst33258是一种DNA荧光染料，可以插入并结合于DNA链的A-T区，受到波长200-380nm的紫外线激发，可释放420nm的蓝色荧光，在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，核无固缩，故在视野中呈现体积较大的浅染核形态，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，核出现不同程度的固缩，常可见DNA荧光碎片(凋亡小体)。

DNA提取及琼脂糖凝胶电泳：将收集的细胞(2×10⁶个)1000r/min，离心5min，移去培养基，用PBS洗两次，加入400μl含有10mmol/LTris-HCl、10mmol/L EDTA、10mmol/L NaCl、1％SDS(pH8.0)的细胞裂解液，充分混匀后加入蛋白酶K(500μg/ml)，37℃消化过夜。在消化液中加入75μl醋酸钾(8mol/L)，4℃静置15min，再加入氯仿750μl，充分混匀。10000r/min，离心10min。将上清吸出，加入750μl无水乙醇，上下轻柔颠倒混合，即可见白色沉淀析出。12000r/min，离心10min，吸弃上清，以70％乙醇洗沉淀1次。将沉淀自然干燥，用40μl TE(10mmol/LTris，1.0mmol/LEDTA，pH7.4，含200μg/ml Rnase A)溶解。于1.0％的琼脂糖凝胶(含0.4μg/ml EB)上以60V电压电泳1h，紫外灯下观察拍照。正常细胞DNA链完整，在加样孔附近呈现粗条带，而凋亡的细胞DNA链以核小体为单位被切割降解，被抽提出来以后在凝胶泳道上呈现180bp为间隔的梯状DNA电泳带型。

流式细胞仪分析细胞亚二倍体峰(凋亡峰)：将收集的单细胞悬液(1×10⁶个)用PBS洗2次，离心后以70％的4℃乙醇固定过夜。测定前离心弃乙醇，细胞重悬于含有50mg/L碘化丙啶(PI)和50mg/LRnase A的染色液中，避光染色30min。以流式细胞仪进样测定，每样本计数12000个细胞，采用荧光强度值并以仪器所配软件进行数据处理，计算凋亡率。

统计方法：定量实验数据以 x±s表示，采用Microsoft Excel t检验进行统计学处理，p＜0.05视为有统计学意义。

结果化合物1可浓度依赖性地抑制肿瘤细胞体外生长活性：浓度为32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、1.9μg/ml的化合物1对人肺癌细胞A549的杀伤率分别为：90.99％、42.66％、21.53％、19.46％。

Claims

1、一种新型天然抗肿瘤活性化合物，其特征在于具有如下的化学结构：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆，R₇，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁，R₁₂选自：氢原子(H)，烃基(alkyl)，芳基(aryl)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，醛基(aldehyde)，氧代基(oxo)，羟基(hydroxyl)，卤素(halogen)，氨基(amino)，烃氨基(alkylamino)，芳氨基(arylamino)，酰氨基(acylamino)，且不全为氢原子(H)；C₇，C₈，C₉，C₁₀，C₁₁，C₁₂，C₁₃位之间的连接形式为双键或叁键或环氧连接。

2、根据权利要求1所述的新型天然抗肿瘤活性化合物，其特征是R₃，R₄，R₅，R₆，R₈，R₉，R₁₀，R₁₁为氢原子(H)，R₁，R₂为甲氧基(OCH₃)，该化合物为(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷。

3、一种权利要求2所述的新型天然抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征是用合适的溶剂浸提杨梅植株粗粉，减压浓缩得到总浸膏，总浸膏用水分散后，用适宜的有机溶剂萃取得到萃取物，萃取物经分离得到所述化合物。

4、根据权利要求3所述的新型天然抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征是浸提可采用95％乙醇或甲醇，萃取的有机溶剂可采用乙酸乙酯、氯仿、乙醚、石油醚、苯任一种。

5、一种权利要求1所述的新型天然抗肿瘤活性化合物的制备方法，其特征是除了(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷以外，其他化合物可以以(11S)-3，5-二甲氧基-11，17-二羟基-4，19-二酮基-[7，0]-间环二芳基庚烷为基础通过化学合成的方法得到。

6、一种权利要求1所述的新型天然抗肿瘤活性化合物的应用，其特征是在制备作为增强机体免疫或消炎的药物方面的应用。

7、一种权利要求1所述的新型天然抗肿瘤活性化合物的应用，其特征是在制备抑制肿瘤细胞药物方面的应用。