CN102040574B

CN102040574B - 具有抗hcv活性的对苯二酚化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN102040574B
Application number: CN2010105961365A
Authority: CN
Inventors: 李蓉涛; 李洪梅; 李海舟; 夏雪山; 李晓蕾
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2012-10-31
Anticipated expiration: 2030-12-20
Also published as: CN102040574A

Abstract

本发明提供一种具有抗丙型肝炎病毒活性的具有苯骈吉枝烯骨架的对苯二酚化合物，选择指数为6.32，可作为治疗丙肝的先导化合物。所述对苯二酚化合物是从新疆紫草(Arnebia euchroma)茎皮中提取分离出来的，且提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。所述具有抗丙型肝炎病毒活性的对苯二酚化合物的分子式为C₁₆H₁₈O₃，化学结构式如下。

Description

具有抗HCV活性的对苯二酚化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的化合物，尤其是一种具有抗HCV活性的对苯二酚化合物及其制备方法，属于药物技术领域。

背景技术

丙型肝炎病毒（HCV）是导致肝癌和肝硬化的主要原因，它感染着超过3%的世界人口，被认为是慢性肝病的主要原因之一。目前的标准治疗，包括PEG-IFN/RBV联合用药，只对过半的感染了丙型肝炎病毒（HCV）的患者有效，且有明显的副作用，对多数感染了丙型肝炎病毒（HCV）的患者的治疗效果不够理想。因此，从传统中药、植物和真菌资源中寻找新的抗HCV药物或先导化合物的研究具有较大的现实意义。然而，抗HCV化合物的筛选平台与其他病毒筛选平台相比尚不够完善。关于抗HCV天然产物的报道较少。如从Moricortex radicis中得到的2个2-arylbenzofuran衍生物，具有很强的抑制HCV复制的作用，IC₅₀值分别为42.9 和 27.0 μmol/L；从真菌 Aspergillus ochraceus中得到的mellein, 具有抗HCV蛋白酶活性，IC₅₀= 35 μmol/L;从Parthenium hispitum中分离得到的5个新的C₁₄-oxygenated 1α-hydroxy-11(13)-pseudoguaien-6β,12-olides, 能有效地抑制HCV的复制。

新疆紫草(Arnebia euchroma)具有活血、解毒（与麻疹、炎症等相关）的功效，传统用于治疗黄疸、烧伤、湿疹以及便秘。

迄今为止，本发明所涉及的化合物euchroquinol A的结构以及抗HCV活性均尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构新颖的具有抗HCV活性的对苯二酚类化合物。

本发明的第二个目的在于提供一种具有抗HCV活性的对苯二酚化合物的提取分离方法。

本发明提供的具有抗HCV活性的对苯二酚化合物euchroquinol A，分子式为C₁₆H₁₈O₃，化学结构式为：

本发明所述具有抗HCV活性的对苯二酚化合物euchroquinol A是从新疆紫草(Arnebia euchroma)茎皮中提取分离出来的，其提取分离方法如下：

A、将紫草粉碎后，按紫草原料:乙醇水溶液 = 1:2～4的质量／体积比（kg/L），将紫草粉放入体积浓度为95%的乙醇水溶液中，室温下浸泡24小时后，得提取液，如此重复提取3次，合并提取液；

B、将A步骤所得提取液浓缩至无乙醇味后，按提取液:石油醚 = 1:1的体积比，于室温下，用石油醚对提取液进行2～3次的萃取，回收石油醚后，得萃取液；

C、按萃取液:乙酸乙酯 = 1:1的体积比，于室温下，用乙酸乙酯对B步骤所得的萃取液进行2～3次的萃取，回收乙酸乙酯后，得浸膏；

D、将C步骤的浸膏上硅胶柱，用氯仿:甲醇 = 1:0, 40:1, 10:1, 8:2, 6:4, 0:1的体积比的洗脱剂，进行梯度洗脱，分别得粗分离物a、b、c、d、e、f；

E、将D步骤所得粗分离物b依次进行硅胶柱层析、凝胶柱层析以及反相柱层析，最终得到对苯二酚化合物euchroquinol A。

所述A步骤的乙醇、B步骤的石油醚、C步骤的乙酸乙酯、D步骤的氯仿、甲醇均为工业级溶剂，重蒸后反复使用。

所述D步骤中使用的硅胶柱、E步骤中使用的硅胶柱、凝胶柱以及反相柱均为现有技术中的常规设备。

本发明具有下列优点：本发明提供的对苯二酚化合物euchroquinol A结构新颖，具有苯骈吉枝烯骨架，且具有抗丙型肝炎病毒HCV活性，治疗指数为6.32，可作为治疗丙型肝炎病的先导化合物，同时本发明提供的提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。

附图说明

图1为对苯二酚化合物euchroquinol A的结构；

图2为对苯二酚化合物euchroquinol A的异核多键相关（HMBC）；

图3为对苯二酚化合物euchroquinol A的旋转坐标系NOE（ROESY）相关。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

Ａ、将干燥的20 kg新疆紫草(A. euchroma)茎皮粉碎后，按紫草粉:乙醇水溶液 = 1:2的质量／体积比（kg/L），将40 L体积浓度为95%的乙醇水溶液与20 kg新疆紫草粉进行充分混合，于室温下浸泡24小时，得提取液，如此重复提取3次，合并提取液；

Ｂ、将Ａ步骤的提取液按常规进行减压浓缩，回收乙醇至无乙醇味后，按提取液:石油醚 = 1:1的体积比，先用石油醚于室温下对提取液重复萃取3次，回收石油醚后，得萃取液；

Ｃ、按萃取液:乙酸乙酯 = 1:1的体积比，用乙酸乙酯于室温下对Ｂ步骤的萃取液重复萃取3次，减压浓缩回收乙酸乙酯后，得浸膏652 g；

Ｄ、将Ｃ步骤的浸膏上硅胶柱（拌样硅胶：650 g, 80-100目, 层析用硅胶：3 kg, 200-300目）进行层析分离，先用氯仿洗脱，再用氯仿:甲醇 = 40:1, 10:1, 8:2, 6:4体积比的洗脱剂梯度洗脱，最后用甲醇洗脱, 得到a、b、c、d、e、f五个极性段位的粗分离物；

Ｅ、将Ｄ步骤的用氯仿:甲醇 = 40:1洗脱得到b极性段位的粗分离物 (137 g)上硅胶柱，经石油醚:丙酮 = 10:1, 5:1, 2:1体积比的洗脱剂进行梯度洗脱，即硅胶柱层析、凝胶柱层析以及反相柱层析，分别得到b1~b7七个极性段位的分离物；

Ｆ、将Ｅ步骤的b4极性段位的分离物（9.8 g,，即用石油醚:丙酮 = 5:1体积比的洗脱剂洗脱的分离作) 经硅胶柱 (用石油醚:乙酸乙酯 = 10:１体积比的洗脱剂)层析, 得到b4-1、b4-2、b4-3三个分离物，其中，b4-1经ODS柱 (体积浓度为30%的甲醇水洗脱)层析，得5 mg对苯二酚化合物euchroquinol A 。

对苯二酚化合物euchroquinol A为白色无定形粉末，根据HRESIMS (m/z 281.1161 [M+Na]⁺, calcd. 281.1153)，并结合¹H和¹³C NMR（表-1），确定分子式为C₁₆H₁₈O₃，不饱和度为8。

对苯二酚化合物euchroquinol A的结构与一个具有苯骈吉枝烯骨架的化合物leucocordiachrome H极为相似，包括苯环上的取代方式以及C-5和C-14之间的五元环。两者的唯一差别在于euchroquinol A的C-8 (δ _H2.43, 2.78, each 1H, d, J = 16.5 Hz, H₂-8; δ _C36.3, t, C-8)位没有被羰基取代。H₃-9 (δ _H 0.87)与C-8, 以及H₂-8与C-6, C-7, C-9, C-10, C-4a, C-8a之间的HMBC相关进一步证明euchroquinol A中C-8位亚甲基的存在。

Euchroquinol A的相对立体化学通过ROESY实验获得。据文献报道，具有苯骈吉枝烯骨架的化合物的H₃-9均为β取向。ROESY谱中，H₃-9与H-8β (δ _H2.78)的相关，说明两者在空间上比较接近。此外，H-8α (δ _H2.43)与H-6 (δ _H 2.82, d, J = 6.4 Hz)，以及H-6与H-5 (δ _H 4.97, d, J = 6.4 Hz)之间的ROESY相关，说明它们均处于α取向。基于以上分析，euchroquinol A的结构得以确定。

表1对苯二酚化合物euchroquinol A的NMR数据 (400 MHz, δppm, J Hz)

Figure 2010105961365100002DEST_PATH_IMAGE002

实施例2

本实施例通过2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系 (HCV cell culture, HCVcc)，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，对抗HCV药物进行MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价。

将对苯二酚化合物euchroquinol A以DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌，原药液浓度为10 mg/mL。

人肝癌细胞株Huh 7.5.1用含15%新生牛血清的DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM) 于37℃ 5% CO₂培养箱中培养。病毒J6/JFH1由Huh 1细胞培养培养后，保存于-80℃。

1) MTT法检测样品细胞毒性

取对数生长期的Huh 7.5.1细胞，以9×10³cells/well细胞铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2 μL DMSO梯度稀释的药物，5倍稀释，5个稀释度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照（只含培养基）、细胞对照、药物颜色对照、DMSO对照及抗HCV阳性药物利巴韦林对照，终体积200 μL/well 。将培养板置于37℃ 5% CO₂培养箱进行培养。第三天于实验孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，37℃ 5% CO₂孵育4小时。弃去上清，加入150 μL/well的DMSO，振荡溶解10 min后，于酶标仪上测定OD490的值，并以Graphad Prism 5.0计算药物CC₅₀值(CC₅₀: 半数抑制浓度, 抑制50%细胞生长所需的浓度）。

2) 样品抗HCV活性测试

取对数生长期的Huh 7.5.1细胞，以9×10³cells/well铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2 μL DMSO梯度稀释的药物，5个稀释度，每个梯度设三个重复孔，同时加入病毒，设细胞对照、病毒对照、抗HCV阳性对照（IFNα-1b及利巴韦林）、DMSO对照，终体积200 μL/well。将培养板置于37℃ 5% CO₂培养箱进行培养，3d后收集上清3000 rpm/min离心10 min，取澄清上清进行RNA载量检测。以Graphad Prism 5.0计算HCV复制抑制率及EC₅₀值 (EC₅₀: 半数效应浓度，引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量)。

Figure 2010105961365100002DEST_PATH_IMAGE004

3) 对苯二酚化合物euchroquinol A的抗HCV药效评价

选择指数 (Selective index, SI)为药物对细胞的半数抑制浓度CC₅₀和对病毒的半数效应浓度EC₅₀的比值，代表药物的安全性，此数值越大越安全。

结果表明（表-2），相对于阳性对照IFNα-1b和利巴韦林，euchroquinol A显示出了较利巴韦林高的细胞毒性; 从抗HCV的效果来看，euchroquinol A表现出了低于利巴韦林的EC₅₀值; 从选择指数来看，euchroquinol A显示出了较阳性对照稍低的选择指数，有一定的抗病毒效果，可作为治疗丙肝的先导化合物。

表2对苯二酚化合物euchroquinol A的抗HCV活性实验结果

Claims

1.一种具有抗HCV活性的对苯二酚化合物，其分子式为C₁₆H₁₈O₃，化学结构式为：

。

2.一种如权利要求1所述具有抗HCV活性的对苯二酚化合物的制备方法，其特征在于经过下列步骤：

A、将新疆紫草的茎皮粉碎后，按新疆紫草的茎皮粉:乙醇水溶液 = 1:2～4的质量／体积比，kg/L，将新疆紫草的茎皮粉放入体积浓度为95%的乙醇水溶液中，室温下浸泡24小时后，得提取液，如此重复提取3次，合并提取液；

E、将D步骤所得粗分离物b依次进行硅胶柱层析、凝胶柱层析以及反相柱层析，最终得到对苯二酚化合物。