CN102060836B - 具有苯骈吉枝烯骨架的化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种具有苯骈吉枝烯骨架的化合物及其制备方法，所述化合物对HCV的选择指数为1.75(或0.62)。所述化合物是从新疆紫草中提取分离出来的，且提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。

Description

具有苯骈吉枝烯骨架的化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种新的化合物，尤其是一种具有苯骈吉枝烯骨架且具有抗HCV活性的化合物及其制备方法，属于药物技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒（HCV）是导致肝癌和肝硬化的主要原因，它感染着超过3%的世界人口，被认为是慢性肝病的主要原因之一。目前的标准治疗，包括PEG-IFN/RBV联合用药，只对过半的感染了丙型肝炎病毒（HCV）的患者有效，且有明显的副作用，对多数感染了丙型肝炎病毒（HCV）的患者的治疗效果不够理想。因此，从传统中药、植物和真菌资源中寻找新的抗HCV药物或先导化合物的研究具有较大的现实意义。然而，抗HCV化合物的筛选平台与其他病毒筛选平台相比尚不够完善。关于抗HCV天然产物的报道较少。如从Moricortex radicis中得到的2个2-arylbenzofuran衍生物，具有很强的抑制HCV复制的作用，IC50值分别为42.9 和 27.0 μmol/L；从真菌 Aspergillus ochraceus中得到的mellein, 具有抗HCV蛋白酶活性，IC50= 35 μmol/L;从Parthenium hispitum中分离得到的5个新的C14-oxygenated 1α-hydroxy-11(13)-pseudoguaien-6β,12-olides, 能有效地抑制HCV的复制。
新疆紫草(Arnebia euchroma)具有活血、解毒（与麻疹、炎症等相关）的功效，传统用于治疗黄疸、烧伤、湿疹以及便秘。
迄今为止，本发明所涉及的化合物的结构以及抗HCV活性均尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有苯骈吉枝烯骨架且具有抗HCV活性的化合物。
本发明的第二个目的在于提供一种具有苯骈吉枝烯骨架且具有抗HCV活性的化合物的提取分离方法。
本发明提供的具有苯骈吉枝烯骨架且具有抗HCV活性的化合物，分子式为C16H16O4， 化学结构式为：
Figure 159217DEST_PATH_IMAGE001
或者，分子式为C18H20O6，化学结构式为：
本发明所述的具有苯骈吉枝烯骨架且具有抗HCV活性的化合物是从新疆紫草(Arnebia euchroma)茎皮中提取分离出来的，其提取分离方法如下：
A、将紫草粉碎后，按紫草原料:乙醇水溶液＝1:2～4的质量／体积比（kg/L），将紫草粉放入体积浓度为95%的乙醇水溶液中，室温下浸泡24小时后，得提取液，如此重复提取3次，合并提取液；
B、将A步骤所得提取液浓缩至无乙醇味后，按提取液:石油醚＝1:1的体积比，于室温下，用石油醚对提取液进行2～3次的萃取，回收石油醚后，得萃取液；
C、按萃取液:乙酸乙酯＝1:1的体积比，于室温下，用乙酸乙酯对B步骤所得的萃取液进行2～3次的萃取，回收乙酸乙酯后，得浸膏；
D、将C步骤的浸膏上硅胶柱，用氯仿:甲醇＝1:0, 40:1, 10:1, 8:2, 6:4, 0:1的体积比的洗脱剂，进行梯度洗脱，分别得粗分离物a、b、c、d、e、f；
E、将D步骤所得粗分离物b依次进行硅胶柱层析、凝胶柱层析以及反相柱层析，最终得到具有苯骈吉枝烯骨架的化合物。
所述A步骤的乙醇、B步骤的石油醚、C步骤的乙酸乙酯、D步骤的氯仿、甲醇均为工业级溶剂，重蒸后反复使用。
所述D步骤中使用的硅胶柱、E步骤中使用的硅胶柱、凝胶柱以及反相柱均为现有技术中的常规设备。
  本发明具有下列优点：本发明提供的化合物结构新颖，具有苯骈吉枝烯骨架，且具有一定的抗HCV的活性，选择指数为1.75 (或0.62)。所述化合物是从新疆紫草(Arnebia euchroma)茎皮中提取分离出来的，且提取分离方法简单易行，成本低，效率高，得率高，提取物质量好。
附图说明    
图1为化合物2（euchroquinol B）的结构；
图2为化合物3（euchroquinol C）的结构；
图3为化合物2、化合物3的结构。
具体实施方式
实施例1
Ａ、将干燥的20 kg新疆紫草(A. euchroma)茎皮粉碎后，按紫草粉:乙醇水溶液＝1:2的质量／体积比（kg/L），将40 L体积浓度为95%的乙醇水溶液与20 kg新疆紫草粉进行充分混合，于室温下浸泡24小时，得提取液，如此重复提取3次，合并提取液；
Ｂ、将Ａ步骤的提取液按常规进行减压浓缩，回收乙醇至无乙醇味后，按提取液:石油醚=1:1的体积比，先用石油醚于室温下对提取液重复萃取3次，回收石油醚后，得萃取液；
Ｃ、按萃取液:乙酸乙酯=1:1的体积比，用乙酸乙酯于室温下对Ｂ步骤的萃取液重复萃取3次，减压浓缩回收乙酸乙酯后，得浸膏652 g；
Ｄ、将Ｃ步骤的浸膏上硅胶柱（拌样硅胶：650 g, 80-100目, 层析用硅胶：3 kg, 200-300目）进行层析分离，先用氯仿洗脱，再用氯仿:甲醇 = 40:1, 10:1, 8:2, 6:4体积比的洗脱剂梯度洗脱，最后用甲醇洗脱, 得到a、b、c、d、e、f五个极性段位的粗分离物；
Ｅ、将Ｄ步骤的用氯仿:甲醇 = 40:1洗脱得到b极性段位的粗分离物 (137 g)上硅胶柱，经石油醚:丙酮 = 10:1, 5:1, 2:1体积比的洗脱剂进行梯度洗脱，即硅胶柱层析、凝胶柱层析以及反相柱层析，分别得到b1~b7七个极性段位的分离物；
F、将E步骤的b4极性段位的分离物 (9.8 g, 即用石油醚:丙酮＝5:1体积比的洗脱剂洗脱的分离物) 经硅胶柱 (用石油醚:乙酸乙酯＝10:1体积比的洗脱剂)层析,，分别得到b4-1～b4-3三个极性段位的分离物；取b4-2分离物经ODS柱 (用体积浓度为50-100%的甲醇水溶液梯度洗脱)层析，析出黄色针晶，经反复纯化得23 mg化合物2，命名为euchroquinol B；
Ｇ、将E步骤的b3极性段位的分离物 (5.5 g，即用石油醚:丙酮＝10:1体积比的洗脱剂洗脱的分离物) 经硅胶柱 (用石油醚:丙酮＝50:1体积比的洗脱剂) 层析，分别得到b3-1～b3-7七个极性段位的分离物；取b3-7分离物依次经ODS柱 (用体积浓度为40-100%的甲醇水溶液梯度洗脱), 硅胶柱 (用石油醚:乙酸乙酯 ＝15:1体积比的洗脱剂), Sephadex LH-20柱 (用氯仿:甲醇＝1:1体积比的洗脱剂), 以及硅胶柱 (用石油醚:乙酸乙酯＝15:1体积比的洗脱剂)反复层析, 最终得到5 mg化合物3，命名为euchroquinol C。
化合物2（euchroquinol B）为黄色针晶，根据HRESIMS (m/z 271.0976 [M-H]-, calcd. 271.0970)，并结合1H和13C NMR，确定分子式为C16H16O4，不饱和度为9，IR谱显示分子中羟基(ν max 3282 cm-1)和羰基(ν max 1648 cm-1)的存在。
化合物2（euchroquinol B）的1H和13C NMR（表-1）显示分子中存在如下基团：1个叔甲基，3个亚甲基（包括1个含氧亚甲基和2个末端双键），5个次甲基（包括1个含氧和3个不饱和次甲基），6个季碳（其中5个为不饱和的），以及1个羰基。上述信息，结合质子以及碳信号的化学位移值，说明化合物2（euchroquinol B）具有苯骈吉枝烯结构单元。
HMBC相关谱中，H3-9与C-6, C-7, C-8和C-10, H-11与C-7和C-10, 以及H-13与C-6, C-12和C-14的相关, 说明C-6, C-8, C-9和C-10与同一个季碳(C-7)相连。H-6(δ H 3.43, s)与C-7, C-9, C-12, C-13, C-14和C-4a的HMBC相关，以及H-8(δ H 5.06, overlap)与C-1, C-6, C-7, C-9, C-10, C-4a和C-8a的HMBC相关，进一步证实了以上推断。此外, H-6与羰基（δ C 204.0）之间的HMBC相关, 以及1H NMR中H-6的单峰信号, 说明羰基连在C-5位上。C-8 (δ C 70.7) 的化学位移在低场说明其被含氧基团取代。此外, Ha-14 (δ H4.04, 1H, d, J = 14.0 Hz)与C-8之间，以及H-8与C-14之间明显的HMBC相关, 说明C-8与C-14通过氧原子形成了六元环, 这在具有苯骈吉枝烯骨架的化合物中是首次发现。
化合物2（euchroquinol B）的相对构型通过ROESY实验得到。H3-9与H-6 和H-8的显著的NOE相关, 说明B环与C环顺式骈合, 且H-6和H-8均为b取向。
基于上述分析，化合物2（euchroquinol B）的结构被最终确定。
化合物3（euchroquinol C）为黄色油状物，由HRESIMS (m/z 355.1157 [M+Na]+, calcd. 355.1157)确定其分子式为C18H20O6。将化合物3（euchroquinol C）的1D和2D NMR数据（表1）与化合物2（euchroquinol B）进行仔细对比，发现除了苯环C-2和C-3位上的取代基不同外，其他的结构极为相似，包括立体化学。化合物3（euchroquinol C）中芳香质子信号的缺失以及两个甲氧基信号的出现，说明化合物3（euchroquinol C）的C-2和C-3位被甲氧基取代，13C NMR数据亦支持上述推断。化学位移在δ H3.94的甲氧基与C-3，以及另一个甲氧基（δ H 4.14）与C-2之间的HMBC相关，进一步证实了以上结论。因此，化合物3（euchroquinol C）是化合物2（euchroquinol B）的二甲氧基衍生物。
表1、化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）的NMR数据 (δppm, J Hz)
Figure 2010105961350100002DEST_PATH_IMAGE003
实施例2
本实验通过2a型嵌合病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞产生有感染性的病毒颗粒这一HCV细胞培养体系 (HCV cell culture, HCVcc)，以干扰素和利巴韦林为阳性对照，对抗HCV药物进行MTT细胞毒性检测及体外抗HCV药效评价。
将化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）分别以DMSO溶解，0.22 μm滤膜过滤除菌，原药液浓度为10 mg/mL。
人肝癌细胞株Huh 7.5.1用含15%新生牛血清的DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM) 于37℃ 5% CO2培养箱中培养。病毒J6/JFH1由Huh 1细胞培养培养后，保存于-80℃。
1) MTT法检测样品细胞毒性
取对数生长期的Huh 7.5.1细胞，以9×103 cells/well细胞铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2μL DMSO梯度稀释的药物，5倍稀释，5个稀释度，每个梯度设三个重复孔，同时设置空白对照（只含培养基）、细胞对照、药物颜色对照、DMSO对照及抗HCV阳性药物利巴韦林对照，终体积200 μL/well 。将培养板置于37℃ 5% CO2培养箱进行培养。第三天于实验孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液，37℃ 5% CO2孵育4小时。弃去上清，加入150 μL/well的DMSO，振荡溶解10 min后，于酶标仪上测定OD490的值，并以Graphad Prism 5.0计算药物CC50值(CC50: 半数抑制浓度, 抑制50%细胞生长所需的浓度）。
Figure 560298DEST_PATH_IMAGE004
2) 样品抗HCV活性实验 
取对数生长期的Huh 7.5.1细胞，以9×103 cells/well铺于96孔板，贴壁5小时后，加入2 μL DMSO梯度稀释的药物，5个稀释度，每个梯度设三个重复孔，同时加入病毒，设细胞对照、病毒对照、抗HCV阳性对照（IFNα-1b及利巴韦林）、DMSO对照，终体积200 μL/well。将培养板置于37℃ 5% CO2培养箱进行培养，3d后收集上清3000 rpm/min离心10 min，取澄清上清进行RNA载量检测。以Graphad Prism 5.0计算HCV复制抑制率及EC50值 (EC50: 半数效应浓度，引起受试对象50%个体产生一种特定效应的药物剂量)。
3) 抗HCV药效评价
选择指数 (Selective index, SI)为药物对细胞的半数抑制浓度CC50和对病毒的半数效应浓度EC50的比值，代表药物的安全性，此数值越大越安全。
结果表明（表-2），相对于阳性对照IFNα-1b和利巴韦林，化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）均显示出了较利巴韦林高的细胞毒性; 从抗HCV的效果来看，化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）均表现出了低于利巴韦林的EC50值; 从选择指数来看，化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）显示出了较阳性对照低的治疗指数，但仍具有一定的抗病毒效果，可作为治疗丙肝的先导化合物。
表2、化合物2（euchroquinol B）和化合物3（euchroquinol C）的抗HCV活性实验结果
Figure 57105DEST_PATH_IMAGE006

Claims (1)

1.一种具有苯骈吉枝烯骨架的化合物，其分子式为C16H16O4，化学结构式为：
                                                                         
或者，分子式为C18H20O6，化学结构式为：
Figure 311210DEST_PATH_IMAGE002
。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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孙志义等.紫草的成分、药理及临床应用研究概况.《山东医药工业》.1998,第17卷(第3期),30-31. *
林志彬等.紫草化学成分抗炎症作用的研究.《北京医学院学报》.1980,第12卷(第2期),101-107. *

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