CN101036664A - 地乌提取物单体在制备中药制剂原料药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了地乌提取物中的4个单体成分W_0a、W_0b、W₁和W₂在制备中药制剂原料药中的应用。该中药制剂用于防治系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、系统硬化症、骨性关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、雷诺病、银屑病，及中医病症中的风湿寒性关节痛、风湿性关节炎、增生性关节炎、肩关节周围炎等。该中药制剂治疗上述自身免疫病发挥双向调节作用，具有疗效显著、毒副反应小的优点，应用前景广阔。

Description

地乌提取物单体在制备中药制剂原料药中的应用

技术领域

本发明涉及地乌提取物中的4个单体成分在制备中药制剂原料药中的应用。

背景技术

地乌系毛茛科银莲花属植物林荫银莲花(Anemone flaccida Fr.Schmidt)的干燥根茎，在《贵州民间药物》、《浙江天目山药植志》等书中均有记载，其性温，味辛微苦，具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，善治风湿疼痛、跌打损伤。(中药大辞典，上海：上海科学技术出版社，2002：802)

本所(湖北中医学院中药研究所)由地乌中得到地乌提取物，制成地乌风湿安胶囊，用于治疗类风湿性关节炎(RA)，于2004年9月2日获国家5类中药新药的临床研究批件，现处于临床实验阶段。已申报的相关专利有：“地乌提取物的主要成分、制备方法及应用”(申请号200510019169.2)，“一种地乌总皂苷的制备方法”(申请号200510075306.4)，“一种地乌总皂苷提取物”(申请号200610033184.7)，“一种地乌提取物及其用途”(申请号200610033185.1)。

本所由地乌提取物中进一步分离纯化得到了5个主要单体成分，暂定名：W_0a、W_0b、W₁、W₂、W₃。其中W₃拟作为风湿安中药制剂的原料药，应用于风湿类疾病的治疗；已获证书的专利有“风湿安中药制剂及制备和应用”(专利号ZL200510018364.3)和“从林荫银莲花提取的地乌皂苷W₃标准品及制备工艺”(专利号ZL200510018363.9)。其它4个单体W_0a、W_0b、W₁和W₂的来源、化学名称、结构、分子式、图谱鉴定等在申报的专利“地乌提取物的主要成分、制备方法及应用”中已予以说明。

发明内容

本发明的目的在于提供地乌提取物中的4个单体成分W_0a、W_0b、W₁和W₂(统称为地乌提取物单体)在制备中药制剂原料药中的新应用。

本发明涉及地乌提取物单体作为制备治疗或预防系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、系统硬化症的中药制剂原料药中的应用。

本发明涉及地乌提取物单体作为制备治疗或预防骨性关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症的中药制剂原料药中的应用。

本发明涉及地乌提取物单体作为制备治疗或预防雷诺病的中药制剂原料药中的应用。

本发明涉及地乌提取物单体作为制备治疗预防银屑病的中药制剂原料药中的应用。

本发明涉及地乌提取物单体作为制备治疗中医病症中的风湿寒性关节痛、风湿性关节炎、增生性关节炎、肩关节周围炎的中药制剂原料药中的应用。

本发明的中药制剂应用于治疗上述自身免疫性疾病。本中药制剂在治疗上述自身免疫病时，是通过针对机体特定的免疫调节状态来调节免疫，避免非特异性免疫抑制及药物的毒性作用，具有疗效显著、毒副作用小的优点。

本发明的有益效果是，对已知地乌提取物单体发掘出新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。

附图说明

图1是W_0a，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

图2是W_0b，3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸-齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

图3是W₁，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷；

图4是W₂，3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖-齐墩果酸-28-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。

具体实施方式

实施例一地乌提取物单体的制备

取地乌提取物，用甲醇溶解，加入2倍质量的硅胶G混匀，水浴挥去溶剂，得到样品；按样品∶硅胶G＝1∶30的重量比例上硅胶干柱，通过氯仿∶甲醇∶水＝20∶10∶1(体积)系统洗脱，粗分成I、II、III、IV、V5段；经薄层检查，取II段以甲醇洗脱，洗脱液浓缩至干，得浓缩物；将浓缩物与2倍质量的硅胶G混匀，水浴挥去溶剂，按样品∶硅胶G＝1∶30的重量比例上硅胶干柱，以氯仿∶甲醇∶水＝7∶4∶1(体积)系统洗脱，将其分成II-1、II-2、II-3、II-4、II-5、II-6六段。

收集II-2段，以甲醇洗脱，洗脱液浓缩至干，浓缩物以40％～80％甲醇溶解，以Rp-18柱进行制备分离，以甲醇-水系统洗脱，经紫外检测分离得W_0a和W_0b；

收集II-3段，同前述II-2段方法处理，经紫外检测分离得W₁；

收集II-4段，同前述II-2段方法处理，制备分离以乙腈-水系统洗脱，经紫外检测分离得W₂。

本发明中除另有说明之外乙醇百分浓度均是指容量百分浓度，化合物百分含量是指质量百分含量。

实施例二中药制剂的制备

上述4个单体成分：W_0a、W_0b、W₁、W₂，纯度≥90wt％，作为原料药制成中药制剂，剂型包括粉剂、丸剂、滴剂、片剂等。口服，用于治疗自身免疫病。

实施例三地乌提取物单体对系统性红斑狼疮(SLE)样小鼠作用的实验研究

1方法

1.1SLE样症状小鼠模型的制备：密度梯度离心法无菌分离BALB/c小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞，⁶⁰C₀照射(剂量6Gy)，诱导85％左右细胞发生凋亡(丫啶橙染色法观察凋亡率)。照射后淋巴细胞继续在37℃、5％CO₂环境下孵育4h。将获得的凋亡细胞成分分别于0、7、14天皮下途径免疫小鼠，每只小鼠10⁷个淋巴细胞。第一次免疫用完全弗氏佐剂(CFA)，第二次、第三次重复免疫采用不完全弗氏佐剂(IFA)^[1，2]。

1.2动物分组与给药：以同龄同性别未经照射未输入淋巴细胞悬液的F1代杂交小鼠作为正常对照。将F1代小鼠随机分为6组，①正常对照组；②W_0a组：208mg/kg；③W_0b组：208mg/kg；④W₁组：208mg/kg；⑤W₂组：208mg/kg；⑥模型对照组。灌胃给药，每日1次。正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水。

1.3标本收集：(1)血清制备：采用毛细吸管经后眼眶静脉丛取血约0.2ml/次，第1次于输注前。输注后每2周1次，共7次。离心分离血清，保存于-30℃低温冰箱，统一测定。(2)尿液收集：取尿前小鼠禁食12h，只给饮水，然后收集尿液约0.5ml，当即检测。第1次于输注前。输注后每2周1次，共7次。(3)组织检查：输注后至第14周结束时，放血处死小鼠，取出脾脏和肾脏做脾指数测定和肾脏组织学检测。

1.4标本检测

1.4.1参照文献方法^[1]，使用ELISA法检测抗dsDNA抗体及抗组蛋白抗体。

1.4.2尿蛋白测定：用尿蛋白试纸比色法测定新鲜尿液的蛋白质含量，分-(＜1mg％)、±(1mg％～10mg％)、+(10mg％～30mg％)、++(30mg％～100mg％)、+++(100mg％～300mg％)、++++(＞300mg％)共6个等级。

1.4.3脾指数测定：小鼠处死前称其重量(g)。放血处死小鼠取出脾脏，以滤纸吸干表面血污，测其重量(mg)。脾指数＝脾重(mg)数×10/体重(g)数。

1.4.4病理检测：常规HE染色：取出肾组织后，以10％的中性福尔马林溶液固定，按常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、做HE染色、固封、镜检。免疫荧光检查：取新鲜小鼠肾组织，冰冻切片，厚约3μm，室温干燥1h，纯丙酮固定20min，用0.01M PH7.2的PBS洗涤3次，略干燥，滴加1∶40稀释的免抗小鼠IgG-FITC于切片上，37℃孵育1h，冲洗，风干，于万能显微镜下观察IgG沉积及分布情况。

1.4.5统计学处理：自身抗体水平以均数±标准差( X±S)表示，多组间用单因素方差分析，以P＜0.05作为差异显著的标准。尿蛋白水平依-、±、+、++、+++、++++分别记为0、5、10、20、30、40分，多组间差异统计用Ridit分析。

2结果

2.1自身抗体(抗dsDNA抗体、抗组蛋白抗体)的变化：模型组与正常组相比较，抗dsDNA抗体，诱导后第4周末至第14周末明显高于正常组，差异显著(P＜0.05)，且于第10周末达到峰值(P＜0.01)；抗组蛋白抗体，诱导后第2周末至第14周末模型组高于正常组，差异显著(P＜0.05)，且于第8周末达到峰值(P＜0.01)。模型组与各用药组相比较，诱导后第6周末至第14周末，各用药组的自身抗体水平较模型组低，差异显著(P＜0.05)。各用药组14周自身抗体平均水平无显著性差异(P＞0.05)。见表1、表2。

表1药物对诱导后第8周末抗组蛋白抗体变化的影响( X±S)

组别	动物数(只)	抗组蛋白抗体
			正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	101010101010	0.809±0.098**2.356±0.1751.167±0.189*1.354±0.156*1.164±0.271*1.125±0.101*

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

                   表2药物对自身抗体平均水平的影响( X±S)

组别	动物数(只)	抗组蛋白抗体	抗dsDNA抗体
				正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	101010101010	0.787±0.077**1.813±0.5321.228±0.163*1.396±0.254*1.287±0.170*1.294±0.169*	0.654±0.048**1.653±0.2901.047±0.104*1.096±0.136*1.027±0.058*1.029±0.076*

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

2.2尿蛋白水平变化：诱导后第6周末模型组较正常组和各用药组高(P＜0.05)，持续到第14周末，于第14周末达到峰值(P＜0.01)。各用药组之间无显著性差异(P＞0.05)，见表3。脾指数见表4。

                     表3药物对尿蛋白总体变化的影响( X±S)

组别	动物数(只)	尿蛋白
								-	±	+	++	+++	++++
		正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	658080808080	39842383950	181425242420	826812127	0255653							060000	010000

       表4药物对脾指数变化的影响( X±S)

组别	动物数(只)	脾指数
			正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	101010101010	21.67±2.56718.92±2.23922.00±3.10014.70±1.578**15.15±2.224**14.60±12.421**

注：与模型组比较，^**P＜0.01。

2.3组织学检查：模型组可见部分肾小球萎缩或增生，大小不均匀，间质细胞增生，毛细血管壁有增厚的迹象，间质血管充血及少量淋巴细胞浸润。正常组未见明显改变。用药各组肾小球轻度增生，数量较少，间有萎缩。免疫荧光检查可见，IgG荧光抗体沉积于肾小球基底膜及间质毛细血管内皮区域，呈颗粒状。各用药组仅见部分肾小球有大量荧光抗体沉积，强度较弱，正常组未发现阳性结果。

3参考文献

[1]林晨.同种异体淋巴细胞诱导的SLE样小鼠模型[J].上海免疫学杂志，1980，9(2)：73-76.

[2]高春芳.青蒿琥酯对系统性红斑狼疮样小鼠模型的影响[J].中华皮肤科杂志，1995，28(1)：17-19.

实施例四地乌提取物单体治疗骨质疏松症的实验研究

1方法

取体重230g-270g的雌性大鼠60只，乙醚麻醉下手术，其中50只行双侧卵巢摘除术，剩余10只为正常对照组，做单纯腹腔开关手术。术后室温下分笼饲养。术后2周，将摘除卵巢的大鼠随机分为5组，分别为模型组、W_0a组、W_0b组、W₁组、W₂组，各用药组剂量为144mg/kg，正常对照组和模型组给予等体积生理盐水。灌胃给药，每天1次，连续120天。末次给药后24h将动物处死，取股骨分别测定骨密度(BMD)、骨重、骨长、骨直径、骨强度和骨钙含量，并做病理组织学检查。

2结果

W_0a、W_0b、W₁及W₂各组均可增加骨质疏松大鼠骨的重量、长度、强度及骨钙的含量。因此W_0a、W_0b、W₁、W₂对去势大鼠骨质疏松均有治疗作用。结果见表5。

                        表5药物对去势大鼠BMD、骨重、骨长、骨强度和骨钙含量的影响( X±S)

组别	动物数(只)	BMD(g/cm2)	骨重(mg)	骨长(cm)	骨强度(kg)	骨钙含量(mg)
							正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	101010101010	0.351±0.038*0.309±0.0360.352±0.037*0.368±0.045*0.368±0.032*0.354±0.043*	705.1±23.98***588.86±53.90598.89±67.45*674.50±50.69*654.10±43.23*637.80±34.87*	3.92±0.12**3.77±0.093.88±0.09**3.87±0.18*3.90±0.09**3.91±0.11**	7.66±0.99**5.55±1.007.00±0.98**7.60±1.00**7.45±0.89**7.65±0.99**	0.19±0.033**0.12±0.1130.17±0.041**0.18±0.050**0.19±0.043**0.18±0.100**

注：与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

实施例五地乌提取物单体对兔骨性关节炎影响的实验研究

1方法

1.1兔骨性关节炎模型的制备^[1]：选用日本大耳白兔36只，体重2.0-2.5kg，雌雄各半，随机分成6组，正常对照组、模型组、W_0a组、W_0b组、W₁组、W₂组。除正常对照组外，其余各组每兔用石膏绷带制动左侧膝关节。制动两周后，按10mL/kg体重开始灌胃给药，各用药组剂量为75mg/kg，正常对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，每日给药1次，连续6周。末次给药后12h，将各组动物解除制动进行各项指标的测定。

1.2动物膝关节活动范围的测定^[1]：将兔膝关节伸展，再回缩膝关节，用量角器测量伸展至回缩的角度，即为膝关节活动范围。

1.3血液Ca、P检测及Ca/P比值的计算：动物心脏采血，全自动生化分析仪检测。

1.4关节滑膜厚度的测定：切取完整的膝关节，立即打开膝关节腔，用螺旋测微器测定关节滑膜厚度。

1.5关节滑膜中蛋白含量及SOD活力的测定^[2]：用锐利刀片切取膝前正中部的滑膜组织200mg，用冰冻的生理盐水冲洗血液，滤纸拭干，放入2mL冰生理盐水中。将滑膜组织块取出剪碎，倒入玻璃匀浆管中冰生理盐水下匀浆，制成10％的组织匀浆，以3000r/min离心10min，取上清液。按照考马斯亮兰蛋白测定试剂盒及SOD测定试剂盒的说明书依次进行检测。

1.6滑膜液炎性细胞计数：取膝关节滑膜液涂片计数炎性细胞，光镜下观察记录。每张涂片随机观察5个视野(10×40倍)，计算每一视野平均炎性细胞数。计数标准：-：细胞数为0个/视野(HP)；+：细胞数＜10个/HP；++：细胞10～20个/HP；+++：细胞数＞20个/HP。

1.7病理组织学观察记录^[3]：膝关节标本用10％福尔马林(包含1％的醋酸与7％的EDTA)脱钙、石蜡包埋后切片(切片部位：胫骨平台取前外象限的1/2交界处，股骨髁标本取外象限中央点处；沿股骨内、外髁最底位的冠状面常规制片)，苏木素和伊红染色观察形态学。膝关节分级标准为：0级示滑膜完整，细胞排列整齐，无充血水肿，无炎性细胞浸润；关节软骨完整，无剥离，无坏死；潮线清晰可见。I级示滑膜血管充血水肿，表层细胞增生；骨膜增生，骨质疏松；潮线间断。II级示滑膜细胞显著增生，滑骨质疏松；潮线间断。III级示滑膜细胞显著增生，滑膜内血管增生，肉芽组织形成；关节软骨糜烂；潮线消失。IV级示滑膜内肉芽组织纤维化；关节软骨有灶性坏死。

2结果

2.1W_0a、W_0b、W₁、W₂对兔膝关节活动范围的影响：各用药组对模型兔膝关节活动范围有明显的改善作用，与模型组比较有明显的改善作用；关节滑膜厚，各组与模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)；Ca/P比值也明显升高(P＜0.01)。说明W_0a、W_0b、W₁、W₂各组对模型兔膝关节滑膜厚度肿胀有显著抑制作用(P＜0.01)。结果见表6。

 表6药物对兔膝关节活动范围、关节滑膜厚度和Ca/P比值的影响( X±S，n＝6)

组别	膝关节活动范围(度)	关节滑膜厚度(mm)	Ca/P比值
				正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	169.1±5.4**130.1±7.6147.2±6.4**149.8±4.5**150.2±7.3**146.5±6.5**	1.01±0.04**1.45±0.051.21±0.05**1.25±0.07**1.27±0.03**1.24±0.06**	2.17±0.32**1.36±0.151.57±0.11**1.63±0.34**1.75±0.22**1.68±0.17**

注：与模型组比较，^**P＜0.01。

2.2W_0a、W_0b、W₁、W₂对兔滑膜蛋白含量及SOD活力的影响：与模型组比较，W_0a、W_0b、W₁、W₂各组能明显增强滑膜组织SOD的活性(P＜0.01)，具有清除氧自由基增强机体抗氧化的能力。结果见表7。

  表7药物对兔滑膜蛋白含量及SOD活力的影响( X±S，n＝6)

组别	蛋白含量(g/L)	SOD活力(U/mgprot)
			正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	0.495±0.034**0.360±0.0350.465±0.050**0.443±0.032**0.438±0.028**0.457±0.044**	95.56±9.03**74.97±3.5890.12±8.75**86.56±5.76**85.92±6.71**84.89±4.23**

注：与模型组比较，^**P＜0.01。

2.3W_0a、W_0b、W₁、W₂对兔膝关节滑膜液炎性细胞计数的影响：模型组细胞计数以++、+++为主，给药组以+、++为主，与模型组比较，W_0a、W_0b、W₁、W₂各组能明显减少滑膜液炎性细胞数，疗效显著。结果见表8。

表8药物对兔膝关节滑膜液炎性细胞计数的影响( X±S，n＝6)

组别	炎性细胞计数分级(只)
					-	+	++	+++
	正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	401222	203244	021100					041100

注：与模型组比较，^*P＜0.05。

2.4W_0a、W_0b、W₁、W₂对兔滑膜与关节病理改变的影响：模型组病变以II、III级为主，用药组以I、II级为主。与模型组比较，各用药组能够抑制滑膜内血管增生和肉芽组织形成，减轻关节软骨糜烂或坏死，对制动后膝关节内滑膜及软骨的病理变化有显著的改善。见表9。

表9药物对兔滑膜与关节病理改变的影响( X±S，n＝6)

组别	滑膜与关节病理改变分级(只)
					0	I	II	III
	正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	600222	013244	032100					021100

注：与模型组比较，^*P＜0.05。

3参考文献

[1]王耶，刘建宇，宋艳，等.丹参和透明质酸钠注射液对骨性关节炎治疗作用的实验研究[J].中国生化药物杂志，1998，19(5)：248-251.

[2]张吉力，张闻生，邹季.风湿骨痛药酒药槌外治法治疗兔膝关节骨关节炎的实验研究[J].中医正骨，2001，13(7)：9-11.

[3]华英汇，顾湘杰，陈世盖，等.威灵仙注射液对骨关节炎影响的实验研究[J].中国运动医学杂志，2003，22(4)：420-422.

实施例六地乌提取物单体治疗银屑病的实验研究(药物局部外用对雌激素周期小鼠阴道上皮细胞有丝分裂的影响)

1方法

取60只小鼠，随机分为正常组、模型组、W_0a组、W_0b组、W₁组、W₂组。实验开始第1、2、3d正常组腹腔注射生理盐水0.1mL/只，其他组腹腔注射已烯雌酚0.1mL/只，使小鼠阴道上皮处于雌激素周期。第4、5、6d，各用药组阴道灌注药物0.01mL/只，正常组和模型组阴道灌注等体积生理盐水，1次/d。第7d上午正常组腹腔注射生理盐水0.01mL/只，其他各组均腹腔注射秋水仙碱0.05mg/只(秋水仙碱能使细胞有丝分裂周期停滞在中期便于进行计算)。1h后，再次给药。6h后，处死小鼠并切取阴道上皮组织，做常规组织切片，HE染色，在光学显微镜下计数，300个小鼠阴道上皮基底细胞中所出现的有丝分裂数，即有丝分裂指数。比较各组小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂指数，进行统计学处理。

2结果

模型组小鼠阴道上皮细胞的有丝分裂明显高于正常组，两组比较具有极显著性异(P＜0.01)，证明造模成功，小鼠属于雌激素周期的阴道上皮。W_0a、W_0b、W₁、W₂各组小鼠阴道上皮细胞有丝分裂明显少于模型组，与模型组比较具有极显著性差异(P＜0.01)。结果见表10。

表10药物对小鼠阴道上皮细胞有丝分裂指数的影响( X±S)

组别	动物数(只)	平均有丝分裂指数
			正常组模型组W0a组W0b组W1组W2组	101010101010	0.50±0.30**34.50±21.3015.50±10.34***14.63±8.91***10.26±5.72***9.76±2.03***

从实施例三～实施例六可以看出，由地乌提取物单体制备而成的中药制剂可用于治疗或预防自身免疫性疾病，如上述提到的系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、系统硬化症骨性关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症、雷诺病、银屑病、风湿寒性关节痛、风湿性关节炎、增生性关节炎、肩关节周围炎。

Claims (5)

1、地乌提取物单体作为制备治疗或预防系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肌炎、系统硬化症的中药制剂原料药中的应用。

2、地乌提取物单体作为制备治疗或预防骨性关节炎、强直性脊柱炎、骨质疏松症的中药制剂原料药中的应用。

3、地乌提取物单体作为制备治疗或预防雷诺病的中药制剂原料药中的应用。

4、地乌提取物单体作为制备治疗或预防银屑病的中药制剂原料药中的应用。

5、地乌提取物单体作为制备治疗中医病症中的风湿寒性关节痛、风湿性关节炎、增生性关节炎、肩关节周围炎的中药制剂原料药中的应用。

Images