CN100336542C - 土茯苓总苷提取物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种土茯苓总苷提取物及其制备方法和用途，该提取方法的步骤是：(1)用乙醇水溶液对土茯苓渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液；(2)回收乙醇水溶液，浓缩至每毫升含2-6克生药；(3)用乙酸乙酯分次萃取，合并萃取液；(4)回收乙酸乙酯提取液，干燥得到土茯苓总苷提取物。在土茯苓总苷提取物中，土茯苓总苷的含量为50-80%，落新妇苷的含量为20-40%。本发明的特点是：土茯苓总苷提取采用乙醇提取乙酸乙酯萃取的方法，工艺简单，提取物中的总苷及有效成分的含量较高，土茯苓总苷提取物对于各种炎症反应和免疫应答具有显著的抑制作用，可以在制备具有抗炎和免疫抑制作用的药物中应用。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种中药提取物、提取方法和提取物的用途，特别是土茯苓总苷提取物及其提取方法，以及土茯苓总苷提取物用于治疗各种炎症和免疫性疾病。
二、背景技术
土茯苓为百合科植物光叶菝葜Smilax glabra Roxb.的干燥根茎，它是一种常用中药材，具有除湿、解毒、通利关节的功效。主治梅毒、淋浊、筋骨挛痛、瘰疬、疥癣、痈肿等病症。土茯苓的水提物能抑制致敏T淋巴细胞介导的炎症反应；对于佐剂关节炎等炎症反应具有显著的抗炎活性；对于佐剂关节炎中的迟发相，即T淋巴细胞介导的炎症反应具有显著的抑制作用，其机理与调节CD4/CD8T细胞的比值有关。它还可通过选择性地诱导肝浸润T淋巴细胞的凋亡而发挥对细胞免疫反应性肝损伤的改善作用。
土茯苓中所含的主要活性成分落新妇苷对各种细胞免疫反应均有显著的抑制活性，其作用与选择性诱导活化T细胞的失能有关。
上述研究是基于土茯苓的水提物及其成分落新妇苷，但尚未有关于土茯苓总苷部位提取工艺及其活性的报道。
三、发明内容
1、发明目的：本发明的目的之一是提供一种土茯苓总苷提取物的提取方法，该方法通过乙醇渗漉提取、乙酸乙酯萃取、干燥等获得土茯苓总苷的有效部位。
本发明的目的之二是提供利用上述方法所获得的土茯苓总苷提取物。
本发明的目的之三是提供了该总苷提取物作为具有抗炎和免疫抑制作用的提取物，在制备治疗具有抗炎和免疫抑制作用的药物中的应用。
2、技术方案：本发明所述的土茯苓提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)用6-12倍于土茯苓重量的、浓度为30-95％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液；
(2)回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含2-6克生药；
(3)用相当于生药量0.5-2.0倍体积的乙酸乙酯分次萃取，合并萃取液；
(4)回收乙酸乙酯提取液，干燥得到总苷提取物。
在步骤(1)中，乙醇水溶液的浓度优选为40-80％，更优选是60％。
在步骤(1)中，用渗漉进行提取，优选将药材浸泡过夜，提取1-12小时，更优选3-8小时，最优选5小时。
在步骤(2)中，提取液浓度优选每毫升含2-6克生药，更优选2.5-5克/毫升，最优选5克/毫升。
在步骤(3)中，乙酸乙酯用量优选为生药量的0.5-2.0倍，更优选0.8-1.5倍，最优选1倍。
在步骤(3)中，用乙酸乙酯进行萃取的次数优选3-5次，最优选4次。
在步骤(4)中，干燥方法优选真空干燥，温度60-80℃，最优选70℃。
利用本发明上述提取方法所得的土茯苓总苷提取物，其中土茯苓的总苷提取物含量为50-80％，落新妇苷的含量为20-40％，均按总提取物重量计。
本发明中，可以用高效液相层析法在291nm波长下，流速1.0ml/分钟，用甲醇∶水∶冰醋酸(35∶65∶0.2)检测落新妇苷的含量。
所述的土茯苓总苷提取物的用途，在于该提取物在制备具有抗炎和免疫抑制作用的药物中的应用。
特别是该提取物在制备治疗各种炎症和免疫性疾病的药物中的应用。如在制备治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、移植排斥、过敏性皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性心肌炎、I、II、III和IV型变态反应性疾病、各种结肠炎、器官移植排斥、各型病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、化学性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、重症肝炎、暴发性肝衰竭、肝硬化、肝纤维化、脂肪肝等的药物中的应用。
3、有益效果：本发明的土茯苓总苷提取方法采用乙醇作为提取试剂，与常规的乙醇回流提取及乙醇浸泡提取方法不同，用乙醇渗漉提取，无论在提取率，提取物中总苷及主要有效成分方面都有明显优势。本发明提取工艺简单，提取物中总苷和有效成分的含量较高，提取物可以在制备具有抗炎和免疫抑制作用的药物中的应用。
四、具体实施方式
土茯苓是一种常用中药材，一般以饮片的形式使用。该药材可从各土茯苓产地直接购得，也可在安徽亳州等药材市场及各中药饮片厂购买。本发明是将药材粉碎成粗颗粒形式提取使用。
实施例1：土茯苓总苷提取物的提取方法包括以下步骤：
1、用8倍于土茯苓重量的、浓度为60％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液，提取时间为5小时；
2、回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含2克生药；
3、用相当于生药量1.0倍体积的乙酸乙酯分4次萃取，合并萃取液；
4、回收乙酸乙酯提取液，用真空干燥的方法干燥，干燥的温度为60℃，干燥得到总苷提取物。
经测试，在土茯苓总苷提取物中，土茯苓总苷提取物的含量为58％(重量)，落新妇苷的含量为28％(重量)。
实施例2：土茯苓总苷提取物的提取方法包括以下步骤：
1、用6倍于土茯苓重量的、浓度为95％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液，提取时间为2小时；
2、回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含6克生药；
3、用相当于生药量2倍体积的乙酸乙酯分5次萃取，合并萃取液；
4、回收乙酸乙酯提取液，用真空干燥的方法干燥，干燥的温度为80℃，干燥得到总苷提取物。
经测试，在土茯苓总苷提取物中，土茯苓总苷提取物的含量为66％(重量)，落新妇苷的含量为27％(重量)。
实施例3：土茯苓总苷提取物的提取方法包括以下步骤：
1、用12倍于土茯苓重量的、浓度为30％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液，提取时间为12小时；
2、回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含5克生药；
3、用相当于生药量0.6倍体积的乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液；
4、回收乙酸乙酯提取液，用真空干燥的方法干燥，干燥的温度为70℃，干燥得到总苷提取物。
经测试，在土茯苓总苷提取物中，土茯苓总苷提取物的含量为55％(重量)，落新妇苷的含量为24％(重量)。
实施例4：用上述实施例1提取方法得到的土茯苓总苷提取物进行药理实验、药理结果与分析，以证明土茯苓总苷提取物在制备具有抗炎和免疫抑制作用的药物中的应用。
土茯苓总苷提取物的药理实验：
1、小鼠胶原性关节炎模型。
取昆明种小鼠，随机分组，每组10只，用螺旋测微器测其左右后足足跖厚度作为初始值。取冰醋酸20μl，用生理盐水稀释成3.5ml，加II型鸡胶原(CII)6.9mg混匀，混悬为CII乳剂(2mg/ml)，加弗氏完全佐剂原液3.5ml，混匀，配成1mg/ml的浓度用于致敏，于小鼠尾根部皮内注射一次致敏(0.1ml/鼠)。另取冰醋酸20μl，用生理盐水稀释成3.5ml，加II型鸡胶原7.0mg混匀，混悬为CII乳剂(2mg/ml)，加生理盐水3.5ml，混匀，配成1mg/ml的浓度用于攻击。于致敏的20天后，给小鼠腹腔注射攻击(0.1ml/鼠)，诱导其关节免疫应答。致敏后至攻击前每4天测量小鼠足跖厚度以及体重变化，攻击后，每2天测量模型动物足跖以及关节部位的肿胀程度，记录耳、尾等其它部位发病症状；同时检测体重变化。
2、大鼠佐剂关节炎模型。
SD大鼠正常饲养两天后，随机分组，每组10只。致敏前用螺旋测微器预测大鼠左右后足的足跖厚度，随后，左足足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎。每隔一天用螺旋测微器测量一次左右后足足跖厚度，以厚度的变化作为免疫反应程度的衡量指标；称量大鼠体重，并观察模型动物的耳红斑、尾部结节等免疫炎症并发症状。于实验结束时分取大鼠右足，以福尔马林固定，做病理切片检查。
3、三硝基氯苯致小鼠迟发型变态反应。
取昆明种小鼠，剃去腹部之毛，涂以1％2，4，6-三硝基氯苯的乙醇溶液100μl致敏，致敏后随机分组，5天后，用1％2，4，6-三硝基氯苯的橄榄油溶液30μl均匀涂于小鼠右耳的上下两面攻击。攻击22小时后，用螺旋测微器测量小鼠左右耳廓厚度，以其差值作为炎症反应的强度。
4、鸡蛋清致小鼠足跖肿胀。
取昆明种小鼠，随机分组，将10％蛋清液50μl注射于小鼠左后足皮下致炎，并于致炎4小时后用螺旋测微器测量小鼠左右足足跖厚度，以前后差值作为炎症反应的强度。
5、二甲苯所致小鼠耳肿胀。
取昆明种小鼠，于小鼠右耳上下两面均匀涂抹30μl的二甲苯致炎，并于致炎后2小时用螺旋测微器(0.001mm，Mitutoyo，Tokyo，Japan)测量小鼠左右耳廓的厚度，以其差值作为炎症反应的强度。
土茯苓总苷提取物的药理结果与分析：
1、土茯苓总苷对小鼠胶原性关节炎模型关节病变的影响。
于攻击的当天(设为d0天)起开始给药，每天一次，持续24天。在设定日期于给药后5h时测量模型足跖厚度以及相关各项指标。Normal组为正常条件下饲养；Control组口服给予蒸馏水；土茯苓总苷经口给药，剂量为：10、40和120mg/kg；环孢素A(CsA)为腹腔注射给药，剂量为5mg/kg。
小鼠足关节的肿胀于攻击后第2～4天即可观测，而后有所减弱，伴随第16天左右发生的第二次周身免疫炎症反应，关节的肿胀开始且持续增强，并于第20～24天时达到高峰。周身免疫炎症反应多数表现为前足明显红肿，偶见小鼠尾部成粥样肿胀。
与对照组相比，土茯苓总苷各剂量组经口给药对于模型小鼠的关节肿胀均呈现了显著的抑制活性，尤其是40mg/kg剂量组，在给药后即呈现显著的治疗效果，且与CsA5mg/kg(ip)的活性相当(表1)，且动物的整体状况明显优于CsA组，CsA组动物整体状态不佳，尾部坏死、肢体衰残、肝部纤维化、甚至死亡等现象的发生率明显高于土茯苓总苷各剂量组。
结果表明，土茯苓总苷和CsA对小鼠的胶原性关节病变均有明显的治疗作用。
2、土茯苓总苷对大鼠佐剂关节炎模型关节病变的预防作用。
于致敏当天给药，此后每天一次，连续16天，给药后5小时测量足跖厚度以及监测各项指标。Normal组正常条件下饲养；Control组口服给药蒸馏水；土茯苓总苷的剂量为：10、20和40mg/kg，口服给药；CsA的给药剂量为5mg/kg，腹腔注射给药。
致敏足炎症反应分为两个阶段，D2时达到第一个肿胀高峰，随后，炎症逐渐消褪，D10起，开始继发性炎症反应，再次开始持续性的肿胀。对足的足跖肿胀属继发性的免疫炎症反应，在D10开始明显肿胀，同时，周身性的免疫炎症反应也开始出现。
与对照组相比，致敏足的肿胀度，CsA组从开始给药时即有明显的抑制作用，土茯苓总苷高剂量组(40mg/kg)的抑制作用在继发性免疫炎症反应时开始出现显著差异；而在对足的肿胀度变化上，土茯苓总苷高剂量组与CsA组的作用相当，均在第14天开始显效(见表2)。土茯苓总苷的低、中两个剂量组对于大鼠的足跖肿胀有一定的抑制作用，但未出现显著性的统计学差异。必须指出，CsA组有两只动物死亡，尸解发现有肝硬化的症状。土茯苓总苷有恢复模型动物体重的趋势，而CsA则使模型动物的体重进一步减轻。
关节组织病理切片中，对照组大鼠关节周围软组织内均见大量急、慢性炎细胞浸润及炎性肉芽肿形成，局灶性软组织坏死明显，滑膜充血水肿，上皮细胞增生，软骨面可见锯齿状破坏；土茯苓总苷各剂量组大鼠关节炎症程度均明显低于对照组，滑膜与软骨形态学改变不同程度地恢复正常，以40mg/kg组效果最为明显，炎症状况基本同正常组，仅3例模型动物滑膜与软骨形态学类似对照组；CsA组大鼠的关节滑膜与软骨形态学均基本相同于正常组，仅1例可见滑膜轻度充血及少量炎细胞浸润。
3、土茯苓总苷对大鼠佐剂关节炎模型关节病变的治疗作用。
于致敏后第19天开始给药，此后每天一次，连续7天，给药后5小时测量足跖厚度以及监测各项指标。Control组口服给药蒸馏水；土茯苓总苷的剂量为：20、40和80mg/kg，口服给药；CsA的给药剂量为5mg/kg，腹腔注射给药。
与对照组相比，给药组的足肿胀显著受抑，对于致敏足肿胀的作用，CsA组较土茯苓总苷高剂量组显效略早。而在对足的肿胀度变化上，土茯苓总苷高剂量组与CsA组无明显差异，均在服药后第七天开始显效(见表3)。土茯苓总苷的20和40mg/kg两个剂量组对于大鼠的致敏足足跖肿胀有一定的抑制作用，而40mg/kg剂量组对对足肿胀的抑制作用也有显著意义。
4、土茯苓总苷对2，4，6-三硝基氯苯致小鼠迟发型变态反应的影响。
于攻击同时、攻击后5及10小时连续3次经口给予土茯苓总苷20、40和80mg/kg，肌注地塞米松(DEX)5mg/kg。对照组经口给予等量的蒸馏水。如表4所示，与对照组相比，土茯苓总苷的中、高两剂量组和阳性对照药DEX均显著地抑制了2，4，6-三硝基氯苯所致的小鼠耳廓肿胀，低剂量组亦有一定的抑制趋势，但无统计学差异。药物作用呈量效关系。
5、土茯苓总苷对鸡蛋清所致小鼠足跖肿胀的影响。
取昆明种小鼠，经口给予土茯苓总苷20、40和80mg/kg，连续三次；肌注DEX5mg/kg，连续两次，每次给药时间间隔均为三小时。对照组经口给予等量的蒸馏水。末次给药的同时致炎，结果如表5所示，与对照组相比，土茯苓总苷中、高两剂量组和阳性对照药DEX均能显著地抑制鸡蛋清所致的小鼠左足足跖肿胀，而土茯苓总苷低剂量组有一定的抑制趋势。药物作用呈量效关系。
6、土茯苓总苷对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响。
取昆明种小鼠，随机分成5组，分别经口给予土茯苓总苷10、20和40mg/kg，连续三次；肌注DEX 5mg/kg，连续两次，每次给药时间间隔均为三小时。对照组经口给予等量的蒸馏水。末次给药的同时致炎，如表6所示，与对照组相比，土茯苓总苷的低、中剂量组对二甲苯所致的小鼠右耳肿胀有一定的抑制作用，高剂量组和阳性对照药DEX则有显著的抑制作用。
综上，本研究应用各种非特异性炎症模型和免疫性炎症模型，包括特异性蛋白、化学物质等诱发的炎症模型，大鼠佐剂性关节炎以及小鼠胶原性关节炎等病理模型，观察了土茯苓总苷在抗炎以及免疫抑制方面的药效。结果表明：土茯苓总苷能显著地抑制鸡蛋清、二甲苯所致的非特异性炎症反应，2、4、6-三硝基氯苯(Picryl chloride，PCl)所致的免疫性炎症反应，减轻炎症反应部位的肿胀程度；对于大鼠佐剂性关节炎以及小鼠胶原性关节炎有明显的预防和治疗作用，能显著减轻足跖部位关节的肿胀程度以及周身炎症的程度，恢复模型动物降低的脾脏重量及体重，组织病理研究显示土茯苓总苷还可以抑制模型动物关节滑膜细胞层的增生，减少炎细胞浸润，减轻滑膜充血水肿，降低滑膜层的损伤，进而调整改善模型动物的病症。
以上结果表明，土茯苓总苷可显著改善各种非特异性炎症和特异性免疫炎症，提示其可用于治疗各种免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、移植排斥、过敏性皮炎、胰岛素依赖性糖尿病、自身免疫性心肌炎、I、II、III和IV型变态反应性疾病、各种结肠炎、器官移植排斥、各型病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、化学性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、重症肝炎、暴发性肝衰竭、肝硬化、肝纤维化、脂肪肝等。
表4.土茯苓总苷对2，4，6-三硝基氯苯所致小鼠迟发性变态反应的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 足跖肿胀度x±SD(×10-3mm) | P值 | 抑制率(％) |
| 对照组土茯苓总苷DEX | -2040805 | 1616161616 | 95±4573.9±2763±30*55±32**19±11*** | -0.12140.03190.0059＜0.0001 | /22.533.542.780.4 |
其中：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较
表5.土茯苓总苷对鸡蛋清所致小鼠足跖肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 足跖肿胀度x±SD(×10-3mm) | P值 | 抑制率(％) |
| 对照组土茯苓总苷DEX | -2040805 | 1616161616 | 237±42213±42206±26*156±79**120±52*** | -0.12020.01980.0011＜0.0001 | -9.812.934.349.4 |
其中：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较
表6.土茯苓总苷对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | 耳廓厚度差值x±SD(×10-3mm) | P值 | 抑制率(％) |
| 对照组土茯苓总苷DEX | -1020405 | 1616161616 | 134±32124±39107±4892±36**77±40*** | -0.44890.06630.0013＜0.0001 | /7.220.533.942.8 |
其中：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较
表1.土茯苓总苷和CsA对CIA模型小鼠关节病变(足跖肿胀)的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | D0(基础值) | D2 | D4 | D8 | ||||
| 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | ||
| 正常组对照组土茯苓总苷CsA | /-10401205 | 1636±1121659±421670±741684±681664±491652±46 | /----- | 14±5493±63##-8±43***3±56**25±43*10±35** | /-108.696.873.189.2 | 7±65105±89#25±95**-6±66**9±25**-8±84* | /-76.2105.791.4107.6 | -7±9276±72#58±160-28±46**42±54-17±39** | /-23.7136.844.7122.4 |
| D12 | D16 | D20 | D24 | ||||||
| 肿胀度μm | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀度(μm) | 抑制率(％) | ||
| 正常组对照组土茯苓总苷CsA | /-10401205 | -14±9358±53#62±123-46±70**13±33*-39±60** | /--6.9179.377.6167.2 | 12±119129±81#74±1104±86**56±48*15±65* | /-42.696.956.688.4 | 4±110152±83##64±95*42±94*57±59*35±37** | /-57.972.462.577.0 | -9±117153±78##81±8755±63**94±4255±20* | /-47.164.138.664.1 |
#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001与正常组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较。
表2.土茯苓总苷和CsA对AA模型大鼠关节病变的预防作用
| 组别 | 剂量mg/kg | D4 | D10 | D14 | D18 | D22 | |||||
| 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | ||
| 致敏足 | |||||||||||
| 正常组对照组土茯苓总苷CsA | /-1020405 | 122±463066±1301###2237±5662315±8292076±392*1856±737* | /-27.024.532.339.5 | 287±502496±989###2028±11451980±6331710±411*1047±366*** | /-18.820.731.558.1 | 261±643156±1554###2384±18772227±9461729±611*800±372*** | /-24.529.445.274.6 | 268±933704±2265###2634±25682508±15331842±839*682±263** | /-28.932.350.381.6 | 324±733969±2374###2651±24882836±16102175±1054675±225** | /-33.228.545.283.0 |
| 对足 | |||||||||||
| 正常组对照组土茯苓总苷CsA | /-1020405 | 141±43154±86146±117124±54133±108131±50 | /-5.219.513.614.9 | 284±76499±64#367±93349±100371±74358±103 | /-26.530.125.728.3 | 245±50752±543#383±253314±125*228±128*222±157** | /-49.158.269.770.5 | 251±451068±1134#388±557425±624183±175*116±68* | /-63.760.282.989.1 | 294±711208±1240#396±517458±641232±119*108±96* | /-67.262.180.891.1 |
#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001与正常组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较。
表3.土茯苓总苷对AA模型大鼠的治疗作用
| 组别 | 剂量(mg/kg) | D2 | D10 | D20 | D24 | D26 | |||||
| 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | 肿胀程度(μm) | 抑制率(％) | ||
| 致敏足 | |||||||||||
| 对照组土茯苓总苷CsA | -2040805 | 3038±7443213±6882908±6692761±7673113±345 | ----- | 2178±30662174±20572253±7142308±5902254±392 | ----- | 4057±24483031±22392591±18332518±17082490±2046 | -25.336.137.938.6 | 3850±26552633±17932335±20262259±18371437±1213* | -31.639.441.362.7 | 3968±26612520±17152240±20541750±1658*1087±1070** | -36.543.555.972.6 |
| 对足 | |||||||||||
| 对照组土茯苓总苷CsA | -2040805 | 39±4037±5045±4841±3836±45 | ----- | 193±227192±237194±237191±202186±254 | ----- | 930±1613322±401307±411193±321139±328 | -65.467.079.285.1 | 1230±1688292±402169±17845±57*57±88* | -76.286.396.395.4 | 1368±1677280±419120±130*46±75*36±54* | -79.591.296.697.7 |
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001与对照组比较。
Claims (5)
1、一种土茯苓总苷提取物的提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)用6-12倍于土茯苓重量的、浓度为30-95％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液；
(2)回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含2-6克生药；
(3)用相当于生药量0.5-2.0倍体积的乙酸乙酯分次萃取，合并萃取液；
(4)回收乙酸乙酯提取液，用真空干燥的方法干燥，温度为60-80℃，得到总苷提取物；
(5)所获得的土茯苓总苷提取物的重量百分比含量为50-80％，落新妇苷的重量百分比含量为20-40％。
2、如权利要求1所述的土茯苓总苷提取物的提取方法，其特征在于在步骤(1)中，用渗漉提取的提取时间为1-12小时。
3、如权利要求1所述的土茯苓总苷提取物的提取方法，其特征在于在步骤(3)中，萃取次数为3-5次。
4、一种土茯苓总苷提取物，其特征在于，该提取物通过以下步骤得到：
(1)用6-12倍于土茯苓重量的、浓度为30-95％的乙醇水溶液对土茯苓进行渗漉提取，合并乙醇水溶液提取液；
(2)回收乙醇水溶液提取液，并使之浓缩至每毫升含2-6克生药；
(3)用相当于生药量0.5-2.0倍体积的乙酸乙酯分次萃取，合并萃取液；
(4)回收乙酸乙酯提取液，用真空干燥的方法干燥，温度为60-80℃，得到总苷提取物；
所获得的土茯苓总苷提取物的重量百分比含量为50-80％，落新妇苷的重量百分比含量为20-40％。
5、如权利要求4所述的土茯苓总苷提取物的用途，其特征在于该提取物在制备治疗类风湿性关节炎、风湿性关节炎、过敏性皮炎、接触性皮炎药物中的应用。
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| 土茯苓中二氢黄酮醇甙的研究 陈广耀 等，中国中药杂志，第21卷第6期 2001 * |
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